CN107737134A - 人参黄酮苷在过敏性疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人参黄酮苷[山奈酚‑3‑O‑β‑D‑半乳糖‑(2→1)‑β‑D‑葡萄糖苷]在过敏性疾病中的应用，所述的过敏性疾病机理涉及IgE介导的肥大细胞脱颗粒以及T细胞参与的免疫应答。本发明的优点在于：本发明提供了一种人参黄酮苷的用途，拓宽了人参黄酮苷的药用范围，填补了人参黄酮苷在过敏性疾病治疗领域的空白，为过敏性疾病患者提供了新的治疗途径。

Description

人参黄酮苷在过敏性疾病中的应用

技术领域

本发明涉及化合物的应用，具体涉及人参黄酮苷在过敏性疾病中的应用。

背景技术

随着人类生活质量的不断提高，过敏性疾病患病率在迅速增高，已达到某种流行病的程度，成为了一个世界性的难题。2005年6月28日，WAO联合各国变态反应机构共同发起了对抗过敏性疾病的全球倡议，将每年的7月8日定为世界过敏性疾病日。在世界首个过敏性疾病日，世界变态反应组织公布对30个国家进行流行病学调查结果显示：在这些国家的12亿总人口中，22％患有免疫球蛋白E(IgE)介导的过敏性疾病，如过敏性鼻炎、哮喘、湿疹、食物过敏、药物过敏和严重过敏反应等。目前抗过敏活性的研究方法主要为体外抑制实验、被动皮肤过敏反应、动物模型等。

肥大细胞是参与变态反应的一种细胞，富含嗜碱性颗粒，包括β-己糖苷酶(β-HEX)、组胺、5-羟色胺、白三烯等，在哮喘发病机制中起着不可替代的核心作用。基于肥大细胞的过敏反应是一种IgE介导的免疫反应。过敏反应发生时，β-HEX释放率升高，胞内钙离子浓度升高。大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株(rat basophilic leukemia cell line,RBL-2H3)具有肥大细胞相似的细胞结构与脱颗粒机制，能模拟肥大细胞的多种功能，可传代培养、性状稳定，是体外研究与肥大细胞相关的各种生理、病理、药物作用机制等的理想替代模型。

OVA是一种常见的过敏原，基于其易于获得，免疫原性强和相关试剂选择性大等优点，OVA成为建立过敏动物模型中常用的过敏原，常与特定的非免疫原性的佐剂联合使用。BALB/c小鼠较易出现强烈的Th2型细胞因子免疫反应，遗传背景清楚，故采用BALB/c小鼠作为过敏动物模型。过敏反应发生时，Th2免疫应答增强，Th2细胞通过释放IL-4,IL-5和IL-13细胞因子，从而诱导B淋巴细胞产生IgE抗体。因此血清中IgE含量,肺泡灌洗液中IL-4,IL-5和IL-13的含量是过敏动物模型中的重要考察指标。

科学家不断探寻高效低毒的抗过敏药物，副作用较小的天然产物，在抗过敏药物中逐渐占据重要地位。有报道表明，陈皮总黄酮、桔皮素、山奈小花提取物等黄酮类药物具有一定的抗过敏活性。但是人参黄酮类化合物的生物活性研究主要集中在抗氧化活性，尚未出现其在过敏性疾病中的应用。本发明首次验证了人参黄酮苷的抗过敏作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种人参黄酮苷在制备治疗免疫球蛋白E(IgE)介导的疾病的药物中的应用。所述疾病为过敏性疾病。所述过敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、湿疹、食物过敏、药物过敏和严重过敏反应等。

人参黄酮苷的结构如下：

本发明在体外模拟了人参黄酮苷对肥大细胞脱颗粒的影响。结果表明，人参黄酮苷对肥大细胞脱颗粒有显著的抑制作用，并且该作用是通过对Ca²⁺信号通路的抑制实现的。同时，本发明从肺组织切片、免疫器官质量、细胞因子、T细胞数目等几个方面对人参黄酮苷的抗过敏活性进行验证，并取得了显著效果。实验结果证明，人参黄酮苷可以影响IgE介导的免疫应答和T细胞参与的免疫应答。说明人参黄酮苷能够有效治疗免疫球蛋白E(IgE)介导的过敏性疾病，如过敏性鼻炎、哮喘、湿疹、食物过敏、药物过敏和严重过敏反应等。

附图说明

图1显示人参黄酮苷对RBL-2H3细胞活力的影响(Mean±SE,N＝3)(^*P<0.05，表示和对照组有显著差异)。

图2显示人参黄酮苷对RBL-2H3细胞释放β-HEX的影响(Mean±SE,N＝3)(^*P<0.05，表示和对照组有显著差异；^**P<0.01，表示和对照组有极其显著差异)。

图3显示人参黄酮苷对RBL-2H3细胞胞内Ca²⁺浓度的影响(Mean±SE,N＝3)(^*P<0.05，表示和对照组有显著差异；^**P<0.01，表示和对照组有极其显著差异)。

图4显示肺组织中炎症细胞浸润情况(N＝3,Light microscopy,×100)(A对照组,B模型组,C人参黄酮苷10mg/kg组,D人参黄酮苷30mg/kg组)。

图5显示人参黄酮苷对小鼠脾脏和胸腺质量的影响(Mean±SE,N＝6)(^#P＜0.05,^##P＜0.01，表示和对照组有显著性差异.^*P＜0.05,^**P＜0.01，表示和模型组有显著性差异)。

图6显示人参黄酮苷对IgE,IL-4,IL-5和IL-13的影响(Mean±SE,N＝6)(^#P＜0.05,^##P＜0.01，表示和对照组有显著性差异.^*P＜0.05,^**P＜0.01，表示和模型组有显著性差异)。

图7显示人参黄酮苷对脾脏T细胞的影响(Mean±SE,N＝6)(^#P＜0.05,^##P＜0.01，表示和对照组有显著性差异.^*P＜0.05,^**P＜0.01，表示和模型组有显著性差异)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1人参黄酮苷的制备

干燥的人参叶20g，研磨，过40目筛。样品粉末用300mL水煎煮2h。提取物溶液经D101大孔树脂吸附，用95％乙醇解吸。提取物经反复硅胶柱层析，流动相为甲醇-氯仿-水(12:5:0.8)，得到人参黄酮苷单体。产品在使用前干燥，冻干。

试验例一人参黄酮苷的体外实验

(一)细胞毒性试验

RBL-2H3细胞株，使用DMEM培养基培养(含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)。设空白组，对照组和药物组。药物组加入人参黄酮苷的浓度依次为1.5625,3.125,6.25,12.5,25,50,75和100μg/mL。药物和细胞作用20h后，加入MTT作用4h。去除上清，用DMSO溶解，酶标仪测定吸光度。细胞活力(％)＝(药物组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。(空白组：不铺细胞；对照组：细胞不加药；药物组：细胞加药)

MTT实验结果见图1。结果表明，除了100μg/mL浓度组，人参黄酮苷对RBL-2H3细胞的细胞活力没有明显影响。根据实际需求，选择3.125-50μg/mL的浓度范围进行β-HEX抑制实验。

(二)β-HEX抑制实验

RBL-2H3细胞在24孔板中培养24h。加入0.125μg/mL的抗DNP-IgE致敏过夜。根据MTT实验结果，选择3.125-50μg/mL浓度范围的人参黄酮苷，与细胞作用2.5h。台式缓冲液清洗细胞两次后，加入10μL DNP-BSA(0.25μg/mL)，作用1h激发过敏反应。取反应后的细胞上清液50μL，加入50μL显色液(1mmol/L)，培养1.5h后，加入终止液(Na₂CO₃/NaHCO₃)停止反应。用酶标仪测定吸光度值。β-HEX抑制率(％)＝[1-(药物组OD值-对照组OD值)/(模型组OD值-对照组OD值)]×100％。(对照组：细胞不致敏不加药；模型组：细胞致敏不加药；药物组：细胞致敏加药)

β-HEX抑制实验结果见图2。如图所示，人参黄酮苷显著抑制了β-HEX的释放。并且随着药物浓度的升高，人参黄酮苷对β-HEX的抑制也变得极其显著。结果表明，人参黄酮苷可以抑制RBL-2H3细胞脱颗粒。

(三)胞内钙离子抑制实验

细胞按照上述方法致敏加药后，加入Fluo 3-AM荧光探针(4μmol/L)作用30min。用台式缓冲液清洗细胞两次后，加入10μL DNP-BSA(0.25μg/mL)，作用10min激发过敏反应。使用荧光倒置显微镜测定荧光强度。胞内钙离子抑制率(％)＝(1-药物组荧光强度/模型组荧光强度)×100％。(模型组：细胞致敏不加药；药物组：细胞致敏加药)

胞内Ca²⁺抑制实验结果见图3。如图所示，人参黄酮苷显著抑制了胞内Ca²⁺的浓度，并且抑制率随浓度显著升高。结果表明，人参黄酮苷抑制脱颗粒的机制可能是Ca²⁺信号通路。

通过以上实验，我们在体外模拟了人参黄酮苷对肥大细胞脱颗粒的影响。结果表明，人参黄酮苷对肥大细胞脱颗粒有显著的抑制作用，并且该作用是通过对Ca²⁺信号通路的抑制实现的。

试验例二人参黄酮苷的体内实验

(一)肺组织切片

6-8周的雌性BALB/c小鼠，体重18-22g，购自长春生物制品研究所有限责任公司。小鼠饲养采取常规分笼方式，饮水和采食自由，温度24±2℃，相对湿度40-80％。实验在吉林大学动物中心的指导下完成。小鼠饲养一周适应环境后进行实验。共36只小鼠，分为4组：对照组，模型组，人参黄酮苷10mg/kg组，人参黄酮苷30mg/kg组。模型组和人参黄酮苷组采用腹腔和皮下注射结合的方式在第0、7、14天每只每次注射OVA 0.2mL致敏，空白组注射生理盐水。在第21、22、23天，人参黄酮苷组经腹腔注射相应浓度的人参黄酮苷。注射量为0.2mL。模型组和空白组注射生理盐水。注射1h后，对模型组和人参黄酮苷组的小鼠进行滴鼻激发，激发液为50μL OVA，空白组使用生理盐水。最后一次滴鼻激发24h后，处死小鼠。

处死小鼠后，取出肺组织，用生理盐水清理干净。肺组织用4％中性甲醛固定，4℃保存。将固定好的肺组织清洗干净，脱水处理，制作石蜡切片，H&E染色，使用倒置显微镜观察切片。

肺组织切片结果见图4。相比于对照组，模型组的血管和支气管周围有明显的炎症细胞浸润，说明动物模型建立成功；而相比于模型组，人参黄酮苷组能明显改善炎性浸润，且呈剂量依赖。该结果比较直观的说明了人参黄酮苷对过敏性哮喘的治疗作用。

(二)人参黄酮苷对小鼠脾脏和胸腺质量的影响

胸腺和脾脏是重要的免疫器官，影响细胞免疫和体液免疫。当过敏反应发生时，免疫细胞的增殖能力受到影响，从而影响免疫器官质量。

胸腺和脾脏的质量见图5。结果显示，相比于对照组，模型组的脾脏质量明显升高，而胸腺质量明显降低。药物组抑制了脾脏质量上升和胸腺质量降低。说明人参黄酮苷对免疫系统有调节作用。

(三)血清中IgE和肺泡灌洗液中细胞因子检测

于最后一次滴鼻激发24h后，进行小鼠眼球取血，获得血液。室温放置30min后，4℃放置过夜，离心制备血清。使用ELISA试剂盒检测血清中IgE含量。

小鼠取血后，用PBS缓冲液对肺组织进行灌洗，收集灌洗液约1mL。离心获得肺泡灌洗液上清液，使用ELISA试剂盒检测上清液中IL-4，IL-5，IL-13含量。

血清中IgE和肺泡灌洗液中细胞因子结果见图6。结果显示，相比于模型组，人参黄酮苷30mg/kg组显著降低了血清中IgE的含量。相对于模型组，两个组别的人参黄酮苷都使IL-4显著降低。尽管IL-4，IL-5，IL-13都是Th2相关的细胞因子，本实验中IL-5和IL-13的含量变化却不明显，文献中也有相似结果。因此，有足够的理由证明，人参黄酮苷抑制Th2免疫应答，从而治疗过敏性疾病。

(四)流式细胞术检测脾脏T细胞

脾脏经研磨、过滤得到脾细胞，去除红细胞后，使用尼龙毛柱纯化，得到脾脏T细胞。加入CD3-PerCP-Cy5.5,CD4-FITC，CD8-PE抗体，4℃孵育30min。用冰的PBS缓冲液清洗细胞3次。加入300μL PBS缓冲液重悬细胞，立即上机检测。

健康人体的CD4⁺和CD8⁺T细胞维持在一个稳定的水平，CD4⁺和CD8⁺T细胞的比值存在一个平衡，而在过敏性疾病患者身体上，这种平衡被打破。

脾脏CD4⁺和CD8⁺T细胞变化见图7。结果显示，相比于模型组，人参黄酮苷组对CD4⁺和CD8⁺T细胞都有影响。这种影响在CD4⁺和CD8⁺T细胞的比值上表现的尤为明显。人参黄酮苷能明显提高CD4⁺和CD8⁺T细胞的比值，从而影响T细胞免疫。

综合体内实验结果，我们从肺组织切片、免疫器官质量、细胞因子、T细胞数目等几个方面对人参黄酮苷的抗过敏活性进行验证，并取得了显著效果。实验结果证明，人参黄酮苷可以影响IgE介导的免疫应答和T细胞参与的免疫应答。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (3)

1.一种人参黄酮苷在制备治疗免疫球蛋白E(IgE)介导的疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述疾病为过敏性疾病。

3.根据权利要求2所述的应用，所述过敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、湿疹、食物过敏、药物过敏和严重过敏反应等。