CN107674828B - 户外孢子分离器和孢子的分离采集方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种户外孢子分离器和方法，包括消毒槽、下阀盘、中阀盘和上盖盘，并自下而上可拆卸式地组装在一起，下阀盘上设置有贯穿下阀盘的灭菌孔和收集孔，中阀盘上设置有贯穿中阀盘的孔道，孔道至少具有位于下阀盘的灭菌孔之上或收集孔之上的两种安装位，上盖盘上设置有存样槽，存样槽至少具有位于下阀盘的灭菌孔之上或收集孔之上的两种安装位。所述分离器和分离方法可以在无菌情况下分离真菌孢子，避免了传统方法需要在超净工作台中操作的设备要求，是一种携带方便，小巧易操作的便携式户外孢子分离器。因此本发明的孢子分离器在户外采集病原真菌中具有极高的应用价值。

Description

户外孢子分离器和孢子的分离采集方法及应用

技术领域

本发明涉及菌种的分离采集领域，具体而言，涉及一种适用于非洁净环境 下的孢子分离采集器和采集方法。

背景技术

在真菌的研究过程中，菌种的分离、扩大培养十分重要。菌种分离是将目 标真菌从混杂的微生物中分离开，再将分离得到的目标菌于适宜环境内纯化培 养。为了避免污染，分离工作要求在无菌条件下进行。目前分离培养需要在无菌 室、无菌箱或无菌工作台(超净工作台)上进行。无菌室和无菌箱要经过喷雾除 尘，并用药物或紫外线照射消毒，常用消毒药物为70％酒精、2％煤酚皂液、5％ 石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟。

以虫霉目真菌为例，虫霉目(Entomophthorales)真菌隶属于虫霉亚门(Entomophthoromycotina)，分布广泛，世界各地均有关于虫霉真菌的报道。虫 霉目真菌多为陆生节肢动物的专性病原菌，其中以昆虫为主，也有少数种类侵染 线虫等低级无脊椎动物。很多虫霉真菌能够通过在昆虫种群中引发高强度的流行 病而发挥控制害虫的作用。而虫霉目真菌的调查往往需要将感病蚜尸带回实验室 进行分离鉴定，加上虫霉目真菌会在较短的时间内弹射分生孢子，而且分生孢子不容易保藏。在户外无菌操作无法得到保证，因此目前依赖实验室超净工作台分 离的传统做法无法应用于户外采集，这给虫霉目真菌地深入研究带来很大的障 碍。

发明内容

本发明正是基于上述问题，提出了一种结构简单、小巧，携带方便，易操作 且能在户外进行无菌收集真菌孢子的分离器。

一种户外孢子分离器，包括消毒槽、下阀盘、中阀盘和上盖盘，并自下而上 可拆卸式地组装在一起，下阀盘上设置有贯穿下阀盘的灭菌孔和收集孔，中阀盘 上设置有贯穿中阀盘的孔道，孔道至少具有位于下阀盘的灭菌孔之上或收集孔之 上的两种安装位，上盖盘上设置有存样槽，存样槽至少具有位于下阀盘的灭菌孔 之上或收集孔之上的两种安装位。

其中，中阀盘可相对下阀盘移动，上阀盘可相对下阀盘移动，并使孢子分离 器具有至少两种安装位，其中第一种安装位为灭菌孔、孔道和存样槽三者连通， 第二种安装位为收集孔、孔道和存样槽三者连通。

进一步的，消毒槽、下阀盘、中阀盘和上盖盘为圆柱体，下阀盘圆柱体的圆 面等分辐射处设置有灭菌孔和收集孔，中阀盘圆柱体的圆面等分辐射处设置有孔 道，上盖盘圆柱体的圆面等分辐射处设置有存样槽，灭菌孔和收集孔的圆心到下 阀盘圆面中心点的距离、孔道圆心到中阀盘圆面中心点的距离、存样槽圆心到上 盖盘圆面圆心的距离，上述三者的距离相等。

当灭菌孔和收集孔各包括两个以上时，灭菌孔和收集孔间隔排布。

进一步的，中阀盘等分辐射的角度是下阀盘等分辐射角度的两倍。

户外孢子分离器还可包括螺柱栓，下阀盘、中阀盘和上盖盘的圆柱体圆面中 心位置开设有中心孔，所述螺柱栓插入中心孔内，将下阀盘、中阀盘和上盖盘三 者组装在一起。

户外孢子分离器还可包括定位孔和定位销。进一步的，在下阀盘、中阀盘和 上盖盘的盘边缘处各设有标记刻痕。

为了方便更换液体，在消毒槽的上部设有注液口，下部设有排液口。

在收集孔的内侧壁还可上嵌设有O形圈。

户外孢子分离器还包括定时器；也可包括温度控制器。

本发明还提供了一种户外孢子的分离采集方法，采用发明所述户外孢子分离 器，包括以下步骤：

(1)消毒槽中装入挥发性消毒液，并下阀盘、中阀盘和上盖盘进行灭菌处 理；

(2)上盖盘的存样槽中设置粘胶材料，将感病生物体粘于存样槽中；

(3)将盛有无菌培养基的收集管放置在下阀盘的收集孔中，迅速盖上上盖 盘，使上盖盘的存样槽、中阀盘的孔道和下阀盘的灭菌孔连通，灭菌；

(4)灭菌结束后，中阀盘和上盖盘一同转动一定角度，使存样槽、孔道和 收集孔连通，在合适的条件下，感病生物体内的真菌孢子弹射于收集管内；

(5)收集完毕后，上盖盘和中阀盘再次转动一定角度，使得收集管处于封 闭状态，同时卸除上盖盘和中阀盘，取出收集管，待用。

进一步的，还可包括在对生物体灭菌结束后，将消毒槽内的挥发性消毒液更 换为无菌水。在孢子收集结束后，再将消毒槽中的无菌水更换为挥发性的消毒液。

本发明还提供了上述的户外孢子分离器在户外采集孢子的应用

本发明的有益效果是：在户外分离和收集孢子的过程中，利用了本发明所述 分离器消毒槽中存放的挥发性消毒液，保证了孢子分离器内部及附近所处空间是 一个相对无菌的环境。便携式户外孢子分离器下阀盘等分辐射地设有收集孔和灭 菌孔，其中用于放置孢子收集管的收集孔和形成流体通道的灭菌孔间隔排布；中 阀盘等分辐射分布着的孔道，等分角度是下阀盘的两倍，孔道数量与收集孔和/ 或灭菌孔相同；利用下阀盘各孔在盘中分布角度不同于中阀盘孔道的分布角度， 借助旋转实现流体通道的形成和流体通道的切断，即类似阀门的作用。

所述孢子分离器改变原有的实验室超净工作台分离的传统做法，是在保证无 菌的情况下，实现在较短时间内能够高效、方便地从感病蚜尸体上收集病原真菌 的孢子。且便携式户外孢子分离器小巧不占空间，易于携带；结构简单，操作方 法简便；分离效果较好，避免了过大投资而设备闲置造成的资源浪费，实用性强， 便于推广。

附图说明

图1是包括消毒槽、下阀盘、中阀盘和上盖盘的便携式户外孢子分离器。

图 2是图1的便携式户外孢子分离器的分解图。

图3包括注液口和排液口的消毒槽示意图。

图4是图1所述下阀盘的立体图。

图5是图1所述下阀盘正面示意图。

图6是图5A-A方向的剖面视图。

图7是图1所述中阀盘的立体图。

图8图1所述中阀盘正面视图。

图9是图8A-A方向的剖面视图。

图10是图1所述上盖盘的立体图。

图11是图1所述上盖盘的正面视图。

图12是图11A-A方向的剖面视图。

图13是冻存管和孢子分离器的每日平均弹孢数量。当两者出现相同的小写字母时，表示无显著差异性，不同小写字母表示具有显著差异性；出现不同的大 写字母时表示具有极显著差异性，相同的大写字母表示无极显著差异性。

图14是冻存管和孢子分离器平均每只蚜虫总产孢量。

图15是分离器的无菌情况分析实验图。

图16是传统法与孢子分离器法的无菌率比较。

图17具两个灭菌孔和两个收集槽的下阀盘、与之配合的中阀盘和上盖盘。

图18是上盖盘上设有定时器的便携式户外孢子分离器。

图19是收集孔内设有O形圈的下阀盘。

具体实施方式

下面结合具体附图对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在 不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和 本发明结合而产生的其他具体的实施方案。

实施例1一种便携式孢子分离器的结构

如图1至12所示的便携式户外孢子分离器，包括消毒槽1、下阀盘2、中 阀盘3和上盖盘4，并自下而上可拆卸式地组装在一起。

消毒槽1用于盛放挥发性消毒灭菌液或无菌水，同时作为便携式户外孢子 分离器的支撑装置位于分离器的底部。

下阀盘2为圆柱体并在圆柱体的圆面21上六等分辐射位置处设有一定直径 的贯穿孔。其中的三个贯穿孔为灭菌孔22，灭菌孔作为挥发性灭菌液的挥发通 道可对采集的生物体样本(例如蚜尸体)以及安装于消毒槽上的下阀盘、中阀盘和上盖盘三个盘组装后形成的流体通道进行灭菌。下阀盘的另外三个贯穿孔为收 集孔23，收集孔用来放置和固定装有无菌培养基的收集管9。在本实施例中，所 述灭菌孔22和收集孔23间隔排布。

中阀盘3为圆柱体并在圆柱体圆面31上三等分辐射位置处设有一定直径的 孔道32，所述孔道32的圆心距离中阀盘圆面中心点的距离与下阀盘的灭菌孔和 收集孔的圆心距离下阀盘圆面中心点的距离相同。中阀盘起到密封隔绝的作用。

上盖盘4为圆柱体并在圆柱体圆面41的下表面设置有凹槽42，在凹槽底 部的圆面上三等分辐射分布位置处设有存样槽43用来存放采集到的生物体。所 述存样槽43槽孔圆心距离上盖盘圆面中心点的距离与下阀盘的灭菌孔和收集孔 的圆心距离下阀盘圆面中心点的距离相同。在一个制造上盖盘的实施例中，首先 在上盖盘圆柱体内挖去一个直径和高度略小于圆柱体的小圆柱体形成凹槽42。 在凹槽底部的圆面上三等分辐射分布位置处，再加工出三个具有一定直径和深度 的小圆形凹槽作为存放生物体样本的存样槽43。在此实施例中，存样槽43并不 贯穿上盖盘。在一个优选的实施例中，上盖盘的存样槽中自带有黏胶层。

为了提高孢子计数的速度，在另一个方案中，上盖盘4的凹槽42底部的圆 面上六等分辐射分布位置处设有存样槽43用来存放采集到的生物体。其中三个 间隔的存样槽用于孢子收集，另外三个间隔的存样槽用来做孢子计数用，这样就 可以用六个存样槽中的样品来计数，计数速度加快1倍。

消毒槽1、下阀盘2、中阀盘3和上盖盘4的材料选自不锈钢、可高温灭菌 且不形变的塑料材料等。优选的为不锈钢，例如下阀盘2、中阀盘3和上盖盘4 均是在具有一定高度和直径的圆柱体形不锈钢材料的基础上加工而成。

便携式户外孢子分离器使用时，自下而上将消毒槽1、下阀盘2、中阀盘3 和上盖盘4组装在一起。当中阀盘3的三个孔道32与下阀盘2的灭菌孔22连通 形成流体通道时，消毒槽内的挥发性灭菌液通过该流体通道对放置在上盖盘4 存样槽43内的生物体样本(例如蚜尸)、流体通道本身和上盖等装置实施灭菌。 当下阀盘2的灭菌孔22与中阀盘孔道32不连通，而是下阀盘放置有收集管的收 集孔23与中阀盘孔道32连通，此时收集孔23与孔道32以及上存样槽43三者 连通，在重力作用下，生物体样本携带的真菌弹射出孢子并顺利地落入放置在下 阀盘收集孔23内装有无菌培养基的收集管中。

户外孢子分离器的消毒槽1、下阀盘2、中阀盘3和上盖盘4相互之间可拆 卸地组装在一起，例如通过螺纹拧合、卡扣件扣合等方式。在一个实施例中，消 毒槽与下阀盘之间通过螺纹拧合的方式组合在一起。

在本实施例中，下阀盘2，中阀盘3和上盖盘4的圆柱体圆面正中心分别 钻出一定直径且具有螺纹的中心孔51，中心孔内可插入螺柱栓5，螺柱栓的作用 是为了使上盖盘、中阀盘和下阀盘三者组装成一个整体。螺柱栓的长度由上盖盘、 中阀盘和下阀盘三个组装在一起时的厚度决定，螺柱栓的直径与各个盘中心孔直 径相适配。在一个优选的设计方案中，螺柱栓只在开始的一端有一段长度的螺纹。

为了让下阀盘2，中阀盘3和上盖盘4各部分彼此紧密地镶嵌在一起，在 一个更优的实施例中，把上述三个盘的各个圆柱体加工出可相互配合的凹凸结 构。例如，下阀盘2包括一个凸部25；中阀盘3包括一个凹部34和一个凸部35；上盖盘4包括一个凹部44。当三个盘组装在一起时，下阀盘的凸部25嵌合在中 阀盘3的凹部34，中阀盘的凸部35嵌合在上盖盘的凹部44。

当下阀盘的灭菌孔22与中阀盘的孔道32及上盖盘连通形成流体通道时， 分离器处于消毒状态；当孢子分离器的下阀盘的收集孔23与中阀盘的孔道32 及上盖盘的存样槽43连通形成流体通道时，分离器处于收集孢子的状态。即本 发明所述孢子分离器可实现在户外先对分离器的下阀盘各孔、中阀盘和上盖盘进 行消毒后，并在无菌状态下实施孢子收集工作。在本实施例中，上盖盘、中阀盘 和下阀盘三者间通过旋转配合的方式实现分离器消毒状态或收集状态的转换。为了使操作者更直观、有效地控制三个盘的旋转角度，分离器上还包括有定位装置， 保证每次旋转的角度是一个定值，从而保证灭菌孔或收集孔与孔道和存样槽之间 保持顺畅的连通。定位装置选用但不限于以下方式：定位孔6和定位销7的配合、 标记刻痕指示8等。

在定位孔和定位销配合的实施例中，上盖盘、中阀盘和下阀盘的相应位置 处均设有定位孔6，利用定位销7是否能完全插入三盘的上的定位孔6以判断三 个盘的旋转角度是否到位。如图1和2所示，下阀盘上至少设有两个定位孔6， 分别为消毒状态定位孔和孢子收集状态定位孔，上盖盘和中阀盘上至少各设有一 个定位孔。上盖盘和中阀盘的定位孔与下阀盘的消毒状态定位孔对齐，定位销可 顺利插入至三个定位孔内，此时下阀盘的灭菌孔与中阀盘的孔道及上盖盘存样槽 就完全对准形成流体通道，可实施消毒；上盖盘和中阀盘的定位孔与下阀盘的孢子收集状态定位孔对齐，定位销可顺利插入至三个定位孔，此时下阀盘的收集孔 与中阀盘的孔道及上盖盘的存样槽对齐，可收集孢子。

在标记刻痕的实施例中，下阀盘的盘边缘上至少设有两条标记刻痕8，上 盖盘和中阀盘盘边缘上至少设有一条标记刻痕8。下阀盘的一条标记刻痕为消毒 状态的标记刻痕，当上盖盘和中阀盘的标记刻痕与下阀盘的消毒状态标记刻痕对 齐时，下阀盘的灭菌孔与中阀盘的孔道及上盖盘连通形成流体通道时，分离器处 于消毒状态；下阀盘的另一条标记刻痕为收集状态的标记刻痕，当上盖盘和中阀盘的标记刻痕与下阀盘的消毒状态标记刻痕对齐时，下阀盘的收集孔与中阀盘的 孔道及上盖盘的存样槽连通形成流体通道时，分离器处于收集孢子的状态。

在一更优选的实例中，分离器包括定位孔和定位销，在定位孔处对应的盘 边缘上设标记刻痕。一方面定位孔和定位销的结合确保三个盘旋转角度的准确 性，另一方面，标记刻痕更容易让实验者观察到需要旋转的方向和角度。在一个 优选的方案中，标记刻痕处还可标注灭菌或收集字样，以提醒实验员分离器目前 的状态。

实施例2利用实施例1所述便携式孢子分离器采集孢子的方法

以采集虫霉目真菌孢子为例进行具体说明。所有操作者戴口罩和一次性橡 胶手套进行操作。

用75％的酒精或其他消毒液首先对下阀盘2、中阀盘3、上盖盘4等部件进 行消毒处理。

将一定量的挥发性灭菌液装入消毒槽1中，用消毒过的取样棒获取感病蚜 虫(例如用喷有75％酒精处理过的毛笔取感病蚜虫)，将感病蚜虫(蚜尸)固定于上盖盘内顶部间隔位的存样槽43中。固定感病蚜虫的方式可以是借助双面胶 或存样槽自带的黏胶层等方式实现。

将下阀盘2装在消毒槽1上，消毒数分钟之后把装有无菌培养基(例如无 菌蛋黄培养基)的孢子收集管(图中未视出)放置在间隔设置的三个收集孔23 中，快速组装上灭过菌的中阀盘3，保持下阀盘2的灭菌孔22与中阀盘3上的 孔道32连通，即收集管处于封闭状态。最后把上盖盘4安装在中阀盘之上，且使装有蚜尸的存样槽与下阀盘的灭菌孔、中阀盘的孔道三者连通，灭菌1min。 所述孢子收集管可以是试管或凹底容器等。

上述灭菌完毕后，保持上盖盘4与中阀盘3地同步转动，并一同旋转60 度，此时上盖盘上粘有蚜虫的存样槽43和中阀盘孔道32以及下阀盘收集孔23 内的收集管连通。分离器于20℃恒温培养箱中静置过夜，静待真菌弹孢子，在 重力作用下真菌所弹孢子会落入装有无菌培养基的收集管中。

恒温箱中放置过夜后，将上盖盘4与中阀盘3同步旋转60度，此时上盖盘 的存样槽与下阀盘的灭菌孔、中阀盘的孔道三者连通，然后依次卸除上盖盘和中 阀盘，取出下阀盘中的收集管，收获收集管中的孢子，待用。

操作至此就已经达到在非超净工作台中收集真菌孢子的目的。消毒槽在整 个操作中的作用是利用其中的挥发性消毒液，使分离器所处空间是一个相对无菌 的环境，与酒精灯火焰周围提供的无菌环境有异曲同工之妙。

保持整个分离器的环境湿度将更有利于孢子的培养。因此，在一个优选方 案中，在装有蚜尸的存样槽与下阀盘的灭菌孔、中阀盘孔道三者连通，灭菌1min 后，上盖盘4与中阀盘3保持同步一同旋转60度，此时上盖盘上粘有蚜虫的存 样槽43和中阀盘孔道32以及下阀盘收集孔23内的收集管连通。之后把消毒槽 中的挥发性消毒液换成无菌水，以用来在恒温培养时保持整个装置的环境湿度。 当分离器在恒温培养箱放置过夜后，把消毒槽1中的无菌水更换成挥发性消毒 液，之后再将上盖盘4与中阀盘3同步旋转60度，依次卸除上盖盘，中阀盘，取出收集管，收获孢子。消毒槽中的消毒液和无菌水的更换，可以直接从消毒槽的上开口通过吸液和注液等方式完成。在如图3所示消毒槽的实施例中，消毒槽 的上部设有注液口11、下部设有排液口12，注液口和排液口上均被可打开的密封件13密封。在一个具体的更换方法中，消毒槽内的消毒液对分离器各部件消 毒后，打开排液口12处的密封件13排出消毒槽内的挥发性消毒液，然后再次用 密封件封闭排液口。接着打开注液口11的密封件13，根据需要从注液口中注入 无菌水，注液完毕后再次用密封件封闭注液口。

消毒槽中的无菌水为真菌弹孢子提供了一定的湿度环境，每日弹孢子数量 相对均匀的变化而不会突然极度下降。在野外采集感病蚜虫时，不可能每隔一段 时间更换新的培养基去收集孢子，因此本发明所述分离器这一性能，其实是从时 间维度上延长了分离到纯的真菌的可能性。这样本发明所述孢子分离器既保证了 不被外界干扰的密闭性，又提供了一个适于真菌生长的湿度要求。

实施例3产孢数量的对比实验

产孢数量指标的对比试验采用实施例1所述便携式孢子分离器收集和冻存 管收集这两种收集方式，计数两种收集方式中的产孢数量。通过统计学方法对两 种方式下孢子数进行差异性分析，进而判定本发明所述户外孢子分离器收集方式 的可行性。选择30头的感病蚜虫作为试验对象，来进行统计学分析即针对两种 方式，各随机选取30头大小接近的感病蚜虫进行试验。

利用实施例1所述孢子分离器和实施例2各盘的安装方式，将收集到的感 病蚜虫用双面胶固定在分离器上盖盘中的存样槽中，把凹底容器放到分离器下阀 盘的收集孔上，往凹底容器中事先加入0.5％SDS溶液250μL，让感病蚜虫与凹 底容器一一对应。然后，将分离器放在光照培养箱(20℃，12L:12D)中培养， 每隔24小时更换凹底容器，直至感病蚜虫不再弹孢。每个凹底容器中的孢子液 用血球计数板的方法在光学显微镜下进行观察计数7个0.1μL液样中的孢子。血 球计数区有25个格子，每次只随机选取5个格子计数，5个格子的液体体积为0.02ul，所以计算凹底容器中的孢子数时需要乘以一个系数k＝5*10⁴。将每天弹射孢子的数量都加起来，即可得到该只蚜虫的产孢总量。

冻存管收集方式是：将冻存管管体中间截取一部分，使得盖子部分与底部 贴合较近，底部加0.5％SDS溶液200μL，将收集的感病蚜虫用双面胶固定在盖 子中央，使得盖上以后虫体与试剂贴合较近又不能与试剂溶液表面接触，能够尽 可能多的收集蚜虫上弹射下来的孢子。然后，将所有采孢冻存管在光照培养箱 (20℃，12L:12D)中培养，每隔24小时进行更换底部冻存管，直至感病蚜虫 不再弹孢。每个冻存管管体中的孢子液用血球计数板的方法在光学显微镜下进行 观察计数7个0.1μL液样中的孢子。血球计数区有25个格子，每次只随机选取 5个格子计数，5个格子的液体体积为0.02μL，所以计算冻存管中的孢子数时需要乘以一个系数k＝5*10⁴。将每天弹射孢子的数量都加起来，即可得到该只蚜虫 的产孢总量。

根据对样本容量为30头的感病蚜虫进行的连续计数，对数据进行统计分析 后其结果如图13和图14所示。

图13是通过对弹孢时序每日冻存管和分离器中30个样本该日的平均产孢 子数进行t检验得出的，由图13可知，第一天、第二天、第三天冻存管和分离 器收集到的孢子数无显著性差异，第四天和第五天冻存管和分离器收集到的孢子 数有极显著性差异。分离器的这一性能，为病原真菌的野外采集赢得了时间，这 是非常具有实际应用价值的。

图14显示每日累加的产孢子量，第五天即为所有样本弹孢量的总量。两种 方式收集到的产孢数量之间的差异并不大，由图14可知在第一，第二天的每日 弹孢子数量，冻存管中的数量虽然比分离器中的多，但是从统计学角度两者无显著差异，第三天两者弹孢子数量也是无显著性差异，但是从第三天开始，分离器 中的弹孢子数量比冻存管中的多，第四，第五天两者出现极显著差异，最后累积 的结果是分离器中收集到的总的弹孢数量比冻存管中的多。冻存管方式收集孢子 前期产孢稍多，而总数较少，分离器法收集孢子前期产孢稍少，而产孢总量较多， 从弹孢数总量的结果来看，也证实了分离器具有更好的收集性能。结合图13和 图14的结果表明，本发明所述的分离器法优于传统的冻存管法。

实施例4分离器无菌性验证

无菌评价指标主要通过对分离器收集方式与传统收集方式这两种收集方式 下，收集结果中无菌情况样本数进行统计学分析来判定分离器收集方式的可行 性。选择30头的感病蚜虫作为试验对象。

新蚜虫疠霉在普通的常规条件下培养非常难，因为新蚜虫疠霉是一种专性 昆虫病原真菌，而这种专性病原真菌对于生活环境和营养需求很高，所以我们采 用萨氏培养基并且在其中加入蛋黄和牛奶来进行分离和离体培养。

传统收集方式：

1.对超净工作台的台面进行酒精擦拭，之后照紫外灭菌30min；

2.剪取小块双面胶，粘贴于培养皿皿盖内表面上中心位置；

3.用75％的酒精消过毒的毛笔取感病蚜虫一头，粘在双面胶上，之后拿着 皿盖，放置在盛有消毒液的消毒槽的上方进行消毒灭菌，1min之后，再将皿盖 放置在盛有蛋黄培养基的培养皿上；

4.20℃培养箱中过夜放置后用新的无菌皿盖换下之前粘有感病蚜尸的皿 盖，继续放置于培养箱中数天；

5.陆续观察数天后，检查培养基是否染菌，记录结果。

本发明所述孢子分离器收集方式：

1.在实验台桌面上，消毒槽中盛有挥发性消毒液，用75％的酒精对分离器 中的下阀盘、中阀盘、上盖盘进行灭菌处理；

2.在上盖盘中的三个间隔存样槽中粘贴上双面胶，用毛笔取感病蚜虫，把 感病蚜虫粘在双面胶上；

3.把事先配置好的盛在凹底容器中的蛋黄培养基间隔放置在下阀盘的收 集孔中，迅速盖上中阀盘使凹底容器处于封闭状态(底部消毒槽中的挥发性消毒 液创造了一个无菌的空间)；

4.盖上上盖盘，使下阀盘和中阀盘的孔连通且孔正对着上盖盘的蚜尸体；

5.灭菌1min后，中阀盘和上盖盘一同旋转60°，此时感病蚜虫与下阀盘 的凹底容器处于连通状态；

6.灭菌处理1min；

7.把分离器放在20℃的培养箱中，过夜放置后中阀盘和上盖盘一同旋转 60°，此时凹底容器处于封闭状态；

8.取出分离器放于实验台上，卸除上盖盘、中阀盘，把凹底容器迅速取下 放入到一次性培养皿中，培养皿用封口膜封好；

9.把培养皿放置在20℃的培养箱中培养；

10.在培养的过程中检查培养基的染菌情况，做好记录。

无菌情况的鉴定说明。无菌情况的定义应该包括两个部分：一个是培养基 分离到单一的菌落，另一个是培养基保持无菌的状态即无杂菌在培养基上生长， 因为实际情况中判定蚜虫是否感病取决于采样者的经验即人认为的感病蚜虫也 可能实际并没有感病，那么此时就无法获得目的真菌孢子也就无法分离到孢子， 此时如果分离培养基上没出现杂菌生长，说明分离器保证了分离操作中的无菌 性。

实验结果如图15所示：a图为传统分离方式下培养基无变化的样本，b图 为传统分离方式下收集到单一菌落的样本，c图为传统分离方式下染杂菌的样本； d图中的d2，d3为分离器法分离方式下的培养基无变化的样本，e图中为分离到 单一菌落的情况，f图和d1图为培养基本身染菌的情况。传统法中的图ab视为 无菌情况，分离器法中图d2,d3和e视为无菌情况。

无菌性能的统计分析评价：

选择样本容量为30头的感病蚜虫作为试验对象，来进行统计学分析即针对 两种分离方法，各随机选取30只感病蚜虫进行试验。

传统分离方法和本发明所述孢子分离器分离方法在本实验中都开展了三个 批次，第一批次中，传统法的无菌率为96.67％，分离器法无菌率为76.67％；第 二批次中，传统法的无菌率为66.67％，分离器法无菌率为58.33％；第三批次中， 传统法的无菌率为69.44％，分离器法无菌率为94.44％。同一批次中的两组数据 在相同条件下开展获得。如图16所示，以柱状图的形式分别列出了第一，二， 三批次中的无菌率，并以这三组数据进行了t检验分析，结果是两种分离方法无 显著性差异即在无菌性能方面，本发明所述孢子分离器法与传统法在超净台中分离真菌在无菌性能方面无差异。

实施例5

本实施例上盖盘的存样槽43为贯穿孔设计，其余的结构以及灭菌收集方式 与前述实施例相同。在生物样本的采集步骤中，剪取与上盖盘存样槽面积略大的 胶布，用75％的酒精消过毒的毛笔取感病蚜虫并将蚜虫转粘在胶布的胶面的中心位置，然后将粘有蚜虫的胶布粘附在上盖盘上表面的存样槽处将存样槽覆盖住。 存样槽的贯穿设计使蚜虫存放于上盖盘的操作更容易。

实施例6

本发明所述的孢子分离器上还安装有定时器55，定时器可随分离器一起被 运送，因此无论分离器被运送到哪里，或换了一名实验员，都能直接从所述分离 器的定时器上获得时间信息，容器灭菌和/或孢子收集等每一个步骤结束后，定 时器就会发出提示音提醒实验员。在一个优选的实施例中，定时器可同时显示和 设置灭菌开始时间和/或灭菌结束倒计时，孢子收集开始时间和/或孢子收集结束 倒计时等项目。在如图18所示的实施例中，定时器安装在上盖盘。

实施例7

孢子分离器上还可安装有温度控制器，以将分离器的温度控制在孢子收集 和生长的最适温度。例如不锈钢的消毒槽底部设有温度控制器，可将温度控制器 的温度调节到20℃或其他合适的温度，以保持分离器处于恒温培养状态。在另 一个方案中，消毒槽1、下阀盘2、中阀盘3和上盖盘4外部设有保温材料，以 减少分离器与外界环境的热交换。

实施例8

下阀盘的灭菌孔和收集孔的个数和排布方式，中阀盘孔道的个数和排布方 式以及上盖盘的存样槽的个数和排布方式并不限于以上实施例所列举，还可以是 例如，下阀盘的灭菌孔和收集孔分别为2个并在四等分辐射位置间隔排布，与之 对应的中阀盘的孔道或上盖盘的存样槽数量各为2个。图17所示的下阀盘的灭 菌孔和收集孔分别为2个并在四等分辐射位置对称排布，与之对应的中阀盘的孔 道或上盖盘的存样槽数量各为2个。根据需要灭菌孔收集孔孔道和存样槽的个数可以1至N个，N为大于1的数字。

下阀盘、中阀盘和上盖盘的形状并不限于上述实施例所列举的圆形或正方 形，也可以例如椭圆形，多边形等。

实施例9

孢子收集管可能存在加工误差，有些收集管的直径会略大于或略小于设计 尺寸，从而不能顺利放入收集孔中或立于收集孔。因此如图19所示的收集孔23 内侧壁上还嵌设有O形圈56，O形圈具有一定的弹性，孢子收集管插入带有O 形圈的收集孔中，可以被O形圈卡住，特别是孢子收集管直径产生偏差，比正 常收集管稍大的收集管也可以利用O形圈的弹性，挤压O形圈而顺利插入收集 槽中。

通过产孢数量统计的实验可以比较得出：本发明所述便携式户外孢子分离 器的收集性能强于传统冻存管法的孢子收集方式，研究表明分离器装置对于孢子 的收集稳定性能更好，收集到的孢子总量也更多。尽管传统的孢子收集方法让蚜 虫和培养液几乎达到了紧密接触的程度，这能保证真菌所弹孢子尽可能多地被收 集，但是收集管过于封闭，不利于菌的生长，进一步影响到弹孢。而本发明所述孢子分离器的上盖盘与收集管之间具有一定的距离，给密闭空间提供了一个更有 利于真菌生长的环境。

通过对无菌性情况的统计分析可以得出：本发明所述便携式户外孢子分离 器的无菌性与传统方法的无菌性无显著性差异，但是传统方式的操作局限性很 大，需要借助类似在超净工作台这样的无菌设备开展分离实验，而分离器装置结 构简单、小巧，携带方便，易操作，可以在户外随时随地使用，大大地提高了工 作效率，应用更为广泛。同时分离器装置还有着许多传统收集方法不具备的功能，分离器装置可以兼顾灭菌，收集培养等多项功能。本发明所述分离器装置实际应 用价值巨大，而且具有开放性和普及性，造价便宜具有很大的市场前景，能够为 生物防治等许多产业提供关键的装备支持。

Claims (8)

1.一种户外孢子分离器，包括消毒槽、下阀盘、中阀盘和上盖盘，并自下而上可拆卸式地组装在一起，其特征在于，下阀盘上设置有贯穿下阀盘的灭菌孔和收集孔，中阀盘上设置有贯穿中阀盘的孔道，孔道至少具有位于下阀盘的灭菌孔之上或收集孔之上的两种安装位，上盖盘上设置有存样槽，存样槽至少具有位于下阀盘的灭菌孔之上或收集孔之上的两种安装位，中阀盘可相对下阀盘移动，上阀盘可相对下阀盘移动，并使孢子分离器具有至少两种安装位，其中第一种安装位为灭菌孔、孔道和存样槽三者连通，第二种安装位为收集孔、孔道和存样槽三者连通，消毒槽、下阀盘、中阀盘和上盖盘为圆柱体，下阀盘圆柱体的圆面等分辐射处设置有灭菌孔和收集孔，中阀盘圆柱体的圆面等分辐射处设置有孔道，上盖盘圆柱体的圆面等分辐射处设置有存样槽，灭菌孔和收集孔的圆心到下阀盘圆面中心点的距离、孔道圆心到中阀盘圆面中心点的距离、存样槽圆心到上盖盘圆面圆心的距离，上述三者的距离相等。

2.根据权利要求1所述的户外孢子分离器，其特征在于，灭菌孔和收集孔至少各包括两个，并间隔排布。

3.根据权利要求1所述的户外孢子分离器，其特征在于，中阀盘等分辐射的角度是下阀盘等分辐射角度的两倍。

4.根据权利要求1所述的户外孢子分离器，其特征在于，还包括螺柱栓，下阀盘、中阀盘和上盖盘的圆柱体圆面中心位置开设有中心孔，所述螺柱栓插入中心孔内，将下阀盘、中阀盘和上盖盘三者组装在一起。

5.根据权利要求1所述的户外孢子分离器，其特征在于，还包括定位孔和定位销。

6.根据权利要求1所述的户外孢子分离器，其特征在于，所述消毒槽的上部设有注液口，下部设有排液口。

7.一种户外孢子的分离采集方法，其特征在于，采用权利要求1至6之一所述的户外孢子分离器，包括以下步骤：

（1）消毒槽中装入挥发性消毒液，并对下阀盘、中阀盘和上盖盘进行灭菌处理；

（2）上盖盘的存样槽中设置粘胶材料，将感病生物体粘于存样槽中；

（3）将盛有无菌培养基的收集管放置在下阀盘的收集孔中，迅速盖上上盖盘，使上盖盘的存样槽、中阀盘的孔道和下阀盘的灭菌孔连通，灭菌；

（4）灭菌结束后，中阀盘和上盖盘一同转动一定角度，使存样槽、孔道和收集孔连通，在合适的条件下，感病生物体内的真菌孢子弹射于收集管内；

（5）收集完毕后，上盖盘和中阀盘再次转动一定角度，使得收集管处于封闭状态，同时卸除上盖盘和中阀盘，取出收集管，待用。

8.根据权利要求1至6之一所述的户外孢子分离器在户外采集孢子的应用。

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