CN107820775A - 一种玉米抗旱性的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玉米抗旱性的鉴定方法，利用PEG‑6000渗透胁迫结合卷纸法发芽，模拟玉米萌芽期干旱胁迫，对待测玉米种子材料进行抗旱性鉴定。本发明提供的方法操作简单，鉴定周期短，采用卷纸法进行种子发芽，种子生长空间相对独立，种子从吸涨、萌动、发芽以及胚根伸长都能达到自然状态，便于形态观察和数据测量，减少实验误差，且渗透胁迫的测试效果较其他方法更好，能够对玉米材料的抗旱性进行准确的鉴定。
Description
技术领域
本发明是对玉米萌芽期抗旱性进行定性定量评价的方法，利用该方法可以高效准确地反映玉米萌芽期抗旱性的强弱和抗旱程度，进而筛选抗旱的玉米种子资源。
背景技术
干旱是限制全球农业生产的一个最重要非生物胁迫因子，特别是旱地农业生产尤为突出。作为旱地作物的玉米，干旱胁迫会影响播种、出苗、全苗、壮苗进而影响产量。干旱胁迫下，不同遗传背景的玉米材料的植株形态特征、生理生化特性及生长发育等方面的表现是不同的，因此，鉴定和评价玉米种质的抗旱性，是选育稳产、高产、抗逆性强的玉米新品种的前提，是解决干旱胁迫对玉米生产最有效的措施。
玉米在不同生育时期表现的抗旱性完全不同，为提高抗旱性评价的准确性和科学性，必需针对生育时期建立最为有效的鉴定指标。萌芽期是玉米整个生育期的第一阶段，该阶段需水较少(仅占总需水量的3.1～6.1％)，但对水分却最为敏感。萌发期遇旱会影响种子的发芽率，造成缺苗断垄，严重时缺苗可达40～50％。因此，玉米能否在土壤水分胁迫下保持较高的萌发率和出苗率，直接关系到以后的生长发育和产量形成。此外，在萌芽期对玉米进行抗旱筛选还能省工省时。近年来，许多学者对玉米的干旱机制、抗旱性的鉴定方法和指标等方面做了大量研究，而对玉米萌芽期抗旱性鉴定研究较少。
大量研究结果也表明，用高渗溶液进行干旱模拟可代替土壤干旱胁迫处理获得比较可靠的结果。甘露醇溶液渗透萌发法、TTC定量测定法、种子吸水率检测法均可作为玉米萌芽期抗旱性鉴定的方法。近年来，聚乙二醇－6000(PEG-6000)高渗溶液法已经成为研究种子萌发性状的重要方法。该方法不但避免了田间鉴定的周期长、花费人物力较多的缺点，而且PEG-6000对植物无毒害，且能保持稳定的渗透压，是十分有效可行的方法。
使用PEG-6000水溶液对种子进行渗透胁迫处理，常用的具体步骤如下：选取籽粒饱满、大小均匀的种子，培养前种子消毒，用垫有滤纸的灭菌培养皿或发芽盒，加入适量的特定浓度的PEG-6000水溶液，加盖，防止水分蒸发，设置重复2～3次，相同材料加去离子水或蒸馏水作对照。种子放置于25～28℃恒温条件下培养，隔天调查发芽种子数。此外，一些实验为保证高渗水溶液的浓度，采取每天定时定量更换新溶液。在评价指标方面，以计算种子发芽抗旱指数进行抗旱性评价。此外，有些研究会对胚芽和胚根的长度和重量等指标进行测定。
在利用PEG-6000水溶液进行胁迫的过程中，存在以下三点问题：(1)在培养皿或发芽盒中，无法保证所有待测材料的胚根完全接触高浓度胁迫水溶液，保持受渗透胁迫状态；(2)密闭环境中容易造成种子缺氧，温湿度增加，胚乳长时间浸泡水溶液中发生脓烂，或伴有霉菌等情况；(3)培养皿或发芽盒空间有限，易造成胚芽和胚根扭曲畸形，不便于直观观察和测量胚芽和胚根长度等指标。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种玉米抗旱性的鉴定方法，利用PEG-6000渗透胁迫结合卷纸法发芽，模拟玉米萌芽期干旱胁迫，对待测玉米种子材料进行抗旱性鉴定。
具体的，本发明提供的玉米抗旱性的鉴定方法，具体包括如下步骤：
S1：种子前处理
选择数颗发育良好、大小均匀一致，籽粒饱满、无破损的待鉴定玉米种子，对所选种子做消毒处理后，备用；
S2：发芽纸处理
将3张发芽纸置于2.5g/L的克菌丹溶液中完全湿润，取出置于干净面板上；
S3：卷纸法摆种
3张发芽纸层叠放置，将S1消毒处理过的玉米种子，胚向下，整齐一致的均匀散放在中层发芽纸上，发芽纸上放置数粒种子，将最上面一层发芽纸盖在玉米种子上，将层叠放置的3张发芽纸卷成纸卷并扎捆，制成一个纸卷；
S4：胁迫处理和对比处理
将S3制得的多个纸卷随机分成两组，将其中一组卷纸竖放在烧杯中，倒入一定体积，一定浓度的PEG-6000水溶液，作为胁迫处理组；将另一组卷纸竖放在烧杯中，倒入与PEG-6000水溶液等体积的去离子水，作为对照处理组；为防止玉米种子发生霉菌，胁迫处理组和对照处理组的烧杯中还均另加有适量克菌丹粉末，克菌丹水溶液的终浓度是0.5～0.8g/L；
S5：玉米种子培养
将经S4处理后的胁迫处理组卷纸和对照处理组卷纸均放置在光照培养箱中，黑暗条件28℃/24h培养4天后，第5天接受光照，温度及光暗周期设置为28℃/16h和22℃/8h，光照强度为750～1250μmol m-2/S，交替光照期间，胁迫处理组更换一次新鲜的PEG-6000水溶液，新鲜PEG-6000水溶液的更换量为初始体积的1/2，并另加有初始量1/2的克菌丹粉末；对照处理组更换一次去离子水，去离子水的更换量为初始体积的1/2，并另加有初始量1/2的克菌丹粉末，第7天结束培养；黑暗条件培养时每天通过换气孔换气；
S6：对玉米种子的抗旱性进行评价。
优选地，S1中，待鉴定玉米种子的消毒处理过程如下：
用质量浓度6％的次氯酸钠浸泡10min，不时摇晃除菌，然后用超纯水冲洗2～4次，每次2分钟，用滤纸吸干附着水。
优选地，S2中，所用发芽纸的型号为：长20cm×宽15cm。
更优选地，S3中，胚向下，散放在中层发芽纸上，发芽纸上放置5～8粒玉米种子，控制种子摆放间距，防止种子间根系相互接触，3张发芽纸层叠放置后沿长度方向卷成纸卷。
优选地，S4中，所述PEG-6000水溶液的终浓度为20％，所述克菌丹溶液的终浓度为0.66g/L。
优选地，S6中，对玉米种子的抗旱性进行评价的具体过程如下：
(1)指标测定
(11)根据玉米种子发芽情况，分别测定胁迫处理组和对照处理组玉米种植的发芽天数Dt，以及与Dt相对应的每天发芽种子数Gt；
计算发芽指数GIn，发芽指数GIn的计算公式如下式(1)所示：
式中，Dt为发芽天数，Gt为与Dt相对应的每天发芽种子数，n为s或c，s表示胁迫处理组，c表示对照处理组；上述玉米种子发芽指的是胚芽长达到种子长度的一半，种子根长度与种子相等；
通过式(1)计算得到胁迫条件下种子发芽指数GIs和对照条件下种子发芽指数GIc；
(12)通过GIn计算玉米种子活力指数VI，玉米种子活力指数VI的计算公式如下式(2)所示：
VI＝GIn×S (2)；
其中：S表示培养7d后的幼苗单株的平均长度，cm，或平均干重，g；
(13)通过式(3)计算玉米种子发芽势GP，
培养3d后测定；
(14)通过式(4)计算平均发芽时间MGT，
式中，Dt-发芽天数，Gt-与Dt相对应的每天发芽种子数；
(15)通过上述(11)-(14)计算得到的各指标的性状值，算出各指标的抗旱系数DRCi，抗旱系数DRCi的计算公式如式(5)所示：
式中，Ts和Tc分别为胁迫和对照条件下各指标对应的性状值；
(2)采用隶属函数法对玉米种子的抗旱性进行综合性评价
通过式(6)所示的公式计算各指标抗旱隶属值，抗旱隶属值的平均值越大说明抗旱性越强；
式中，R(Xi)为抗旱系数的隶属值，Xi为第i个指标的抗旱系数，即式(5)计算的DRCi，Xmin、Xmax为第i个指标的抗旱系数的最小值和最大值。
更优选地，所述隶属值的抗旱性评价标准如下表所示：
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明利用PEG-6000渗透胁迫结合卷纸法发芽，模拟玉米萌芽期干旱胁迫，对待测玉米种子材料进行抗旱性鉴定，操作简单，鉴定周期短。采用卷纸法进行种子发芽，种子生长空间相对独立，种子从吸涨、萌动、发芽以及胚根伸长都能达到自然状态，便于形态观察和数据测量，减少实验误差；
(2)利用卷纸法发芽结合PEG-6000渗透胁迫进行种子发芽，种子可以通过周围的发芽纸吸取PEG-6000溶液，待测材料能持续接受渗透胁迫，渗透胁迫的测试效果较其他方法更好；
(3)在抗旱评价方面，不仅引用活力指数进行评价抗旱性，还考虑量化指标共同评价芽期抗旱性，准确率更高。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，下文中所用是的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明以下各实施例中用到的各种原料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买得到或者通过现有方法制备得到。
实施例1
本实施例以浓度为20％的PEG-6000溶液为例，选取5个玉米自交系作为待鉴定玉米种子，采用相同的鉴定方法，鉴定这些玉米品种的抗旱性。具体的，鉴定方法具体包括如下步骤：
S1：种子前处理
挑选精选发育良好、大小均匀一致，籽粒饱满、无破损的待鉴定玉米种子每个品种各180粒(种子质量符合GB 4404.1要求)，用6mL质量浓度6.0％的次氯酸钠浸泡10min，不时摇晃除菌，然后用超纯水冲洗3次左右，每次2分钟，用滤纸吸干附着水，备用。
S2：发芽纸处理
用托盘(长30cm×宽25cm×深5cm)盛取浓度为2.5g/L的克菌丹溶液适量，取3张发芽纸(长20cm×宽15cm)置于盘中，完全湿润，取出置于干净面板上。
S3：卷纸法摆种
3张发芽纸层叠放置，将S1消毒处理过的玉米种子，胚向下，整齐一致的均匀散放在中层发芽纸上，发芽纸上放置5粒种子，放好后将最上面一层发芽纸盖在玉米种子上，将沿长度方向将层叠放置的3张发芽纸卷成纸卷，种子在各层纸之间，用皮筋扎捆。需要说明的是，控制种子摆放间距，防止种子间根系相互接触，且纸卷不宜卷扎过紧。
S4：胁迫处理和对比处理
通过上述方法共制备36个纸卷，对36个纸卷随机均分成两组，每组18个，30粒种子为1个重复，选取一个2L的玻璃烧杯，18个纸卷竖放在烧杯中，向玻璃烧杯中倒入150mL浓度为20％的PEG-6000水溶液，作为胁迫处理组；
同样在选取一个2L的玻璃烧杯，将另一组的18个纸卷竖放在烧杯中，倒入150mL去离子水，作为对照处理组；
为防止玉米种子发生霉菌，胁迫处理组和对照处理组的烧杯中还均另加有100mg的克菌丹粉末；
S5：玉米种子培养
将经S4处理后的胁迫处理组卷纸和对照处理组卷纸连同烧杯均放置在光照培养箱中，黑暗条件28℃/24h培养4天后，第5天接受光照，温度及光暗周期设置为28℃/16h和22℃/8h，光照强度为750～1250μmol m-2/S，交替光照期间，胁迫处理组更换一次新鲜的PEG-6000水溶液，新鲜PEG-6000水溶液的更换量为75mL，并另加50mg克菌丹粉末；对照处理组更换一次去离子水，去离子水的更换量为75mL，并另加50mg克菌丹，第7天结束培养；黑暗条件培养，用黑色袋子封住光照培养箱，袋子上留有小孔，并且每天揭开换气。
S6：然后我们再根据常规方法对玉米种子的抗旱性进行评价。
通过本实施例1提供的方法对玉米种子的抗旱性进行评价的过程中，我们对5种玉米品种进行测定可以发现，种子没有脓烂和发霉现象，种子发育良好，便于形态观察和数据测量。
实施例2
在实施例1的基础上，我们还进一步改进了玉米种子的抗旱性评价方法，具体的评价过程具体如下：
在实施实施例1的S1～S5步骤之后，我们先测定玉米种子的如下指标：
玉米种子发芽在本实施例中指的是胚芽长达到种子长度的一半，种子根长度约与种子相等；每天相同时间记载发芽种子数，发芽试验结束时，测定幼苗初生根长度(每个重复随机取5株求平均值)。根据玉米种子发芽情况，分别计算玉米种子的发芽势、发芽指数、平均发芽时间和活力指数，相关指标计算公式如下：
(1)发芽指数GIn的计算公式如下式(1)所示：
式中，Dt为发芽天数，Gt为与Dt相对应的每天发芽种子数，n为s或c，s表示胁迫处理组，c表示对照处理组；
(2)发芽势GP的计算公式如下式(3)所示：
培养3d后测定。
(3)平均发芽时间MGT的计算公式如下式(4)所示：
式中，Dt-发芽天数，Gt-与Dt相对应的每天发芽种子数。
(4)活力指数VI的计算公式如下式(2)所示：
VI＝GIn×S (2)
S表示培养7d后的幼苗单株的平均长度，cm。
经上述公式(1)-(4)进行计算，所得的具体统计及计算结果见下表1。
表1各玉米品种指标测定结果
(5)接着，我们通过上述指标的性状值计算得到各品种的抗旱系数DRCi，抗旱系数DRCi的计算公式如式(5)所示：
式中，Ts和Tc分别为胁迫和对照条件下上述各品种的指标对应的性状值。
(6)最后，我们采用隶属函数法进行综合性评价，通过公式(6)所示的公式计算隶属值，具体公式如下所示：
式中，R(Xi)为抗旱系数的隶属值，Xi为第i个指标的抗旱系数(所述指标指的是参试材料的发芽势、发芽指数、平均发芽时间、活力指数等指标)，即公式(5)计算的DRCi；Xmin、Xmax为所有参试材料第i个指标的抗旱系数的最小值和最大值(所有参试材料的同一指标的抗旱系数的最大值和最小值)，如果某一指标与抗旱性为负相关，则用反隶属函数进行转换。计算每个自交系各性状抗旱隶属函数平均值R，平均值越大说明抗旱性越强。具体结果见表2所示，种子发芽期的抗旱性评价标准具体如图3所示：
表2各玉米品种抗旱系数和隶属值结果
表3种子发芽期的抗旱性评价标准
| 级别 | 抗旱强度 | 种子发芽期抗旱隶属值 |
| 1 | 极强(HR) | R≥0.70 |
| 2 | 强(R) | 0.5≤R＜0.70 |
| 3 | 中等(M) | 0.4≤R＜0.5 |
| 4 | 弱(S) | 0＜R＜0.4 |
我们对5种玉米品种进行测定可以发现，实际鉴定结果与实际情况高度吻合，可见通过量化指标共同评价芽期抗旱性，准确率更高。
实施例3
在实施例2的基础上，我们还进一步对玉米自交系的改良株系的抗旱性进行整体评价。其中，Z01-04为PH4CV的改良系；Z05-07为DH4866的改良系；Z08-12为郑58的改良系。具体的评价过程具体如下：
在实施实施例1的S1～S5步骤之后，我们先测定玉米种子的指标，具体如下表4所示，各玉米品种抗旱系数和隶属值结果具体如下表5所示。
表4各玉米品种指标测定结果
表5各玉米品种抗旱系数和隶属值结果
我们对同批次鉴定的3份自交系及其对应改良株系的测定可以发现，自交系抗旱性评价稳定，适用于抗旱种质或品种的抗旱性评价，可见通过量化指标共同评价芽期抗旱性，准确率更高。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (7)
1.一种玉米抗旱性的鉴定方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1：种子前处理
选择数颗发育良好、大小均匀一致，籽粒饱满、无破损的待鉴定玉米种子，对所选种子做消毒处理后，备用；
S2：发芽纸处理
将3张发芽纸置于2.5g/L的克菌丹溶液中完全湿润，取出置于干净面板上；
S3：卷纸法摆种
3张发芽纸层叠放置，将S1消毒处理过的玉米种子，胚向下，整齐一致的均匀散放在中层发芽纸上，发芽纸上放置数粒种子后，将最上面一层发芽纸盖在玉米种子上，将层叠放置的3张发芽纸卷成纸卷并扎捆，制成一个纸卷；
S4：胁迫处理和对比处理
将S3制得的多个纸卷随机分成两组，将其中一组卷纸竖放在烧杯中，倒入一定体积，一定浓度的PEG-6000水溶液，作为胁迫处理组；将另一组卷纸竖放在烧杯中，倒入与PEG-6000水溶液等体积的去离子水，作为对照处理组；为防止玉米种子发生霉菌，胁迫处理组和对照处理组的烧杯中还均另加有适量克菌丹粉末，克菌丹水溶液的终浓度是0.5～0.8g/L；
S5：玉米种子培养
将经S4处理后的胁迫处理组卷纸和对照处理组卷纸均放置在光照培养箱中，黑暗条件28℃/24h培养4天后，第5天接受光照，温度及光暗周期设置为28℃/16h和22℃/8h，光照强度为750～1250μmol m-2/S，交替光照期间，胁迫处理组更换一次新鲜的PEG-6000水溶液，新鲜PEG-6000水溶液的更换量为初始体积的1/2，并另加有初始量1/2的克菌丹粉末；对照处理组更换一次去离子水，去离子水的更换量为初始体积的1/2，并另加有初始量1/2的克菌丹粉末，第7天结束培养；黑暗条件培养时每天通过换气孔换气；
S6：对玉米种子的抗旱性进行评价。
2.根据权利要求1所述的玉米抗旱性的鉴定方法，其特征在于，S1中，待鉴定玉米种子的消毒处理过程如下：
用质量浓度6％的次氯酸钠浸泡10min，不时摇晃除菌，然后用超纯水冲洗2～4次，每次2分钟，用滤纸吸干附着水。
3.根据权利要求1所述的玉米抗旱性的鉴定方法，其特征在于，S2中，所用发芽纸的型号为：长20cm×宽15cm。
4.根据权利要求3所述的玉米抗旱性的鉴定方法，其特征在于，S3中，胚向下，散放在中层发芽纸上，发芽纸上放置5～8粒玉米种子，控制种子摆放间距，防止种子间根系相互接触，3张发芽纸层叠放置后沿长度方向卷成纸卷。
5.根据权利要求1所述的玉米抗旱性的鉴定方法，其特征在于，S4中，所述PEG-6000水溶液的终浓度为20％，所述克菌丹溶液的终浓度为0.66g/L。
6.根据权利要求1所述的玉米抗旱性的鉴定方法，其特征在于，S6中，对玉米种子的抗旱性进行评价的具体过程如下：
(1)指标测定
(11)根据玉米种子发芽情况，分别测定胁迫处理组和对照处理组玉米种植的发芽天数Dt，以及与Dt相对应的每天发芽种子数Gt；
计算发芽指数GIn，发芽指数GIn的计算公式如下式(1)所示：
<mrow>
<mi>G</mi>
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</mrow>
</mrow>
式中，Dt为发芽天数，Gt为与Dt相对应的每天发芽种子数，n为s或c，s表示胁迫处理组，c表示对照处理组；上述玉米种子发芽指的是胚芽长达到种子长度的一半，种子根长度与种子相等；
通过式(1)计算得到胁迫条件下种子发芽指数GIs和对照条件下种子发芽指数GIc；
(12)通过GIn计算玉米种子活力指数VI，玉米种子活力指数VI的计算公式如下式(2)所示：
VI＝GIn×S (2)；
其中：S表示培养7d后的幼苗单株的平均长度，cm，或平均干重，g；
(13)通过式(3)计算玉米种子发芽势GP，
培养3d后测定；
(14)通过式(4)计算平均发芽时间MGT，
<mrow>
<mi>M</mi>
<mi>G</mi>
<mi>T</mi>
<mo>=</mo>
<mfrac>
<mrow>
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</mrow>
</mrow>
式中，Dt-发芽天数，Gt-与Dt相对应的每天发芽种子数；
(15)通过上述(11)-(14)计算得到的各指标的性状值，算出各指标的抗旱系数DRCi，抗旱系数DRCi的计算公式如式(5)所示：
<mrow>
<mi>D</mi>
<mi>R</mi>
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<mo>(</mo>
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<mo>)</mo>
</mrow>
</mrow>
式中，Ts和Tc分别为胁迫和对照条件下各指标对应的性状值；
(2)采用隶属函数法对玉米种子的抗旱性进行综合性评价
通过式(6)所示的公式计算各指标抗旱隶属值，抗旱隶属值的平均值越大说明抗旱性越强；
<mrow>
<mi>R</mi>
<mrow>
<mo>(</mo>
<mi>X</mi>
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<mo>(</mo>
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<mo>)</mo>
</mrow>
</mrow>
式中，R(Xi)为抗旱系数的隶属值，Xi为第i个指标的抗旱系数，即式(5)计算的DRCi，Xmin、Xmax为第i个指标的抗旱系数的最小值和最大值。
7.根据权利要求6所述的玉米抗旱性的鉴定方法，其特征在于，所述隶属值的抗旱性评价标准如下表所示：
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| CN201711105124.6A Pending CN107820775A (zh) | 2017-11-10 | 2017-11-10 | 一种玉米抗旱性的鉴定方法 |
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| CN (1) | CN107820775A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108849334A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-11-23 | 四川省农业科学院植物保护研究所 | 一种基于分级系数的水稻芽期抗旱性综合评价方法 |
| CN111257509A (zh) * | 2020-01-18 | 2020-06-09 | 吉林省农业科学院 | 一种用于玉米萌发期耐旱鉴定的方法 |
| CN111919536A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-13 | 青岛农业大学 | 一种玉米种子活力萌发事件测定方法与装备 |
| CN114051788A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-02-18 | 山西农业大学农业基因资源研究中心 | 一种大豆芽期抗旱性鉴定的方法 |
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-
2017
- 2017-11-10 CN CN201711105124.6A patent/CN107820775A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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