CN107828785A - 用于构建猴子bcr文库的成套试剂与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于构建猴子BCR文库的成套试剂与方法。本发明公开的构建猴子BCR文库的成套试剂为成套试剂A或成套试剂B；成套试剂A由成套试剂A1与成套试剂A2组成，成套试剂A1为序列表中序列1‑7所示的七条单链DNA，成套试剂A2为在序列表中序列8‑17的5′端均标记生物素的十条单链DNA；成套试剂B由成套试剂B1与成套试剂B2组成，成套试剂B1为序列表中序列18‑24所示的七条单链DNA，成套试剂B2为在序列表中序列25‑34的5′端均标记生物素的十条单链DNA。利用本发明的成套试剂构建的猴子BCR文库覆盖度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，用于构建猴子BCR文库的成套试剂与方法。
背景技术
获得性免疫又称为特异性免疫，是在抗原刺激下，机体产生的自我保护系统。这个系统主要由淋巴细胞构成，在抗原刺激下，淋巴细胞发生特异性的扩增，进而发挥生理作用。其中，淋巴细胞参与抗原识别的分子，在T、B淋巴细胞上分别是T细胞抗原识别分子(TCR)、B细胞抗原识别分子(BCR)。在人体内，TCR是由异源二聚体分子构成的，主要有αβ型和γδ型，其中，外周循环系统中，超过95％的TCR是属于αβ型。与此同时，这种二聚体组合也具有多样性，目前，已知的种类约2X107。而上述的多样性由其基因决定，主要是染色体V\D\J基因区域存在复等位基因以及缺失和插入现象。在这一复杂基因区域中，有一段基因位置是高可变区，是主要的抗原决定区域，它由部分V\J区和全部的D区构成，被称为互补决定区3(CDR3)。
B细胞受体是表达在B细胞表面的抗原识别分子，同时，它也能够被释放入外周系统，是主要的体液免疫分子。BCR的单体结构，主要是有两条轻链和两条重链所构成。与TCR类似，它也存在一段可变区，分别被称为互补决定区1、2、3。与TCR需要主要组织相容性物质(MHC)呈递抗原不同，BCR能够直接识别抗原，并通过中和等作用，保护机体。
而上述两种分子其多样性来源于其基因水平上的多样性，尤其是BCR，还存在着体突变(一种在B细胞发育成熟后，在扩增过程发生的基因水平的突变)。因此，研究机体的TCR和BCR序列，有助于进一步发现获得性免疫系统的功能，更加精准地诊断以及治疗疾病，有助于促进治疗手段和药物开发。
随着下一代测序技术(NGS)的出现和发展，能够高通量的检测TCR\BCR的序列，建立TCR\BCR库，并展开相关的研究，而这种技术被统称为免疫组库技术。
猴子是一种常用的动物模型，它被长期用于多种人类疾病的研究，并且，由于其机体构成与人类的相似性，也常被用于人类获得性免疫系统的研究。于1992年，GeneLevinson et al.等，通过RT-PCR和克隆的方法，在恒河猴的外周血中发现了23种TRB重排。尽管在后其研究中，检测到的序列在增加，但是，尚不满足TCR\BCR库检测的需要。目前，已有对猴子B细胞BCR建库的方法，该方法中采用5’RACE方法，在收集恒河猴外周血单个核细胞后，提取RNA，加入设计的反转录序列，从mRNA 3’端反转录至5’端，之后，通过在引物中加入测序接头PGM，分别从5’RACE和已知序列处扩增cDNA。该方法将3’端引物设计在constant区域上游较远处，PCR产物较长，达到600-800bp，对测序处理有较大难度；设计的引物仅能覆盖IgG，无法用于其他免疫球蛋白CDR3区域的检测；另外，该方法适用于454测序平台，在illumina测序平台上的使用尚需验证。因此，目前急需开发一种新的方法用于猴子免疫系统的高通量测序评估系统。
发明内容
本发明的目的是提供可用于构建猴子BCR文库的成套试剂以及构建猴子BCR文库的方法。
本发明首先提供的用于构建猴子BCR文库的成套试剂(记为成套试剂甲)，为名称分别为成套试剂A或成套试剂B的成套试剂；
所述成套试剂A包括名称为成套试剂A1的成套试剂；所述成套试剂A1由名称分别为成套试剂A11和成套试剂A12的成套试剂组成；
所述成套试剂A11由名称分别为IGHG-A1、IGHD-A2、IGHA-A3、IGHM-A4和IGHE-A5的单链DNA组成；
所述IGHG-A1是如下a11)至a14)中的任一种单链DNA：
a11)序列表中序列1的所示的单链DNA；
a12)在a11)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a13)与a11)或a12)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a14)在严格条件下与a11)或a12)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHD-A2是如下a21)至a24)中的任一种单链DNA：
a21)序列表中序列2的所示的单链DNA；
a22)在a21)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a23)与a21)或a22)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a24)在严格条件下与a21)或a22)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHA-A3是如下a31)至a34)中的任一种单链DNA：
a31)序列表中序列3的所示的单链DNA；
a32)在a31)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a33)与a31)或a32)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a34)在严格条件下与a31)或a32)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHM-A4是如下a41)至a44)中的任一种单链DNA：
a41)序列表中序列4的所示的单链DNA；
a42)在a41)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a43)与a41)或a42)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a44)在严格条件下与a41)或a42)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHE-A5是如下a51)至a54)中的任一种单链DNA：
a51)序列表中序列5的所示的单链DNA；
a52)在a51)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a53)与a51)或a52)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a54)在严格条件下与a51)或a52)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述成套试剂A12由名称分别为IGKC-A6和IGLC-A7的单链DNA组成；
所述IGKC-A6是如下a61)至a64)中的任一种单链DNA：
a61)序列表中序列6的所示的单链DNA；
a62)在a61)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a63)与a61)或a62)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a64)在严格条件下与a61)或a62)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGLC-A7是如下a71)至a74)中的任一种单链DNA：
a71)序列表中序列7的所示的单链DNA；
a72)在a71)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a73)与a71)或a72)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a74)在严格条件下与a71)或a72)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述成套试剂B包括名称为成套试剂B1的成套试剂；所述成套试剂B1由名称分别为成套试剂B11和成套试剂B12的成套试剂组成；
所述成套试剂B11由名称分别为IGHG-B1、IGHD-B2、IGHA-B3、IGHM-B4和IGHE-B5的单链DNA组成；
所述IGHG-B1是如下b11)至b14)中的任一种单链DNA：
b11)序列表中序列18的所示的单链DNA；
b12)在b11)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b13)与b11)或b12)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b14)在严格条件下与b11)或b12)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHD-B2是如下b21)至b24)中的任一种单链DNA：
b21)序列表中序列19的所示的单链DNA；
b22)在b21)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b23)与b21)或b22)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b24)在严格条件下与b21)或b22)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHA-B3是如下b31)至b34)中的任一种单链DNA：
b31)序列表中序列20的所示的单链DNA；
b32)在b31)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b33)与b31)或b32)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b34)在严格条件下与b31)或b32)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHM-B4是如下b41)至b44)中的任一种单链DNA：
b41)序列表中序列21的所示的单链DNA；
b42)在b41)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b43)与b41)或b42)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b44)在严格条件下与b41)或b42)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHE-B5是如下b51)至b54)中的任一种单链DNA：
b51)序列表中序列22的所示的单链DNA；
b52)在b51)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b53)与b51)或b52)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b54)在严格条件下与b51)或b52)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述成套试剂B12由名称分别为IGKC-B6和IGLC-B7的单链DNA组成；
所述IGKC-B6是如下b61)至b64)中的任一种单链DNA：
b61)序列表中序列23的所示的单链DNA；
b62)在b61)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b63)与b61)或b62)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b64)在严格条件下与b61)或b62)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGLC-B7是如下b71)至b74)中的任一种单链DNA：
b71)序列表中序列24的所示的单链DNA；
b72)在b71)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b73)与b71)或b72)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b74)在严格条件下与b71)或b72)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
上述成套试剂中，所述成套试剂A还可包括名称为成套试剂A2的成套试剂；所述成套试剂A2由名称分别为成套试剂A21和成套试剂A22的成套试剂组成；
所述成套试剂A21由名称分别为IGHG-PCR-A1、IGHD-PCR-A2、IGHA-PCR-A3、IGHM-PCR-A4和IGHE-PCR-A5的引物组成；
所述IGHG-PCR-A1的序列为如下a81)至a84)中的任一种：
a81)序列表中序列8的第14-31位；
a82)在a81)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a83)与a81)或a82)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a84)在严格条件下与a81)或a82)限定的序列杂交的序列；
所述IGHD-PCR-A2的序列为如下a91)至a94)中的任一种：
a91)序列表中序列9的第14-32位；
a92)在a91)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a93)与a91)或a92)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a94)在严格条件下与a91)或a92)限定的序列杂交的序列；
所述IGHA-PCR-A3的序列为如下a101)至a104)中的任一种：
a101)序列表中序列10的第14-32位；
a102)在a101)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a103)与a101)或a102)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a104)在严格条件下与a101)或a102)限定的序列杂交的序列；
所述IGHM-PCR-A4的序列为如下a111)至a114)中的任一种：
a111)序列表中序列11的第14-31位；
a112)在a111)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a113)与a111)或a112)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a114)在严格条件下与a111)或a112)限定的序列杂交的序列；
所述IGHE-PCR-A5的序列为如下a121)至a124)中的任一种：
a121)序列表中序列12的第14-31位；
a122)在a121)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a123)与a121)或a122)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a124)在严格条件下与a121)或a122)限定的序列杂交的序列；
所述成套试剂A22由名称分别为IGKC-PCR-A6、IGL1C-PCR-A7、IGL2C-PCR-A8、IGL3C-PCR-A9和IGL4C-PCR-A10的引物组成；
所述IGKC-PCR-A6的序列为如下a131)至a134)中的任一种：
a131)序列表中序列13的第14-33位；
a132)在a131)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a133)与a131)或a132)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a134)在严格条件下与a131)或a132)限定的序列杂交的序列；
所述IGL1C-PCR-A7的序列为如下a141)至a144)中的任一种：
a141)序列表中序列14的第14-31位；
a142)在a141)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a143)与a141)或a142)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a144)在严格条件下与a141)或a142)限定的序列杂交的序列；
所述IGL2C-PCR-A8的序列为如下a151)至a154)中的任一种：
a151)序列表中序列15的第14-31位；
a152)在a151)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a153)与a151)或a152)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a154)在严格条件下与a151)或a152)限定的序列杂交的序列；
所述IGL3C-PCR-A9的序列为如下a161)至a164)中的任一种：
a161)序列表中序列16的第14-31位；
a162)在a161)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a163)与a161)或a162)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a164)在严格条件下与a161)或a162)限定的序列杂交的序列；
所述IGL4C-PCR-A10的序列为如下a171)至a174)中的任一种：
a171)序列表中序列9的第14-31位；
a172)在a171)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a173)与a171)或a172)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a174)在严格条件下与a171)或a172)限定的序列杂交的序列；
所述成套试剂B还可包括名称为成套试剂B2的成套试剂；所述成套试剂B2由名称分别为成套试剂B21和成套试剂B22的成套试剂组成；
所述成套试剂B21由名称分别为IGHG-PCR-B1、IGHD-PCR-B2、IGHA-PCR-B3、IGHM-PCR-B4和IGHE-PCR-B5的引物组成；
所述IGHG-PCR-B1的序列为如下b81)至b84)中的任一种：
b81)序列表中序列25的第14-31位；
b82)在b81)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b83)与b81)或b82)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b84)在严格条件下与b81)或b82)限定的序列杂交的序列；
所述IGHD-PCR-B2的序列为如下b91)至b94)中的任一种：
b91)序列表中序列26的第14-32位；
b92)在b91)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b93)与b91)或b92)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b94)在严格条件下与b91)或b92)限定的序列杂交的序列；
所述IGHA-PCR-B3的序列为如下b101)至b104)中的任一种：
b101)序列表中序列27的第14-32位；
b102)在b101)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b103)与b101)或b102)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b104)在严格条件下与b101)或b102)限定的序列杂交的序列；
所述IGHM-PCR-B4的序列为如下b111)至b114)中的任一种：
b111)序列表中序列28的第14-31位；
b112)在b111)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b113)与b111)或b112)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b114)在严格条件下与b111)或b112)限定的序列杂交的序列；
所述IGHE-PCR-B5的序列为如下b121)至b124)中的任一种：
b121)序列表中序列29的第14-31位；
b122)在b121)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b123)与b121)或b122)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b124)在严格条件下与b121)或b122)限定的序列杂交的序列；
所述成套试剂B22由名称分别为IGKC-PCR-B6、IGL1C-PCR-B7、IGL2C-PCR-B8、IGL3C-PCR-B9和IGL4C-PCR-B10的引物组成；
所述IGKC-PCR-B6的序列为如下b131)至b134)中的任一种：
b131)序列表中序列30的第14-33位；
b132)在b131)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b133)与b131)或b132)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b134)在严格条件下与b131)或b132)限定的序列杂交的序列；
所述IGL1C-PCR-B7的序列为如下b141)至b144)中的任一种：
b141)序列表中序列31的第14-31位；
b142)在b141)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b143)与b141)或b142)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b144)在严格条件下与b141)或b142)限定的序列杂交的序列；
所述IGL2C-PCR-B8的序列为如下b151)至b154)中的任一种：
b151)序列表中序列32的第14-31位；
b152)在b151)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b153)与b151)或b152)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b154)在严格条件下与b151)或b152)限定的序列杂交的序列；
所述IGL3C-PCR-B9的序列为如下b161)至b164)中的任一种：
b161)序列表中序列33的第14-31位；
b162)在b161)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b163)与b161)或b162)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b164)在严格条件下与b161)或b162)限定的序列杂交的序列；
所述IGL4C-PCR-B10的序列为如下b171)至b174)中的任一种：
b171)序列表中序列34的第14-31位；
b172)在b171)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b173)与b171)或b172)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b174)在严格条件下与b171)或b172)限定的序列杂交的序列。
上述成套试剂中，a2)所述添加一个或几个核苷酸可为在相应序列的5′端和/或3′端添加一至十五个核苷酸。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的核苷酸序列具有70％或更高，75％或更高，85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述70％以上同一性，可为70％、75％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述成套试剂中，a82)、a92)、a102)、a112)、a122)、a132)、a142)、a152)、a162)、a172)、b82)、b92)、b102)、b112)、b122)、b132)、b142)、b152)、b162)和b172)所述序列分别为在a81)、a91)、a101)、a111)、a121)、a131)、a141)、a151)、a161)、a171)、b81)、b91)、b101)、b111)、b121)、b131)、b141)、b151)、b161)和b171)所述序列的5′端添加限制性内切酶的识别序列和/或所述限制性内切酶的保护序列得到的序列。
所述成套试剂A2和所述成套试剂B2中各引物的5′端均可标记有生物素。即，所述成套试剂A2和所述成套试剂B2中各引物均为5′端标记有生物素的单链DNA。
所述限制性内切酶具体可为Pac I。
a82)、a92)、a102)、a112)、a122)、a132)、a142)、a152)、a162)、a172)、b82)、b92)、b102)、b112)、b122)、b132)、b142)、b152)、b162)和b172)所述序列分别可为在a81)、a91)、a101)、a111)、a121)、a131)、a141)、a151)、a161)、a171)、b81)、b91)、b101)、b111)、b121)、b131)、b141)、b151)、b161)和b171)所述序列的5′端添加序列表中序列8的第1-13位得到的序列。
a81)、a91)、a101)、a111)、a121)、a131)、a141)、a151)、a161)、a171)、b81)、b91)、b101)、b111)、b121)、b131)、b141)、b151)、b161)和b171)所述序列具体依次可为序列表中序列8-17、序列25-34。
所述成套试剂A可仅由所述成套试剂A1组成，也可由所述成套试剂A1与所述成套试剂A2组成，还可由所述成套试剂A1、所述成套试剂A2与构建BCR文库所用其他试剂组成。所述其他试剂可为所述限制性内切酶。
所述成套试剂B可仅由所述成套试剂B1组成，也可由所述成套试剂B1与所述成套试剂B2组成，还可由所述成套试剂B1、所述成套试剂B2与构建BCR文库所用其他试剂组成。所述其他试剂可为所述限制性内切酶。
所述成套试剂A可用于构建恒河猴BCR文库。所述成套试剂A1可作为引物用于恒河猴B细胞RNA的反转录得到cDNA。所述成套试剂A1中，所述A11的五条引物摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；所述A12的两条引物摩尔数相等，这两条引物可独立包装也可包装在一起；所述成套试剂A1的七条引物的摩尔数可相等。所述成套试剂A2可用于利用5′RACE对所述成套试剂A1反转录得到cDNA的扩增。所述成套试剂A2中，所述A21的五条引物摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；所述A22的五条引物摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；所述成套试剂A2的十条引物的摩尔数可相等。
所述成套试剂B可用于构建非洲绿猴BCR文库。所述成套试剂B1可作为引物用于非洲绿猴B细胞RNA的反转录得到cDNA。所述成套试剂B1中，所述B11的五条引物摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；所述B12的两条引物摩尔数相等，这两条引物可独立包装也可包装在一起；所述成套试剂B1的七条引物的摩尔数可相等。所述成套试剂B2可用于利用5′RACE对所述成套试剂B1反转录得到cDNA的扩增。所述成套试剂B2中，所述B21的五条引物摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；所述B22的五条引物摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；所述成套试剂B2的十条引物的摩尔数可相等。
本发明还提供了用于构建猴子BCR文库的成套试剂(记为成套试剂乙)，该成套试剂为下述Y1)-Y4)中的任一种：
Y1)用于构建恒河猴BCR重链文库的成套试剂，为所述A11和/或所述A21；
Y2)用于构建恒河猴BCR轻链文库的成套试剂，为所述A12和/或所述A22；
Y3)用于构建非洲绿猴BCR重链文库的成套试剂，为所述B11和/或所述B21；
Y4)用于构建非洲绿猴BCR轻链文库的成套试剂，为所述B12和/或所述B22。
本发明还提供了构建猴子BCR文库的方法，所述方法包括：利用所述成套试剂A1或所述成套试剂B1对待测样本的RNA反转录，得到cDNA；利用所述cDNA构建猴子BCR文库。
上述方法中，所述利用所述cDNA构建猴子BCR文库可包括：利用所述成套试剂A2或所述成套试剂B2对所述cDNA进行扩增，得到猴子BCR文库。在该步骤中，在所述成套试剂A2或所述成套试剂B2含有所述限制性内切酶的识别序列时，该步骤还可包括利用所述限制性内切酶对所述成套试剂A2或所述成套试剂B2的PCR产物进行酶切。
所述方法还可包括对所述成套试剂A2或所述成套试剂B2的扩增产物进行打断和/或利用所述限制性内切酶进行酶切，得到打断/酶切产物。所述打断/酶切产物可作为BCR文库，也可在连接接头后作为BCR文库。
本发明还提供了所述成套试剂甲或所述成套试剂乙的下述任一应用：
X1)在制备构建猴子BCR文库产品中的应用；
X2)构建猴子BCR文库中的应用；
X3)在制备对猴子BCR进行测序产品中的应用；
X4)在对猴子BCR进行测序中的应用。
所述产品可为试剂盒。
本发明中，所述对猴子BCR进行测序可为对编码猴子BCR的RNA进行测序，也可为将编码猴子BCR的RNA转录为cDNA后进行测序。
本发明中，所述猴子可为恒河猴或非洲绿猴。
所述BCR文库可为B细胞抗原识别分子基因文库。
所述BCR重链文库可为B细胞抗原识别分子重链基因文库。
所述BCR轻链文库可为B细胞抗原识别分子轻链基因文库。
实验证明，利用本发明的成套试剂构建的猴子BCR文库，可以得到BCR CDR3种类数目(得到的CDR3种类数大于105)，覆盖IMGT和NCBI的所有VJ基因，并且还可以检测到猴子重链C基因五种免疫球蛋白IgA、IgM、IgG、IgD、IgE的分布情况。在猴子动物模型中，在利用本发明的成套试剂构建BCR文库时，测序可以得到更多的与免疫相关的信息，例如，疫苗评价、感染等模型，可全面分析试验中的免疫反应。本发明在猴子参考序列不完善的情况下，通过少量引物得到了其较完整的BCR文库。
附图说明
图1为检测恒河猴和非洲绿猴B细胞抗原受体库技术流程图。
图2为恒河猴和绿猴重轻链CDR3区域克隆频率分布图。
图3为恒河猴和绿猴重轻链的CDR3长度分布图。
图4为J基因使用频率分布。
图5为恒河猴重链各V基因使用频率分布。
图6为非洲绿猴重链各V基因使用频率分布。
图7为恒河猴轻链各V基因使用频率分布。
图8为非洲绿猴轻链各V基因使用频率分布。
图9为恒河猴重链VJ配对后的3D分布情况。
图10为非洲绿猴重链VJ配对后的3D分布情况。
图11为恒河猴轻链VJ配对后的3D分布情况。
图12为非洲绿猴轻链VJ配对后的3D分布情况。
图13为5种免疫球蛋白的分布。左图为恒河猴的结果，右图为非洲绿猴的结果。
图2-图12中绿猴均表示非洲绿猴。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
检测恒河猴和非洲绿猴B细胞抗原受体库技术流程图如图1所示。首先用RNA进行5′race建库，然后进行测序平台文库构建，利用高通量测序，最后用信息分析的方法得到BCR抗原受体库(即B细胞抗原识别分子基因文库)。
实施例1、构建猴子BCR文库的成套试剂的制备
本实施例提供的构建猴子BCR文库的成套试剂为构建恒河猴BCR文库的成套试剂(命名为成套试剂A)和构建非洲绿猴BCR文库的成套试剂(命名为成套试剂B)。
1、成套试剂A
成套试剂A由名称分别为成套试剂A1和成套试剂A2的成套试剂组成。
成套试剂A1由成套试剂A11和成套试剂A12组成。成套试剂A11由名称分别为IGHG-A1、IGHD-A2、IGHA-A3、IGHM-A4和IGHE-A5的引物组成，成套试剂A12由名称分别为IGKC-A6和IGLC-A7的引物组成，各引物均为单链DNA，序列如表1所示。成套试剂A11中五条引物的摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；成套试剂A12中两条引物的摩尔数相等，这两条引物可独立包装也可包装在一起；成套试剂A1中的七条引物的摩尔数相等。
成套试剂A2由成套试剂A21和成套试剂A22组成。成套试剂A21由名称分别为IGHG-PCR-A1、IGHD-PCR-A2、IGHA-PCR-A3、IGHM-PCR-A4和IGHE-PCR-A5的引物组成，成套试剂A22由名称分别为IGKC-PCR-A6、IGL1C-PCR-A7、IGL2C-PCR-A8、IGL3C-PCR-A9和IGL4C-PCR-A10的引物组成，这十条引物均为5′端由生物素标记的单链DNA，如表2所示。成套试剂A21中五条引物的摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；成套试剂A22中五条引物的摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；成套试剂A2中的十条引物的摩尔数相等。
成套试剂A中的十七条引物的摩尔数相等。在应用中，成套试剂A用于构建恒河猴BCR文库，成套试剂A11和成套试剂A21组合在一起用于构建恒河猴BCR重链文库，成套试剂A12和成套试剂A22组合在一起用于构建恒河猴BCR轻链文库。
表1 成套试剂A1各引物序列
表2 成套试剂A2各引物信息
表1和表2中S表示C或G，K表示G或T，V表示A、C或G，Y表示C或T，W表示A或T。
2、成套试剂B
成套试剂B由名称分别为成套试剂B1和成套试剂B2的成套试剂组成。
成套试剂B1由成套试剂B11和成套试剂B12组成。成套试剂B11由名称分别为IGHG-B1、IGHD-B2、IGHA-B3、IGHM-B4和IGHE-B5的引物组成，成套试剂B12由名称分别为IGKC-B6和IGLC-B7的引物组成，各引物均为单链DNA，序列如表3所示。成套试剂B11中五条引物的摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；成套试剂B12中两条引物的摩尔数相等，这两条引物可独立包装也可包装在一起；成套试剂B1中的七条引物的摩尔数相等。
成套试剂B2由成套试剂B21和成套试剂B22组成。成套试剂B21由名称分别为IGHG-PCR-B1、IGHD-PCR-B2、IGHA-PCR-B3、IGHM-PCR-B4、IGHE-PCR-B5的引物组成，成套试剂B22由名称分别为IGKC-PCR-B6、IGL1C-PCR-B7、IGL2C-PCR-B8、IGL3C-PCR-B9和IGL4C-PCR-B10的引物组成，这十条引物均为5′端由生物素标记的单链DNA，序列如表4所示。成套试剂B21中五条引物的摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；成套试剂B22中五条引物的摩尔数相等，这五条引物可独立包装也可包装在一起；成套试剂B2中的十条引物的摩尔数相等。
成套试剂B中的十七条引物的摩尔数相等。在应用中，成套试剂B用于构建非洲绿猴BCR文库，成套试剂B11和成套试剂B21组合在一起用于构建非洲绿猴BCR重链文库，成套试剂B12和成套试剂B22组合在一起用于构建非洲绿猴BCR轻链文库。
表3 成套试剂B1各引物序列
表4 成套试剂B2各引物信息
表3和表4中S表示C或G，K表示G或T，V表示A、C或G，Y表示C或T，W表示A或T。
实施例2、猴子BCR文库的构建
本实施例利用实施例1的成套试剂构建了猴子BCR文库，其中成套试剂A用于构建恒河猴BCR文库，成套试剂B用于构建非洲绿猴BCR文库。
一、BCR文库的构建
所用样本分别为恒河猴和非洲绿猴的外周血，首先取2ml外周血，分离单个核细胞，提取单个核细胞RNA，每种猴子均取三个样本进行实验。具体构建步骤如下：
1 cDNA合成
1)按以下体系配制反应体系(1个样品)：
2)将配置好的反应体系70℃孵育10min，放置冰上1min，反应结束后，向每个反应体系中加入以下试剂,42℃孵育1min。其中，以下反应的试剂均为5′race试剂盒(invitrogen，货号18374-058)中试剂，dNTP mix为四种dNTP的混合物。
3)向步骤2)反应结束后的体系中加入1μL SuperscriptⅡ，SuperscriptⅡ为5′race试剂盒(invitrogen，货号18374-058)中试剂,42℃反应50min,70℃反应15min。
4)向步骤3)反应结束后的体系中加入1μL RNase mix，RNase mix为5′race试剂盒(invitrogen，货号18374-058)中试剂，37℃孵育30min。
2纯化
向步骤1反应结束后的体系中添加是反应体系1.5倍体积的磁珠纯化得到cDNA,用18μL无核酸水回溶cDNA，得到cDNA溶液。
3 TdT Tailing cDNA
1)按以下体系配制反应体系，以下反应的试剂均为5′race试剂盒(invitrogen，货号18374-058)中试剂。
2)94℃孵育2-3min，冰上冷却1min。
3)步骤2)反应结束后向反应体系中加入1ul TdT，TdT为5′race试剂盒(invitrogen，货号18374-058)中试剂。混匀，37℃孵育10min,65℃孵育10min，得到Dc-tailed cDNA。
4 PCR扩增dC-tailed cDNA
1)按以下体系配制反应体系，其中，10×PCR buffer、25mM MgCl2、10mM dNTPmix、Abridged Anchor Primer和Taq DNA聚合酶均为5′race试剂盒(invitrogen，货号18374-058)中试剂，dNTP mix为四种dNTP的混合物。“*”表示成套试剂A2或成套试剂B2中的十条引物的总浓度，即每条引物的浓度为1μM。在下述体系中，成套试剂A2或成套试剂B2中的每条引物的浓度均为0.04μM。
2)将步骤1)配置好的反应体系置于PCR仪中按照下列程序反应，得到扩增产物：
5纯化
用是步骤4的1)的反应体系1倍体积的磁珠纯化步骤2)得到的扩增产物，用20μL无核酸水回溶，得到纯化扩增产物溶液。
6 Covaris打断样品
Covaris打断步骤5得到的纯化扩增产物溶液中的DNA至250bp左右，并用电泳检测打断效果。利用链霉素磁珠M-270(invitrogen)洗涤Covaris打断样品。
7限制性酶内切
1)按以下体系配制酶切体系：
2)置于PCR仪中按照下列程序反应，反应结束后置于磁力架上,吸取上清，即为目的产物(打断/酶切产物)。
a.37℃2h
b.65℃20min
8连接接头
通过连接酶在步骤8得到的目的产物上引入测序接头，即得到猴子BCR文库。
9文库检测
利用Bioanalyzer analysis system(Agilent)检测DNA片段大小及含量；Q-PCR精确定量文库的浓度。
二、测序及数据分析
1.测序
文库检测合格后，按照双末端151个碱基的读长在Hiseq2000测序仪上进行测序。测序量为每个文库2G。
2.数据预处理
数据过滤：检查序列是否有测序接头污染，若有接头序列，并且在末端(最后50bp)则切掉末端污染部分，否则过滤掉整个序列。序列末端测序低质量值(<Q10)的碱基被切掉。
拼接read：对Paired-end的测序类型，将两条reads通过中间重叠的部分拼接起来，成为一条序列(重叠区域，长度>10bp，mismatch<＝10％)。恒河猴S1、恒河猴S2和恒河猴S3分别为恒河猴的三个样本，非洲绿猴S1、非洲绿猴S2和非洲绿猴S3分别为非洲绿猴的三个样本。具体信息如下表所示：
| 样本 | 原始测序量 | 低质量过滤后数据(％) | 序列拼接(％) | 质量过滤(％) |
| 恒河猴S1-重链 | 7865940 | 74.29 | 95.47 | 91.12 |
| 恒河猴S2-重链 | 5519855 | 89.82 | 96.61 | 93.4 |
| 恒河猴S3-重链 | 7100449 | 85.8 | 96.85 | 93.64 |
| 非洲绿猴S1-重链 | 6554757 | 84.88 | 97.29 | 93.17 |
| 非洲绿猴S2-重链 | 7240635 | 81.38 | 95.76 | 92.37 |
| 非洲绿猴S3-重链 | 8750008 | 74 | 96.9 | 92.54 |
| 恒河猴S1-轻链 | 7286121 | 74.41 | 96.79 | 92.32 |
| 非洲绿猴S1-轻链 | 8051661 | 71.32 | 95.66 | 92.17 |
3.鉴定V和J基因
从IMGT数据库下载已有的V和J基因的重排前序列，将步骤2得到的拼接好的序列与这些重排前基因进行比对，比对时再对CDR3部分进行重比对，所用软件为IMonitor。比对的一致性(identity，即比对率)达到70％以上的测序序列才会保留下来，具体的比对结果如下：
| 样本 | V基因比对率(％) | J基因比对率(％) | VJ基因比对率(％) |
| 恒河猴S1-重链 | 93.18 | 97.77 | 92.95 |
| 恒河猴S2-重链 | 92.78 | 97.03 | 92.52 |
| 恒河猴S3-重链 | 92.66 | 97.84 | 92.46 |
| 非洲绿猴S1-重链 | 94.87 | 98.48 | 94.38 |
| 非洲绿猴S2-重链 | 93.89 | 97.57 | 93.54 |
| 非洲绿猴S3-重链 | 92.59 | 97.4 | 92.12 |
| 恒河猴S1-轻链 | 88.33 | 94.28 | 88.04 |
| 非洲绿猴S1-轻链 | 87.38 | 92.07 | 86.60 |
4.确定序列的结构
根据比对的结果，确定序列上V和J的准确位置，找出插入和删除的碱基序列，并确定序列的结构，如框架区和高变区(CDR3)。根据CDR3和V/J基因，将测序序列分为有功能序列、终止密码子、假基因和开放阅读框不正确序列(即CDR3区的核苷酸不是3的倍数的部分，一般是1％左右)。最后将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。结果显示，终止密码子的含量与实际是相符合的。
| 样本 | 有功能序列(％) | 终止密码子(％) | 开放阅读框不正确序列(％) | 假基因(％) |
| 恒河猴S1-重链 | 95.07 | 0.58 | 0.34 | 4.01 |
| 恒河猴S2-重链 | 92.23 | 0.44 | 0.83 | 6.5 |
| 恒河猴S3-重链 | 94.27 | 0.41 | 0.28 | 5.03 |
| 非洲绿猴S1-重链 | 93.51 | 0.43 | 0.19 | 5.87 |
| 非洲绿猴S2-重链 | 92.37 | 0.61 | 0.49 | 6.53 |
| 非洲绿猴S3-重链 | 92.19 | 0.77 | 0.42 | 6.62 |
| 恒河猴S1-轻链 | 90.23 | 0.97 | 1.59 | 7.21 |
| 非洲绿猴S1-轻链 | 91.37 | 0.73 | 1.42 | 6.48 |
5.数据统计的图形展示(恒河猴和非洲绿猴重链结果)
计算所有序列的克隆数和多样性指数(反映抗原受体库的种类)，统计V、J和VJ配对的使用频率(反映多种亚型，即多样性)，CDR3的长度分布(反映可变区多样性)和整体频率分布等。图2-图13为恒河猴和非洲绿猴各一个样本的图形展示例子。
图2为恒河猴和绿猴重轻链CDR3区域克隆频率分布图。纵坐标为CDR3的克隆的序列数，横坐标为CDR3的克隆种类。图2展示了CDR3分布的特点，各种CDR3克隆的频率变化情况，高频的比较少，分布正常。
图3为恒河猴和绿猴重轻链的CDR3长度分布图。可以看到恒河猴重链CDR3长度大部分在33-61bp，非洲绿猴重链CDR3长度大部分在35-60bp。恒河猴和非洲绿猴轻链的分布比较相近。
图4为J基因使用频率分布。可以看出恒河猴和绿猴重链都是J4占比最多，轻链KJ4、LJ3占比最多，LJ4是没有功能的基因，所以没有设计该基因的引物，结果表明本发明得到的序列覆盖了所有有功能的J基因。
图5-图8为V基因使用频率分布，图5为恒河猴重链各V基因使用频率分布，图6为非洲绿猴重链各V基因使用频率分布，图7为恒河猴轻链各V基因使用频率分布，图8为非洲绿猴轻链各V基因使用频率分布。结果表明本发明得到的序列覆盖了所有有功能的V基因。
图9-图12为VJ基因配对频率分布。图9为恒河猴重链VJ配对后的3D分布情况，图10为非洲绿猴重链VJ配对后的3D分布情况，图11为恒河猴轻链VJ配对后的3D分布情况，图12为非洲绿猴轻链VJ配对后的3D分布情况。恒河猴重链最高的VJ组合比例是2.1％，非洲绿猴重链最高的VJ组合比例是4.2％。恒河猴轻链最高的VJ组合比例是1.2％，非洲绿猴重链最高的VJ组合比例是1.5％。
本发明建库的测序结果不仅可以覆盖IMGT和NCBI上所有已知的VJ参考序列，还覆盖了恒河猴和非洲绿猴所有的V基因、J基因和C基因。重链得到的CDR3种类数大于105，轻链大于104，如下表。还可以分出重链5种免疫球蛋白的比例，如图13所示。图13为恒河猴和非洲绿猴重链C基因测序后，分析得到的5种免疫球蛋白的分布。饼图上每种颜色标注的数字为每种免疫球蛋白的百分比。
<110> 深圳华大生命科学研究院
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<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 1
tgctctsgga ggtgctc 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gcacgctgat gtgatgg 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gaccacgtta tctgactg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
ggcattctca caggagac 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
caggggatca aggggaa 17
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
agttattcag caggcacac 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
ttkgcttgva gctcctcaga 20
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
acacttaatt aacctsggag gtgctcctgg a 31
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
acacttaatt aacgcacgct gatatgatgg gg 32
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
acacttaatt aacagacctt gggkytggtc gg 32
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
acacttaatt aacgttgggg cggatgcact c 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
acacttaatt aacacgaagg ggctctgtat g 31
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
acacttaatt aacatggcgg gaagatgaag aca 33
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
acacttaatt aacaacggag tgaccgaggg a 31
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
acacttaatt aacaacagag tgactgacgg g 31
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
acacttaatt aacaacagag tgaccaaggg g 31
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
acacttaatt aacaavagag tgaccgwggg g 31
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
tgctctsgga ggtgctc 17
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
gcacgctgat gtgatgg 17
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
gaccacgtta tctgactg 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
ggcattctca caggagac 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
cggaggtggc attggagg 18
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 23
agttattcag caggcacac 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 24
ttkgcttgva gctcctcaga 20
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 25
acacttaatt aacctsggag gtgctcctgg a 31
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 26
acacttaatt aacgcacgct gatatgatgg gg 32
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 27
acacttaatt aacagacctt gggkytggtc gg 32
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
acacttaatt aacgttgggg cggatgcact c 31
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 29
acacttaatt aaccggaggt ggcattggag g 31
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 30
acacttaatt aacatggcgg gaagatgaag aca 33
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 31
acacttaatt aacaacggag tgaccgaggg a 31
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 32
acacttaatt aacaacagag tgactgacgg g 31
<210> 33
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 33
acacttaatt aacaacagag tgaccaaggg g 31
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 34
acacttaatt aacaavagag tgaccgwggg g 31
Claims (10)
1.成套试剂，为名称分别为成套试剂A或成套试剂B的成套试剂；
所述成套试剂A包括名称为成套试剂A1的成套试剂；所述成套试剂A1由名称分别为成套试剂A11和成套试剂A12的成套试剂组成；
所述成套试剂A11由名称分别为IGHG-A1、IGHD-A2、IGHA-A3、IGHM-A4和IGHE-A5的单链DNA组成；
所述IGHG-A1是如下a11)至a14)中的任一种单链DNA：
a11)序列表中序列1的所示的单链DNA；
a12)在a11)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a13)与a11)或a12)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a14)在严格条件下与a11)或a12)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHD-A2是如下a21)至a24)中的任一种单链DNA：
a21)序列表中序列2的所示的单链DNA；
a22)在a21)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a23)与a21)或a22)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a24)在严格条件下与a21)或a22)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHA-A3是如下a31)至a34)中的任一种单链DNA：
a31)序列表中序列3的所示的单链DNA；
a32)在a31)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a33)与a31)或a32)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a34)在严格条件下与a31)或a32)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHM-A4是如下a41)至a44)中的任一种单链DNA：
a41)序列表中序列4的所示的单链DNA；
a42)在a41)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a43)与a41)或a42)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a44)在严格条件下与a41)或a42)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHE-A5是如下a51)至a54)中的任一种单链DNA：
a51)序列表中序列5的所示的单链DNA；
a52)在a51)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a53)与a51)或a52)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a54)在严格条件下与a51)或a52)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述成套试剂A12由名称分别为IGKC-A6和IGLC-A7的单链DNA组成；
所述IGKC-A6是如下a61)至a64)中的任一种单链DNA：
a61)序列表中序列6的所示的单链DNA；
a62)在a61)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a63)与a61)或a62)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a64)在严格条件下与a61)或a62)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGLC-A7是如下a71)至a74)中的任一种单链DNA：
a71)序列表中序列7的所示的单链DNA；
a72)在a71)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a73)与a71)或a72)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a74)在严格条件下与a71)或a72)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述成套试剂B包括名称为成套试剂B1的成套试剂；所述成套试剂B1由名称分别为成套试剂B11和成套试剂B12的成套试剂组成；
所述成套试剂B11由名称分别为IGHG-B1、IGHD-B2、IGHA-B3、IGHM-B4和IGHE-B5的单链DNA组成；
所述IGHG-B1是如下b11)至b14)中的任一种单链DNA：
b11)序列表中序列18的所示的单链DNA；
b12)在b11)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b13)与b11)或b12)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b14)在严格条件下与b11)或b12)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHD-B2是如下b21)至b24)中的任一种单链DNA：
b21)序列表中序列19的所示的单链DNA；
b22)在b21)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b23)与b21)或b22)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b24)在严格条件下与b21)或b22)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHA-B3是如下b31)至b34)中的任一种单链DNA：
b31)序列表中序列20的所示的单链DNA；
b32)在b31)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b33)与b31)或b32)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b34)在严格条件下与b31)或b32)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHM-B4是如下b41)至b44)中的任一种单链DNA：
b41)序列表中序列21的所示的单链DNA；
b42)在b41)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b43)与b41)或b42)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b44)在严格条件下与b41)或b42)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGHE-B5是如下b51)至b54)中的任一种单链DNA：
b51)序列表中序列22的所示的单链DNA；
b52)在b51)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b53)与b51)或b52)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b54)在严格条件下与b51)或b52)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述成套试剂B12由名称分别为IGKC-B6和IGLC-B7的单链DNA组成；
所述IGKC-B6是如下b61)至b64)中的任一种单链DNA：
b61)序列表中序列23的所示的单链DNA；
b62)在b61)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b63)与b61)或b62)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b64)在严格条件下与b61)或b62)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述IGLC-B7是如下b71)至b74)中的任一种单链DNA：
b71)序列表中序列24的所示的单链DNA；
b72)在b71)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b73)与b71)或b72)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b74)在严格条件下与b71)或b72)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂A还包括名称为成套试剂A2的成套试剂；所述成套试剂A2由名称分别为成套试剂A21和成套试剂A22的成套试剂组成；
所述成套试剂A21由名称分别为IGHG-PCR-A1、IGHD-PCR-A2、IGHA-PCR-A3、IGHM-PCR-A4和IGHE-PCR-A5的引物组成；
所述IGHG-PCR-A1的序列为如下a81)至a84)中的任一种：
a81)序列表中序列8的第14-31位；
a82)在a81)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a83)与a81)或a82)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a84)在严格条件下与a81)或a82)限定的序列杂交的序列；
所述IGHD-PCR-A2的序列为如下a91)至a94)中的任一种：
a91)序列表中序列9的第14-32位；
a92)在a91)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a93)与a91)或a92)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a94)在严格条件下与a91)或a92)限定的序列杂交的序列；
所述IGHA-PCR-A3的序列为如下a101)至a104)中的任一种：
a101)序列表中序列10的第14-32位；
a102)在a101)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a103)与a101)或a102)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a104)在严格条件下与a101)或a102)限定的序列杂交的序列；
所述IGHM-PCR-A4的序列为如下a111)至a114)中的任一种：
a111)序列表中序列11的第14-31位；
a112)在a111)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a113)与a111)或a112)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a114)在严格条件下与a111)或a112)限定的序列杂交的序列；
所述IGHE-PCR-A5的序列为如下a121)至a124)中的任一种：
a121)序列表中序列12的第14-31位；
a122)在a121)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a123)与a121)或a122)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a124)在严格条件下与a121)或a122)限定的序列杂交的序列；
所述成套试剂A22由名称分别为IGKC-PCR-A6、IGL1C-PCR-A7、IGL2C-PCR-A8、IGL3C-PCR-A9和IGL4C-PCR-A10的引物组成；
所述IGKC-PCR-A6的序列为如下a131)至a134)中的任一种：
a131)序列表中序列13的第14-33位；
a132)在a131)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a133)与a131)或a132)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a134)在严格条件下与a131)或a132)限定的序列杂交的序列；
所述IGL1C-PCR-A7的序列为如下a141)至a144)中的任一种：
a141)序列表中序列14的第14-31位；
a142)在a141)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a143)与a141)或a142)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a144)在严格条件下与a141)或a142)限定的序列杂交的序列；
所述IGL2C-PCR-A8的序列为如下a151)至a154)中的任一种：
a151)序列表中序列15的第14-31位；
a152)在a151)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a153)与a151)或a152)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a154)在严格条件下与a151)或a152)限定的序列杂交的序列；
所述IGL3C-PCR-A9的序列为如下a161)至a164)中的任一种：
a161)序列表中序列16的第14-31位；
a162)在a161)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a163)与a161)或a162)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a164)在严格条件下与a161)或a162)限定的序列杂交的序列；
所述IGL4C-PCR-A10的序列为如下a171)至a174)中的任一种：
a171)序列表中序列9的第14-31位；
a172)在a171)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
a173)与a171)或a172)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
a174)在严格条件下与a171)或a172)限定的序列杂交的序列；
所述成套试剂B还包括名称为成套试剂B2的成套试剂；所述成套试剂B2由名称分别为成套试剂B21和成套试剂B22的成套试剂组成；
所述成套试剂B21由名称分别为IGHG-PCR-B1、IGHD-PCR-B2、IGHA-PCR-B3、IGHM-PCR-B4和IGHE-PCR-B5的引物组成；
所述IGHG-PCR-B1的序列为如下b81)至b84)中的任一种：
b81)序列表中序列25的第14-31位；
b82)在b81)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b83)与b81)或b82)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b84)在严格条件下与b81)或b82)限定的序列杂交的序列；
所述IGHD-PCR-B2的序列为如下b91)至b94)中的任一种：
b91)序列表中序列26的第14-32位；
b92)在b91)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b93)与b91)或b92)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b94)在严格条件下与b91)或b92)限定的序列杂交的序列；
所述IGHA-PCR-B3的序列为如下b101)至b104)中的任一种：
b101)序列表中序列27的第14-32位；
b102)在b101)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b103)与b101)或b102)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b104)在严格条件下与b101)或b102)限定的序列杂交的序列；
所述IGHM-PCR-B4的序列为如下b111)至b114)中的任一种：
b111)序列表中序列28的第14-31位；
b112)在b111)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b113)与b111)或b112)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b114)在严格条件下与b111)或b112)限定的序列杂交的序列；
所述IGHE-PCR-B5的序列为如下b121)至b124)中的任一种：
b121)序列表中序列29的第14-31位；
b122)在b121)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b123)与b121)或b122)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b124)在严格条件下与b121)或b122)限定的序列杂交的序列；
所述成套试剂B22由名称分别为IGKC-PCR-B6、IGL1C-PCR-B7、IGL2C-PCR-B8、IGL3C-PCR-B9和IGL4C-PCR-B10的引物组成；
所述IGKC-PCR-B6的序列为如下b131)至b134)中的任一种：
b131)序列表中序列30的第14-33位；
b132)在b131)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b133)与b131)或b132)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b134)在严格条件下与b131)或b132)限定的序列杂交的序列；
所述IGL1C-PCR-B7的序列为如下b141)至b144)中的任一种：
b141)序列表中序列31的第14-31位；
b142)在b141)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b143)与b141)或b142)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b144)在严格条件下与b141)或b142)限定的序列杂交的序列；
所述IGL2C-PCR-B8的序列为如下b151)至b154)中的任一种：
b151)序列表中序列32的第14-31位；
b152)在b151)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b153)与b151)或b152)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b154)在严格条件下与b151)或b152)限定的序列杂交的序列；
所述IGL3C-PCR-B9的序列为如下b161)至b164)中的任一种：
b161)序列表中序列33的第14-31位；
b162)在b161)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b163)与b161)或b162)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b164)在严格条件下与b161)或b162)限定的序列杂交的序列；
所述IGL4C-PCR-B10的序列为如下b171)至b174)中的任一种：
b171)序列表中序列34的第14-31位；
b172)在b171)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
b173)与b171)或b172)限定的序列具有70％以上的同一性的序列；
b174)在严格条件下与b171)或b172)限定的序列杂交的序列。
3.根据权利要求2所述的成套试剂，其特征在于：
a82)、a92)、a102)、a112)、a122)、a132)、a142)、a152)、a162)、a172)、b82)、b92)、b102)、b112)、b122)、b132)、b142)、b152)、b162)和b172)所述序列分别为在a81)、a91)、a101)、a111)、a121)、a131)、a141)、a151)、a161)、a171)、b81)、b91)、b101)、b111)、b121)、b131)、b141)、b151)、b161)和b171)所述序列的5′端添加限制性内切酶的识别序列和/或所述限制性内切酶的保护序列得到的序列；
和/或所述成套试剂A2和所述成套试剂B2中各引物的5′端均标记有生物素。
4.根据权利要求3所述的成套试剂，其特征在于：所述限制性内切酶为Pac I。
5.根据权利要求2-4中任一所述的成套试剂，其特征在于：
a82)、a92)、a102)、a112)、a122)、a132)、a142)、a152)、a162)、a172)、b82)、b92)、b102)、b112)、b122)、b132)、b142)、b152)、b162)和b172)所述序列分别为在a81)、a91)、a101)、a111)、a121)、a131)、a141)、a151)、a161)、a171)、b81)、b91)、b101)、b111)、b121)、b131)、b141)、b151)、b161)和b171)所述序列的5′端添加序列表中序列8的第1-13位得到的序列。
6.用于构建猴子BCR文库的成套试剂，为下述Y1)-Y4)中的任一种：
Y1)用于构建恒河猴BCR重链文库的成套试剂，为权利要求1-5中任一所述A11和/或所述A21；
Y2)用于构建恒河猴BCR轻链文库的成套试剂，为权利要求1-5中任一所述A12和/或所述A22；
Y3)用于构建非洲绿猴BCR重链文库的成套试剂，为权利要求1-5中任一所述B11和/或所述B21；
Y4)用于构建非洲绿猴BCR轻链文库的成套试剂，为权利要求1-5中任一所述B12和/或所述B22。
7.构建猴子BCR文库的方法，包括：利用权利要求1中所述成套试剂A1或所述成套试剂B1对待测样本的RNA反转录，得到cDNA；利用所述cDNA构建猴子BCR文库。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述利用所述cDNA构建猴子BCR文库包括：利用权利要求2-5中任一所述成套试剂A2或所述成套试剂B2对所述cDNA进行扩增，得到猴子BCR文库。
9.权利要求1-6中任一所述成套试剂的下述任一应用：
X1)在制备构建猴子BCR文库产品中的应用；
X2)构建猴子BCR文库中的应用；
X3)在制备对猴子BCR进行测序产品中的应用；
X4)在对猴子BCR进行测序中的应用。
10.根据权利要求7或8所述的方法，或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述猴子为恒河猴或非洲绿猴。
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|---|---|---|---|---|
| CN111808195A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-10-23 | 中国科学院心理研究所 | 抗n-甲基-d-天冬氨酸受体脑炎的b细胞抗体基因获取方法及其免疫组库研究 |
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| WO2010037397A1 (en) * | 2008-10-01 | 2010-04-08 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers in cmv immune monitoring |
| CN107038349A (zh) * | 2016-02-03 | 2017-08-11 | 深圳华大基因研究院 | 确定重排前v/j基因序列的方法和装置 |
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2017
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