CN107805636B - 一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用 - Google Patents

一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107805636B
CN107805636B CN201710959278.5A CN201710959278A CN107805636B CN 107805636 B CN107805636 B CN 107805636B CN 201710959278 A CN201710959278 A CN 201710959278A CN 107805636 B CN107805636 B CN 107805636B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gpc
3dna
tri
phosphate
antisense strand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710959278.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107805636A (zh
Inventor
韩秋菊
张彩
于馨
邵利伟
张建
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN201710959278.5A priority Critical patent/CN107805636B/zh
Publication of CN107805636A publication Critical patent/CN107805636A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107805636B publication Critical patent/CN107805636B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种双功能5′‑tri‑phosphate siGPC‑3及制备方法与应用。是含有三磷酸基团的GPC‑3特异性siRNA，正义链由5′到3′的序列为CCUUGCAGAACUGGCCUAU，其中，5′端修饰有三磷酸基团，反义链由5′到3′的序列为AUAGGCCAGUUCUGCAAGG，反义链的5′端修饰有三磷酸基团。兼具基因沉默功能和RIG‑I激活功能。

Description

一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及RNA干扰(RNAi)技术治疗领域，具体涉及一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用。
背景技术
肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康。肝癌的治疗手段主要包括肝移植、肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等。但是，由于肝癌特别是肝细胞性肝癌(HCC)早期易发生转移以及治疗后易复发，使得采用上述治疗手段治疗肝细胞性肝癌的效果不明显，因此，寻找一个可以准确判断预后的指标和有效的肝癌治疗靶点具有重要意义。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)是近年来受到关注的靶点之一。该分子在肝癌组织中呈现特异性高表达，参与肝癌细胞的增殖、凋亡和迁移过程，与肝癌的发生、发展密切相关。
RNAi技术可作为技术手段用于新基因、新靶点的研究，并且还广泛应用于抗病毒和抗肿瘤的基础研究领域。无论是细胞水平，还是动物模型，基于RNAi技术的siRNA分子均取得明显的治疗效果。
目前为止，以GPC3可作为肝癌治疗的靶点利用RNAi技术获得兼具基因沉默功能和RIG-I激活功能的siRNA未见报道。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3，兼具基因沉默功能和RIG-I激活功能。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3，是含有三磷酸基团的GPC-3特异性siRNA，正义链由5′到3′的序列为CCUUGCAGAACUGGCCUAU，其中，5′端修饰有三磷酸基团，反义链由5′到3′的序列为AUAGGCCAGUUCUGCAAGG，反义链的5′端修饰有三磷酸基团。
本发明对靶向GPC3的siRNA进行设计，并在靶向GPC3的siRNA的5′端修饰三磷酸基团，5′端的三磷酸基团可被胞内天然免疫受体RIG-I识别，进而激活下游干扰素信号通路，因而使得制备的双功能5′-tri-phosphate siGPC-3具基因沉默功能和RIG-I激活功能。
本发明的目的之二是提供一种制备上述双功能5′-tri-phosphate siGPC-3的DNA模板，包括GPC-3DNA正义链1、GPC-3DNA反义链2、GPC-3DNA正义链3、GPC-3DNA反义链4，所述GPC-3DNA正义链1与GPC-3DNA反义链2配对，所述GPC-3DNA正义链3与GPC-3
DNA反义链4配对；
所述GPC-3DNA正义链1由5′到3′的序列为：
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCCTTGCAGAACTGGCCTATTT，
所述GPC-3DNA反义链2由5′到3′的序列为：
AAATAGGCCAGTTCTGCAAGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC，
所述GPC-3DNA正义链3由5′到3′的序列为：
AACCTTGCAGAACTGGCCTATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC，
所述GPC-3DNA反义链4由5′到3′的序列为：
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGATAGGCCAGTTCTGCAAGGTT。
本发明的目的之三是提供一种制备上述双功能5′-tri-phosphate siGPC-3的制备方法，将上述DNA模板中的GPC-3DNA正义链1、GPC-3DNA反义链2、GPC-3DNA正义链3、GPC-3DNA反义链4进行退火反应分别制备两种双链DNA，将两种双链DNA配置成RNA体外转录反应液进行体外转录反应，将体外转录反应后的产品经过纯化即得双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3。
本发明的目的之四是提供一种上述双功能5′-tri-phosphate siGPC-3在制备治疗肝细胞性肝癌药物中的应用。
本发明的目的之五是提供一种治疗肿瘤的药物组合物，包括上述双功能5′-tri-phosphate siGPC-3。
本发明的有益效果为：
1.将本发明制备的双功能5′-tri-phosphate siGPC3转染肝癌细胞Hep1-6细胞后，发现均能够下调肝癌细胞GPC-3基因的表达，并且显著抑制肝癌细胞增殖，促进其凋亡。在荷瘤小鼠模型中，5′-tri-phosphate siGPC3可抑制Hep1-6细胞生长，并活化体内抗肿瘤免疫应答。
2.本发明的体外转录的5′-tri-phosphate siGPC3，转染Hep1-6细胞后，RIG-I通路可被显著激活并产生干扰素。可以作为抗肝癌的药物应用。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为5′-tri-phosphate siGPC3在Hep1-6细胞中的沉默作用检测，其中，A代表mRNA水平，B代表蛋白水平；
图2为5′-tri-phosphate siGPC3能抑制肝癌细胞的增殖，其中，A为抑制率，B为Ki67的mRNA水平，C图为Ki67蛋白表达；
图3为5′-tri-phosphate siGPC3能促进肝癌细胞的凋亡，其中，A为凋亡比例图，B为统计图，C图为凋亡相关蛋白表达；
图4为5′-tri-phosphate siGPC3能激活肝癌细胞RIG-I信号通路，其中，A为IFN-α/β的mRNA水平，B为IFN-α/β的蛋白水平；
图5为5′-tri-phosphate siGPC3体内抑瘤效果，其中，A为路线示意图，B肿瘤体积；
图6为5′-tri-phosphate siGPC3促进体内抗肿瘤免疫应答，其中，A为肿瘤组织CD4+T细胞比例和活化，B为肿瘤组织CD8+T细胞比例和活化，C为肿瘤组织内NK细胞比例和活化。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，以GPC3可作为肝癌治疗的靶点利用RNAi技术获得兼具基因沉默功能和RIG-I激活功能的siRNA未见报道，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用。
本申请的一种典型实施方式，提供了一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3，是含有三磷酸基团的GPC-3特异性siRNA，正义链由5′到3′的序列为CCUUGCAGAACUGGCCUAU(SEQ ID NO.1)，其中，5′端修饰有三磷酸基团，反义链由5′到3′的序列为AUAGGCCAGUUCUGCAAGG(SEQ ID NO.2)，反义链的5′端修饰有三磷酸基团。
本发明对靶向GPC3的siRNA进行设计，并在靶向GPC3的siRNA的5′端修饰三磷酸基团，5′端的三磷酸基团可被胞内天然免疫受体RIG-I识别，进而激活下游干扰素信号通路，因而使得制备的双功能5′-tri-phosphate siGPC-3具基因沉默功能和RIG-I激活功能。
优选的，作用的靶基因由5′到3′的序列为CCTTGCAGAACTGGCCTAT(SEQ ID NO.3)。
本申请的另一种实施方式，提供了一种制备上述双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3的DNA模板，包括GPC-3DNA正义链1、GPC-3DNA反义链2、GPC-3DNA正义链3、GPC-3DNA反义链4，所述GPC-3DNA正义链1与GPC-3DNA反义链2配对，所述GPC-3DNA正义链3与GPC-3DNA反义链4配对；
所述GPC-3DNA正义链1由5′到3′的序列为：
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCCTTGCAGAACTGGCCTATTT(SEQ ID NO.4)，
所述GPC-3DNA反义链2由5′到3′的序列为：
AAATAGGCCAGTTCTGCAAGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC(SEQ ID NO.5)，
所述GPC-3DNA正义链3由5′到3′的序列为：
AACCTTGCAGAACTGGCCTATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC(SEQ ID NO.6)，
所述GPC-3DNA反义链4由5′到3′的序列为：
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGATAGGCCAGTTCTGCAAGGTT(SEQ ID NO.7)。
本申请的第三种实施方式，提供了一种制备上述双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3的制备方法，将上述DNA模板中的GPC-3DNA正义链1、GPC-3DNA反义链2、GPC-3DNA正义链3、GPC-3DNA反义链4进行退火反应分别制备两种双链DNA，将两种双链DNA配置成RNA体外转录反应液进行体外转录反应，将体外转录反应后的产品经过纯化即得双功能5′-tri-phosphate siGPC-3。
优选的，所述退火反应的步骤为：将配对的GPC-3DNA正义链和GPC-3DNA反义链配置成退火反应液，将所述退火反应液置于PCR扩增仪处理。在PCR扩增仪的处理步骤为95℃处理2分钟后，经45分钟冷却至25℃，然后在25℃保持10分钟。
进一步优选的，所述退火反应液中含有转录缓冲液和DEPC水。DEPC水是指用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水(超纯水)。
优选的，所述RNA体外转录反应液中包含RNA酶抑制剂、T7RNA聚合酶。
优选的，体外转录反应的条件为：42±1℃反应16±1h。
优选的，所述纯化的步骤为，对体外转录反应后液体中进行萃取，将萃取后获得的水层进行洗涤、离心。
进一步优选的，所述萃取采用的萃取剂为水饱和的苯酚、氯仿与异戊醇的混合液。更进一步优选的，水饱和的苯酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1。
进一步优选的，向萃取后的水层加入醋酸钠和99.5％(体积)的乙醇，静置后离心，去除上清液后加入75％(体积)的乙醇，静置后离心去除上清液，加入DEPC水即可获得双功能5′-tri-phosphate siGPC-3。
本申请的第四种实施方式，提供了一种上述双功能5′-tri-phosphate siGPC-3在制备治疗肝细胞性肝癌药物中的应用。
本申请的第五种实施方式，提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，包括上述双功能5′-tri-phosphate siGPC-3。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。
靶向GPC3的siRNA的设计
Pubmed检索GPC3基因序列，设计针对该基因的特异性沉默RNA，用Ambion siRNATarget Finder在线软件进行设计，设定相关参数包括siRNA的长度为19个碱基序列；GC比例在35-50之间。将潜在的序列利用BLAST进行基因数据库的比较，排除和其他编码序列同源的序列。
5′-tri-phosphate siRNA的制备过程
(1)合成附带T7promoter的靶向GPC3的siRNA序列相对应的单链DNA模板序列见表1。
表1用于体外转录的DNA模板
Name Type Sequence 5′–>3
GPC3-1-sense 1 DNA GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCCTTGCAGAACTGGCCTATTT
GPC3-1-antisense 2 DNA AAATAGGCCAGTTCTGCAAGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC
GPC3-1-sense 3 DNA AACCTTGCAGAACTGGCCTATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC
GPC3-1-antisense 4 DNA GATCACTAATACGACTCACTATAGGGATAGGCCAGTTCTGCAAGGTT
(2)双链Oligo DNA的制备(体外转录试剂盒购自Takara公司)。
①将合成的单链Oligo DNA用DEPC水溶解，配制成100pmol/μL的DNA溶液。
②按下列组份配制Oligo DNA退火反应液，如表2所示；
表2退火反应液体系
成分名称 体积(μL)
10×Annealing Buffer 2
100pmol/μL Oligo A* 2
100pmol/μL Oligo B* 2
DEPC水 14
*A、B必须配对，具体配对情况如下：
Oligo-1(GPC3-1-sense 1)和Oligo-2(GPC3-1-antisense 2)；Oligo-3(GPC3-1-sense 3)和Oligo-4(GPC3-1-antisense 4)；
将上述Oligo DNA退火反应液置于PCR扩增仪上，95℃处理2分钟后，经45分钟冷却至25℃，然后在25℃保持10分钟。此时一对单链Oligo DNA便经退火形成双链Oligo DNA，双链Oligo DNA的浓度为：10pmol/μL。进行体外转录实验时应将本溶液稀释(使用DEPC处理水)成4pmol/μL后使用。
(3)体外转录反应
①按下列组份配制RNA体外转录反应液，如表3所示：
表3体外转录体系
成分名称 体积(μL)
10×Transcription Buffer 2
ATP Solution 2
GTP Solution 2
CTP Solution 2
UTP Solution 2
RNase Inhibitor 0.5
T7RNA Polymerase 2
RNase free dH2O 5.5
4pmol/μl双链Oligo DNA溶液(Oligo-1/-2)* 1
4pmol/μl双链Oligo DNA溶液(Oligo-3/-4)* 1
合计 20
②将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，42℃反应16小时。
(4)5′-tri-phosphate的纯化
①向上述反应液中加入水饱和的酸性苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，上下充分倒置混合后室温，10000rpm，离心5分钟。
②将上层(水层)移至另一新的1.5mL离心管中，加入等量的5M的醋酸钠(pH5.6)和4倍量的99.5％的乙醇。
③室温静置5分钟后，4℃,12000rpm离心10分钟。
④除去上清液后加入1mL75％的乙醇，4℃，12000rpm离心5分钟
⑤除去上清液，轻微干燥后加入50μL的DEPC水溶解沉淀，即为5′-tri-phosphatesiGPC3。
⑥取1μL用DEPC水稀释10倍，其中2μL用于测定OD260nm值，剩余的8μL进行4％的琼脂糖凝胶电泳确认RNA纯度，条带位置在21bp，并无杂带。
⑦根据测定的浓度(浓度为0.096nmol/l/μL)，将上述溶液稀释为20pmol/μL溶液，进行RNA干扰实验，检测结果如图1～6所示。
上述实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规实验方法，上述实验试剂均为市售产品。
1.5′-tri-phosphate siGPC3(简称3p-siGPC-3)在Hep1-6细胞中的沉默作用检测
以Hep1-6肝癌细胞作为研究对象，使用lipofectamin 2000(购自invitrogen)进行体外转录3p-siRNA的转染，转染24h或48h后，检测GPC-3基因或蛋白表达水平。如图2A所示(横坐标分别代表siRNA、3p-siRNA不同的处理组，纵坐标代表以Scramble组为1，其他实验组的相对诱导倍数)。并且，与对照组相比，siGPC-3和3p-siGPC-3组蛋白表达均显著降低，并且3p-siGPC3组下降更为显著。这一结果表明，较化学合成siRNA相比，5′-tri-phosphate siGPC3具有更为显著的沉默效果。
2.3p-siGPC-3能抑制肝癌细胞的增殖
转染3p-siGPC-3后，检测Hep1-6细胞增殖水平以及增殖相关基因Ki67的表达。MTT实验结果表明，与Scramble组相比，转染3p-siGPC-3后，Hep1-6细胞增殖能力受到显著抑制(图2A)。进一步研究观察，与对照组相比，siGPC-3和3p-siGPC-3组ki67基因水平显著降低，且3p-siGPC-3组效果最为明显(图2B)。利用免疫荧光检测Ki67的蛋白水平也观察到类似的现象(图2C)。这一结果表明，3p-siGPC-3能抑制肝癌细胞的增殖。
3.3p-siGPC-3能促进肝癌细胞的凋亡
接下来，检测3p-siGPC-3对肝癌细胞凋亡的影响。如图3A&B所示，与对照组相比，siGPC-3和3p-siGPC-3组凋亡比例显著增加，且3p-siGPC-3组凋亡水平更为显著。进一步研究观察，凋亡指标Caspase3表达明显升高，而抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-XL表达显著降低(图3C)。这一结果表明，3p-siGPC-3沉默靶基因后可显著促进肝癌细胞的凋亡。
4.3p-siGPC-3能激活肝癌细胞RIG-I信号通路
RIG-I活化后可诱导I型干扰素的产生，进一步观察了3p-siGPC-3能否诱导干扰素信号通路。如图4A所示，与对照组相比，3p-siGPC-3可诱导IFN-α、IFN-β基因mRNA水平，而siGPC-3化学合成组对IFN-α/β表达表达并无显著影响。ELISA进一步发现，3p-siGPC-3可促进IFN-α/β的分泌，这与基因水平的结果是一致的(图4B)。以上结果表明，3p-siGPC-3中的三磷酸基团对于RIG-I信号通路的活化和干扰素的产生是必需的。
5.3p-siGPC-3在小鼠移植肿瘤模型发挥显著抑瘤作用
进一步观察了3p-siGPC-3的体内抗肿瘤效果。首先，建立移植肿瘤模型，将1×106Hep1-6细胞皮下接种到C57BL/6小鼠，10天后，瘤内注射不同类型的RNA，两周后处死小鼠，观察各组小鼠肿瘤体积(图5A)。发现，与对照组相比，3p-siGPC-3治疗后，肿瘤体积显著降低(结果5B)。这一结果表明，3p-siGPC-3能够在小鼠移植肿瘤模型中发挥抗肿瘤效果。
6.3p-siGPC-3促进体内抗肿瘤免疫应答
观察到3p-siGPC-3能够在体外细胞模型和体内移植肿瘤模型中发挥抗肿瘤作用后，进一步观察3p-siGPC-3对抗肿瘤免疫应答的影响。分离不同处理组肿瘤的单个核细胞，对不同的免疫细胞亚群的比例和活化状态进行了检测。结果发现，与对照组相比，3p-siGPC-3处理后，肿瘤浸润CD4+T细胞比例和CD69阳性比例均显著升高(图6A)。并且对肿瘤浸润部位CD8+T细胞和NK细胞的比例以及活化进行检测，也观察到了同样的现象(图6B&6C)。这一结果表明，3p-siGPC-3沉默靶基因后，不仅在体外模型中活化RIG-I信号通路，还可显著促进体内抗肿瘤免疫应答。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用
<130> 2017
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccuugcagaa cuggccuau 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
auaggccagu ucugcaagg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 肝癌细胞mRNA
<400> 3
ccttgcagaa ctggcctat 19
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatcactaat acgactcact atagggcctt gcagaactgg cctattt 47
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaataggcca gttctgcaag gccctatagt gagtcgtatt agtgatc 47
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaataggcca gttctgcaag gccctatagt gagtcgtatt agtgatc 47
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gatcactaat acgactcact atagggatag gccagttctg caaggtt 47

Claims (8)

1.一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3，其特征是，是含有三磷酸基团的GPC-3特异性siRNA，正义链由5′到3′的序列为CCUUGCAGAACUGGCCUAU，其中，5′端修饰有三磷酸基团，反义链由5′到3′的序列为AUAGGCCAGUUCUGCAAGG，反义链的5′端修饰有三磷酸基团；作用的靶基因由5′到3′的序列为CCTTGCAGAACTGGCCTAT。
2.一种制备权利要求1所述的双功能5′-tri-phosphate siGPC-3的制备方法，其特征是，制备所述双功能5′-tri-phosphate siGPC-3的DNA模板包括GPC-3DNA正义链1、GPC-3DNA反义链2、GPC-3DNA正义链3、GPC-3DNA反义链4，所述GPC-3DNA正义链1与GPC-3DNA反义链2配对，所述GPC-3DNA正义链3与GPC-3DNA反义链4配对；
所述GPC-3DNA正义链1由5′到3′的序列为：
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCCTTGCAGAACTGGCCTATTT，
所述GPC-3DNA反义链2由5′到3′的序列为：
AAATAGGCCAGTTCTGCAAGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC，
所述GPC-3DNA正义链3由5′到3′的序列为：
AACCTTGCAGAACTGGCCTATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC，
所述GPC-3DNA反义链4由5′到3′的序列为：
GATCACTAATACGACTCACTATAGGGATAGGCCAGTTCTGCAAGGTT；
将DNA模板中的GPC-3DNA正义链1、GPC-3DNA反义链2、GPC-3DNA正义链3、GPC-3DNA反义链4进行退火反应分别制备两种双链DNA，将两种双链DNA配置成RNA体外转录反应液进行体外转录反应，将体外转录反应后的产品经过纯化即得双功能5′-tri-phosphate siGPC-3。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述退火反应的步骤为：将配对的GPC-3DNA正义链和GPC-3DNA反义链配置成退火反应液，将所述退火反应液置于PCR扩增仪处理。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，体外转录反应的条件为：42±1℃反应16±1h。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述纯化的步骤为，对体外转录反应后液体中进行萃取，将萃取后获得的水层进行洗涤、离心。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述萃取采用的萃取剂为水饱和的苯酚、氯仿与异戊醇的混合液；
或，向萃取后的水层加入醋酸钠和体积分数为99.5％的乙醇，静置后离心，去除上清液后加入体积分数为75％的乙醇，静置后离心去除上清液，加入DEPC水即可获得双功能5′-tri-phosphate siGPC-3。
7.一种权利要求1所述的双功能5′-tri-phosphate siGPC-3在制备治疗肝细胞性肝癌药物中的应用。
8.一种包括权利要求1所述的双功能5′-tri-phosphate siGPC-3的治疗肿瘤的药物组合物。
CN201710959278.5A 2017-10-16 2017-10-16 一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用 Active CN107805636B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710959278.5A CN107805636B (zh) 2017-10-16 2017-10-16 一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710959278.5A CN107805636B (zh) 2017-10-16 2017-10-16 一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107805636A CN107805636A (zh) 2018-03-16
CN107805636B true CN107805636B (zh) 2023-05-26

Family

ID=61584149

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710959278.5A Active CN107805636B (zh) 2017-10-16 2017-10-16 一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107805636B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116836973A (zh) * 2023-06-20 2023-10-03 江苏申基生物科技有限公司 一种5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974529A (zh) * 2010-09-21 2011-02-16 魏继武 含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA及其应用
CN102321652A (zh) * 2011-06-29 2012-01-18 山东大学 免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010113507A1 (en) * 2009-04-02 2010-10-07 Oncotherapy Science, Inc. Double-stranded molecule inhibiting the expression of gpc3

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974529A (zh) * 2010-09-21 2011-02-16 魏继武 含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA及其应用
CN102321652A (zh) * 2011-06-29 2012-01-18 山东大学 免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107805636A (zh) 2018-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Soheilyfar et al. In vivo and in vitro impact of miR-31 and miR-143 on the suppression of metastasis and invasion in breast cancer
Gailhouste et al. miR‐148a plays a pivotal role in the liver by promoting the hepatospecific phenotype and suppressing the invasiveness of transformed cells
Wu et al. miR-17-5p promotes proliferation by targeting SOCS6 in gastric cancer cells
Lang et al. MiR-124 suppresses cell proliferation in hepatocellular carcinoma by targeting PIK3CA
Shi et al. miR‐125b promotes growth of prostate cancer xenograft tumor through targeting pro‐apoptotic genes
Won et al. MicroRNA-199b-5p is involved in the Notch signaling pathway in osteosarcoma
Lu et al. MicroRNA-124 suppresses growth of human hepatocellular carcinoma by targeting STAT3
Kong et al. RUNX3-mediated up-regulation of miR-29b suppresses the proliferation and migration of gastric cancer cells by targeting KDM2A
Bao et al. LncRNA DBH-AS1 facilitates the tumorigenesis of hepatocellular carcinoma by targeting miR-138 via FAK/Src/ERK pathway
Liang et al. MiRNA-10b sponge: An anti-breast cancer study in vitro
Guo et al. miR-133a suppresses ovarian cancer cell proliferation by directly targeting insulin-like growth factor 1 receptor
Herr et al. MiR-127 and miR-376a act as tumor suppressors by in vivo targeting of COA1 and PDIA6 in giant cell tumor of bone
WO2011022316A1 (en) Mirnas dysregulated in triple-negative breast cancer
Guo et al. Micro RNA‐301b‐3p contributes to tumour growth of human hepatocellular carcinoma by repressing vestigial like family member 4
Trinh et al. Immune evasion by TGFβ-induced miR-183 repression of MICA/B expression in human lung tumor cells
EP3469081A1 (en) Antisense oligonucleotides for modulation of long noncoding rnas
Shen et al. MicroRNA-21 down-regulates Rb1 expression by targeting PDCD4 in retinoblastoma
CN107828888B (zh) 环状RNA circ-PTPRA的用途
CN102985558A (zh) 用于肝细胞癌症的微rna表达谱分析的组合物和方法
CN107760784B (zh) 环状RNA circ-FOXP1的用途
Sun et al. Effects of miR-221 on the apoptosis of non-small cell lung cancer cells by lncRNA HOTAIR.
CN108796086B (zh) 一种环状RNAcircBCBM1及其非诊断性荧光定量检测方法
CN107619865B (zh) 一种预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的靶点及应用
Esmatabadi et al. Up-regulation of miR-21 decreases chemotherapeutic effect of dendrosomal curcumin in breast cancer cells
CN107805636B (zh) 一种双功能5′-tri-phosphate siGPC-3及制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant