CN107796791A - 一种基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法，该方法以普罗黄素为荧光偏振指示剂，在作用体系中引入氧化石墨烯，可以增大Rev多肽小分子拮抗剂存在与否荧光偏振信号的变化值，建立了基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法。本发明方法操作简单，不必使用荧光标记多肽为指示剂，免去了标记可能带来的大分子构象变化的缺陷，同时，相比传统的荧光偏振方法，该方法对于Rev多肽小分子拮抗剂的识别信号范围更宽，从而更加灵敏，能够实现对Rev多肽小分子拮抗剂的高通量筛选。

Description

一种基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法
技术领域
本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法。
背景技术
艾滋病又称获得性免疫综合症(AIDS)，目前尚无有效根治的药物。艾滋病的病原体为人类免疫缺陷病毒(HIV)，HIV是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒。临床使用的治疗HIV-I的药物主要是蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂，这两类药物容易产生变异性、耐药性和毒性，因此探索发现具有新的作用机制而不易产生耐药性的药物成为当今抗艾滋病药物研究的热点。HIV-I转录过程主要受一些转录因子的调控，如病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulator of virion protein expression,Rev)等。Rev能够影响输出到细胞质的未剪接和部分剪接信使RNA数量，从而调节病毒的基因表达，Rev一个富含精氨酸的区域能够与HIV-I RRE(rev response element)RNA富含腺嘌呤核苷酸的IIB茎环部分相互识别并特异性结合，其中RRE RNA是由大约300个碱基组成的茎环结构。Rev与RRE RNA的相互作用形成Rev-RRE复合物，能够介导mRNA的核转运过程，在HIV-Ι复制周期中起着十分重要的作用。
小分子普罗黄素被发现可以竞争性的结合到Rev结合位点上，抑制Rev与RRE RNA的相互作用；常用氨基糖苷类抗生素如新霉素B、巴龙霉素和庆大霉素，则主要结合到RRERNA的下游茎环部分，通过构象抑制作用阻碍Rev多肽与RRE RNA的结合。
目前对Rev多肽小分子拮抗剂筛选主要是采用荧光标记的Rev多肽为指示剂，该传统方法所产生的偏振变化信号范围较小，灵敏度不高，且对Rev多肽进行荧光标记，可能使多肽链产生不规则折叠或构象变化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简单、灵敏度高的筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：将普罗黄素与含IIB茎环部分的HIV-IRRE RNA片段加入pH＝6.5～8.0的缓冲液中，在37℃下孵育1～5分钟，然后加入待测药物，继续在37℃下孵育1～5分钟，再加入氧化石墨烯，充分混匀，测试加入待测药物前后反应体系的荧光偏振度，若待测药物具有拮抗作用，则荧光偏振度显著降低，据此即可进行Rev多肽小分子拮抗剂的筛选。
上述反应体系中，优选普罗黄素的浓度为200～500nmol/L，其中普罗黄素与含IIB茎环部分的HIV-I RRE RNA片段的摩尔比为2:1。
上述含IIB茎环部分的HIV-I RRE RNA片段优选由34～67个核苷酸组成。
上述反应体系中，待测药物的浓度优选为1～2μmol/L。
上述反应体系中，优选氧化石墨烯的浓度为6～11μg/mL，进一步优选氧化石墨烯的浓度为8～9μg/mL。
上述缓冲液的浓度优选为10～50mmol/L，进一步优选缓冲液的pH＝7.0。
上述缓冲液优选为PBS缓冲液、醋酸铵缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的任意一种。
本发明以普罗黄素为荧光偏振指示剂，在作用体系中引入氧化石墨烯，可以增大Rev多肽小分子拮抗剂存在与否荧光偏振信号的变化值，建立了基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法。本发明方法操作简单，不必使用荧光标记多肽为指示剂，免去了标记可能带来的大分子构象变化的缺陷，同时，相比传统的荧光偏振方法，该方法对于Rev多肽小分子拮抗剂的识别信号范围更宽，从而更加灵敏，能够实现对Rev多肽小分子拮抗剂的高通量筛选。
附图说明
图1是氧化石墨烯用量对加入新霉素B前后荧光偏振度的影响。
图2是氧化石墨烯加入前后对体系荧光偏振度的影响。
图3是不同浓度Rev多肽对体系荧光偏振度的影响。
图4是分别加入巴龙霉素、庆大霉素对体系荧光偏振度的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
将普罗黄素与含IIB茎环部分的HIV-I RRE RNA片段(核苷酸序列为：5’-UGGUCUGGGCGCAGCGCAAGCUGACGGUACAGGCC-3’)加入100μL 20mmol/L pH＝7.0的醋酸铵缓冲液中，在37℃下孵育5分钟，然后加入待测药物，继续在37℃下孵育5分钟，再加入氧化石墨烯，充分混匀后，所得反应体系中普罗黄素的浓度为200nmol/L、含IIB茎环部分的HIV-I RRERNA片段的浓度为100nmol/L、待测药物的浓度为1μmol/L、氧化石墨烯的浓度为8.9μg/mL，采用LS55荧光分光光度计(激发与发射波长分别为455nm和505nm，入射狭缝与出射狭缝均为10nm，间隔时间为1秒)测试加入待测药物前后体系的荧光偏振度，若待测药物具有拮抗作用，则荧光偏振度显著降低，据此即可进行Rev多肽小分子拮抗剂的筛选。
为了确定本发明的工艺条件和可行性，发明人进行了大量的实验室研究试验，具体试验情况如下：
1、确定氧化石墨烯用量
以新霉素B为待测药物，按照实施例1的方法，考察反应体系中氧化石墨烯的浓度分别为0、2.2、4.4、6.7、8.9、11.0μg/mL时，加入新霉素B前后体系的荧光偏振度变化，结果见图1和图2。
由图1可见，随着氧化石墨烯浓度的不断增大，加入新霉素B前后体系的荧光偏振度(FP)降低幅度不断增大，其中氧化石墨烯的浓度为6～11μg/mL时，体系的荧光偏振度降低幅度较大，即荧光偏振度变化值(ΔFP)较大，已经完全可以满足检测要求。由图2可见，与未加氧化石墨烯相比，当体系中加入8.9μg/mL氧化石墨烯时，荧光偏振度降低幅度大约增加了30倍，荧光偏振度变化明显提高。
2、普罗黄素与Rev多肽竞争作用的验证
将普罗黄素与含IIB茎环部分的HIV-I RRE RNA片段(核苷酸序列与实施例1相同)加入100μL 20mmol/L pH＝7.0的醋酸铵缓冲液中，在37℃下孵育5分钟，然后分别加入不同浓度的Rev多肽(氨基酸序列为DTRQARRNRRRRWRERQRAA AAR)，继续在37℃下孵育5分钟，再加入氧化石墨烯，充分混匀后，所得反应体系中普罗黄素的浓度为200nmol/L、含IIB茎环部分的HIV-I RRE RNA片段的浓度为100nmol/L、氧化石墨烯的浓度为8.9μg/mL、Rev多肽的浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700nmol/L，采用LS55荧光分光光度计(激发与发射波长分别为455nm和505nm，入射狭缝与出射狭缝均为10nm，间隔时间为1秒)测试加入Rev多肽前后体系的荧光偏振度，结果见图3。
由图3可见，随着Rev多肽浓度增大，体系的荧光偏振度降低，说明Rev多肽将普罗黄素从RRE RNA上取代下来，从而证明了普罗黄素与Rev多肽之间的竞争作用。
3、评价体系用于药物筛选的可行性
分别以巴龙霉素、庆大霉素为待测药物，按照实施例1的方法，测试加入巴龙霉素、庆大霉素前后体系的荧光偏振度，结果见图4。
由图4可见，分别加入巴龙霉素、庆大霉素后，体系荧光偏振度均降低了约60％，证明了本发明方法用于Rev多肽小分子拮抗剂的筛选是可行的。

Claims (9)

1.一种基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法，其特征在于：将普罗黄素与含IIB茎环部分的HIV-I RRE RNA片段加入pH＝6.5～8.0的缓冲液中，在37℃下孵育1～5分钟，然后加入待测药物，继续在37℃下孵育1～5分钟，再加入氧化石墨烯，充分混匀，测试加入待测药物前后反应体系的荧光偏振度，若待测药物具有拮抗作用，则荧光偏振度显著降低，据此即可进行Rev多肽小分子拮抗剂的筛选。
2.根据权利要求1所述的基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法，其特征在于：所述反应体系中普罗黄素的浓度为200～500nmol/L，普罗黄素与含IIB茎环部分的HIV-I RRE RNA片段的摩尔比为2:1。
3.根据权利要求2所述的基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法，其特征在于：所述含IIB茎环部分的HIV-I RRE RNA片段由34～67个核苷酸组成。
4.根据权利要求1所述的基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法，其特征在于：所述反应体系中待测药物的浓度为1～2μmol/L。
5.根据权利要求1所述的基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法，其特征在于：所述反应体系中氧化石墨烯的浓度为6～11μg/mL。
6.根据权利要求1所述的基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法，其特征在于：所述反应体系中氧化石墨烯的浓度为8～9μg/mL。
7.根据权利要求1所述的基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法，其特征在于：所述缓冲液的浓度为10～50mmol/L。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法，其特征在于：所述缓冲液的pH＝7.0。
9.根据权利要求8所述的基于氧化石墨烯筛选Rev多肽小分子拮抗剂的方法，其特征在于：所述缓冲液为PBS缓冲液、醋酸铵缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的任意一种。
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