CN107841515A - 一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，通过对宿主菌进行代谢途径改造，利用造纸废液为原料生产丁二酸，所述造纸废液为造纸过程中产生的原始废液或者是对原始废液进行蒸馏处理，分离出糖类，残留的含有乙酸和甲酸的蒸馏残留液。本发明通过代谢工程手段构建重组大肠杆菌菌株，能将废液中的抑制物乙酸高效地转化为丁二酸，且利用其中的甲酸为该代谢过程提供能量，提高乙酸的利用率，有效地解决了造纸废液中乙酸及甲酸利用问题。本发明构建的重组大肠杆菌可以利用造纸废液为原料，高效生物合成丁二酸，为造纸废液的利用提供一种新的处理方法。

Description

一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程和环境工程领域，更具体地讲，涉及一种利用造纸废液为原料生物合成丁二酸的方法。
背景技术
造纸过程产生的工业废水具有排放量大、COD高、pH变化幅度大、色度高、有硫醇类恶臭气味等特点，属于较难处理的工业废水，我国造纸工业的平均单位产品耗水量要比发达国家高出1倍以上，年排水量仅次于化学工业及钢铁工业，产生了巨大的废水污染。目前，对造纸废液的处理方法较多，包括物理处理法(过滤法和气浮法)、物理化学法(混凝沉淀法、膜分离法、吸附法)、化学处理法(化学氧化法、光催化氧化法)及生物处理法(真菌处理法、厌氧生物法、好氧生物法)。虽然对造纸废液的处理方法较多，但各种方法都存在着不同的技术问题。生物处理法虽然较其他方法经济成本低且环境友好，但其主要是通过在一定的条件下将有机物降解，存在降解不完全现象。
在造纸废液中含有多种可利用的碳源，如木糖、葡萄糖、阿拉伯糖及未充分水解的木质素等，同时废液中也存在多种抑制物如乙酸、甲酸、糠醛、5-甲基糠醛等，由于这些抑制物的存在也进一步阻碍了糖类的利用。从造纸废液中经过蒸馏处理较容易的分离出糖类物质，但对于抑制物乙酸与甲酸的利用目前没有报道，因此，通过生物转化法将造纸废液中的可利用碳源转化为高附加值化合物，是高效经济处理废液的一种方法。
丁二酸作为一种重要的四碳化合物，广泛地应用于表面活性剂、食品添加剂、医药中间体、可生物降解聚合物的前体等方面。传统的丁二酸多由石油经化工合成生产，但因石油的不可再生和环境污染等原因使得丁二酸作为基本化工原料的广泛应用受到限制。以微生物发酵生产丁二酸则具有较多优点：如环境友好、原料可再生、成本低廉等。现有的丁二酸发酵生产研究大多以糖类为碳源，同时也有报道以非粮食基的甘油和乙酸为碳源。乙酸是许多微生物厌氧代谢的终产物和有氧代谢的不完全氧化产物，同时，木质纤维素在水解利用的过程中也会产生大量的乙酸。野生型大肠杆菌能够利用乙酸为唯一碳源供生长，但细胞内无任何代谢副产物积累，代谢乙酸产生的能量和化合物均用于菌体合成。Li等(ACSSynth Biol.2016；5(11):1299–307)通过对大肠杆菌MG1655进行代谢工程改造，包括敲除琥珀酸脱氢酶编码基因(sdhAB)、乙醛酸循环阻遏基因(iclR)、苹果酸酶编码基因(maeB)及过表达柠檬酸合酶编码基因(gltA)，通过改造的大肠杆菌能在好氧条件下以乙酸为唯一的碳源生产丁二酸。在摇瓶发酵过程中，该基因工程菌在72h能积累16.53mM丁二酸；采用静息细胞转化的方式，该菌株在42h生产丁二酸61.71mM。然而，该基因工程菌丁二酸的产量与产率均较低，且以纯乙酸钠为碳源，存在能量不足而产量产率低等问题。
在野生型大肠杆菌中，甲酸在甲酸脱氢酶的作用下转化为CO2和H2，但在来源于Candida boidinii菌株的甲酸脱氢酶作用下，1mole甲酸则转化为1mole CO2和NADH，且与大肠杆菌自身的甲酸脱氢酶Km值(26mM)相比，来源于C.boidinii菌株的甲酸脱氢酶Km值则更低(13mM)(J.Biol.Chem.1991；(266):13731–13736)。San等(Metab Eng.2002；(4):217–229)在厌氧条件下，通过过表达来源于C.boidinii的甲酸脱氢酶编码基因，在培养基中添加甲酸，以提高胞内可利用的NADH水平。而在好氧条件下，NADH通过氧化呼吸链可以产生ATP，以维持菌体能量代谢。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，通过基因工程手段对大肠杆菌基因进行改造，构建能够利用乙酸和甲酸生产丁二酸的代谢工程大肠杆菌，并能够利用含有乙酸和甲酸的造纸废液为原料，高效地生产丁二酸。
本发明的第二个目的在于提供一种利用造纸废液为原料生产丁二酸的重组大肠杆菌。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，通过对宿主菌进行代谢途径改造，利用造纸废液为原料生产丁二酸，所述造纸废液为造纸过程中产生的原始废液或者是对原始废液进行蒸馏处理，分离出糖类，残留的含有乙酸和甲酸的蒸馏残留液。
作为一个优选方案，所述宿主菌为大肠杆菌，宿主菌改造途径包括以下一种或几种：
1)缺失sdhAB或者下调sdhAB；
2)缺失maeB；
3)缺失pckA；
4)缺失icdA；
5)过表达ackA与pta；
6)过表达gltA；
7)过表达fdh。
作为一个优选方案，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达gltA。
作为一个优选方案，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii。
作为一个优选方案，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta，过表达gltA。
作为一个优选方案，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii。
作为一个优选方案，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta,缺失icdA，过表达gltA。
作为一个优选方案，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta,缺失icdA，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii。
作为一个优选方案，宿主菌改造途径为下调sdhAB基因表达，并缺失maeB，pckA，icdA，过表达ackA和pta，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii。
作为一个优选方案，对于未经蒸馏处理的原始废液，通过静息细胞转化的方式生产丁二酸；对于经过蒸馏处理的造纸废液，通过生长细胞或静息细胞转化的方式生产丁二酸。
作为一个优选方案，用静息细胞转化的方式生产丁二酸时，前期培养阶段在培养基中加入乙酸，以充分诱导相关基因表达。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：一种利用造纸废液为原料生产丁二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的改造途径包括以下一种或几种：
1)缺失sdhAB或者下调sdhAB；
2)缺失maeB；
3)缺失pckA；
4)缺失icdA；
5)过表达ackA与pta；
6)过表达gltA；
7)过表达fdh。
作为一个优选方案，所述重组大肠杆菌的改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达gltA；或者，缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii；或者，缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta，过表达gltA；或者，缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii；或者，缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta,缺失icdA，过表达gltA；或者，缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta,缺失icdA，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii；或者，下调sdhAB基因表达，并缺失maeB，pckA，icdA，过表达ackA和pta，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii。
造纸废液成分与纤维素经酸水解的成分类似，主要包括木糖、葡萄糖、阿拉伯糖等糖类，还有未充分水解的木质素及乙酸、甲酸、糠醛、5-羟甲基糠醛等，正是由于一些代谢抑制物的存在，限制了废液中糖类等的利用。本发明通过构建同时高效利用乙酸和甲酸的代谢工程菌，能够利用造纸废液中抑制物乙酸及甲酸生产丁二酸。乙酸作为发酵生产丁二酸的底物，进入细胞后被转化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入乙醛酸循环被代谢从而积累丁二酸。由于在本发明中，乙酸主要由ACK-PTA途径进入细胞，每1分子乙酸转化为乙酰辅酶A需要消耗2分子ATP,而合成1分子丁二酸需要2分子乙酸，因此，该过程是消耗能量的。而废液中的甲酸则能在来源于C.boidinii的甲酸脱氢酶的作用下转化为NADH和CO2,所生成的NADH在好氧条件下经过电子传递链可产生ATP，进而为细胞代谢及乙酸的运输提供能量。
本发明的优点在于：本发明通过代谢工程手段构建重组大肠杆菌菌株，能将废液中的抑制物乙酸高效地转化为丁二酸，且利用其中的甲酸为该代谢过程提供能量，提高乙酸的利用率，有效地解决了造纸废液中乙酸及甲酸利用问题。因此，构建的重组大肠杆菌可以利用造纸废液为原料，高效生物合成丁二酸，为造纸废液的利用提供一种新的处理方法。
附图说明
图1为重组大肠杆菌利用乙酸发酵生产丁二酸代谢途径。
图2为实施例3结果。
图3为实施例4结果，图3A:HB03(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)以经蒸馏处理的废液为碳源静息细胞转化结果；图3B:HB04(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)以经蒸馏处理的废液为碳源静息细胞转化结果。
图4为实施例5结果。
图5为实施例6结果，图5A:HB03(pTrc99a-gltA,pBAD33-Trc-fdh)以过滤除菌处理未经蒸馏废液静息细胞转化结果；图5B:HB04(pTrc99a-gltA,pBAD33-Trc-fdh)以过滤除菌处理未经蒸馏废液静息细胞转化结果。
图6为实施例6结果，图6A:HB03(pTrc99a-gltA,pBAD33-Trc-fdh)以高温灭菌处理未经蒸馏废液静息细胞转化结果；图6B:HB04(pTrc99a-gltA,pBAD33-Trc-fdh)以高温灭菌处理未经蒸馏废液静息细胞转化结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.代谢工程菌途径改造
以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌进行代谢工程改造。采用RED重组敲除琥珀酸脱氢酶基因(sdhAB)、苹果酸酶基因(maeB)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(pckA)获得基因工程菌HB01；在HB01菌株的基础上通过用由trc启动子突变而来的不同强度的组成型启动子替换基因组上ackA和pta的启动子，以增强其表达，从而得到基因工程菌HB02和HB03；在HB03菌株基础上进一步敲除异柠檬酸脱氢酶基因(icdA)获得基因工程菌HB04。将E.coli柠檬酸合酶编码基因(gltA)克隆并连接到pTrc99a上，获得重组质粒pTrc99a-gltA；克隆来源于Candida boidinii菌株的甲酸脱氢酶编码基因fdh，并连接到pBAD33质粒上，并采用IPTG诱导型的trc启动子替换pBAD33质粒上自身的阿拉伯糖诱导型的启动子，获得重组质粒pBAD33-Trc-fdh。将重组质粒pTrc99a-gltA和pBAD33-Trc-fdh同时通过化学转化法转入上述构建的基因工程菌中。
表1基因工程菌株及质粒
实施例2.利用经过蒸馏处理的废液培养野生型大肠杆菌MG1655
将1mL在甘油管中冷冻保存的MG1655菌株转接到250mL含50mL LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)的摇瓶中，于220rpm,37℃培养9h。取培养好的菌液1mL转接入250mL含50mL M9培养基中，M9培养基直接用经过蒸馏处理的废液配置，用NaOH溶液调pH至7.0左右，采用115℃,30min高温灭菌。M9培养基成分(g/L)：Na2HPO4·12H2O15.12,KH2PO4 3.0,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl2 0.011,NH4Cl 1.0,添加1％(w/v)维生素B1 0.2mL/L,微量元素0.1mL/L。为了维持菌体生长，在M9培养基中添加2g/L酵母提取物。间隔一定时间取样分析。
样品分析：12000rpm离心10分钟分离菌体和上清。发酵液上清适当稀释后，经0.22μm微孔膜过滤，采用日本岛津高效液相色谱仪监测发酵液上清中的有机酸。色谱柱为BioRadAminex HPX-87离子色谱柱(300mm*7.8mm)，配有UV检测器和示差折光检测器。流动相为2.5mM的H2SO4，流速0.5ml/min，柱温50℃。
生物量的测定采用分光光度计法测定600nm下的吸光值。
结果：摇瓶培养12h,乙酸全部消耗完，甲酸有部分消耗，没有代谢中间产物积累，菌体OD600到达最大值4.95。表明在经过蒸馏处理的造纸废液中，野生型大肠杆菌MG1655的生长几乎没有受到抑制，并且能够完全利用废液中的乙酸，且代谢乙酸产生的化合物和能量均用于提供菌体生长。
实施例3.利用经过蒸馏处理的废液培养细胞生产丁二酸
将1mL在甘油管中冷冻保存的HB01(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)、HB02(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)、HB03(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)、HB04(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)分别转接到250mL含50mL LB培养基的摇瓶中，于220rpm,37℃培养9h。取培养好的菌液1mL转接入250mL含50mL M9培养基(添加2g/L酵母提取物)中。M9的配置同实施例2所述。M9培养基中摇瓶培养12h，加入终浓度为0.1mM IPTG。间隔12h取样分析，分析方法如实施例2。
摇瓶发酵结果如图2所示，与其他基因工程菌相比，HB04(pTrc99a-gltA,pBAD33-Trc-fdh)的生长受到抑制，主要是由于缺失TCA循环的关键基因sdhAB及icdA。与在含纯的乙酸和甲酸的M9培养基中相比，四种基因工程菌株的生长则没有受到抑制。在经过蒸馏处理的废液中培养，甲酸均能够在24h消耗完，HB01(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)、HB02(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)、HB03(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)在36h基本能消耗废液中所有的乙酸，丁二酸产量分别为15.59mM、17.02mM及17.86mM，HB04(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)废液中乙酸在摇瓶发酵48h时基本消耗，其丁二酸的产量达到19.69mM，得率为0.414mol/mol，达到理论得率的82.8％，为四种基因工程菌株的最高值。
实施例4.经过蒸馏处理的废液通过静息细胞转化生产丁二酸
静息细胞转化生产丁二酸主要包括两个过程，第一阶段为细胞菌体增殖培养过程，第二阶段为静息细胞转化过程。分别选择产率最高的菌株HB03(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)及产量和最高的菌株HB04(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)进行静息细胞转化实验。分别将1mL在甘油管中冷冻保存的HB03(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)和HB04(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)转接到250mL含50mL LB培养基的摇瓶中，于220rpm,37℃培养9h。取培养好的菌液1mL转接入250mL含50mL M9培养基中，以乙酸钠为碳源，在M9培养基中添加5g/L乙酸钠及5g/L酵母提取物。摇瓶培养12h添加0.1mM IPTG诱导柠檬酸合酶及甲酸脱氢酶表达。培养36h，当菌体OD600达到2.4左右时，在4℃，6000rpm,10min条件下离心收集菌体，浓缩。用经过蒸馏处理地废液配置的M9培养基(不含NH4Cl)重悬菌体,重悬后菌体OD600约为15，将重悬液分装于250mL摇瓶中，装液量为25mL，于220rpm，37℃开始静息细胞转化实验。样品分析方法同实施例2。
静息细胞转化结果如图3所示，HB03(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)静息细胞转化3h,废液中乙酸及甲酸基本耗完，产物丁二酸浓度为11.04mM，得率为0.21mol/mol。HB04(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)静息细胞转化5h,废液中乙酸及甲酸基本耗完，产物丁二酸浓度为19.33mM，得率为0.40mol/mol。
实施例5.造纸原始废液的处理
由于未经蒸馏处理的废液，其成分复杂，除了甲酸、乙酸等抑制物，还可能含有糠醛及5-羟甲基糠醛等其他抑制物，这些抑制物的存在可能会影响乙酸及甲酸的利用，因此，在实验前对原始废液进行活性炭吸附处理。在原始废液中加入3％(w/v)的粉末状活性炭，搅拌混匀，将其置于30℃条件下吸附1h。随后采用8000rpm，离心20min以除去部分活性炭，然后通过0.45μm滤膜过滤以进一步除去残留的活性炭，用NaOH溶液调节pH至7.0左右，分别采用115℃，30min高温灭菌和0.22μm过滤膜过滤除菌两种方式除菌，比较其效果。
结果：如图4所示，活性炭吸附能有效地除去糠醛抑制物，对糖类、乙酸及甲酸的影响则较小，而在高温灭菌下，由于原始废液中有木质素的存在，可能会有乙酸的产生，因此，与过滤除菌相比，高温灭菌下乙酸的浓度有所上升。
实施例6.未经蒸馏处理的废液通过静息细胞转化生产丁二酸
菌体的培养与浓缩同实例2，重悬菌体所用的培养基为用实例5获得的两种不同除菌方式的废液所配置的不含氮源的M9培养基，由于乙酸浓度较经过蒸馏处理的废液中乙酸浓度高，因此，重悬后菌体OD600控制在25左右。其他操作同实施例4。
结果：过滤除菌和高温灭菌获得的废液静息细胞转化结果如图5和图6所示，HB03(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)静息细胞转化期间乙酸的消耗速率较HB04(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)菌株高，经过过滤除菌和高温灭菌获得的废液，HB03(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)静息细胞转化4h,乙酸基本消耗完，丁二酸的产量分别为20.73mM和29.83Mm,得率均为0.27mol/mol；HB04(pTrc99a-gltA，pBAD33-Trc-fdh)由于乙酸消耗速率低，静息细胞转化6h后，乙酸消耗完，经过过滤除菌和高温灭菌获得的废液，丁二酸的浓度分别为37.76mM和58.22mM。生产的丁二酸基于消耗的乙酸的得率分别为0.51mol/mol和0.56mol/mol，超过理论得率的原因可能是有少量的糖类消耗参与丁二酸的合成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，通过对宿主菌进行代谢途径改造，利用造纸废液为原料生产丁二酸，所述造纸废液为造纸过程中产生的原始废液或者是对原始废液进行蒸馏处理，分离出糖类，残留的含有乙酸和甲酸的蒸馏残留液。
2.根据权利要求1所述的一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌，宿主菌改造途径包括以下一种或几种：
1)缺失sdhAB或者下调sdhAB；
2)缺失maeB；
3)缺失pckA；
4)缺失icdA；
5)过表达ackA与pta；
6)过表达gltA；
7)过表达fdh。
3.根据权利要求2所述的一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达gltA。
4.根据权利要求2所述的一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii。
5.根据权利要求2所述的一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta，过表达gltA。
6.根据权利要求2所述的一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii。
7.根据权利要求2所述的一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta,缺失icdA，过表达gltA。
8.根据权利要求2所述的一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，宿主菌改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta,缺失icdA，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii。
9.根据权利要求2所述的一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，宿主菌改造途径为下调sdhAB基因表达，并缺失maeB，pckA，icdA，过表达ackA和pta，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii。
10.根据权利要求1所述的一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，对于未经蒸馏处理的原始废液，通过静息细胞转化的方式生产丁二酸；对于经过蒸馏处理的造纸废液，通过生长细胞或静息细胞转化的方式生产丁二酸。
11.根据权利要求10所述的一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，其特征在于，用静息细胞转化的方式生产丁二酸时，前期培养阶段在培养基中加入乙酸。
12.一种利用造纸废液为原料生产丁二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的改造途径包括以下一种或几种：
1)缺失sdhAB或者下调sdhAB；
2)缺失maeB；
3)缺失pckA；
4)缺失icdA；
5)过表达ackA与pta；
6)过表达gltA；
7)过表达fdh。
13.根据权利要求12所述的一种利用造纸废液为原料生产丁二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的改造途径为缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达gltA；或者，缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii；或者，缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta，过表达gltA；或者，缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii；或者，缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta,缺失icdA，过表达gltA；或者，缺失sdhAB，maeB，pckA，过表达ackA和pta,缺失icdA，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii；或者，下调sdhAB基因表达，并缺失maeB，pckA，icdA，过表达ackA和pta，过表达gltA及fdh基因，所述fdh基因来源于C.boidinii。
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