CN107760617B - 一种微通道内纳米材料混合液分段流培养生物被膜的方法 - Google Patents

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Abstract

一种微通道内纳米材料混合液分段流培养生物被膜的方法，以硅烷试剂修饰微通道内壁，修饰完成后，微通道用微流泵将预培养的重组菌株通入管道中，菌株内植固定后，通入含纳米材料的培养液，采用单相流培养，随后利用T‑型接头连接第二个微流泵注入灭菌空气，采用“空气/纳米材料混合培养液”分段流，在微通道反应器内培养菌株制备稳定生长的生物被膜。该法设计新颖，操作简便，条件温和，解决了重组大肠杆菌在微通道反应器中难以定植和生物被膜生长不可控的技术难题，实现了微通道内生物被膜的可控制备，且其通透性得到明显改善。

Description

一种微通道内纳米材料混合液分段流培养生物被膜的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种微通道内纳米材料混合液分段流培养生物被膜的方法。
背景技术
现有技术：微生物在自然界中主要以生物被膜的生活方式存在，生物被膜主要由表面相关的微生物群体以及微生物形成的絮凝体或凝聚体构成，能够适应各种各样的环境压力。生物被膜有机体能在各种各样的界面(如油/水/空气)产生，并能嵌入自身分泌的胞外聚合物，从而在生物被膜内部以特定的生态位和谐地受益(Trends in Biotechnology,2009,27(11),636-643)。十多年前，人们一直尝试将生物被膜作为一种新型的全细胞催化剂用于化学合成，后逐步拓展到精细化学扩展到精细化学品、生物燃料和微生物燃料电池等领域，但仅限于常规反应器，且大多情况下生物被膜在反应器内无序过度生长甚至无法控制导致传质受限从而降低反应器的工作效率(Chemie Ingenieur Technik,2014,86(12),2215-2225)。为了解决细菌形成生物被膜不可控的问题，因而亟需找到一种控制生物被膜稳定生长的方法。
微流控技术作为影响人类未来15件最重要的发明之一，具有高速混合、高效传热、停留时间分布窄、重复性好、系统响应迅速、便于自动化控制、几乎无放大效应以及安全性能高等诸多优点。微尺度下通道尺寸更接近与生物体内环境，微流传质更能精准的控制细胞生长环境和过程。近年来，随着微流化学(Microfluidic chemistry)和微流控技术(Microfluidic technique)的迅猛发展，以微尺度流体理论、芯片实验室(Lab-on-a-Chip)、微流控生物工程技术为依托，微流控系统基础、方法学及其在生命科学的应用研究逐步深入，人们探索将生物被膜应用于微反应器(Organic Process Research&Development,2016,20(2):361-370)。细菌粘附于接触微反应器通道的从表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。如Ng等用阳离子改性蛋白cBSA-147作为静电介导将大肠杆菌E.coli BL21star(DE3)定植在毛细管柱中，可对映选择性拆分乙酰乙酸乙酯合成R-(-)羟基丁酸乙酯(Biointerphases,5(3),41-47)。2014年，德国多特蒙德工业大学Schmid和Buehler教授课题组在微通道内定植生物被膜取得了重大突破(Biotechnology and Bioengineering,111(9),1831-1840)，课题组应用分段流技术在连续流多相反应器中实现了生物被膜生长和分布的技术制备的Pseudomonas sp.VLB120DC单菌膜催化苯乙烯环氧化反应高效生成(S)-氧化苯乙烯(ee>99.8％)。然而，这些探索仍然存在不足，前者生物被膜在毫米甚至微米尺寸的微通道内难以固定且生长较慢。后者制备的生物菌膜结构过于致密通透性较差，不利于溶液中底物与重组菌株表达的酶蛋白接触，降低催化效果。因此本发明提出的对微通道进行表面修饰，并采用纳米材料与菌株混合培养快速形成生物被膜及改善其结构。
CN 102391947A发明了一种细菌生物被膜的多功能培养装置，利用培养基贮存罐与蠕动泵相连，然后养罐内部设置有用于放置培养载体的圆盘，圆盘上放置生物被膜培养载体，虽然该细菌生物被膜的多功能培养装置，功能多样，实用性强，区别于传统的单一生物被膜培养装置。CN104928148A发明了一种细菌生物被膜的多功能培养装置本发明公开一种适用于原子力显微镜原位、高通量检测生物膜微纳米结构及生物力学特性的细菌生物膜培养新装置。该发明结合微流控技术和原子力显微镜特点，设计一种可嵌入原子力显微镜检测平台生物膜培养装置，用来检测细菌生物膜微纳米结构和生物力学特性。具有重复使用，经济环保、高通量的特点。DE102015209729B3发明一种基于微流控和传感器技术用于测定流体表面的生物膜形成的方法。该装置实现在一定条件下各种相关参数的测定，准确地评估液体表面生物膜形成过程。然而，这些装置仅适用于生物膜的培养和检测，仍存在生物菌膜快速定植及生物被膜生长不可控的问题，也无法实现形成生物被膜催化剂，缺少应用于生物催化的可能性。WO2012152337(A1)发明了一种分段流生物被膜反应器，该装置包括一个毛细管构件，液相和液相的储存器。该反应器内利用M 9培养基培养生物膜作为生物催化剂。该方法简单，适用于多种材料的毛细管，并成功实现生物被膜在微通道内的生长。但存在着在通道内壁菌株吸附过程缓慢及分段流调控方法的问题，而且形成生物被膜的结构过于致密通透性较差，不利于液相中底物分子与重组菌株表达的酶分子接触提高催化效率。迄今，国内外对微流控生物被膜及其催化应用研究报道较少。因此本发明提出的硅烷试剂修饰的微反应器快速定植重组菌株并利用纳米材料混合培养液分段流调控培养重组菌株生物被膜的方法是一种通用的方法，实现重组菌株在微反应器中快速形成稳定有序生长生物被膜并改善其通透性，拓宽了生物被膜的可控制备及其催化应用。
发明内容
解决的技术问题：针对现有技术中所述的微通道中菌株难以快速定植、生物被膜难以稳定有序生长及通透性较差的不足，本发明提供了一种微通道内纳米材料混合液分段流培养生物被膜的方法，有效的解决生物被膜在微通道内难以定植、无序生长及生物被膜通透性较差问题。
技术方案：一种微通道内纳米材料混合液分段流培养生物被膜的方法，步骤为：以硅烷试剂修饰微通道内壁，修饰方法为65-98wt.％的乙醇溶液冲洗微通道内壁0.5-5h，接着通入体积比1-20％的硅烷溶液修饰1-5h，最后通入0.2-20wt.％的戊二醛溶液0.5-5h；修饰后的微通道用微流泵将预培养的重组菌株通入管道中，停止泵后吸附1-8h，温度恒定为25-40℃；菌株固定后，通入纳米材料终浓度为1-200mg/L的培养液，调节pH 5.0-9.0并采用单相流培养1-5天，随后利用T-型接头连接第二个微流泵注入灭菌空气，采用灭菌空气、纳米材料混合培养液分段流，调控制备得到稳定生长的生物被膜，调控分段流条件为流速15-100μL/min，培养时间1-10天。
上述硅烷试剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷、γ-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷、N-辛基三乙氧基硅烷溶液、巯甲基甲基二乙氧基硅烷或(环己氨基丙基)三甲氧基硅烷。
上述微通道长度2-20cm。
上述微通道反应器包括微量注射泵、反应器本体和接收器三部分，由T-型接头与聚四氟乙烯管连接而成，注射泵调节流速；反应器本体材料为聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚四氟乙烯或高硼硅毛细管，由一T-型双入口和一个出口组成，通道直径2-13cm。
上述纳米材料为碳纳米管、Fe2O3、ZnO或石墨烯经超声预处理30min的悬浮液。
上述分段流调控的方法为：pH 5.0-9.0的培养液单相流培养1-5天，随后利用T-型接头连接第二个微流泵注入灭菌空气，培养时间1-10天，流速15-65μL/min，反应温度25-40℃。
有益效果：在使用分段流微反应器纳培养大肠杆菌生物菌膜过程中，采用修饰的微通可以快速固定重组菌株且吸附菌株量大，形成稳定的生物被膜的时间较未修饰的情况下缩短了54％。采用分段流法在通道内壁能够快速形成稳定的生物菌膜且生物总量保持不变，而在单相流体系下生物菌膜形成速率较慢且一直生长。采用纳米材料混合培养液分段流培养重组菌株制备生物被膜，通过生物量场的测定和发射环境扫描电镜的观察，其结构得到了改变。该方法操作简便、条件温和，对环境友好，生物菌膜的无序生长得到了有效的控制，硅烷试剂修饰的微反应器实现了重组菌株的快速定植，纳米材料混合培养液分段流培养重组菌株制备了稳定有序生长的生物被膜及明显改善了其通透性通性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以重组大肠杆菌和微通道反应器为研究对象，按照下述步骤进行：选取保存的菌种，接种于含有卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中(3～5mL)，37℃振荡培养生长至指数期，然后以2％的接菌量转接到含有卡那青霉素抗性(工作浓度50μg/mL)的LB液体培养基中(500mL)，22℃恒温振荡培养至OD600达到0.6～0.8时，然后添加400μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，将温度降到17℃进行低温诱导表达16～20h。即获得绿色荧光标记的大肠杆菌。
本发明生物被膜总量的测定方法：生物被膜培养一定时间后，先利用微流泵通入空气吹去培养液，再通入用甲醇固定20min(期间停止泵的运行)；然后，通入浓度为0.1％的结晶紫对生物膜进行染色，期间静置染色30min；染色后，通入PBS缓冲液去除结晶紫除去浮色，室温干燥30min；最后接入95％的乙醇溶解吸附于生物膜上的结晶紫30min，利用酶标仪测其在590nm下的吸光值即为处理条件下生物被膜总量。
微通道内生物被膜的制备方法：以硅烷试剂修饰微通道内壁，修饰方法为65-98％的乙醇溶液冲洗0.5-5h，接着用1-20％(v/v)的五种硅烷溶液修饰1-5h，最后通入0.2-20％的戊二醛溶液0.5-5h。修饰后微通道用微流泵将预培养的重组菌株通入管道中，停止泵后吸附1-8h，温度恒定为25-40℃。菌株固定后，通入纳米材料终浓度为1-200mg/L的培养液，调节pH5.0-9.0并采用单相流培养1-5，随后利用T-型接头连接第二个微流泵注入灭菌空气，采用“空气/纳米材料混合培养液”分段流微通道反应器内培养的菌株的方法制备稳定生长的生物被膜，调控分段流条件为流速15-100μL/min，培养时间1-10天。
实施例1
利用硅烷试剂和戊二醛修饰微通道内壁：90％的乙醇溶液冲洗1h，接着用10％(v/v)的五种硅烷溶液修饰2h，最后通入10％的戊二醛溶液2h。重组菌株通过注射泵通入微通道内，在流体流动的情况下将会有利于缩短生物菌膜培养时间。温度恒定为25℃。混合纳米材料的培养液(纳米材料终浓度1mg/L，pH 7.0)单相流培养1天，两种吸附方法吸附后重组菌株利用分段流方法培养2天，流速为40μm/min。期间分别在同样的时间段内测定微通道内大肠杆菌菌膜的生物总量，结果用吸光值表示如表1所示。结果表明，在对微通道用戊二醛修饰前后，微管道内大肠杆菌的吸光值随着时间的推移呈现出上升的趋势，即微通道内生物总量在增加，生物菌膜在不断生长，且在相同的时间内修饰后微通道的重组菌株生长的生物总量较高于未修饰的通道组菌株生长的生物总量。
表1不同硅烷化方法处理的微通道吸附重组大肠杆菌的定植程度
实施例2
使用实施例1中的修饰后的微通道吸附重组菌株分段流法培养生物被膜，设定流速培养液-空气等流速为100μL/min，纳米材料石墨烯终浓度1mg/L，pH 7.0培养温度设定为40℃，相同时间培养时间后利用结晶紫染色生物被膜后洗脱，酶标仪测定OD590下微通道中形成生物菌膜的生物总量。实验重复三次，60h后生物菌膜的生物总量OD590值为0.691±0.073，且保持不变。
实施例3
使用实施例1中的修饰后的微通道吸附重组菌株分段流法培养生物被膜，设定流速培养液-空气等流速为15μL/min，混合纳米材料石墨烯终浓度1mg/L的培养液，培养温度设定为40℃，pH 9.0。相同时间培养时间后利用结晶紫染色生物被膜后洗脱，酶标仪测定OD590下微通道中形成生物菌膜的生物总量。实验重复三次，72h后生物菌膜的生物总量OD590值为0.583±0.156，且保持不变。
实施例4
使用实施例1中的修饰后的微通道吸附重组菌株分段流法培养生物被膜，设定流速培养液-空气等流速为45μL/min，混合纳米材料石墨烯终浓度10mg/L的培养液，培养温度设定为32℃，pH 7.0。相同时间培养时间后利用结晶紫染色生物被膜后洗脱，酶标仪测定OD590下微通道中形成生物菌膜的生物总量。实验重复三次，72h后生物菌膜的生物总量OD590值为1.395±0.061，且保持不变。
实施例5
使用实施例1中的修饰后的微通道吸附重组菌株与纳米材料的混合液，纳米材料混合液终浓度为100mg/L。利用分段流法培养生物被膜，设定流速培养液-空气等流速为20μL/min，纳米材料混合培养液终浓度为100mg/L，培养温度设定为32℃，pH 5。相同时间培养时间后利用结晶紫染色生物被膜后洗脱，酶标仪测定OD590下微通道中形成生物菌膜的生物总量。实验重复三次，测定72h后生物菌膜的生物总量OD590(见表2)，并利用场发射扫描电镜表征生物被膜结构，其中石墨烯材料在同浓度下对生物菌膜通透性影响最大。
表2不同种的纳米材料对重组大肠杆菌生物被膜形成的影响
实施例6
使用实施例1中的3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰后的微通道吸附重组菌株与纳米材料的混合液，纳米材料混合液终浓度为5mg/L。利用分段流法培养生物被膜，设定流速培养液-空气等流速为45μL/min，培养温度设定为32℃，pH 7。相同时间培养时间后利用结晶紫染色生物被膜后洗脱，酶标仪测定OD590下微通道中形成生物菌膜的生物总量。实验重复三次，测定72h后生物菌膜的生物总量OD590(见表3)。其中，短壁碳纳米管对重组大肠杆菌生物被膜影响最小且石墨烯对生物被膜的影响相对减小。
表3不同纳米材料对重组大肠杆菌生物被膜形成的影响

Claims (1)

1.一种微通道内纳米材料混合液分段流培养生物被膜的方法，其特征在于步骤为：利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷和戊二醛修饰微通道内壁：90%的乙醇溶液冲洗1 h，接着用10%（v/v）的3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液修饰2 h，最后通入10 %的戊二醛溶液2 h；绿色荧光标记的大肠杆菌通过注射泵通入微通道内；温度恒定为32 ℃；混合纳米材料的培养液单相流培养1天，短壁碳纳米管的浓度5 mg/L，pH 7.0，两种吸附方法吸附后重组菌株利用分段流方法培养2天，流速为45μL/min。
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Toxicity and transformation of graphene oxide and reduced graphene oxide in bacteria biofilm;Zhiling Guo,et al.;《Science of the Total Environment》;20161218;第580卷;摘要，第1301页左栏第1段至第1306页右栏最后1段 *

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