CN107893204B - Tlm钛合金表面一种可促骨形成生物表层的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了TLM钛合金表面一种可促骨形成生物表层的制备方法，其是在高频率的表面机械研磨装置中利用1‑5mm直径的撞击小球对TLM钛合金进行表面处理，处理后的TLM钛合金表面晶粒尺寸达到了10‑30nm左右，表面表现出了更好的亲水性能，和处理前的Ti‑25Nb‑3Mo‑3Zr‑2Sn钛合金样品相比较，表面处理后的钛合金样品更能促进成骨细胞在其表面的黏附、增殖、成骨相关基因表达及蛋白合成。纳米晶的表面更接近细胞外基质及细胞感受器的拓扑结构，因而可以大大促进胞材响应，由于胞材作用更好的种植体表面能诱发更强的骨整合，我们的研究将有助于设计和开发出生物学效应更好的种植体。

Description

TLM钛合金表面一种可促骨形成生物表层的制备方法
技术领域
本发明属于医用钛合金表面改性方法，具体为TLM钛合金表面一种可促骨形成生物表层的制备方法。
背景技术
钛及其合金由于具有良好的力学性质、生物相容性及化学稳定性在临床上有着广泛的应用。Ti-Zr-Nb-Mo-Sn(TLM)合金作为第三代医用近β型钛合金，具有低弹性模量、较高强度、高塑韧性、良好耐磨性及疲劳强度高等优良性能，综合性能优于传统医用钛合金的。作为医用金属植入材料，TLM合金可作为人工关节假体等使用，由于其本身属于生物惰性材料，植入体内后与周围组织的结合仅仅是简单的机械锁合，不能形成良好的化学键合，因而植入体往往被纤维组织包裹而与宿主组织隔离开来，易引起血栓从而导致种植失败。
在生物医用材料领域，纳米化钛合金具备了普通钛材所不及的特殊力学性能，同时纳米结构对体内细胞的黏附、分化和增殖提供了有利条件。另外，纳米钛合金表面具有更多的粒子边界，使得材料表面获得大量自由电子，使得纳米材料具备更高的活化能，促进了材料表面钙磷沉积，相比于光滑表面更能促进体内骨整合，这些结果都揭示了纳米表面钛合金结构作为一种新型骨植入材料具有良好的医学适用性，可以有效提高植入假体界面与骨组织的结合效果。
表面机械研磨(SMAT)是一种新兴的表面处理方法，该法通过强烈的塑性变形使金属材料表面纳米化，获得表面为纳米晶、而晶粒尺寸沿深度方向逐渐增大梯度结构的一种表面处理方法。在表面机械研磨处理过程中，表面光滑的钢球(或者其它材料如玻璃球或陶瓷球)以不同方向作用于样品表面，在样品的表面附近形成应力场，使得处理样品的表面晶粒尺寸不断细化、直至纳米尺度。黄润等在《高等学校化学学报》2017年第4期第38卷522-529页上发表的“表面机械研磨对医用钛合金生物活性的影响”一文采用3mm的GCr15钢球在50Hz条件下对TLM合金进行SMAT处理30min，处理后的TLM合金显著改变了合金的表面粗糙度、拓扑结构、亲水性及表面不同化学态氧元素的含量，表现出更强的生物活性，但是TLM钛合金的物相组成及晶粒尺寸并未获得改变，生物活性有待于进一步改善。此外，G.Balasundaram et al.“An Overview of Nano-Polymers for OrthopedicApplications.Macromolecular Bioscience.2007,7,635–642”一文阐述了20nm左右的晶粒尺寸更加接近细胞外基质的几何拓扑结构，因而更能促进细胞响应。因此，研制更高生物活性和生物学效应的新型钛基表面具有重要的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于现有技术中TLM钛合金作为医用种植体生物学效应差，提供了一种在TLM钛合金表面制备可促骨形成生物表层的方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
TLM钛合金表面一种可促骨形成生物表层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取TLM钛合金圆板，打磨至光滑，而后对圆板表面在丝绒布上抛光处理，再然后用丙酮、去离子水超声清洗、晾干；
步骤二、将抛光面固定在表面纳米试验机处理腔中进行表面研磨，处理过程在真空中进行，撞击小球采用直径为1-5mm的研磨介质，在工作频率为1000-3000Hz,处理时间为30-60min；
步骤三、处理后的TLM钛合金研磨层经酸洗除杂、清洗后进行紫外光照射，高压蒸汽消毒，即得。
优选地，步骤一中的打磨过程为：先使用预磨机打磨，去掉表面氧化层，再经120#、400#、1200#水砂纸逐级打磨。
优选地，步骤一中超声清洗的条件为：超声功率为20-30KW，超声频率为200-300KHz，超声时间为10-20min。
优选地，步骤二中的真空度<0.1Pa。
优选地，步骤二中撞击小球直径为3mm。
优选地，步骤二中的研磨介质为Mo合金、316L不锈钢、GCr15钢、TLM钛合金中的一种。
优选地，步骤二中的表面纳米试验机处理腔的工作频率为2000Hz。
优选地，步骤二中的处理时间为45min。
优选地，步骤三中的酸洗除杂采用的是稀硫酸，所述的稀硫酸的浓度为30-38％。
优选地，步骤三中可促骨形成生物表层的晶粒尺寸为15-25nm，厚度为20μm。
本发明相比现有技术具有以下优点：
将机械表面研磨的振动频率提高到1000-3000Hz，同时通过撞击小球粒径和研磨时间的合理配制，实现了TLM合金表层纳米化，改变了TLM钛合金表层的晶粒尺寸，并且可以将晶粒细化至10-30nm，这一晶粒尺寸更加接近细胞外基质的几何拓扑结构，因而更能促进细胞响应，提高该合金体外的成骨细胞响应，表现出良好的生物学效应。
附图说明
图1为表面机械研磨处理前后TLM钛合金表面的物相组成XRD衍射图。
图2为表面机械研磨处理后TLM钛合金表面的晶粒微观组织结构图。
图3为表面机械研磨处理后TLM钛合金表面的变形层形貌图。
图4为表面机械研磨前后接触角测试效果图；其中：(a)图为处理前；(b)图为处理后。
图5为表面机械研磨前后原子力显微图；其中：(a)图为处理前；(b)图为处理后。
图6为表面机械研磨处理前后培养不同时间表面的成骨细胞个数图。
图7为表面机械研磨处理前后TLM钛合金表面的成骨细胞培养24h后的场发射扫描电镜观察细胞形态图；其中：(a)图为处理前；(b)图为处理后。
图8为表面机械研磨处理前后培养不同时间后表面的成骨细胞胞内成骨相关基因表达情况对比图。
图9为表面机械研磨处理前后培养不同时间后表面的成骨细胞胞内成骨相关蛋白表达情况对比图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例TLM钛合金表面一种可促骨形成生物表层的制备方法的具体步骤为：
试样为真空熔炼后的TLM热轧板，将热轧板切割成直径100mm、厚度5mm的圆片，随后对圆片使用预磨机打磨，去掉表面氧化层，再经120#、400#、1200#水砂纸打磨、表面抛光后，用丙酮和去离子水超声清洗、晾干，采用中国科学院金属研究所和成都新晶格科技有限公司联合制造的SNC-I型金属材料表面纳米试验机对上述抛光后的TLM圆片进行SMAT处理，处理过程在常温常压下进行，撞击小球采用直径为1mm的GCr15的钢球75个，工作频率为3000Hz，抽真空至<0.1Pa，处理时间为30min，处理完成后将SMAT后的TLM圆片线切割为1mm×1mm×5mm的小方块，并在表面用浓度为30％的稀硫酸清洗除杂，然后于丙酮、酒精、去离子水中分别在超声功率25KW，功率为250KHz下超声清洗15min后进行紫外光照射，高压蒸汽消毒，得表面SMAT处理的TLM钛合金样品。
实施例2
本实施例TLM钛合金表面一种可促骨形成生物表层的制备方法的具体步骤为：
试样为真空熔炼后的TLM热轧板，将热轧板切割成直径100mm、厚度5mm的圆片，随后对圆片使用预磨机打磨，去掉表面氧化层，再经120#、400#、1200#水砂纸打磨、表面抛光后，用丙酮和去离子水超声清洗、晾干，采用中国科学院金属研究所和成都新晶格科技有限公司联合制造的SNC-I型金属材料表面纳米试验机对上述抛光后的TLM圆片进行SMAT处理，处理过程在常温常压下进行，撞击小球采用直径为5mm的GCr15的钢球75个，工作频率为1000Hz，抽真空至<0.1Pa，处理时间为60min，处理完成后将SMAT后的TLM圆片线切割为1mm×1mm×5mm的小方块，表面用浓度为35％的稀硫酸清洗除杂，然后于丙酮、酒精、去离子水中分别在超声功率20KW，功率为200KHz下超声清洗15min后进行紫外光照射，高压蒸汽消毒，得表面SMAT处理的TLM钛合金样品。
实施例3
本实施例TLM钛合金表面一种可促骨形成生物表层的制备方法的具体步骤为：
试样为真空熔炼后的TLM热轧板，将热轧板切割成直径100mm、厚度5mm的圆片，随后对圆片使用预磨机打磨，去掉表面氧化层，再经120#、400#、1200#水砂纸打磨、表面抛光后，用丙酮和去离子水超声清洗、晾干，采用中国科学院金属研究所和成都新晶格科技有限公司联合制造的SNC-I型金属材料表面纳米试验机对上述抛光后的TLM圆片进行SMAT处理，处理过程在常温常压下进行，撞击小球采用直径为3mm的GCr15的钢球75个，工作频率为2000Hz，抽真空至<0.1Pa，处理时间为45min，处理完成后将SMAT后的TLM圆片线切割为1mm×1mm×5mm的小方块，表面用浓度为38％的稀硫酸清洗除杂，然后于丙酮、酒精、去离子水中分别在超声功率30KW，功率为300KHz下超声清洗15min后进行紫外光照射，高压蒸汽消毒，得表面SMAT处理的TLM钛合金样品，另取同规格的未经SMAT处理的TLM钛合金作为对照组，分别进行如下性能测试：
(一)表面性能测试
(1)、表面机械研磨处理前后TLM钛合金表面的物相组成XRD衍射测试结构见图1，可见处理前后的TLM钛合金表面均由单一的纯β-Ti相组成，并且β-Ti相的(110)、(200)和(211)3个特征衍射峰峰形相近，表明处理前后合金表面的物相没有发生明显的变化。
(2)表面机械研磨处理后TLM钛合金表面的晶粒微观组织结构图见图2，表面机械研磨处理后TLM钛合金表面的变形层形貌图见图3，结合图2和图3可以看出，处理后的TLM钛合金最表层晶粒平均尺寸为20±5nm，金相显微结构显示变形层厚20μm。
(3)亲水性能测试
采用德国Kruss公司生产的DSA30型接触角测量仪测试处理前后两种样品表面的亲水性能。测试液体采用去离子水，当水滴完全接触到样品表面时，用设备自带的相机拍照并使用DSA1分析软件对接触角进行计算。每种样品设平行样品三个，每个样品上重复测试三次，以确保实验结果的可靠性。表面性能测试结果见图4，可见处理后的表面为亲水性的表面，水滴接触角为47.3±1.6°。
(4)粗糙度测试
采用日本生产的SPM-9500J3型原子力显微镜观察处理前后两种样品表面的形貌，并测试样品表面的粗糙度，原子力显微镜使用Si3N4探针，悬臂弹性常数为60mN·m-1，原子力显微镜的成像采用非接触模式，测试结果以三维形貌显示在计算机上，再摄制成照片；选取代表性的指标Ra(轮廓算术平均值)来评价样品表面的粗糙度，每种样品设平行样品三个，每个试样表面取不同区域测试三次，取平均值作为相应指标测试值；原子力显微分析测出的表面平均粗糙度Ra为22.4±1.7nm。
在成骨细胞培养液中孵育3、7及14天后，在每个时间点，样品表面细胞胞内的成骨相关基因及对应蛋白表达结果共同显示ALP(碱式磷酸酶)、Col-I(I型胶原)、OPN(骨桥蛋白)及OCN(骨钙素)在处理后的样品表面均得到了较大的上调，上述结果证明了表面机械研磨处理后的TLM合金是一种有潜力作为临床医用的新型种植体。进行生物学实验检测，成骨细胞在样品表面黏附个数、铺展程度及胞内成骨相关基因及蛋白表达均大大上调。
(二)体外成骨细胞响应评价
(1)细胞培养
人成骨细胞系hFOB l.19购于中国科学院细胞库，用含10％胎牛血清，0.5mM丙酮酸和0.3mg·mL-1G418的DMEM/F12 1:l混合培养液培养细胞株，当细胞长至80％～90％、约1×106个/mL时，用PBS缓冲液清洗，加入0.25％胰蛋白酶消化约2～3min，镜下见细胞间隙增大、回缩变圆时，用培养液中和终止其消化，吹打制成单细胞悬液，洗涤离心(1000r·min-1，5min)后，重新制成单细胞悬液，分别传代接种于2个大小为25cm2的一次性培养瓶中。之后将培养瓶放入37℃、5％CO2饱和湿度的孵化箱中进行培养。每2～3d更换一次培养液，取传至2～4代的成骨细胞作为实验细胞。
(2)细胞黏附个数检测
将处理前后两种样品置于24孔板中(处理面朝上，下同)，随后将总体积500μL、含8×104个成骨细胞的细胞培养基注入到放有实验样品的24孔板中，置于细胞培养箱中；培养1、5、24、72和168h后，吸弃24孔板中的培养液，用PBS轻柔漂洗3遍(除去没有黏附在材料表面的细胞)，并将样品转入到新的24孔板中；每孔加入300μL胰酶消化3-5min，然后加700μL细胞培养基终止消化；吹打成单细胞悬液，计数，统计结果见图6，从图中可以看出，在每个时间点，经处理后的样品表面细胞个数近乎为处理前样品的2倍。
(3)细胞形态观测
细胞在处理前后两种样品表面培养24h后，其形态通过场发射扫描电镜观察。具体方法如下：将总体积500μL、含8×104个成骨细胞的细胞培养基，注入到放有实验样品的24孔板中，置于细胞培养箱中培养。到目标时间时，取出24孔板，吸弃孔中培养基，用PBS轻柔漂洗3次，并将实验样品转入新的24孔板中，每孔加入300μL2.5％戊二醛，于4℃固定1h；吸弃戊二醛后，于室温下在30％、50％、70％、90％、95％和100％的梯度酒精分别脱水10min；脱水后放入真空干燥箱隔夜，表面喷金后用场发射扫描电镜观察细胞形态，见图7，可以看出成骨细胞在处理后样品表面铺展更加充分。
(4)细胞成骨相关基因的表达
为检测处理前后两种样品表面对成骨细胞hFOB1.19成骨相关基因表达的影响，使用实时定量PCR(qRT-PCR)检测成骨细胞在样品表面上培养不同时间后，成骨相关基因的mRNA水平表达。实验过程如下：(1)样品表面成骨细胞总RNA的提取：每种样品各取4个放在24孔板内，在每孔中加入1mL含8×104个细胞的培养基，放置于孵箱中于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养3、7和14d。到达目标时间后，移弃细胞培养液，用PBS漂洗3次，随后加入1mLTRIzol溶解4个平行试样上的细胞，将细胞裂解液转移至l.5mL离心管中；加入0.2mL氯仿，颠倒混匀，室温静置1min，于4℃、12000r·min-1条件下离心15min；取无色水相液体至另一个1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，室温静置10min，于4℃、12000r·min-1条件下离心10min后弃液体；加入75％乙醇lmL，于4℃、7500r·min-1条件下离心5min后弃液体；加入0.02mL0.1％DEPC水溶解RNA，细胞总RNA提取物使用分光光度计定量分析核酸浓度并调整使总RNA浓度均一化；(2)将RNA逆转录成cDNA：每组样品取模板RNA 4μL，加入Oligo(dT)和DEPC水各1μL后混匀，在70℃条件下反应10min后急速冰浴2min；将反应得到的模板6μL，加入5×M-MLV Buffer 2μL、dNTP 0.5μL、RNA酶抑制剂0.25μL、M-MLV酶0.25μL和DEPC水1μL后混匀，将该混合物体系在42℃条件下反应60min之后再于70℃条件下反应15min；将逆转录得到的各组cDNA置于冰上冷却，放置于-20℃条件下保存待用；(3)实时定量PCR反应：引物及探针序列设计见表1。将(2)中逆转录得到的cDNA 用双蒸水稀释5倍后吸取2μL，转移到实时定量PCR专用的离心管中，与10μL Real-Time PCRMater Mix、7μL双蒸水、上下游引物各0.5μL混匀成20μL的反应体系。反应体系在Bio-Rad iQ5 Real-time PCR仪上进行PCR反应，使用IQ5SYBR Green I Supermix PCR System进行实时荧光定量反应，反应过程为：首先在95℃，30s条件下预变性，然后在60℃、10s和40℃、20s条件下进行目标基因扩增反应，扩增循环40次。该实验检测细胞成骨相关的4种基因：I型胶原(Col-I)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)。GAPDH作为管家基因。每组试样设3个重复。实验数据的处理采用根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，将各测试组目的基因的Ct值除以管家基因的Ct值，以消除系统误差，保证结果分析中一致，测试结构见图8，从图中可以看出，在成骨细胞培养液中孵育3、7及14天后，在每个时间点，样品表面细胞胞内的成骨四种基因表达结果在处理后的样品表面均得到了较大的上调。
表1实时定量PCR各基因使用的上下游引物序列
Figure BDA0001490227740000101
(5)细胞胞内碱式磷酸酶及特异性蛋白检测
成骨细胞在处理前后两种样品表面培养后，其胞内碱性磷酸酶(ALP)活性、胞内特异性蛋白含量用酶联免疫分析法检测。将总体积500μL、含8×104个成骨细胞的细胞培养基，注入到放有实验样品的24孔板中，培养3、7和14d后用PBS轻柔漂洗三次；每孔用200μL0.1％Triton X-100处理试验试样，并反复冻融5个循环裂解细胞，震荡5min；4℃，1000r·min-1离心10min，取上清，-80℃保存备用。分别使用相应的人酶联免疫分析试剂盒测试(R&D，USA)，具体试验操作方法参照试剂盒说明书。本实验检测成骨细胞胞内ALP活性以及胞内三种特异性蛋白(I型胶原(Col-I)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN))的浓度，检测结果见图9，从图中可以看出，在成骨细胞培养液中孵育3、7及14天后，在每个时间点，经表面机械研磨处理后的样品表面ALP活性以及胞内三种特异性蛋白(I型胶原(Col-I)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN))的浓度均得到了较大的上调。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.TLM钛合金表面一种可促骨形成生物表层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取TLM钛合金圆板，打磨至光滑，而后对圆板表面在丝绒布上抛光处理，再然后用丙酮、去离子水超声清洗、晾干；
步骤二、将抛光面固定在表面纳米试验机处理腔中进行表面研磨，处理过程在真空中进行，撞击小球采用直径为1-5mm的研磨介质，工作频率为2000Hz,处理时间为30-60min；所述研磨介质为GCr15钢球，GCr15钢球数量为75个；
步骤三、处理后的TLM钛合金研磨层经酸洗除杂、清洗后进行紫外光照射，高压蒸汽消毒，即得晶粒尺寸为15-25nm，厚度为20μm的可促骨形成生物表层；
所述步骤一中的打磨过程为：先使用预磨机打磨，去掉表面氧化层，再经120#、400#、1200#水砂纸逐级打磨；
所述步骤一中超声清洗的条件为：超声功率为20-30KW，超声频率为200-300KHz，超声时间为10-20min；
所述步骤二中的真空度<0.1Pa；
所述步骤三中的酸洗除杂采用的是稀硫酸，所述的稀硫酸的浓度为30-38％。
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