CN107817309B - 一种规模化代谢组定性方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种规模化代谢组定性方法，借助液相色谱‑高分辨质谱非靶向源内裂解技术，使用特征中性丢失、多个中性丢失组合、中性丢失结合多级质谱及特征子离子识别等多种策略，对植物代谢组进行系统的规模化定性，为进一步研究植物代谢组的变化奠定基础。本发明充分利用高分辨、高灵敏度质谱的优势，实现了具有特征结构代谢物的规模化识别，利于快速锁定代谢物的类别，拓展了传统质谱方法的定性能力，提高了代谢物定性效率，扩充了代谢组的覆盖范围，尤其是部分解决了植物次生代谢物的定性难题，同时可为其他生物体规模化定性研究提供借鉴。

Description

一种规模化代谢组定性方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，是一种基于超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术的规模化代谢组定性新方法。
背景技术
代谢组学是通过考察生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。近年来，液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术的灵敏度和分辨率均得到了快速发展，非靶向代谢组学可检测到的代谢物数量随之不断增加。但是大部分的代谢物结构仍无法鉴定。代谢组定性尤其是规模化定性方法是目前代谢组学研究的热点和难点问题之一。已有的代谢物定性方法包括利用高分辨质谱定性、同位素标记辅助定性和依赖二级及多级质谱数据定性等。其中，高分辨质谱可得到精确分子量，进一步可用于分子式的推测，但由于代谢组中存在大量的同分异构体，分子式推测结果不具有唯一性存在多个候选，其结构确证还需借助于其他手段。同位素辅助定性方法采用单同位素或多重同位素标记结合高分辨质谱检测和相应的数据处理技术，可对化合物分子结构进行推测。该技术可有效地缩小候选代谢物的数量，从而高效锁定未知化合物的化学式，但该方法数据处理繁杂，实验条件控制较复杂，且成本较高。基于化合物结构特征进行定性的技术诸如AB SCIEX公司的LipidViewTM软件，通过在脂质碎片数据库中搜索母离子和碎片离子质量进行脂质分析，适用于各种脂质分子类型、脂质类别和脂肪酸等的分析，但该方法目前也只限于脂类化合物的鉴定。
质谱源内裂解是带电离子被加在离子源锥孔的电压碎裂，产生碎片的现象。选取合适的源内电压可对带电离子雾化过程中结合的溶剂以及形成的离子簇等进行有效去除，得到质谱响应较高的化合物分子离子。许国旺课题组利用源内裂解(in source collisionincluded dissociation，ISCID)技术，对尿液中5种典型的修饰代谢物如乙酰化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化、核糖结合和葡萄糖基化等修饰类型进行了分析，通过源内诱导裂解去除特定的修饰基团，再经高分辨中性丢失匹配可推断出修饰基团的精确分子量，从而对代谢物的修饰类型进行鉴定[1]。
植物代谢组种类众多，包括了糖、脂肪酸、脂类、有机酸、氨基酸及胺类等初生代谢物，以及多酚、萜类、色素、植物激素和生物碱等次生代谢物。次级代谢物往往存在大量的衍生及后修饰现象，其具 有十分重要的生理功能，如多酚类物质，具有良好的抗氧化活性，黄酮苷具有抗氧化抗病毒活性，生物碱类物质随不同的化学结构表现出多样的生物功能等。
目前，代谢组定性尚未有规模化、系统性的定性方法，源内裂解作为一种非靶向的碎裂模式，在代谢组的规模化定性方面有很好的应用前景，本发明借助质谱源内裂解技术，建立一种规模化的代谢组定性方法，为代谢组的定性提供新的手段。
发明内容
本发明提供了一种规模化代谢组定性的方法。为了实现本发明目的，本发明所述的规模化代谢组定性方法利用超高压液相色谱-高分辨质谱联用技术结合质谱源内裂解技术，对植物代谢组实现规模化定性。
为实现上述研究目的，本发明的技术方案如下：
制备植物混合样品，对该样本在不同的质谱源内裂解电压下进行超高效液相色谱-高分辨质谱分析；原始数据经峰匹配后得到峰表，从峰表中得出具有特征中性丢失或特征子离子的代谢物，对其进行质谱数据库检索，快速锁定代谢物类别，实现规模化定性。
植物混合样品为待测样品的均质混合物。
超高效液相色谱-高分辨质谱方法的色谱条件为：采用BEH T3色谱柱，10cm×2.1mm×1.7μm，流动相A相为体积百分比为0.1％甲酸/水，B相为乙腈；液相色谱采用线性梯度，0-2min，2％B，2-5min，升至4％B，5-13min时线性升至70％B，13-21min时线性升至98％B并保持4min，21-25.1min恢复初始2％B；流量为0.3mL/min，进样量为3μL；进样器温度为10℃，柱温为40℃；质谱条件为：毛细管温度325℃，离子源电压正离子模式4.5kV，负离子模式-4.0kV，毛细管电压正离子模式49V，负离子模式-40V；质谱扫描范围为m/z50-1000amu；高分辨质谱的扫描分辨率设置为30000。
对混合样品采用不同的质谱源内裂解电压进行分析；质谱源内裂解电压以5V为步长，从0-45V；在正负离子模式下，源内诱导裂解电压分别设置为0，±5，±10，±15，±20，±25，±30，±35，±40和±45V进行质谱扫描分析。
将混合样品在不同源内裂解电压下得到的原始数据进行峰匹配，得到峰表；对实际代谢样品和混合样品全扫描模式的原始数据进行峰匹配，去除冗余的同位素及加合离子，得到非靶向代谢组学峰表。
对混合样品在不同源内裂解电压下得到的峰表进行特征中性丢失筛选；对保留时间小于0.1min范围内，具有符合特征中性丢失的特定质量数差值，且其质量数差值与特定中性丢失的质量数理论值之 差小于0.002Da的离子进行配对分析；该离子对即被认为是含有特定中性丢失的代谢物的母离子和其源内裂解产生的子离子。
对混合样品在不同源内裂解电压下得到的峰表进行特征性子离子筛选；含有某种特定官能团的代谢物经质谱源内裂解后，会产生特定的子离子，该子离子可作为代谢物含有特定官能团的定性依据。
将上述峰表中得到的具有特征中性丢失或具有特征子离子的代谢物母离子进行定性，用母离子的精确质量数并限定其含有单个特征中性丢失或多个中性丢失组合或中性丢失结合多级质谱或特征子离子等多种方法，进行质谱数据库检索，数据库检索的质量误差范围设置为10ppm。
本发明研究人员经过分析研究，发现含特殊基团的代谢物经过源内裂解，会产生特征的中性丢失和特征子离子，利用该特点可对代谢物进行定性；利用高分辨质谱得到的代谢物母离子的精确质量数结合特征中性丢失，多个中性丢失组合，中性丢失结合多级质谱及特征子离子查找等多种策略，可以达到对植物代谢组中含有酰基、糖基、酚酸基、磷酸基等基团的代谢物的规模化定性。本发明利用超高效液相色谱-高分辨质谱联用方法结合高分辨质谱源内裂解技术，实现对代谢组的规模化定性。该方法充分利用高分辨质谱的高质量精度、高灵敏度的优势，对代谢物特征子结构进行规模化识别，快速锁定代谢物类别，拓展了传统质谱方法的定性能力，提高了代谢物定性效率。
附图说明
图1具有特定中性丢失的代谢物的源内裂解质谱图；
图1中具有特定中性丢失的代谢物的源内裂解质谱图，(A)腐胺(正离子模式，源内裂解电压20V)，(B)谷氨酰胺(正离子模式，源内裂解电压15V)，(C)水杨酸(负离子模式，源内裂解电压-20V)，(D)绿原酸(负离子模式，源内裂解电压-20V)，(E)4-乙酰氨基苯基β-D-葡萄糖醛酸(负离子模式，源内裂解电压-20V)，(F)乙酰谷氨酸(负离子模式，源内裂解电压-25V)，(G)腺苷(正离子模式，源内裂解电压20V)，(H)木犀草苷(正离子模式，源内裂解电压20V)，(I)山奈酚-3-O-β-芸香糖苷(正离子模式，源内裂解电压35V)。图2多个中性丢失组合用于代谢物定性示意图。
图2中多个中性丢失组合用于代谢物离子定性示意图(正离子模式，m/z355.1017，保留时间7.7min)。
图3中性丢失结合多级质谱对代谢物进行规模化定性示意图；
图3中正离子模式下，保留时间8.56min，m/z 611.1612的提取离子色谱图(A)，m/z611.1612离子的二级质谱图(B)，m/z 611.1612离子的三级质谱图(C)，槲皮素标准物质的二级质谱图(D)。
图4具有特征子离子的代谢物源内裂解质谱图举例。
图4中(A)磷酸丝氨酸(负离子模式，源内裂解电压-5V)，(B)可替宁(正离子模式，源内裂解电压40V)。
具体实施方式
下面通过实例进一步阐释本发明，实例仅限于说明本发明以便于理解，而非对本发明的限定。
表1为植物代谢物中典型的21种中性丢失表
表2为具有特征中性丢失的代谢物统计表
表3为部分由精确质量结合特征子离子定性出的代谢物表
实施例1
以植物叶片为例，对其代谢物进行规模化定性研究。具体步骤为：制备植物混合样品，对该样本在不同的质谱源内裂解电压下进行超高效液相色谱-高分辨质谱分析；原始数据经峰匹配后得到峰表，从峰表中得出具有特征中性丢失或特征子离子的代谢物，对其进行质谱数据库检索，快速锁定代谢物类别，实现规模化定性。对有市售标准样品的物质可以进行进一步的标样验证，确证定性结果。具有特定中性丢失特征或特征子离子的代谢物可根据具体结构特点使用单个中性丢失，多个中性丢失或中性丢失结合多级质谱技术或特征子离子等，提高定性的可靠性。
特征中性丢失或特征子离子的精确质量数可由标样质谱分析、数据库中代谢物二级信息及文献报道等获取。植物代谢组中典型的中性丢失主要包括胺类、氨基酸、有机酸、磷酸结合物、磺酸结合物、葡萄糖醛酸结合物、酰基化结合物、糖基化结合物、多酚类等21种特征中性丢失(附表1)以及生物碱，磷酸基团结合物等特征子离子。
样本分析步骤如下所述：
取-80℃保存的植物鲜叶干粉，总计12个样品。每个样品称取100mg，混匀作为植物混合样品。准确称取20mg植物混合样品，加入1mL 80％(v/v)的甲醇水溶液，涡旋提取5min，15000r/m离心5min，取上清液进行分析。
超高效液相色谱-高分辨质谱分析仪器采用ACQUITY UPLC超高效液相色谱分析系统(Waters，美国)和LTQ-Orbitrap XL高分辨质谱(Thermo Fisher，美国)。液相色谱条件为：采用BEH T3色谱柱，10cm×2.1mm×1.7μm，流动相A相为体积百分比为0.1％甲酸/水，B相为乙腈；液相色谱采用线性梯度，0-2min，2％B，2-5min，升至4％B，5-13min时线性升至70％B，13-21min时线性升至98％B并保持4min，21-25.1min恢复初始2％B；流量为0.3mL/min，进样量为3μL；进样器温度为10℃，柱温为40℃；质谱条件为：毛 细管温度325℃，离子源电压正离子模式4.5kV，负离子模式-4.0kV，毛细管电压正离子模式49V，负离子模式-40V；质谱扫描范围为m/z50-1000amu；高分辨质谱的扫描分辨率设置为30000。代谢物二级和多级质谱分析的母离子筛选采用FTMS模式，分辨率设置为7500，子离子扫描采用ITMS模式，碰撞诱导裂解(CID)模式下碰撞能量(CE)为35％。
对混合样品采用不同的质谱源内裂解电压进行分析；质谱源内裂解电压以5V为步长，从0-45V；在正负离子模式下，源内诱导裂解电压分别设置为0，±5，±10，±15，±20，±25，±30，±35，±40和±45V进行质谱扫描分析。
原始数据的峰提取和峰对齐采用Sieve x86软件V1.2(ThermoFisher，美国)，保留时间窗口设置为0.5min，质量数窗口设置为10ppm，最大特征离子提取窗口为5000个。首先将源内裂解模式0-45V下得到的原始数据各自匹配，得到各个源内裂解电压下的峰表，去除冗余的同位素及加合离子。
对混合样品在不同源内裂解电压下得到的峰表进行特征中性丢失筛选；对保留时间小于0.1min范围内，具有符合特征中性丢失的特定质量数差值，且其质量数差值与特定中性丢失的质量数理论值之差小于0.002Da的离子进行配对分析；该离子对即被认为是含有特定中性丢失的代谢物的母离子和其源内裂解产生的子离子。得到具有中性丢失特征的离子后，进一步对母离子采用精确质量数结合中性丢失，多中性丢失组合或中性丢失结合多级质谱，实现规模化定性。
另外，含一些特征基团，如磷酸基团，吡啶基团等的化合物，经源内裂解时，会产生特征性基团的质谱峰，此可作为这些代谢物的定性基础。对混合样品在不同源内裂解电压下得到的峰表进行特征性子离子筛选；含有某种特定官能团的代谢物经质谱源内裂解后，会产生特定的子离子，该子离子可作为代谢物含有特定官能团的定性依据；对特征子离子进行筛选后，进一步通过代谢物母离子的精确分子量并限定含有特定官能团进行数据库检索，对代谢物进行规模化定性。
对得到的具有特征中性丢失或具有特征子离子的代谢物母离子，通过其母离子的精确质量数并限定其含有单个特征中性丢失或多个中性丢失组合或中性丢失结合多级质谱或特征子离子等多种方法，进行质谱数据库检索如METLIN等，数据库检索的质量误差范围设置为10ppm。
图1具有特定中性丢失的代谢物的源内裂解质谱图，(A)腐胺(正离子模式，源内裂解电压20V)，(B)谷氨酰胺(正离子模式，源内裂解电压15V)，(C)水杨酸(负离子模式，源内裂解电压-20V)，(D)绿原酸(负离子模式，源内裂解电压-20V)，(E)4-乙酰氨基 苯基β-D-葡萄糖醛酸(负离子模式，源内裂解电压-20V)，(F)乙酰谷氨酸(负离子模式，源内裂解电压-25V)，(G)腺苷(正离子模式，源内裂解电压20V)，(H)木犀草苷(正离子模式，源内裂解电压20V)，(I)山奈酚-3-O-β-芸香糖苷(正离子模式，源内裂解电压35V)。
图2多个中性丢失组合用于代谢物离子定性示意图(正离子模式，m/z 355.1017，保留时间7.7min)；
图3中性丢失结合多级质谱对代谢物进行规模化定性。正离子模式下，保留时间8.56min，m/z 611.1612的提取离子色谱图(A)，m/z 611.1612离子的二级质谱图(B)，m/z611.1612离子的三级质谱图(C)，槲皮素标准物质的二级质谱图(D)；
图4具有特征子离子的代谢物源内裂解图举例，(A)磷酸丝氨酸(负离子模式，源内裂解电压-5V)，(B)可替宁(正离子模式，源内裂解电压40V)。
表1植物代谢物中典型的21种中性丢失表
Figure BDA0001113713440000061
表2植物叶片中具有特征中性丢失的代谢物统计表
Figure BDA0001113713440000062
Figure BDA0001113713440000071
表3植物叶片中部分由精确质量结合特征子离子定性出的代谢物表
Figure BDA0001113713440000072
附图1给出了部分植物代谢组中具有典型中性丢失的代谢物的源内裂解图，附图2给出了具有两个特征中性丢失的代谢物的源内裂 解质谱图。从图中可知利用单个中性丢失或多个特征丢失组合可推断代谢物的结构信息。以特征中性丢失筛选策略，得到了烟草鲜叶样品中21类修饰代谢物结果，见附表2。其中，糖基结合的代谢物数量较多，正离子模式下有259种，负离子模式下有713种；其次是酰基结合的代谢物，正离子模式下有201种，负离子模式下有688种；植物特有的多酚类也占有一定比例，正离子模式下有160种，负离子模式下有585种；此外，还筛选出氨基酸、有机酸、葡萄糖醛酸结合物、磺酸及磷酸结合物等。由于存在同一代谢物可能含有多个特征官能团，正离子模式下，初步鉴定出1173个含有特征官能团的离子，可归结为814种代谢物；负离子条件下，得到的2423个含有特征官能团的离子，可归结为1372种代谢物。利用同一代谢物具有的多个中性丢失，可获取代谢物更多的子结构信息，甚至可达到对代谢物结构的准确推断。通过限定多个中性丢失，结合母离子的高分辨质量数，经谱图库检索初步定性出的54种化合物，其中9种有市售标准样品的通过了标样验证，说明该定性方法可靠。
此外，还可采用特征中性丢失结合多级质谱策略进行代谢物的规模化定性。附图3说明8.56min处，精确质量数为611.1589的离子的定性过程。其提取离子色谱图如附图3中A。首先，根据质谱源内裂解得到的峰表进行筛选，得出该代谢物离子含有两个符合特征中性丢失的特定质量数差值146.05791和162.05282，分别对应脱氧己糖和己糖，初步确定其结构为双糖基(己糖和脱氧己糖)结合的代谢物。该离子m/z 611.1589的二级质谱如附图3中B所示，从二级质谱也证实确实存在与m/z 611.1589离子有146和162质量数差值的谱峰，该质量数差值分别对应脱氧己糖和己糖，说明二级质谱结果与质谱源内裂解结果一致。此外，与m/z 611.1589具有相同的保留时间，源内裂解还得到了精确质量数为m/z 303.0482离子，该离子在附图3中B的二级质谱上同样存在。用其精确质量数经METLIN数据库搜库得出22个候选化合物，质量偏差均为5ppm，仍难以确定其结构。将m/z303.0482离子进一步打碎，得到其多级质谱图，如附图3中C。将得到的多级质谱图与数据库中候选化合物的二级结构进行比较，该物质可能为槲皮素。将槲皮素标准样品进行质谱分析，其二级质谱结果见附图3中D，与附图3中C结果吻合。通过上述过程，可以确定该化合物为黄酮类代谢物槲皮素的己糖脱氧己糖结合物，即芸香苷。另外，我们尝试了用5V-130V梯度能量分别进行源内裂解对母离子依次打碎，尝试直接得到其黄酮苷元303.0482的碎片信息以直接对其定性。发现在较高能量下，并不能得到黄酮苷元的碎片，这可能是由于源内裂解过程不具有母离子针对性，不能充分利用Orbitrap捕集作用，灵敏度较低造成。因此，对植物代谢组中的糖苷类代谢物，首先应通过源内 裂解推断其含有的苷元，再进行多级打碎分析定性，是更加可靠和灵敏的定性方法。
附图4以磷酸丝氨酸和生物碱可替宁为例，给出了代谢物的源内裂解图及分子结构。从图中可知其含有特征子离子-磷酸离子和吡啶离子。采用精确分子量结合特征子离子鉴定出的植物叶片中的鉴定出的代谢物如附表3所示，主要为磷酸基团结合物及生物碱类。
本发明利用超高效液相色谱-高分辨质谱技术，对复杂植物代谢组进行分离和质谱检测，得到代谢物分子离子峰的精确质量数，利用源内裂解可得到代谢物的部分子结构信息，对快速、高效锁定候选代谢物提供了保证。根据代谢物结构特征，采用特征中性丢失及特征子离子等多种策略对植物样品代谢物进行筛选，扩大了代谢组的覆盖度。同时，源内裂解得到的分析结果同时兼具质量高分辨(分辨率设置为30000)和高灵敏度特点。本发明所用的高分辨Orbitrap质谱得到的二级质谱为低分辨，相比其低分辨的二级质谱，源内裂解更有利于代谢物的准确定性，操作方便快速，通量高，可实现代谢物的规模化定性。本发明以植物叶片为例，采用本方法实现了规模化的代谢组定性。说明本发明提出的规模化代谢组定性方法在实际样品分析中能得到很好的定性结果，表明了方法的可行性和可靠性。
尽管对本发明已作了详细的说明并印证了一些具体实例，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，作各种变化或修正是显然的。

Claims (8)

1.一种规模化植物代谢组定性方法，其特征在于：制备植物混合样品，对其采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用方法结合高分辨质谱源内裂解技术进行分析，对得到的质谱数据通过特征中性丢失、多个中性丢失、中性丢失结合多级质谱以及特征子离子识别方法，对植物代谢组中代谢物进行系统的规模化定性；所述代谢物中含有具有特征中性丢失或特征子离子的官能团；
所述代谢物为含有氨基、羧基、酰基、糖基、酚酸基、磺酸基、磷酸基、葡萄糖醛酸基、酚羟基、糖苷基团和生物碱中的一种或二种以上的代谢物；
超高效液相色谱-高分辨质谱联用方法的色谱条件为：采用BEH T3色谱柱，10 cm ×2.1 mm × 1.7 μm，流动相A相为体积百分比为0.1%甲酸/水，B相为乙腈；液相色谱采用线性梯度，0-2 min，2% B（体积含量），2-5 min线性升至4% B，5-13 min线性升至70% B，13-21min线性升至98% B并保持4 min，21-25.1 min线性恢复初始2% B；柱流量为0.3 mL/min，进样量为3 μL；进样器温度为10 ℃，柱温为40 ℃；质谱条件为：毛细管温度325 ℃，离子源电压正离子模式4.5 kV，负离子模式-4.0 kV，毛细管电压正离子模式49 V，负离子模式-40V；质谱扫描范围为m/z 50-1000 amu; 高分辨质谱扫描分辨率设置为30000。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：制备混合样品，对该样本在不同的质谱源内裂解电压下进行超高效液相色谱-高分辨质谱分析；原始数据经峰匹配后得到峰表，从峰表中得出含有氨基、羧基、酰基、糖基、酚酸基、磺酸基、磷酸基、葡萄糖醛酸基、酚羟基、糖苷基团和生物碱中的一种或二种以上的特征中性丢失或特征子离子的代谢物，对其进行质谱数据库检索，锁定代谢物类别，实现规模化定性。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：植物混合样品为待分析植物样品的均质混合物。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于：对混合样品采用不同的质谱源内裂解电压进行分析；质谱源内裂解电压以5V为步长，从0至45 V及0至-45 V；在正负离子模式下，源内诱导裂解电压分别设置为0，±5，±10，±15，±20，±25，±30，±35，±40和±45 V进行质谱扫描分析。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于：将混合样品在不同源内裂解电压下得到的原始数据进行峰匹配，得到峰表, 峰表中去除冗余的同位素及加合离子。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于：对混合样品在不同源内裂解电压下得到的峰表进行特征中性丢失筛选；对保留时间小于0.1 min范围内，具有符合氨基、羧基、酰基、糖基、酚酸基、磺酸基、磷酸基、葡萄糖醛酸基、酚羟基、糖苷基团特征中性丢失的特定质量数差值，且其质量数差值与特定中性丢失的质量数理论值之差小于0.002 Da的离子进行配对分析；该离子对即被认为是含有特定中性丢失的代谢物的母离子和其源内裂解产生的子离子。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于：对混合样品在不同质谱源内裂解电压下得到的峰表进行特征性子离子筛选；含有磷酸或生物碱官能团的代谢物经质谱源内裂解后，会产生H2PO4/PO3 m/z 96.9691/78.9585或C6H5N m/z 80.0500的子离子，该子离子可作为代谢物含有磷酸或生物碱官能团的定性依据。
8.根据权利要求2所述方法，其特征在于：将上述峰表中得到的含有氨基、羧基、酰基、糖基、酚酸基、磺酸基、磷酸基、葡萄糖醛酸基、酚羟基、糖苷基团和生物碱中的一种或二种以上的特征中性丢失或特征子离子的代谢物进行定性，用母离子的精确质量数并限定其含有单个特征中性丢失或多个中性丢失组合或中性丢失结合多级质谱或特征子离子方法，进行质谱数据库检索，数据库检索的质量误差范围设置为10 ppm。
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