CN107854450A - 一种噬菌体裂解酶缓释纳米微粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种噬菌体裂解酶缓释纳米微粒的制备方法，它涉及一种噬菌体裂解酶缓释纳米微粒的制备方法。本发明解决了现有噬菌体裂解酶在动物体内易降解，药代时间短和现有噬菌体裂解酶也缺乏有效地缓释的问题。制备方法:一、将裂解酶水溶液和壳聚糖酸溶液用匀质机混匀；二、将上述混合液和交联剂硫酸葡聚糖一同加入医用混合机中，得到缓释颗粒，冻干后长期保存。本发明可用于裂解酶药物的生产，在医药领域具有极大的发展空间。

Description

一种噬菌体裂解酶缓释纳米微粒的制备方法
技术领域
本发明涉及一种噬菌体裂解酶缓释纳米微粒的制备方法。
背景技术
噬菌体裂解酶被认为是高效的生物酶抗生素，在当前微生物耐药性日益严重的情况下，裂解酶在动物疫病防控领域的应用前景被全球科学家高度关注。虽然裂解酶来源于噬菌体，但由于噬菌体裂解谱较窄，并且在应用过程中存在变异等的问题，而限制其应用。细菌噬菌体裂解酶是一种新的细菌细胞壁裂解酶，由噬菌体基因组编码，在噬菌体复制后期起释放病毒粒子作用。经典的裂解酶具备两个独立的功能区，包括N端的裂解酶活性区（catalytic domain, CD）和C端的细胞壁结合区（cell wall binding domain，CBD），分别具有裂解酶活性和细胞壁结合活性。一般来说，裂解酶的 N 端为裂解活性域，可以特异性的破坏肽聚糖的化学键。因细胞内溶物外泻而死亡，这种杀菌方式不易使细菌产生耐药性的突变菌株，有望开发为新一代抗菌药物。但是现有的裂解酶缺乏一种有效地缓释包膜。
载药微球能够控制药物释放速度、降低药物的毒副作用、提高疏水性药物对细胞膜的通透性、改善药物的稳定性和改变给药途径、延长药物疗效, 以及靶向给药等。国内有学者用硫酸葡聚糖载体包裹蛋白类药物制作纳米微球，但实验中发现硫酸葡聚糖微球载体与蛋白类药物黏附效果不佳。
发明内容
本发明解决了现有噬菌体裂解酶在动物体内易降解，药代时间短和现有噬菌体裂解酶也缺乏有效地缓释的问题，本发明是这样实现的：
一种裂解酶缓释纳米微粒的制备方法，其特征在于按以下步骤制备:
（1）、将裂解酶水溶液和壳聚糖酸溶液用匀质机混匀；
（2）、将上述混合液和交联剂硫酸葡聚糖一同加入医用混合机中，得到缓释颗粒，冻干后长期保存。
步骤（1）中壳聚糖酸溶液中含有壳聚糖和葡萄糖，其中壳聚糖的质量体积百分比浓度为0.5 % -1%、其脱乙酰度82%-85%，分子量为50000～190000；壳聚糖与葡萄糖的摩尔比为0.2-0.5。
步骤（1）中于裂解酶与壳聚糖的质量比为1:1。
步骤（1）中壳聚糖酸溶液还加入体积浓度为0. 1%-1%的有机酸或无机酸。
步骤（2）中硫酸葡聚糖水溶液中硫酸葡聚糖的质量浓度为0.1%-1%。
步骤（2）中硫酸葡聚糖水溶液与壳聚糖酸-裂解酶混合溶液混匀过程中调节pH值为5. 9-6.3。
步骤（2）硫酸葡聚糖与壳聚糖质量比为6:1。
步骤（2）中形成的缓释颗粒的粒径为50-200nm。
有益效果：
本发明在硫酸葡聚糖纳米微球上引入壳聚糖，实验显示该纳米微球细胞相容性较好，载药率高；裂解酶缓释纳米微粒体外溶出实验条件下，24小时内在模拟肠液中释放82-85%，而在模拟胃液中仅仅释放15 -18%，从而保证包封药物不被胃酸破坏，这种缓释纳米微粒在制剂工艺条件下冻干后，能够保持其原有的强度和控释性能。
本发明可用于裂解酶药物的生产，在医药领域具有极大的发展空间。
具体实施方式
实施例1
裂解酶缓释纳米微粒按以下步骤制备:
（1）、将裂解酶水溶液和壳聚糖酸溶液用匀质机（上海岚誉机械有限公司，LYD500W-T18）混匀；
（2）、将上述混合液和交联剂硫酸葡聚糖一同加入医用混合机（长沙中晶化工机械有限公司，V-50L）中，得到缓释颗粒，冻干后长期保存。
步骤（1）中其特征在于壳聚糖酸溶液中含有壳聚糖和葡萄糖，其中壳聚糖质量浓度为0.5% (W/V)-1% (W/V)、其脱乙酰度为82%-85%，其分子量为50000～190000；壳聚糖酸溶液中壳聚糖与葡萄糖的摩尔比为0.2；壳聚糖酸溶液浓度需>0. 5 % (W/V)，壳聚糖酸溶液浓度升高，缓释微粒的强度增强；裂解酶与壳聚糖的质量比为1:1；步骤（1）中于裂解酶与壳聚糖的质量比为1:1。
步骤（1）中壳聚糖酸溶液还加入体积浓度为0. 1%的乙酸。
步骤（2）中硫酸葡聚糖水溶液中硫酸葡聚糖的质量浓度为0.1%。
步骤（2）中硫酸葡聚糖水溶液与壳聚糖酸-裂解酶混合溶液混匀过程中调节pH值为5. 9。
步骤（2）中硫酸葡聚糖与壳聚糖质量比为6:1。
形成的缓释颗粒经过马尔文粒径仪测定粒径为50-200nm。
本实施例采用超速离心法（22000rpm、1h），去除纳米颗粒，检测未包被裂解酶发现裂解酶包埋的包封率达到70. 26%。而且裂解酶在该分子量壳聚糖中能够有效的缓释，达到长期稳定持续的释放药物。
在体外模拟(胃液、肠液)试验以及动物学试验（模拟胃液消化阴性对照蛋白溶液：选用牛血清白蛋白化作为，模拟胃液消化阴性对照。称取5mg牛血清白蛋白，定容于1ml重蒸水中，混匀。模拟肠液消化阴性对照蛋白溶液：选用牛乳球蛋白Ｂ作为模拟肠液消化阴性对照。称取5mg牛乳球蛋白Ｂ，定容于1ml重蒸水中，混匀。模拟胃液消化阳性对照蛋白溶液：选用大豆肽蛋白酶抑制剂作为模拟胃液消化阳性对照。称取5mg大豆肽蛋白酶抑制剂，定容于1ｍＬ重蒸水中，混匀。模拟肠液消化阳性对照样品溶液：选用大豆膀蛋白酶抑制剂作为模拟肠液消化阳性对照。称取5mg大豆族蛋白酶抑制剂，定容于1ml重蒸水中，混匀。将1.9mL模拟胃/肠消化液加入10ml离心管中，置于巧37°C恒温水浴锅中水浴5min。加入100ul对照蛋白溶液（5mg/ml），涡旋震荡混匀后置于37°C水浴锅中水浴，并准确记录时间，12小时、24小时时，迅速吸取反应液100ul加入1.5ml离心管中，迅速置于冰上，采用超速离心法（22000rpm、1h），去除纳米颗粒，检测裂解酶释放情况。）表明:这个裂解酶缓释纳米微粒在小鼠小肠表面能够粘附12小时以上无破裂，从而保证药物能够被小肠充分吸收。裂解酶缓释纳米微粒体外溶出实验条件下，24小时内在模拟肠液中释放85%，而在模拟胃液中仅仅释放15 %，从而保证包封药物不被胃酸破坏，这种缓释纳米微粒在制剂工艺条件下冻干后，能够保持其原有的强度和控释性能。
实施例2
裂解酶缓释纳米微粒按以下步骤制备:
（1）、将裂解酶水溶液和壳聚糖酸溶液用匀质机（上海岚誉机械有限公司，LYD500W-T18）混匀；
（2）、将上述混合液和交联剂硫酸葡聚糖一同加入医用混合机（长沙中晶化工机械有限公司，V-50L）中，得到缓释颗粒，冻干后长期保存。
步骤（1）中其特征在于壳聚糖酸溶液中含有壳聚糖和葡萄糖，其中壳聚糖质量浓度为0.5% (W/V)-1% (W/V)、其脱乙酰度为82%-85%，其分子量为50000～190000；壳聚糖酸溶液中壳聚糖与葡萄糖的摩尔比为0.2；壳聚糖酸溶液浓度需>0. 5 % (W/V)，壳聚糖酸溶液浓度升高，缓释微粒的强度增强；裂解酶与壳聚糖的质量比为1:1；步骤（1）中于裂解酶与壳聚糖的质量比为1:1。
步骤（1）中壳聚糖酸溶液还加入体积浓度为1%的乙酸。
步骤（2）中硫酸葡聚糖水溶液中硫酸葡聚糖的质量浓度为1%。
步骤（2）中硫酸葡聚糖水溶液与壳聚糖酸-裂解酶混合溶液混匀过程中调节pH值为6.3。
步骤（2）中硫酸葡聚糖与壳聚糖质量比为6:1。
形成的缓释颗粒经过马尔文粒径仪测定粒径为50-200nm。
本实施例采用超速离心法（22000rpm、1h），去除纳米颗粒，检测未包被裂解酶发现裂解酶包埋的包封率达到69. 23%。而且裂解酶在该分子量壳聚糖中能够有效的缓释，达到长期稳定持续的释放药物。
在体外模拟(胃液、肠液)试验以及动物学试验（模拟胃液消化阴性对照蛋白溶液：选用牛血清白蛋白化作为，模拟胃液消化阴性对照。称取5mg牛血清白蛋白，定容于1ml重蒸水中，混匀。模拟肠液消化阴性对照蛋白溶液：选用牛乳球蛋白Ｂ作为模拟肠液消化阴性对照。称取5mg牛乳球蛋白Ｂ，定容于1ml重蒸水中，混匀。模拟胃液消化阳性对照蛋白溶液：选用大豆肽蛋白酶抑制剂作为模拟胃液消化阳性对照。称取5mg大豆肽蛋白酶抑制剂，定容于1ｍＬ重蒸水中，混匀。模拟肠液消化阳性对照样品溶液：选用大豆膀蛋白酶抑制剂作为模拟肠液消化阳性对照。称取5mg大豆族蛋白酶抑制剂，定容于1ml重蒸水中，混匀。将1.9mL模拟胃/肠消化液加入10ml离心管中，置于巧37°C恒温水浴锅中水浴5min。加入100ul对照蛋白溶液（5mg/ml），涡旋震荡混匀后置于37°C水浴锅中水浴，并准确记录时间，12小时、24小时时，迅速吸取反应液100ul加入1.5ml离心管中，迅速置于冰上，采用超速离心法（22000rpm、1h），去除纳米颗粒，检测裂解酶释放情况。）表明:这个裂解酶缓释纳米微粒在小鼠小肠表面能够粘附12小时以上无破裂，从而保证药物能够被小肠充分吸收。裂解酶缓释纳米微粒体外溶出实验条件下，24小时内在模拟肠液中释放82%，而在模拟胃液中释放18%，从而保证包封药物不被胃酸破坏，这种缓释纳米微粒在制剂工艺条件下冻干后，能够保持其原有的强度和控释性能。

Claims (8)

1.一种裂解酶缓释纳米微粒的制备方法，其特征在于按以下步骤制备:
（1）、将裂解酶水溶液和壳聚糖酸溶液用匀质机混匀；
（2）、将上述混合液和交联剂硫酸葡聚糖一同加入医用混合机中，得到缓释颗粒，冻干后长期保存。
2.根据权利要求1所述的裂解酶缓释纳米微粒的制备方法，其特征在于步骤（1）中壳聚糖酸溶液中含有壳聚糖和葡萄糖，其中壳聚糖的质量体积百分比浓度为0.5 % -1%、其脱乙酰度82%-85%，分子量为50000～190000；壳聚糖与葡萄糖的摩尔比为0.2-0.5。
3.根据权利要求1所述的裂解酶缓释纳米微粒的制备方法，其特征在步骤（1）中于裂解酶与壳聚糖的质量比为1:1。
4.根据权利要求1所述的裂解酶缓释纳米微粒的制备方法，其特征在于步骤（1）中壳聚糖酸溶液还加入体积浓度为0. 1%-1%的有机酸或无机酸。
5.根据权利要求1所述的裂解酶缓释纳米微粒的制备方法，其特征在于步骤（2）中硫酸葡聚糖水溶液中硫酸葡聚糖的质量浓度为0.1%-1%。
6.根据权利要求1所述的裂解酶缓释纳米微粒的制备方法，其特征在于步骤（2）调节pH值为5. 9-6.3。
7.根据权利要求1所述的裂解酶缓释纳米微粒的制备方法，其特征在于步骤（2）硫酸葡聚糖与壳聚糖质量比为6:1。
8.根据权利要求1所述的裂解酶缓释纳米微粒的制备方法，其特征在于步骤（2）中形成的缓释颗粒的粒径为50-200nm。
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