CN107810926A - 万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及寄生蜂饲养领域，具体涉及万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法。包括步骤：种植寄主植物奶花豆；饲养寄主美洲斑潜蝇；在室温25℃下以含有30‑35头美洲斑潜蝇寄主幼虫的奶花豆苗叶片供万氏潜蝇姬小蜂雌蜂取食、产卵。该方法方便快捷，生产成本低，使万氏潜蝇姬小蜂能够实现大规模扩繁，从而在潜叶蝇类害虫危害严重的地区释放，可有效减少化学农药的使用，降低农药对环境的污染，保障食品安全，带来巨大的经济、生态和社会效益。

Description

万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法

技术领域

本发明涉及寄生蜂饲养领域，具体涉及万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法。

背景技术

潜叶蝇(agromyzid leafminers)是危害蔬菜、花卉等经济作物的一类世界性重要小型害虫，合理利用寄生蜂进行生物防治成为潜叶蝇类害虫的防控首选策略。

潜叶蝇的一种优势寄生蜂-豌豆潜蝇姬小蜂Diglyphus isaea(Walker)在饲养过程中容易出现后代性比失调(偏雄)导致连代持续饲养困难，生产成本高的问题，而万氏潜蝇姬小蜂是孤雌产雌繁殖模式，不需要与雄性交配即可产雌，后代全部为雌性，不存在种群难以扩繁的情况并且在实际应用中主要是雌蜂控制潜叶蝇类害虫，后代全为雌性可以有效减少生产成本。

万氏潜蝇姬小蜂Diglyphus wani Liu,Zhu&Yefremova sp.nov.是膜翅目(Hymenoptera)小蜂总科(Chalcidoidea)姬小蜂科(Eulophidae)潜蝇姬小蜂属(Diglyphus)的寄生蜂中，首例发现具有孤雌产雌特性的寄主取食型寄生蜂。可用于控制豌豆彩潜蝇Chromatomyia horticola(Goureau)、葱斑潜蝇Liriomyza chinensis(Kato)、南美斑潜蝇L.huidobrensis(Blanchard)、番茄斑潜蝇L.bryoniae(Kaltenbach)、美洲斑潜蝇L.strigata(Meigen)、三叶草斑潜蝇L.trifolii(Burgess)等潜叶蝇类害虫。

目前现有技术还未有关于万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养的报道，虽然豌豆潜蝇姬小蜂与万氏潜蝇姬小蜂均为潜蝇姬小蜂属，但对于豌豆潜蝇姬小蜂，其人工大规模繁殖需主要克服豌豆潜蝇姬小蜂个体小、生殖力弱、后代性比偏雄、难于连代持续饲养、且繁蜂成本较高问题；对于万氏潜蝇姬小蜂来说，寿命短、单日控害效率低、保种困难则为饲养过程中急需解决的问题。针对不同的寄生蜂生物学特性和饲养问题，不能依靠单一的饲养方法和技术直接运用到其他寄生蜂的饲养过程中，需要对不同寄生蜂采取特异性强的饲养方法和优化条件。

目前人工饲养寄生蜂存在的主要技术问题集中在饲养成本高、寄生蜂种群建立优化条件不同、饲养器具不方便使用、饲养方法重复性有待提高、种群快速扩繁方法的实现，以及充分发挥生防潜力的条件等。

发明内容

本发明的目的在于提供万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法。

根据本发明的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法包括以下步骤：

(1)种植寄主植物奶花豆；

(2)饲养寄主美洲斑潜蝇，以经步骤(1)种植获得的奶花豆饲喂美洲斑潜蝇；

(3)接种万氏潜蝇姬小蜂，其中每片叶片上包括30-35头美洲斑潜蝇寄主，在室温25℃下饲养万氏潜蝇姬小蜂。

根据本发明的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，选用“奶花豆-美洲斑潜蝇”的系统饲养万氏潜蝇姬小蜂，可以高效快速获得寄生蜂种群，并且寄主和寄主植物的培育也方便快捷，而豌豆彩潜蝇不适合作为万氏潜蝇姬小蜂的寄主幼虫。

根据本发明的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，首先在室内采用美洲斑潜蝇为寄主进行连代饲养发现该寄生蜂具有较强的寄主取食特性，在实验室适温25℃条件下，可以竞争替代芙新姬小蜂和豌豆潜蝇姬小蜂而成为优势种。由于在利用寄生蜂防治田间害虫的过程中，实际起作用的是雌蜂，而产雌孤雌生殖的寄生蜂全部是由雌蜂组成的，增加了寄生蜂的种群增值率和产卵寄生率，减少寄生蜂释放时的放蜂数量，降低了繁育和释放成本。

根据本发明的具体实施方式的万氏潜蝇姬小蜂的人工大规模饲养方法包括以下步骤：

(1)种植未被任何病虫害危害的健康清洁奶花豆苗；

(2)饲养寄主美洲斑潜蝇，美洲斑潜蝇2龄末-3龄初寄主幼虫为最佳龄期的寄主，该寄主幼虫在寄主植物叶片上分布相对均匀，且寄主密度方便控制。相比豌豆彩潜蝇和南美斑潜蝇为寄主，饲养更加方便快捷，危害奶花豆叶片的密度最大，并且鉴于奶花豆生长快，叶片大小适宜，存活率高，种植操作简单等特点，“奶花豆-美洲斑潜蝇”的“寄主植物-寄主”系统有利于扩繁万氏潜蝇姬小蜂；

(3)饲养万氏潜蝇姬小蜂

在养虫笼中利用含有美洲斑潜蝇2龄末3龄初寄主幼虫的奶花豆苗的两片真叶饲养万氏潜蝇姬小蜂，把定制的养虫笼(60×57×60cm)置于25℃，相对湿度为30-50％，光照时间L:D＝14h:10h的养虫房间中，然后在养虫笼中释放100头孤雌产雌的万氏潜蝇姬小蜂成蜂，待其产卵后的奶花豆叶片接近干枯，可将被寄生蜂处理过的含有美洲斑潜蝇的叶片剪下放入羽化笼，待寄生蜂羽化收集。

根据本发明的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，放入的美洲斑潜蝇的雌雄比例约为1:1，共400头。

根据本发明的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，不仅成本低而且生长周期短，在25℃条件下利用2龄末-3龄初的美洲斑潜蝇幼虫饲喂万氏潜蝇姬小蜂，从种植奶花豆苗到寄生蜂成蜂羽化，所需时间约为1个月，能够在较短时间内大规模扩繁寄生蜂种群，用于实验或者释放。

本发明的积极有益效果如下：

(1)本发明通过对万氏潜蝇姬小蜂发育历期、优势营养源和最佳温度适应范围等进行研究，发现万氏潜蝇姬小蜂成蜂具有寄主取食特性，所以确定寄主密度为30-35头/叶。该寄生蜂在22-26℃具有较强的控害潜力，适当补充20％葡萄糖水或20％蜂蜜水，均可显著延长寄生蜂的寿命和对美洲斑潜蝇的控害作用；

(2)本发明中万氏潜蝇姬小蜂成蜂在25℃条件下未成熟发育历期短仅为12.1天，种群增长速率快，能在短时间内进行寄生蜂大量繁殖；

(3)本发明的饲养方法简单易行，容易掌握。万氏潜蝇姬小蜂具有孤雌产雌特性，不需要交配即可产生大量雌蜂，极大地节约了寄生蜂的生产成本，提高生物防治效率和质量，并能在种群密度较低的时候快速建立稳定种群。

(4)根据本发明的饲养方法，万氏潜蝇姬小蜂因具有三种寄主致死行为，因此防控斑潜蝇的效果比仅单靠寄生致死的寄生蜂，防控效果增加3倍，有利于减少农药使用和农药污染，降低农民防治潜叶蝇害虫的成本，增大防控效果。

(5)本发明方法方便快捷，生产成本低，使万氏潜蝇姬小蜂能够实现大规模扩繁，从而在斑潜蝇危害严重的地区释放，可有效减少化学农药的使用，降低农药对环境的污染，保障食品安全，响应“绿色环保”的发展理念，同时带来巨大的经济、生态、社会效益。

具体实施方式

实施例1

万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法包括以下步骤：

(1)奶花豆植株作为寄主植物的选择：选择了英国红芸豆、奶花豆、莴笋、油菜、上海青、蚕豆、羽衣甘蓝、绿叶甘蓝、芥蓝、豌豆11种寄主植物，在适宜温湿度条件下饲养豌豆彩潜蝇，但通过比较，莴笋叶片用于室内饲养建立种群最有效，其次是油菜、上海青、芥蓝、英国红芸豆、奶花豆。但是在饲养过程中，莴笋每片叶片最多也仅仅有20头寄主幼虫的密度，并且莴笋、油菜、上海青、芥蓝、甘蓝的生长周期较长，通常需要约2个月才能达到可用状态，并且种植方法繁琐，苗株生产成本较高。另外，豌豆叶片获得的寄主幼虫密度小；在蚕豆上仅有产卵孔，偶有1-2条潜道；英国红芸豆和奶花豆生长周期短，但是每片叶片上寄主幼虫密度少于20头；羽衣甘蓝和绿叶甘蓝取食几乎没有，产卵孔也没，而最终选用“奶花豆-美洲斑潜蝇”的系统饲养万氏潜蝇姬小蜂可以高效快速获得寄生蜂种群，并且寄主和寄主植物的培育也方便快捷，成本低。

(2)美洲斑潜蝇的饲养：对于美洲斑潜蝇幼虫的饲养，要用2片真叶刚舒展开的菜豆苗作为食物。美洲斑潜蝇用养虫笼(长*宽*高＝76cm*76cm*60.5cm)饲养，并在养虫笼里面悬挂脱脂棉花条，在脱脂棉花条上每天喷20％蜂蜜水或20％葡萄糖溶液，用来延长美洲斑潜蝇的寿命和增大其繁殖力。

(3)万氏潜蝇姬小蜂的饲养：将万氏潜蝇姬小蜂放入已发育到2龄末至3龄初的美洲斑潜蝇水培苗养虫笼中，供其取食和产卵，同时在养虫笼顶部的棉条上喷20％蜂蜜水和清水，其中每片寄主植物上万氏潜蝇姬小蜂的密度为1-2对，每天更换新水培含美洲斑潜蝇幼虫的寄主植物叶片，将已被寄生蜂寄生的植物叶片放入室内另一个养虫笼中，并标记为出蜂笼，待其羽化后连代饲养。供试万氏潜蝇姬小蜂在人工气候箱中饲养(温度T＝25±1℃，相对湿度RH＝30±5％，光照强度60％，光周期L:D＝14h:10h)。在人工气候培养箱中用帐篷式养虫笼饲养潜蝇姬小蜂，每天提供有美洲斑潜蝇2龄末-3龄初的寄主幼虫取食的奶花豆水培苗作为万氏潜蝇姬小蜂的食物，一般6-7天后待叶片萎蔫，就可以把被万氏潜蝇姬小蜂寄生美洲斑潜蝇幼虫的叶片剪下来。放入另一个人工气候培养箱(温度T＝25±1℃，相对湿度RH＝30±5％，光照强度60％，光周期L:D＝14h:10h)中待其羽化。

万氏潜蝇姬小蜂未成熟期发育阶段主要分为卵期、幼虫期和蛹期。选用含20头左右的2龄末3龄初美洲斑潜蝇的奶花豆真叶制作培养皿(直径9cm，高1.5cm)用1％(琼脂/水的比例是1g/100m)琼脂保湿叶片，将培养皿用封口膜覆盖扎孔保持空气流通。每个培养皿分别放入用20％蜂蜜水饲喂2d的潜蝇姬小蜂孤雌品系雌蜂5-10头进行产卵，3h后移除寄生蜂(9:00-12:00)，每间隔12h在体视显微镜(Olympus SZ51；型号SZ2-ST；Tokyo,Japan)下观察发育情况，标记叶片上的卵粒，待其孵化，直到寄生蜂羽化，仅预蛹期每隔6h记录一次。记录35头雌蜂的卵、幼虫、预蛹、蛹等各未成熟期阶段的发育历期。然后，提供寄主幼虫处理(n＝32)，即培养皿中事先放入含30-35头2龄末-3龄初美洲斑潜蝇幼虫叶片并按顺序标记，每隔24h更换新鲜的寄主食物，48h后用荧光体式显微镜(Olympus SZX-16)对雌蜂处理过的寄主幼虫进行解剖检查，记录每天产卵数以及寿命，直至寄生蜂死亡。以上实验均在人工气候箱(T＝25±1℃，RH＝30±5％，L:D＝14:10)条件下进行。最后利用TIMING-MSChart软件(Chi,2015)分析寄生蜂的生命表数据来对其种群增长作出预测。

表1美洲斑潜蝇上的万氏潜蝇姬小蜂发育历期

表2饲养万氏潜蝇姬小蜂的周期

饲养流程	时间(天)
		培养寄主植物奶花豆	10
得到2龄末3龄初的美洲斑潜蝇	3-4
		接种万氏潜蝇姬小蜂	2-3
收集已寄生的奶花豆叶片放于出蜂笼	12
		收集羽化的万氏潜蝇姬小蜂成蜂	2-3

在分析种群增长时，寄生蜂初始量为设定10粒卵来模拟60d的种群增长情况。可以得到在该种群理想条件下预计种群数量可以达到至少4,907,475个个体，雌成蜂数量为318,553头，可总致死寄主幼虫约40,774,784头。

实施例2不同温度下万氏潜蝇姬小蜂对美洲斑潜蝇的控害潜力

提前制备好含有30-35头2龄末-3龄初的美洲斑潜蝇寄主幼虫的奶花豆叶片培养皿。寄主食物培养皿制作：1)挑选含有30头左右2龄末3龄初美洲斑潜蝇幼虫的奶花豆叶片；2)以1.2:100的比例制作琼脂(Coolaber^TM，Cat#CA1331-1KG)；3)在培养皿里面倒入琼脂，把挑选好的含有30头左右2龄末-3龄初期美洲斑潜蝇幼虫的叶片剪下，叶柄插在琼脂中，叶片轻放在琼脂上；4)用封口膜进行封口，并用解剖针在封口膜上扎孔；5)制作好的培养皿放在人工气候培养箱(温度T＝25±1℃，相对湿度RH＝30±5％，光照周期L:D＝14:10)。

选取25℃人工气候箱中早上8:00-10:00初羽化的万氏潜蝇姬小蜂，吸入到提前制作好的培养皿中，每个培养皿放一头雌蜂，然后分别放在设置好的相应的4个温度梯度(18℃，22℃，26℃，30℃)下的4个人工气候箱(相对湿度RH＝50±5％，光照周期L:D＝14h:10h，光照强度60％)。处理24h后把万氏潜蝇姬小蜂吸出来换到新的含有30-35头2龄末-3龄初的美洲斑潜蝇的培养皿中继续处理，而前一天处理的培养皿待48h后进行镜检。对于万氏潜蝇姬小蜂3种致死行为的判定，具体区别是：取食寄主幼虫使得虫体稍有干瘪，表皮较松弛，无光泽，用解剖针轻挑可以发现，表皮不紧绷，虫体易变形。但是直接致死的寄主幼虫虫体较僵硬和饱满，表皮没有出现干瘪，并且表皮比较有光泽。用解剖针轻挑时，可以发现虫体不易变形，有弹性，并且容易粘在解剖针上。万氏潜蝇姬小蜂产卵是产在寄主幼虫体表或虫体附近。每天更换寄主食物和非寄主食物直至万氏潜蝇姬小蜂自然死亡，记录万氏潜蝇姬小蜂的三种寄主致死行为和寿命。所有处理的有效重复要保证在20-25个左右。

如表3结果所示，可以得出该蜂适宜温度范围较广，比较适宜较低温度。在18℃下寄生蜂寿命最长，该温度适合在饲养过程中用于保种，该温度下因为寿命的延长使得一生杀死寄主幼虫数量最多，但是每天杀死寄主数量在温度为26℃时，达到最大为单日平均杀死寄主幼虫18.6头，单日产平均产卵数为3.1粒，在22℃时单日平均产卵数为3.8粒，说明22℃有利于提高单日控害效率，因此综合考虑22-26℃适合用于饲养万氏潜蝇姬小蜂。另外，在18℃、22℃、26℃和30℃条件下，寄主取食致死的数量占总寄主致死数的比例均在70％以上，说明在评价寄生蜂的防控潜力时，单一考虑寄生蜂的产卵寄生能力是不准确的，寄生蜂的非繁殖型杀死寄主幼虫的行为(取食寄主行为和不取食也不产卵寄生仅直接杀死寄主行为)在杀死寄主幼虫中所占比例大，要综合考虑三种杀死寄主的方式才能准确评价寄生蜂控害效果。

表3不同温度下万氏潜蝇姬小蜂对美洲斑潜蝇的控害潜力

实例3不同营养下万氏潜蝇姬小蜂对美洲斑潜蝇的控害潜力

从人工气候培养箱(温度T＝25±1℃，相对湿度RH＝50±5％，光照周期L:D＝14:10)中的养蜂笼中挑选早上8:00-10：00初羽化的万氏潜蝇姬小蜂。分别提供4个处理：20％葡萄糖+寄主幼虫，20％蜂蜜水(洋槐蜂蜜)+寄主幼虫，20％葡萄糖+10％酵母+寄主幼虫，蒸馏水+寄主幼虫，提供的寄主幼虫均为30头左右2龄末期-3龄初美洲斑潜蝇幼虫作为食物；与此同时还需要检测仅提供20％葡萄糖，20％蜂蜜水，20％葡萄糖+10％酵母，蒸馏水的寄生蜂寿命，然后全部放在人工气候箱(温度T＝25±1℃，相对湿度RH＝50±5％，光照周期L:D＝14:10)中进行不同营养物质对万氏潜蝇姬小蜂控害潜力影响的实验。具体操作为：提供含有30头左右的2龄末-3龄初美洲斑潜蝇幼虫并分别加入蘸有20％葡萄糖、20％蜂蜜水、20％葡萄糖+10％酵母、清水的棉球的培养皿，每个培养皿放入1头万氏潜蝇姬小蜂处理24h(4个处理需要同期做，每次增加重复数时也需要尽可能同时添加4个处理的重复数)。每天早上8:00为寄生蜂更换对应的食物(人工气候箱8：00开灯，必须在开灯之前完成食物更换)，直至寄生蜂死亡，每隔48h对培养皿进行镜检，记录万氏潜蝇姬小蜂的三种寄主致死行为和寿命，所有处理的有效重复数保证在25个以上。

试剂配制：

(1)20％葡萄糖：称取20g葡萄糖，加入100ml蒸馏水，搅拌待用。配制好的溶液放入4℃冰箱保存；

(2)20％蜂蜜水：称取20g洋槐蜂蜜，加入100ml蒸馏水，搅拌震荡。(一般一次性配制200ml，用250ml试剂瓶装然后4℃保存)；

(3)20％葡萄糖+10％酵母粉：先称取20g葡萄糖，加入100ml蒸馏水，然后再称取10g酵母粉加入已经配好的20％葡萄糖溶液中，搅拌均匀。同样4℃保存。

结果如表4所示，仅提供20％葡萄糖、20％蜂蜜水和10％酵母+20％葡萄糖时可以显著延长寄生蜂的寿命，分别是仅提供蒸馏水时寄生蜂寿命的12.9、12.5和15.2倍。当同时提供寄主食物和这些非寄主食物(20％葡萄糖、20％蜂蜜水和10％酵母+20％葡萄糖)时，寄主幼虫+20％葡萄糖处理的寄生蜂寿命最长，产卵数最大，一生杀死寄主幼虫数量最多为354.9头，而对芙新姬小蜂补充10％葡萄糖+寄主幼虫，芙新姬小蜂一生杀死寄主幼虫数为204.6头，万氏潜蝇姬小蜂的控害效果更好。与芙新姬小蜂在26℃下取食寄主幼虫和寄主幼虫+20％蜂蜜后总致死寄主量为113.8头和221.6头相比，万氏潜蝇姬小蜂提供寄主幼虫和寄主幼虫+20％蜂蜜水条件下总寄主致死量更大，说明万氏潜蝇姬小蜂作为防控潜叶蝇害虫的天敌，相比其他潜叶蝇天敌寄生蜂具有更加高效的控害潜力和良好的应用前景。

表4不同营养下万氏潜蝇姬小蜂对美洲斑潜蝇的控害潜力

万氏潜蝇姬小蜂的饲养提供寄主幼虫时补充20％葡萄糖或者20％蜂蜜水时可以显著增强其生防潜力，不仅延长其寿命还可以增加其繁殖力。利用10％酵母+20％葡萄糖保种时可以最大程度的延长该寄生蜂的寿命；本发明结合温度条件，发现万氏潜蝇姬小蜂在22-26℃温度范围内和提供20％葡萄糖和寄主(30-35头)的条件下可达到最佳防控美洲斑潜蝇的效果。

Claims (8)

1.万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)种植寄主植物奶花豆；

(2)饲养寄主为美洲斑潜蝇，以奶花豆苗饲喂美洲斑潜蝇，得到适龄的美洲斑潜蝇寄主幼虫用于饲喂寄生蜂；

(3)饲养万氏潜蝇姬小蜂，在室温25℃下以含有30-35头美洲斑潜蝇寄主幼虫的奶花豆苗叶片供万氏潜蝇姬小蜂雌蜂取食和产卵。

2.根据权利要求1所述的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，以两片真叶完全展开的奶花豆饲喂美洲斑潜蝇。

3.根据权利要求1所述的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，为美洲斑潜蝇补充20％蜂蜜水或20％葡萄糖水。

4.根据权利要求1所述的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，接入的美洲斑潜蝇密度控制在每片叶片上4-5头，每天更换2-3次寄主植株，控制每片叶片上平均产卵30-35粒。

5.根据权利要求1所述的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，每天向万氏潜蝇姬小蜂补充含有适龄的美洲斑潜蝇寄主幼虫的奶花豆苗。

6.根据权利要求1所述的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，其特征在于，在步骤(1)中，奶花豆种子要选取饱满的种子，并且利用跖石：营养土＝1:1.5培育幼苗，育苗温度为25-28℃，相对湿度为30-50％，光照时间L:D＝14:10。

7.根据权利要求1所述的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，其特征在于，在步骤(3)中，提供的寄主美洲斑潜蝇幼虫虫龄为2龄末-3龄初，并在提供寄主幼虫的基础上添加20％蜂蜜水或20％葡萄糖水。

8.根据权利要求1所述的万氏潜蝇姬小蜂的人工规模化饲养方法，其特征在于，在步骤(3)中，饲养万氏潜蝇姬小蜂的相对湿度为30-50％，光照时间L:D＝14:10。