CN107636464A - 口腔中微生物毒力因子的解毒 - Google Patents

口腔中微生物毒力因子的解毒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定用于对口腔毒力因子解毒的组分的方法，以及用于测定解毒剂的效果的方法。

Description

口腔中微生物毒力因子的解毒
技术领域
本发明涉及用于鉴定用于对口腔毒力因子解毒的试剂的方法，以及用于测定解毒剂的效果的方法。
背景技术
细菌细胞壁的毒素(Henkel等人，EXS.(2010)100：1-29)与健康相关问题诸如败血性休克、发烧和不适相关联(V.Liebers等人，Am J Ind Med.(2006)49(6):474-91)。与健康问题相关的革兰氏阴性细胞壁毒素的示例是内毒素，诸如脂多糖(LPS)、肽聚糖和菌毛；与健康问题相关的革兰氏阳性细胞壁毒素是脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖。存在许多其它的细菌毒素，诸如内毒素和外毒素，如Henkel等人，EXS.2010；100:1-29中所报道的。就口腔环境而言，LPS和LTA似乎是细菌诱导的免疫应答的主要驱动物，或至少是最有特征性的。由身体响应于这些毒素引起的免疫应答取决于毒素的起源和个体对所述毒素的暴露历史。LPS是革兰氏阴性菌的组分，其在菌株与菌株之间不同，如由大肠杆菌(E.coli)的毒力差异所示的(Raetz和Whitfield Annu.Rev.Biochem(2002)71：635-700)。LPS由脂质A片段、核心区域组成，并且可具有O-抗原。已经示出脂质A片段的脂肪酸组合物响应于其与Toll样4(TLR4)受体的相互作用而确定其毒力。LTA已与各种炎性反应相关(Y.Yokoyama等人，ActaOtolaryngol Suppl.(1996)523：108-111)并且与Toll样受体2(TLR2)活化相关。普遍地据信，仅裂解的细菌释放可引发炎症反应的LPS(CA2323630)。然而，Zhang等人示出生长的细菌以与其生长阶段成比例的含量分泌LPS(H.Zhang等人，(1998)Infection&Immunity,66(11),5196-5201)。因此，即使在刷牙之后在牙齿上留下小部分的菌斑也可由于从存在于菌斑中的革兰氏阴性菌释放LPS而引起炎症级联。
检测特定细菌物种的方法已经在本领域中展示。在美国专利公布2012/019735A1中，提出了经由分光光度计法区分致病菌的方法。尽管其能够示出特定细菌的存在，但他们的发明不允许使用者确定特定位点的毒力水平。此外，他们的方法需要在实验室中培养细菌以获得足量的LTA或LPS用于检测。因此，他们的发明缺乏检测存在不可培养物种的能力，并且可能不允许测量生物样品的毒力。
在美国专利5,175,089中，施用使用鲎变形细胞裂解物(LAL)的外毒素(LPS)测定，来测定牙周腔洞中的内毒素量。尽管其能够示出存在的内毒素的总量，缺乏区分患病内毒素相对于健康内毒素的能力，并且不能量化内毒素的毒力水平。此外，他们的发明将其限制于革兰氏阴性内毒素，因为LTA不可通过LAL试剂盒检测。
TLR信号转导涉及伴侣蛋白10与活化簇中的Toll样受体的缔合。在美国专利公布2009/0047240中，伴侣蛋白10(Cpn10)抗体用于调节细胞系(鼠RAW264)中Cpn10的成簇，从而改变TLR的信号转导。尽管其示出了HEK细胞系中的TLR-4、7和9报告基因，但他们的体系不允许对具有较弱活化LPS的微生物群所需的更敏感或低水平的检测，因为那些基因仅处于NFkB结合位点的控制下(最小启动子)。他们的体系缺乏区分具有多种微生物物种和不存在大量生物体的生物体系所需的敏感性。此外，他们的体系需要强NFkB激活因子以克服用于其体系中的弱启动子，因此不能吸收较弱的TLR LPS激动剂，诸如来自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的LPS。此外，他们的体系缺乏检测TLR3激动剂的能力，这对表征炎性疾病诸如齿龈炎是不利的。
美国专利公布2007/0160544描述了用于测定口腔有害细菌的方法。他们的方法要求齿龈细胞与细菌或细菌组分接触并测量炎性标记。根据美国专利公布2007/0160544，标记的存在指示炎症和细菌标记是有害的。相反地，认为不存在标记指示细菌不是问题。尽管其引用了本领域已知作为产生细胞因子的路径的一部分的Toll样受体，但其方法仅允许确定细胞因子的存在。概述于‘544中的方法基于Dongari-Bagtzoglou和Ebersole在J.Perio.Res.31:90-8 1996中的工作，其中Dongari示出通过测量IL-1β、IL-6或IL-8细胞因子的产生，人齿龈成纤维细胞可用于筛选炎症反应的细菌。‘544专利申请类似于Madiano等人在J.Clinical Perio.32:57-71 2005中的工作，其中Madiano概述了关于细菌毒力因子的文献并且公开了牙龈细胞的概念作为确定来自多种菌种的多细菌组分的抗炎特性的方法。他们的体系提出了使用由通过任何Toll样受体活化的宿主免疫应答产生的指示物质(细胞因子)。经过他们提出的体系可产生细胞因子，如在文献(Shapira等人，J.Dent.Res.76:1381-6 1997)中展示的，但他们提出的发明可能不允许量化特定的细胞因子，也不能允许测定细菌组分的毒力潜力。因此，需要可定量毒力并且测定效能水平的发明。
因为口腔细胞包含细菌毒力因子可对其激活的一种或多种受体，所以筛选个体受体需要使用工程化细胞，诸如包含感兴趣的受体基因的报告细胞。使天然口腔细胞诸如齿龈细胞的使用进一步复杂化的是受体如Toll样受体的表达和活化对于细胞功能是特异性的。齿龈细胞由于其与牙菌斑中微生物的不断接触而不太可能对细菌毒力因子起反应。因此，需要具有工程化细胞，其中直接反应可经由报告体系测量。
除了量化细菌组分和副产物的毒力之外，还需要有机和无机分子的炎症潜能的体外筛选，这可允许测定药代动力学参数。
发明内容
本发明提供一种用于鉴定用于对口腔毒力因子解毒的方法，所述方法包括提供表达TLR2或TLR4中的至少一种的报告细胞；提供口腔毒力因子；提供潜在解毒剂；将口腔毒力因子和潜在解毒剂与报告细胞混合；测定毒力因子的EC50。
本发明提供用于鉴定与脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种结合的解毒剂的方法，所述方法包括提供表达TLR2或TLR4中的至少一种的报告细胞；提供脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种；将脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种和潜在解毒剂与报告细胞混合；使用低EC50脂多糖或脂磷壁酸的BODIPY法或LAL法中的至少一种测量潜在解毒剂的结合；以及测定脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种的EC50。
本发明提供口腔护理组合物，所述口腔护理组合物包含下列中的至少一种：氯化十四烷基-γ-甲基吡啶鎓、亚油酸钾、十六烷基硫酸钠、fenugreek、N-吡啶鎓氯化物(steapyrium chloride)、α-甘油单油酸酯、硬脂基二乙醇胺、二甲氨基丙基十二烷基酰胺、硬脂基酰氨基丙基二甲基胺、亚油酰胺、N-十二烷基二乙醇胺、硬脂基三甲基氯化铵、六聚乙二醇单癸醚、月桂基聚氧乙烯醚-6、月桂基聚氧乙烯醚-9、季铵-17、溴烯醇内酯、油胺、十六烷基三甲基氯化铵、或棕榈酰胺单乙醇胺。
附图说明
图1A具有示出培养时细菌生长期间的LPS分泌的图。
图1B具有示出培养基中细菌生长的时间过程的图。
图1C具有示出培养时细菌生长期间的LPS分泌的图。
图1D具有示出在培养24小时下细菌生长期间的LPS分泌的图。
图1E具有示出在培养24小时下细菌生长期间每个细菌的LPS量的图。
图2A具有示出来自不同细菌的脂多糖的细胞培养物和毒力测定的图。
图2B具有示出培养时TLR4报告基因的细菌活化的图。
图2C具有示出培养时细菌生长的上清液活化TLR4报告基因的图。
图3具有示出氟化亚锡抑制由大肠杆菌LPS刺激的TLR4报告基因表达的图。
图4具有示出氟化亚锡抑制牙龈卟啉单胞菌LPS活化TLR2报告基因表达的图。
图5具有示出通过氟化亚锡减少牙龈卟啉单胞菌LPS对TLR-4的活化的百分比的图。
图6具有示出激活TLR4-SEAP信号转导的龈下菌斑的EC50测定的图。
图7具有示出人龈下菌斑(健康相对于齿龈炎)的TLR4评价的图。
图8A具有示出来自不同细菌的LTA的细胞培养和毒力测定的图。
图8B具有示出来自不同细菌的LPS的细胞培养和毒力测定的图。
图8C具有示出来自不同细菌的LPS的细胞培养和毒力测定的图。
图8D具有示出来自不同细菌的LPS的细胞培养和毒力测定的图。
图9具有示出激活TLR2-SEAP信号转导的龈下菌斑的EC50测定的图。
图10具有示出人龈下菌斑(健康相对于齿龈炎)的TLR2评价的图。
图11具有示出来自不同细菌的鞭毛蛋白的细胞培养和毒力测定的图。
图12具有示出人单核细胞THP-1中的LPS刺激的TLR活性的图。THP-1细胞产生了多种功能性TLR受体。
图13具有示出在THP1双报告细胞中检测不同细菌的LTA的图。
图14具有示出临床测量的图。
图15具有示出龈缘菌斑中的DNA总量的丰度变化的图。
图16A具有示出在六周方案治疗期间龈上菌斑中细菌丰度减小的图。
图16B具有示出在六周方案治疗期间龈上菌斑中细菌相对丰度减小的图。
图17具有示出经过六周方案治疗，颊面-刷样品中瓜氨酸浓度减小的图。
图18具有示出治疗期间，颊面刷样品中蛋白质结合鸟氨酸减少的图。
图19具有示出鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸循环中的酶的图表。
图20具有示出6周治疗期间鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸基因的表达变化的图。
图21具有示出在实验性齿龈炎中，颊面-刷样品中瓜氨酸浓度增加的图。
图22具有示出在实验诱导性齿龈炎中，颊面刷样品中蛋白质结合瓜氨酸减少的图。
图23具有示出在实验诱导性齿龈炎中，颊面刷样品中蛋白质结合鸟氨酸的浓度增加的图。
图24具有示出在实验诱导性齿龈炎中，颊面刷样品中总鸟氨酸的浓度增加的图。
图25具有示出在实验诱导性齿龈炎中，颊面刷样品中蛋白质结合精氨酸的浓度减小的图。
图26具有示出在实验诱导性齿龈炎中，颊面刷样品中总精氨酸的浓度减小的图。
图27具有示出瓜氨酸抑制THP-1细胞中由牙龈卟啉单胞菌LPS 1690刺激的细胞因子产生的图。
图28具有示出细菌LTA以剂量依赖方式降低BC荧光染料的荧光强度的图。
图29具有示出LPS以剂量依赖方式降低BC荧光染料的荧光强度的图。
图30具有示出细菌培养物的上清液以剂量依赖方式降低BC荧光染料的荧光强度的图。
图31具有示出细菌以剂量依赖方式降低BC荧光染料的荧光强度的图。
图32具有示出氟化亚锡与大肠杆菌LPS结合的图。使用MALDI-TOF质谱检测氟化亚锡与LPS的结合。
图33具有示出氟化亚锡抑制LPS活化THP-1细胞中的TLR-报告基因的图。
图34具有示出氟化亚锡抑制LPS刺激人原单核细胞中细胞因子产生的图。
图35具有示出氟化亚锡移除LPS刺激人原单核细胞中细胞因子产生的图。
图36具有示出结合到TLR4受体的大肠杆菌LPS的图片。
图37A具有示出细菌刺激人原血单核细胞中促炎性细胞因子产生的图。
图37B具有示出细菌刺激人原血单核细胞中促炎性细胞因子产生的图。
图37C具有示出细菌刺激人原血单核细胞中促炎性细胞因子产生的图。
图37D具有示出细菌刺激人原血单核细胞中促炎性细胞因子产生的图。
图37E具有示出细菌刺激人原血单核细胞中促炎性细胞因子产生的图。
图38A具有示出LPS刺激人原血单核细胞中促炎性细胞因子产生的图。
图38B具有示出LPS刺激人原血单核细胞中促炎性细胞因子产生的图。
图38C具有示出LPS刺激人原血单核细胞中促炎性细胞因子产生的图。
图38D具有示出LPS刺激人原血单核细胞中促炎性细胞因子产生的图。
图38E具有示出LPS刺激人原血单核细胞中促炎性细胞因子产生的图。
具体实施方式
如本文所公开的，令人惊奇地发现，本发明可用于检测并量化龈下菌斑和龈上菌斑中的毒力，因此区分健康齿龈与患有齿龈炎症状的发炎位点。本发明可通过检测细菌毒素如内毒素，使用非齿龈工程化细胞测定口腔健康状态。另外，宿主对毒力因子的反应方式可利用宿主的代谢途径来测定，诸如量化尿素循环的产物来测定。
毒力因子为由微生物诸如细菌、真菌、或原生动物，或者微生物剂诸如病毒产生的分子，这两者均在宿主炎症反应方面有助于微生物或微生物剂的致病性。毒力因子的非限制性示例包括下列中的一种或多种：来自革兰氏阴性菌的脂多糖；来自革兰氏阳性菌的脂磷壁酸；来自细菌的核酸，诸如DNA和/或RNA；来自微生物蛋白质和/或酶，诸如蛋白酶、脂肪酶或凝固酶；鸟苷三磷酸水解酶劫持剂，如沙门氏菌蛋白SopE，其可加速宿主细胞定植；菌毛；鞭毛蛋白；粘连；胞外多糖；外毒素如破伤风毒素；铁载体；细胞毒素；超抗原；和纤毛。
如本文所用，解毒、去毒和/或排毒是指毒力因子的失活。毒力因子的非限制性示例为来自革兰氏阴性菌的脂多糖或内毒素；或者来自革兰氏阳性菌的脂磷壁酸。毒力因子的失活被定义为毒力因子丧失其刺激宿主免疫应答的能力。刺激宿主免疫应答的非限制性示例可以为Toll样受体中一种或多种，如TLR-4的活化，其中脂多糖可具有对该受体的一定活化水平。该受体的活化减少30％或更多可在解毒的定义内。另外，解毒可以为从体系中移除毒力因子。
Toll样受体(TLR)为在免疫应答中起作用的真核细胞中的一类蛋白质。目前该类具有经鉴定的13种蛋白质并可随着该领域中的研究扩展而增长。其通常缩写为TLR-#，其中#为1至13。这些中的一些为跨膜蛋白，其位于真核细胞的表面上并且允许对细胞周围的环境起反应。具体的反应包括检测病原菌成分，如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖。另外，TLR蛋白质中的一些被称为模式识别受体或病原体相关分子模式(PAMP)。
齿龈炎根据FDA专著(12CFR第356章，第68卷，103号(2003))定义为“最常由牙菌斑引发的齿龈的炎性损伤。齿龈炎的特征在于组织肿胀和发红、点彩(其中健康的齿龈表面由小叶组成的正常状态)损失、光泽表面和升高的组织温度。齿龈还在温和刺激时，诸如刷牙时出血，或可自发出血。齿龈炎通常不疼。”在该专著中，牙菌斑被定义为由多种细菌物种组成。这些物种对宿主组织实施恒定的炎性压力。
当炎症进展到齿龈炎状态时，需要量化其严重程度以及口腔卫生产品的治疗在减少炎症反应方面的有效程度。由于齿龈细胞上的膜结合受体活化引起的炎症反应减少被称为解毒；并且需要测量解毒水平以教育消费者其口腔卫生的功效，这是本领域中缺少的。
齿龈炎的发病机制涉及细菌和宿主反应。本发明公开了体外测量牙菌斑中的毒力因子的方法，并且还公开了体内测量毒力因子对齿龈组织的影响的方法。所述方法允许理解牙菌斑中存在哪些毒力因子类型，以及宿主如何反应。重要的是，这些测量根据牙菌斑中微生物的毒力因子和宿主健康状况提供了对齿龈炎严重性的详细评估。此外，这些方法有助于评价技术在预防和治疗齿龈炎方面的效果。
本发明的方法包括：(1)使用内毒素检测试剂盒或BODIPY-TR尸胺法量化存在于生物样品中的总LPS和LTA并且检测抑制内毒素检测测定的技术；(2)使用Toll样受体测定来确定经纯化毒力和口腔牙菌斑的效能，并测量中和毒力因子的毒性的技术的功效；(3)使用元测序来鉴定并量化龈上菌斑中的细菌，(4)测量齿龈拭子样品中的鸟氨酸和瓜氨酸以确定齿龈组织的健康状况，(5)测定抑制瓜氨酸在LPS诱导性促炎性细胞因子产生方面的活性，(6)测量SnF2与LPS的结合，和(7)测定细菌和LPS对刺激人原血单核细胞中细胞因子产生的有效剂量50。
上述方法和化学物质可以条形式施用于牙齿和齿龈线的外表面。所述条可包含着色试剂或荧光试剂以与存在的毒力因子相互作用，从而允许半定量测定存在的毒力。这将允许快速评估齿龈炎和/或牙周炎疾病的严重程度或确定口服产品的效果。所述方法的该类型实施可允许消费者在家中确定其牙齿健康的状态或允许专业人员诸如牙医快速测量患者的口腔健康状态。
在实施本发明的过程中，佩戴者可将材料条带施加于期望的口腔表面。材料的面向口腔表面的侧面至少是其中施加本文所述组合物的侧面。该口腔护理组合物提供活性物质的载体以及口腔表面与材料条带之间的粘附性，长时间将材料条带保持在适当的位置。使用材料条带的时间段可为例如约一至约三十分钟。
所述条带包括一个或多个层，其中第一层可包含抗菌剂和生物膜/菌斑溶解剂如精油。第一层可溶解，留下包含解毒剂的第二层。第三层可包含背衬试剂。另选地，前两层可完全溶解而不需要背衬试剂。此外，在某些实施方案中，所述条带可以为包含解毒剂的单一可溶层。
材料条带可通过将材料条带轻轻地压按，而易于贴合口腔护理表面。佩戴者易于通过使用手指或指甲将材料条带剥离，来移除所述材料条带。在某些实施方案中，每次相继治疗使用全新的材料条带。
在口腔护理表面为牙齿表面的情况下，无需在施加本发明的递送体系之前准备牙齿表面。例如，佩戴者可能或可能不选择在施用递送体系之前刷牙或漱口。在施用材料条带之前，不要求干燥牙齿表面，也不要求用唾液或水过分润湿牙齿表面。
本文的递送体系可任选用两个手指施用至需要治疗的口腔表面并且允许保留在适当位置上至少五分钟。可施用递送体系以覆盖牙齿的至少一部分和邻接软组织(齿龈)区域的至少一部分。
上述方法可用于确定有机和无机分子的细胞影响，例如，在分子与靶受体之间存在相互作用时。另外，本发明的方法可用于确定分子是否可导致刺激或炎性反应，在该反应的受体已知时。如本文所述，所讨论的受体将用于报告体系，并且确定所讨论的分子的分子影响。可测定所讨论的分子对于与生物学应答相关的受体的EC50值，因此减少或消除了进行动物测试的需要。
代谢变化在齿龈炎期间出现于齿龈组织，包括碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸以及它们的代谢产物的降解和合成。这些变化可改变齿龈组织、唾液、牙龈沟液和牙菌斑中的RNA、核酸、碳水化合物、脂质、脂肪酸、蛋白质、肽、氨基酸及其代谢产物的含量。此类生物活性分子对刺激炎性反应或促进组织修复非常有效。因此，齿龈炎的代谢变化有利于缓解牙龈炎或加剧对牙周组织的炎性或有害损伤。
瓜氨酸和鸟氨酸为尿素循环中的两种氨基酸。瓜氨酸首先由Koga和Odake在1914年从西瓜中分离。其是尿素循环途径中的重要中间体。瓜氨酸还作为由一氧化氮合酶催化的酶反应的副产物产生。后者将精氨酸氧化成一氧化氮和瓜氨酸。一氧化氮是重要的血管扩张剂，并且还有助于宿主防御，并且似乎对某些病原体具有细胞生长抑制和细胞毒作用。此外，一些革兰氏阳性菌，诸如金黄色葡萄球菌，也可将精氨酸转换成一氧化氮和瓜氨酸。鸟氨酸是精氨酸酶的产物之一，其将精氨酸水解成鸟氨酸和尿素。
瓜氨酸和鸟氨酸都不由任何基因密码子编码，即不是任何新合成的蛋白质。然而，宿主和细菌酶均可将蛋白质中的精氨酸残基改性为瓜氨酸或鸟氨酸残基。结果，改性的蛋白质丧失其原始功能或者获得新活性。重要的是，细菌产生毒力因子，所述毒力因子具有将蛋白质中的精氨酸转化为鸟氨酸或瓜氨酸的酶，从而将蛋白质的功能改性以导致致病条件或帮助组织愈合。
代谢变化也改变细胞因子、趋化因子、细胞外基质蛋白和其它细胞蛋白的产生和表达。类似地，代谢变化使不同种群的免疫细胞转移。在这些变化中，包括与齿龈组织中的碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸相关的小分子，都将反映齿龈组织的健康状况，并可以单独用作生物标记。总的来说，这些变化将详细评估口腔中毒力因子的效能和水平。
除非另外指明，下文中所用的所有百分比和比率均按总组合物的重量计。除非另外指明，本文提及的所有成分的百分比、比率和含量均基于该成分的实际含量，并且不包括在市售产品中可与这些成分一起使用的溶剂、填料或其它物质。
除非另外指明，本文提及的所有测量均在约25℃(即室温)下进行。
如本文所用，单词“包括/包含”及其变体旨在是非限制性的，使得列表中条目的叙述不排除其它也可能在本发明的材料、组合物、装置和方法中有用的类似条目。
如本文所用，词语“或”在用作两个或更多个元素的连词时，是指包括单独的所述元素或所述元素的组合；例如X或Y是指X或Y或二者。
所谓“个人护理组合物”是指在常规使用过程中被施用至身体表面或与身体表面接触以提供有益效果的产品。身体表面包括皮肤，例如表皮或粘膜；身体表面还包括与身体表面相关联的结构，例如毛发、牙齿、或指/趾甲。个人护理组合物的示例包括被施用于人体以改善外观、清洁、和气味控制或整体美观的产品。个人护理组合物的非限制性示例包括毛发着色组合物、口腔护理组合物、剃须后凝胶和霜膏、剃须前制剂、剃刮凝胶、霜膏或泡沫、保湿剂和洗剂、咳嗽和感冒组合物、免洗型皮肤洗剂和霜膏、洗发剂、调理剂、沐浴凝胶、条皂、盥洗室条皂、止汗剂、除臭剂、脱毛剂、口红、粉底、睫毛膏、防晒美黑霜和防晒乳液。
如本文所用，所谓“口腔护理组合物”是指在一般使用过程中不是被故意吞咽以用于特定治疗剂的全身给药的目的，而是在口腔中保留足够长的时间以接触牙齿表面或口腔组织的产品。口腔护理组合物的示例包括洁齿剂、漱口水、摩丝、泡沫、口喷剂、锭剂、咀嚼片、口香糖、牙贴白、牙线及牙线涂层、口气清新可溶解条带、或义齿护理或粘合剂产品。所述口腔护理组合物还可掺入到条或膜上，用于直接施用或粘附到口腔表面。
如本文所用，术语“洁齿剂”包括牙齿或龈下糊剂、凝胶、或液体制剂，除非另外指明。洁齿剂组合物可以是单相组合物，或可以是两种或更多种单独洁齿剂组合物的组合。洁齿剂组合物可呈任何期望的形式，如深条纹的、浅条纹的、多层的、糊剂周围有凝胶的、或它们的任意组合。在包括两种或更多种单独洁齿剂组合物的洁齿剂中，每种洁齿剂组合物均可被包含于物理上独立的分配器隔室中，并且并排分配。
如本文所用，术语“牙齿”是指自然牙齿以及人造牙齿或假牙。
本发明可包括获得口腔物质样品。口腔物质可包括齿龈线菌斑、龈下菌斑、龈上菌斑、间质菌斑、齿龈沟液(GCF)、齿龈活检、唾液或舌拭子。口腔物质可通过本领域中已知的任何方法获得，例如，龈下菌斑样品可通过刮擦或通过使用纸尖来物理收集。菌斑可从牙槽离开牙齿下龈、形成的牙周腔洞、或在齿龈线处收集。例如，可将每个纸尖置于牙齿和齿龈之间的腔洞中10秒。在10秒之后，可移除纸尖并且置于具有700μl磷酸盐缓冲盐水的预标记的1.5ml管中。可用三个以上的纸尖重复取样规程。在收集全部四个纸尖之后，将1.5ml管密封，涡旋30秒并置于干冰上直至样品储存在-80℃冷冻机中。另一种收集方法可包括有助于从牙齿表面释放菌斑的机械装置，诸如声波除垢器。口腔物质可在治疗从其中获得口腔物质的口腔位点之前和之后获得。从其中获得口腔物质的口腔位点包括宿主组织和细菌物质。口腔位点的进一步治疗可多于一次，并且可包括多次不同的治疗，例如方案，诸如刷牙之后漱口。除了在完全治疗之前和之后获得口腔物质之外，口腔物质还可在独立治疗之间获得，例如在刷牙之后利用漱口水之间获得。
口腔物质样品与报告细胞中的Toll样受体混合。可用于本发明的Toll样受体的示例包括TLR 2、TLR 4、TLR 5和TLR 9。人TLR cDNA(TLR1、2、3、4和5)首先在1998年被克隆并且其序列被公开(Rock FL,Hardiman G,Timans JC,Kastelein RA,Bazan JF.A family ofhuman receptors structurally related to Drosophila Toll.Proc Natl Acad Sci US A.1998年1月20日；95:588-93)。Rock等人发现果蝇Toll和人白细胞介素1受体的细胞质结构域共享高序列同源性，并且假设两个分子都触发相关信号通路，这些信号通路与Rel-type转录因子的核移位相关。其克隆了一类假定人受体，所述假定人受体具有在细胞内区段和细胞外区段均类似于果蝇Toll的蛋白质结构。他们假设五个人Toll样受体(命名为TLR1-5)-可能是蝇分子的直接同系物，并且因此可构成人先天免疫的重要且未被识别的组分。公布了TLR1至TLR5的DNA序列之后不久，也发现了其它TLR DNA序列。例如，在1999年报道了TLR6cDNA序列(Takeuchi O1,Kawai T,Sanjo H,Copeland NG,Gilbert DJ,Jenkins NA,Takeda K,Akira S.A novel member of an expanding toll-like receptorfamily.Gene.1999年4月29日；29；231(1-2):59-65)。在2000年报道了人TLR7、TLR8和TLR9的cDNA序列(Chuang TH1,Ulevitch RJ.Cloning and characterization of a sub-family of human toll-like receptors:hTLR7,hTLR8and hTLR9.Eur CytokineNetw.2000年9月；11(3):372-8)。
本文中示出SEQ ID NO：1至9的氨基酸序列的序列表以名称为“13838M_AA_序列表_ST25”的ASCII本文文件形式与本申请同时提交。ASCII文本文件在2016年4月6日形成并且大小为68Kb。根据MPEP§605.08和37CFR§1.52(e)，ASCII文本文件的主题以引用方式并入本文。
TLR蛋白质可形成异源二聚体或同源二聚体。人类中鉴定出10种TLR基因。其基因产物形成细胞膜中的同源二聚体或异源二聚体。例如，TLR1可与TLR形成异源二聚体。类似地，TLR6还可与TLR2组装异源二聚体。另一方面，TLR4形成同源二聚体。Toll样受体(TLR)是在先天免疫体系以及消化体系中起到关键作用的一类蛋白质。它们是跨膜的非催化性受体，所述受体通常在识别源自微生物的结构保守分子的细胞如巨噬细胞、枝状体细胞和齿龈上皮细胞中表达。一旦这些微生物破坏了物理屏障诸如皮肤或肠道粘膜或口腔上皮细胞，其就被激活免疫细胞反应的TLR来识别。Toll样受体是靶向的，因为它们是由牙菌斑中微生物产生的毒力因子的主传感器。TLR 1、2、4、5和6在细胞质膜中表达，从而为毒力因子被宿主受体感测提供了便利途径。TLR 3、7、8和9位于核内体的膜上；并且随着毒力因子被吞噬入细胞中，其也可获得进入TLR 3、7、8和9的途径。
报告细胞是指真核细胞，诸如但不限于HEK 293T、人单核细胞(THP1)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、鼠细胞或猴肾上皮(Vero)细胞，其被工程化以表达预定数的TLR受体，例如单个TLR受体；这与表达多个功能性TLR受体的齿龈细胞相反。因此，一种类型的工程化报告细胞仅响应于牙菌斑中的一种类型的毒力因子。与之相比，齿龈细胞表达多种类型的功能性TLR，并且不能用于鉴定牙菌斑中的单一类型的毒力因子。齿龈细胞的排出物是牙菌斑中各种毒力因子的总和。HEK 293T细胞可用作报告因子，因为其容易维持并且具有与口腔上皮细胞类似的基因表达谱，使其与齿龈细胞的基因表达更密切匹配，从而使得结果将反映体内结果。与天然存在的齿龈细胞相反，本发明的报告细胞容易在实验室中保持并且表型稳定。另外，报告细胞使毒力因子的检测更简单，更加可重复，增加精确性，提供更高通量、更具特异性并且更可量化。
受体基因附接到可编码绿色荧光蛋白、荧光素酶、碱性磷酸酶和/或红色荧光蛋白的另一基因(报告基因)，诸如荧光基因或发光基因的调节序列。报告基因的示例为SEAP报告基因。SEAP报告基因编码分泌型酶，其被称为胚胎碱性磷酸酶或SEAP。例如，在某些实施方案中，将SEAP报告基因置于与五个NFkB和AP-1-结合位点融合的干扰素-β最小启动子的控制下。重组体Toll-样受体结合其配体，并引发一系列反应，从而导致NFkB和AP1转录因子聚集到报告基因启动子，这诱导SEAP表达。与测量免疫应答相比，本发明的报告基因允许快速、特异性和可再现的测量毒力因子。其它受体可与Toll样受体组合使用，例如，核苷酸结合低聚结构域(NOD)1和NOD2识别肽聚糖衍生物、内消旋-二氨基庚二酸(meso-DAP)和胞壁酰二肽(MDP)，并触发宿主先天免疫反应。
受体活化的水平可以通过本领域已知用于所用报告基因类型的任何方法来测定。例如如果使用NFkB-SEAP报告基因，则可测量培养基中SEAP的产生。报告细胞可利用在治疗之前或之后收集的毒力因子或牙菌斑物质处理。报告基因的表达将受刺激并且当受毒力因子刺激时，SEAP被分泌到培养基中。报告基因产物SEAP的含量可用商业试剂盒容易地测量，并且将与特定类型的毒力因子量成比例。类似地，如果使用NFkB荧光素酶、NFkB-β-内酰胺、或其它报告基因，则可用的试剂盒可用于测量报告基因产物。
然后可基于参数如EC50和刺激倍数来测定效能。EC50提供了关于引起炎症反应所需的毒力因子的量的量度，并且刺激的倍数指示毒力因子引起的炎性反应的严重性。EC50用于测定效能；其中如由Merck Manual所定义的，“效能”是指如由分级剂量响应曲线所描绘的，产生50％化学最大效应所需的化合物浓度(EC50)。当占用和响应之间存在线性关系时，EC50等于Kd(解离常数，其为50％的与所述受体结合的所考虑物质的量度)。通常，在受体占用和响应之间存在信号放大，这致使响应的EC50大幅小于(即位于对数剂量响应曲线横坐标的左边)受体占用的Kd。效能取决于化合物对其受体的亲和力，以及化合物-受体交互作用与响应相关联的效率。产生效应所需的化合物的剂量与效能负相关。一般来讲，仅在造成施用不可行的大剂量化合物的需要时，低效能才是重要的。量子剂量响应曲线提供化合物效能信息，所述信息不同于由分级剂量响应曲线导出的信息。在量子剂量响应关系中，EC50为50％个体表现出指定量子效应的剂量。
在本发明中，内毒素或脂多糖的活性可使用内毒素检测测定或LAL测定来测量。鲎变形细胞裂解物(LAL)测试已经用于检测LPS。LAL源于鲎(Limulus polyphemus)的血细胞、或变形细胞。目前，一些主要内毒素检测试剂源于重组蛋白质。下文中，内毒素检测测定和LAL测定互换使用。
在某些实施方案中，基于Toll样受体中的一种或多种的活化来指定毒力的测定。毒力因子包括但不限于：革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞壁组分，如脂多糖和脂磷壁酸；细菌DNA；鞭毛蛋白；肽聚糖；细菌代谢物；菌毛；外膜囊泡；和细菌蛋白质和/或酶。基于Toll样受体的活性降低，毒力减少或“解毒”可用于测量各种治疗物的效果。术语“解毒”或“去毒”或“排毒”是指中和、减少、和/或除去微生物毒力因子，如通过受体活化的减少所测量的，已知所述受体与工程化细胞如报告细胞系中的毒力因子反应。
本发明的口腔护理组合物还可包含一种或多种下列组分，其能够包括金属盐、甜味剂、载体材料、抗微生物剂、口臭减轻剂、不同于过氧化氢的漂白剂、表面活性剂、调味剂、抗牙垢剂、着色剂、感觉剂、研磨抛光材料、增稠材料、湿润剂、和其它添加剂。
A.一种用于鉴定用于对口腔毒力因子解毒的方法，所述方法包括：提供表达TLR2或TLR4中的至少一种的报告细胞；提供口腔毒力因子；提供潜在解毒剂；将口腔毒力因子和潜在解毒剂与报告细胞混合；测定毒力因子的EC50。
B.根据段A所述的方法，其中，所述毒力因子为脂多糖，优选地其中所述脂多糖来自革兰氏阴性菌。
C.根据段A所述的方法，其中，所述毒力因子为脂磷壁酸，优选地其中所述脂磷壁酸来自革兰氏阳性菌。
D.根据段A至C中任一项所述的方法，其中所述潜在解毒剂为下列中的至少一种：氯化十四烷基-γ-甲基吡啶鎓、亚油酸钾、十六烷基硫酸钠、fenugreek、N-吡啶鎓氯化物、α-甘油单油酸酯、硬脂基二乙醇胺、二甲氨基丙基十二烷基酰胺、硬脂基酰氨基丙基二甲基胺、亚油酰胺、N-十二烷基二乙醇胺、硬脂基三甲基氯化铵、六聚乙二醇单癸醚、月桂基聚氧乙烯醚-6、月桂基聚氧乙烯醚-9、季铵-17、溴烯醇内酯、油胺、十六烷基三甲基氯化铵、或棕榈酰胺单乙醇胺。
E.一种鉴定与脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种结合的解毒剂的方法，所述方法包括：
a)提供表达TLR2或TLR4中的至少一种的报告细胞；
b)提供脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种；
c)使所述脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种和潜在解毒剂与报告细胞混合；
d)使用低EC50脂多糖或脂磷壁酸的BODIPY法或LAL法中的至少一种测量潜在解毒剂的结合；以及
e)测定脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种的EC50。
F.一种口腔护理组合物，所述口腔组合物包含：
解毒剂，所述解毒剂为下列中的至少一种：氯化十四烷基-γ-甲基吡啶鎓、亚油酸钾、十六烷基硫酸钠、fenugreek、N-吡啶鎓氯化物、α-甘油单油酸酯、硬脂基二乙醇胺、二甲氨基丙基十二烷基酰胺、硬脂基酰氨基丙基二甲基胺、亚油酰胺、N-十二烷基二乙醇胺、硬脂基三甲基氯化铵、六聚乙二醇单癸醚、月桂基聚氧乙烯醚-6、月桂基聚氧乙烯醚-9、季铵-17、溴烯醇内酯、油胺、十六烷基三甲基氯化铵、或棕榈酰胺单乙醇胺。
G.根据段F所述的口腔护理组合物，其中所述解毒剂以按所述口腔护理组合物的重量计，约0.001％至约2.0％的量存在。
H.根据段F或G所述的口腔护理组合物，其中所述口腔护理组合物为条带。
实施例
实施例1—测定由细菌分泌的脂多糖
细菌的生长：大肠杆菌ATCC 8739的24小时培养物的1ml等分试样用于在250ml带导流板的烧瓶中接种100ml的Luria-Bertani(LB)液体培养基。然后在37℃与搅拌(220rpm)下温育该培养基并且在30分钟时间间隔时取样。在SpectraMax盘式分析仪M3(MolecularDevices，Sunnydale，CA)中评估样品的浊度(OD600)，这是监测微生物生长和生理状态的一种方法。然后记录样品浊度并且将样品在室温下以5000RPM离心10min。随后，使用如下文所述的规程，分析下文中被称为“细菌培养物的上清液”的上清液的LPS含量。
用牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277、苍白普雷沃菌(P.pallens)ATCC 700821或变黑普雷沃菌(P.nigrescens)ATCC 25261接种20ml等分试样的MTGE液体培养基(AnaerobeSystems,Morgan Hill,CA)。这些培养物在Whitely A45厌氧工作站(Don WhitleyScientific，Frederick，MD)中在37℃下以85:10:5N2:CO2:H2气体比率培养过夜。然后，这些起始培养物的1ml等分试样用于接种250ml带导流板烧瓶中的99ml膜-胰蛋白胨葡萄糖提取物(m-TGE)液体培养基。然后如先前所述，在搅拌(200rpm)下培养这些培养物，并且以规则的时间间隔取样。在Tecan Infinite m200Pro(Tecan Trading AG，Switzerland)中评估样品的浊度(OD600)，然后在室温下以16,100×g离心10min。在分析LPS含量之前，将上清液滗析并通过0.22μM过滤器。
在实验时，仅测量OD600。为了以下实验的一致性，将OD600读数转换成细菌数，尽管对于每种细菌，OD600读数和细菌数之间的关系不同。细菌数基于OD600下的分光光度计读数来评价(1.0的OD600＝8×108个细胞/ml)。
鲎变形细胞裂解物测定(LAL)是测定被测试样品中脂多糖(LPS)的总量的测定(Pierce LAL显色内毒素量化试剂盒，ThermoFischer Scientific，Waltham，MA)。按照制造商的说明进行所述测定。首先在37℃下将九十六孔微板在热块中平衡10min。将各自55μl的标准品或样品分配到微板孔中并且在37℃下将覆盖的板培养5min。然后将50μl LAL加入每个孔中。将所述板轻轻振摇并且在37℃下培养10min。加入100μl的显色底物并在37℃下培养6min。最后，加入50μl的终止剂，并且在Spectramax M3盘式分析仪(Molecular Device，Sunnyvale，CA)上在405-410nm下测量吸光度。
图1A、1C和1D示出作为其正常生长周期的一部分，微生物脱落LPS的能力。该数据示出需要将化学物质递送到龈下菌斑以有效减轻LPS，因为刷牙通常不去除龈下菌斑。
由细菌(大肠杆菌K12)脱落的LPS(如通过LAL试剂盒测量，以每ml内毒素单位计(EU/ml))如图1A所描绘的。在120分钟左右，生长培养基开始耗尽复合糖，如以图1B中的细菌生长曲线所反应的，其中LPS脱落开始下降。该数据给出了认为如果存在食物来源，则成熟的生物膜/菌斑可向宿主细胞提供恒量LPS的理由。然后LPS可具有从宿主细胞诱导炎性反应的能力。
重要的是，LPS分泌到细菌培养物的上清液中(图1D)。LPS也存在于细菌壁中(图1E)。另外，该数据还强迫需要将化学物质递送到龈下菌斑以有效减轻LPS，因为刷牙通常不去除龈下菌斑。
实施例2—量化牙菌斑中的毒力因子的LAL测定
具有至少三个出血位点的七名专门小组成员参加该测试。具有执照的牙齿保健师收集龈下菌斑样品。然后在牙齿/齿龈界面处采集样品(仅颊面)，小心避免与口腔软组织接触。从每个专门小组成员取样六个龈下菌斑位点(3个健康位点和3个不健康位点)。不健康牙齿具有出血位点，其具有大于3mm的腔洞，并且健康位点不出血且腔洞深度小于2mm。在取样之前，指示专门小组成员放弃口腔卫生12小时并且避免进食、口香糖、饮水(除了小口水)。接着，在取样位点处用刮匙收集专门小组成员的龈缘菌斑。然后，从相同位点，用3个连续纸尖收集龈下菌斑样品。用棉棒分离取样位点并且轻轻吹干。将纸尖(PROFLOWincorporated，Amityville，New York)轻轻置于腔洞中并持续10秒直至感到最小阻力。10秒之后，取出纸尖并且置于预标记的1.5ml管中。利用另外2个纸尖重复相同取样规程(纸尖进入单独管中)。所有专门小组成员的健康位点的第一、第二和第三样品纸尖分别汇集到三个管中，并分别标记为纸尖1、2和3。类似地，同样汇集不健康位点的样品。
表1示出不健康牙菌斑比健康牙菌斑包含更多内毒素。将1Ml PBS加入1.5ml管中的每个汇集样品中。将细菌在MolBio Fast Prep珠磨器(MP Biomedicals，Santa Ana，CA)中裂解。将样品在4℃下以10,000RPM离心10min，收集上清液并且按照制造商的说明利用LAL测定试剂盒分析，如实施例1中所述。
预期在相同受试者中，在不健康位点中的龈缘菌斑比健康位点中的那些龈缘菌斑具有更多的内毒素(表1)。随后，利用名称为纸尖1、2和3的三个纸尖从龈下腔洞获得三个样品。同样，由纸尖1获得的龈下菌斑在不健康位点中比健康位点中具有更多内毒素(表1)。对于由纸尖2和3获得样品同样如此。重要的是，不健康龈下腔洞中的牙菌斑比健康腔洞的菌斑具有更多内毒素。这可解释不健康齿龈趋于在探测时出血的原因。
实施例3—使用LAL测定试剂盒的技术开发
如实施例1中所述，LAL测定被改性用于开发技术，所述技术抑制LPS在LAL测定中激活酶原。Thermo Scientific Pierce LAL显色内毒素定量试剂盒是用于检测LPS的定量终点测定，所述LPS在改性的鲎变形细胞裂解物测定(LAL)中催化酶原的活化。然后活化的酶原从无色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA中分裂对硝基苯胺(pNA)。产物pNA在405-410nm下光度测量。如果SnF2结合到LPS，则后者不能与LAL试剂盒中的酶原反应。因此，酶原不活化，并且无色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA将不分裂并且不产生有色产物。将牙龈卟啉单胞菌LPS 1690(1ng/ml)或大肠杆菌(1ng/ml)和氟化亚锡以及如表2中所列的其它物质(50μM和500μM)溶于不含内毒素的水中。然后将50μl LAL加入每个孔中。将所述板轻轻振摇并且在37℃下培养10min。加入100μl的显色底物并在37℃下培养6min。最后，加入50μl的终止剂，并且在Spectramax M3盘式分析仪(Molecular Device，Sunnyvale，CA)上在405-410nm下测量吸光度。
如表2中所示，SnF2和一些其它化合物抑制LAL测定时的LPS活性。
实施例4—BODIPY-TR-尸胺与LPS结合，并且用氟化亚锡置换结合的LPS
除了LPS的LAL量化之外，BODIPY方法可用于评估LPS含量。解毒技术能够靶向并中和细菌毒力因子，诸如LPS和LTA。为了开发诸如LPS和LTA螯合作用技术，使用高通量筛选来鉴定破坏由LPS和LTA和其它毒力因子对Toll样受体的活化的分子。高通量筛选利用荧光染料BODIPY-TR-尸胺5-(((4-(4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-基)苯氧基)乙酰基)氨基)戊胺盐酸盐(BC荧光染料)，购自Life Technologies(Carlsbad，CA)，如先前由Wood、Miller和David(2004)所述的(Comb Chem High Throughput Screen，2004年5月；7(3)：239-49。Anti-endotoxin agents.1.Development of a fluorescentprobe displacement method optimized for the rapid identification oflipopolysaccharide-binding agents)。在22℃下进行实验。在96孔实心黑色平底板(Corning Incorporated,Corning,NY)的孔中将大肠杆菌LPS(15μg/ml)与pH 7.4的30μl50mM Tris缓冲液中的SNF2和氯化十六烷基吡啶鎓混合10min，然后添加20μl60μM BC荧光染料，紧接着在22℃或室温下进行荧光测量。在SpectraMax M3自动96孔板分析仪中进行荧光测量(Molecular Device，Sunnyvale，CA)。激发波长为580nM，并且荧光发射在620nM下测量。
如表3中所示，主要的抗齿龈炎技术，诸如氟化亚锡从BODIPY TR尸胺中置换LPS。
表3由结合到BODIPY TR尸胺置换LPS
实施例5—来自不同细菌的脂多糖的细胞培养和毒力测定
报告基因细胞系，人HEK 293T细胞购自Invivogen(San Diego，CA)。HEK 293T细胞用至少两种外源基因，TLR4结构基因和受NFkB转录因子控制的SEAP报告基因稳定转染。细胞系在本文中命名为TLR4-SEAP。报告基因编码分泌型酶，其被称为胚胎碱性磷酸酶或SEAP。将SEAP报告基因置于与五个NF-κB和AP-1-结合位点融合的IL-12p40最小启动子的控制下。此外，TLR4-SEAP细胞系还包含CD14辅助受体基因，其是将LPS转移到TLR4受体所需的。重组体TLR结合其配体，或不同的病原体结合分子，引发一系列反应，从而导致NFkB和AP1转录因子聚集到报告基因启动子，这诱导SEAP表达。
细胞培养和处理：在37℃、5％CO2和95％湿度下，在T75烧瓶中，使500,000个基因报告细胞在包含补充有10％胎牛血清的DMEM培养基的15ml生长培养基中生长并保持三天。就处理而言，96孔板的孔在100μL生长培养基中以10,000个细胞/孔接种。在37℃、5％CO2和95％湿度下将所述细胞培养72小时直至第4天。在第4天，将培养基更换为测定培养基(90μl)，其是不具有胎牛血清的DMEM培养基。如实施例1中所述，首先将LPS、细菌和细菌的培养基溶解或与测定培养基混合。将10μl的细菌、LPS和细菌生长的培养基加入TLR4-SEAP细胞中。24小时后取样，之后添加LPS、细菌和培养基。利用可商购获得的试剂盒量化报告基因(SEAP)的表达(Cayman Chemical Co.(Ann Arbor，MI)的SEAP报告基因测定)。
使用GraphPad Prism软件计算EC50(GraphPad Software，La Jolla，CA)。具有较低EC50的样品比具有较高EC50的那些样品在激活TLR4报告基因方面更有效。如图2A所示，来自大肠杆菌的LPS比来自牙龈卟啉单胞菌的LPS具有更低的EC50，因此比牙龈卟啉单胞菌(Pg)更有效。明尼苏达沙门氏菌(Salmonella Minnesota)LPS不如大肠杆菌那样有效，但是比牙龈卟啉单胞菌LPS 1690和1435的那些更有效。细菌的每个物种产生多种形式的LPS。来自相同物种的细菌的每种形式的LPS在刺激TLR4-下游信号通路方面具有不同效能。例如，Pg 1690LPS比Pg1435/50更有效。LPS为细胞壁中的组分。同样，当其与宿主血细胞直接接触时，大肠杆菌细胞壁比牙龈卟啉单胞菌在诱导宿主细胞中产生促炎细胞因子方面更具毒力。如图2B所示，牙龈卟啉单胞菌比苍白普雷沃菌和变黑普雷沃菌在刺激TLR4受体基因表达方面具有高得多的EC50，这表明苍白普雷沃菌和变黑普雷沃菌比牙龈卟啉单胞菌更容易在宿主细胞中促进促炎细胞因子的产生。
细菌将LPS释放到细菌培养物的上清液中。如图2C所示，在刺激TLR4报告基因的表达方面，苍白普雷沃菌的上清液具有类似于变黑普雷沃菌的EC50，但远低于牙龈卟啉单胞菌。同样，那些结果意味着苍白普雷沃菌和变黑普雷沃菌的产物比牙龈卟啉单胞菌更容易在宿主细胞中促进促炎细胞因子的产生。
实施例6—开发抑制LPS对刺激经NFkB调节的报告基因表达的作用的技术
氟化亚锡为P&G牙膏产品的主要的抗齿龈炎技术。进行测试以理解氟化亚锡是否可降低触发宿主细胞中的促炎性反应的能力。在存在或不存在LPS的情况下，使用如实施例5中所述的相同条件，制备TLR4-SEAP报告细胞。SEAP的生产也如实施例5所述的进行量化。
图3示出62.5uM至1,000uM的各种浓度下的亚锡对100ng/ml大肠杆菌LPS的作用，如由TLR-4的活化所报告的。在500uM或更高的亚锡浓度下，TLR-4的大肠杆菌诱导水平降低。
图4示出62.5uM至1,000uM的各种浓度下的亚锡对牙龈卟啉单胞菌LPS的作用，如由TLR-2的活化所报告的。在1000uM的亚锡浓度下，TLR-2的牙龈卟啉单胞菌诱导水平降低。
图5中的数据示出通过来自氟化亚锡盐的亚锡离子降低LPS活性。所述数据示出1.6mM和3.2mM的氟化亚锡减少约50％的牙龈卟啉单胞菌LPS(500ng/ml)对TLP4报告体系的活化(一个星号表示P<0.05，两个星号表示P<0.01)。
实施例7—在由临床样品活化TLR4-SEAP信号转导时的细胞培养和EC50毒力测定
实施例5中所述的方法在测定不同细菌的LPS效能时是有效的。使用相同的方法测定临床样品的EC 50，如实施例2中所述。如图6所示，来自不健康位点的牙菌斑比来自健康位点的那些具有更小的EC50，这表明来自不健康位点的牙菌斑包含更多毒力因子。
实施例5中所述的相同方法用于检查另一研究中的临床样品。进行临床研究以评估样本收集方法和测量规程。其是受控的不知道检查者的研究。四十名专家小组成员满足纳入标准，其中为了纳入研究，每位专家小组成员必须：
·提供书面知情同意来参与研究；
·为18岁或更大；
·同意在该研究过程中不参加任何其它口腔/牙科产品研究；
·同意延迟任何选择性牙科(包括牙病预防)直至研究已经完成；
·同意在治疗阶段期间避免任何形式的非特定口腔卫生，包括但不限于使用产品，诸如牙线或美白产品；
·同意返回以进行所有定期访问并遵循研究规程；
·必须具有至少16个天然牙齿；
·处于良好的总体健康下，如基于参与研究的健康史/更新的综述，由研究者/指定人员所确定的。
就不健康组而言(高出血者组)：
·具有至少20个出血位点(关于GBI指数，分数为1或2的位点)；具有最少3个取样位点，其中出血和腔洞深度>3mm但不深于4mm；
·具有最少3个取样位点，但不出血，并且腔洞深度<2mm
就健康组而言(低出血者组)：
·具有最大3个出血位点(关于GBI指数，分数为1或2的位点)；
·不具有深于2mm的腔洞。二十(20)名专门小组成员定性为健康-最高达3个出血位点，并且所有腔洞的深度小于或等于2mm，并且二十(20)名专门小组成员定性为不健康-具有大于20个出血位点，其中至少3个腔洞大于或等于3mm但不深于4mm并且出血，并且至少3个腔洞的深度小于或等于2mm，并且取样时无出血。所有专门小组成员都具有被确定为“取样位点”的6个位点。“取样位点”具有在基线处、第2周、和第4周收集的龈上菌斑和龈下菌斑。从预确定位点中从齿龈沟获取龈下菌斑。在样品收集之前，所述位点具有利用刮匙移除的龈上菌斑。将所述位点干燥并且用另一牙科刮匙收集龈下菌斑样品(例如，Gracey 13/14、15/16、11/12、7/8、1/2)。每个Gracey刮匙被设计成适用于特定区域或牙齿表面。例如，Gracey 13/14被设计成适用于后牙的远端表面。来自每个位点的样品置于包含300μl的DPBS缓冲液与约50个无菌1mm玻璃珠的预标记2.0ml无菌管中。将样品储存于4℃。将龈下样品储存于-80℃直至分析。将样品在室温下解冻并且以30次振摇/秒在TissueLyser II(Qiagen，Valencia，CA，USA)中分散3min。使用Pierce microBCA蛋白质试剂盒(ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY，USA)测量分散的龈下样品的蛋白质浓度。
通过用4ml水冲洗30秒并且然后将口腔内容物吐到离心管中，在清醒时收集口腔灌洗样品(每个专门小组成员一次)。将这些样品在家中冷冻直至其被带入冷库中的位置中。在整个研究过程中每个专门小组成员收集至多15个样品。提交的唾液样品在-70℃下冷冻。
给予所有专门小组成员研究的产品：在用Pro-Health Clinical护龈牙膏(0.454％氟化亚锡)和Indicator软手动牙刷。专门小组成员继续其定期口腔卫生习惯，并且从基线开始到四周治疗研究结束不使用任何新产品。在四周治疗期间，专门小组成员以其习惯方式使用指定的牙粉和软手动牙刷每天早上和晚上刷牙两次。
以如实施例5所述的规程，将来自上述临床研究的龈下菌斑施用于TLR4报告细胞。表7示出从基线开始在利用Crest ProHealth Clinical牙膏治疗四周内的40名专门小组成员的四周研究的结果。高出血者组的出血位点中的龈下菌斑样品刺激TLR4报告基因的高表达。样品中的较多毒力引起TLR4报告基因测定中的较高RLU(相对发光单位)读数。如图7所示，高出血者组的基线样品在出血和非出血位点上比低出血者的那些具有更高的RLU。在用Pro-Health Clinical护龈牙膏(0.454％氟化亚锡)和Indicator软手动牙刷治疗四周后，在高出血者和低出血者组中出血和非出血位点两者处的毒力在第4周均降低。
实施例8—来自不同细菌的脂磷壁酸的细胞培养和毒力测定
报告基因细胞系，人HEK 293T细胞购自Invivogen(San Diego，CA)。HEK 293T细胞用至少两种外源基因，TLR2结构基因和受NFkB转录因子控制的SEAP报告基因稳定转染。细胞系在本文中命名为TLR2-SEAP。报告基因编码分泌型酶，其被称为胚胎碱性磷酸酶或SEAP。将SEAP报告基因置于与五个NFkB和AP-1-结合位点融合的干扰素-β最小启动子的控制下。另外，在CD14已被鉴定为增强TLR反应的TLR2配体的辅助受体时，将CD14辅助受体基因转染到表达TLR2的报告基因细胞中。需要CD14辅助受体以将LTA转移到TLR2受体。重组体TLR2结合其配体或不同的病原体结合的分子，引发一系列反应，从而导致NFkB和AP1转录因子聚集到报告基因启动子，这诱导SEAP表达。
细胞培养和处理：在37℃、5％CO2和95％湿度下，在T75烧瓶中，使500,000个基因报告细胞在包含补充有10％胎牛血清的DMEM培养基的15ml生长培养基中生长并保持三天。就利用LTA处理而言，96孔板的孔在100μL生长培养基中以10,000个细胞/孔接种。在37℃、5％CO2和95％湿度下将所述细胞培养72小时直至第4天。在第4天，将培养基(100μL)装入不具有胎牛血清的DMEM培养基中。如实施例7中所述，加入LTA、LPS和细菌细胞。24小时之后取样，之后添加样品。利用可商购获得的试剂盒定量报告基因(SEAP)的表达(CaymanChemical Co.(Ann Arbor，MI)的SEAP报告基因测定)。
如图8A、8B、8C和8D所示，LTA、LPS、细菌和细菌培养物的上清液可结合到TLR2并且以剂量依赖性方式活化TLR2下游信号通路。如图8A所示，枯草芽孢杆菌(BS)LTA比希氏肠球菌的效能更大。如图8B所示，牙龈卟啉单胞菌LPS也活化TLR2报告基因的表达。例如，如图8B所示，Pg1690活化TLR2-SEAP信号转导，并刺激SEAP产生。如图8B所示，大肠杆菌LPS不活化TLR2-SEAP报告细胞。还应当注意，苍白普雷沃菌、变黑普雷沃菌和牙龈卟啉单胞菌在刺激TLR2报告基因的表达时具有相似的EC50(图8C)。然而，从三种不同的细菌释放的TLR2配体对TLR2报告基因的活化具有非常不同的EC50。
实施例9—在由临床样品活化TLR4-SEAP信号转导时的细胞培养和EC50毒力测定。
实施例8所述的方法在测定不同细菌的LTA和其它TLR2配体的EC50时是有效的。使用相同的方法测定临床样品的EC50，如实施例2中所述。如图9所示，来自不健康(出血)位点的牙菌斑比来自健康(不出血)位点的那些具有更小的EC50，这表明来自不健康位点的牙菌斑包含更多毒力因子。
使用TLR2-SEAP报告基因测定来检查如实施例7的图7所述的临床样品。结果示于图10。来自不健康组(高出血者)的不健康(出血)位点中的龈下样品比其它位点具有更多毒力因子。高出血者组的基线样品在出血位点和非出血位点上比低出血者的那些具有更高的RLU。在用Pro-Health Clinical护龈牙膏(0.454％氟化亚锡)和Indicator软手动牙刷治疗四周后，在高出血者和低出血者组中在出血位点处，毒力在第4周均降低。
实施例10—来自不同细菌的鞭毛蛋白的细胞培养和毒力测定
报告基因细胞系，人HEK 293T细胞购自Invivogen(San Diego，CA)。HEK 293T细胞用两种外源基因，TLR5结构基因和受NFkB转录因子控制的SEAP报告基因稳定转染。细胞系被命名为TLR5-NFkB-SEAP。报告基因编码分泌型酶，其被称为胚胎碱性磷酸酶或SEAP。将SEAP报告基因置于与五个NFkB和AP-1-结合位点融合的干扰素-β最小启动子的控制下。重组体TLR5结合其配体，或不同的病原体结合的分子，并且引发一系列反应，从而导致NFkB和AP1转录因子聚集到报告基因启动子，这诱导SEAP表达。
细胞培养和处理：在37℃、5％CO2和95％湿度下，在T75烧瓶中，使500,000个基因报告细胞在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中生长并保持三天。就利用鞭毛蛋白处理而言，96孔板的孔在100μL生长培养基中以10,000个细胞/孔接种。所述细胞在37℃、5％CO2和95％湿度下培养72小时直至在将细胞接种到96孔板的孔上之后的第4天。在第4天，将培养基(100μL)装入不具有胎牛血清的DMEM培养基中。以0.97ng至1μg/ml的浓度范围，添加枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌鞭毛蛋白。在添加鞭毛蛋白之后的6小时和24小时获取样品。利用可商购获得的试剂盒定量报告基因(SEAP)的表达(Cayman Chemical Co.(Ann Arbor，MI)的SEAP报告基因测定)。
图11示出两种鞭毛蛋白(枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌)均可活化TLR5下游信号通路。来自枯草芽孢杆菌的鞭毛蛋白以剂量依赖性方式刺激TLR5-SEAP信号转导。鞭毛蛋白对TLR5的EC50在5小时为0.02ng/ml并且在23小时为0.014ng/ml。来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的鞭毛蛋白对TLR5的EC50在5小时为0.0049并且在23小时为0.0019。来自铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白对于刺激TLR5信号通路更有效。
实施例11—细胞培养和来自不同细菌的LPS在THP1双报告细胞中的毒力测定
细菌细胞壁和膜组分由TLR2识别。TLR2识别微生物基序PGN(肽聚糖)/脂蛋白/dectin和LPS。TLR1和TLR6与TLR2形成异源二聚体并分别结合三酰化脂蛋白和二酰化脂蛋白。THP1NFkB-SEAP和IRF-LuciaTM报告单核细胞购自Invivogen，San Diego，CA。THP1-双细胞通过两个诱导型报告基因构建体的稳定整合源自人THP-1单核细胞系。THP1-双细胞特征在于Lucia基因在ISG54(干扰素-刺激基因)最小启动子连同五个干扰素-刺激的反应元件的控制下。THP1-双细胞还表达由IFN-b最小启动子驱动的SEAP报告基因，所述IFN-b最小启动子融合到NF-kB共有转录反应元件的五个拷贝和c-Rel结合位点的三个拷贝。因此，THP1-双细胞允许同时通过监测SEAP的活性研究NFkB途径，和通过评估Lucia的活性研究干扰素调节因子(IRF)途径(IRF-Luc)。在细胞培养上清液中可容易地测量两种报告蛋白。该THP-1细胞系具有购自Invivogen的功能性TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR8。TLR4感测来自革兰氏阴性菌的LPS，然而TLR5识别来自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者的细菌鞭毛蛋白，TLR8检测长单链RNA。
培养和处理：将THP1-双细胞在37℃和5％CO2下在T75烧瓶中在15ml生长培养基(RPMI 1640与10％加热灭活的胎牛血清)中培养。每隔3至4天通过将300,000-500,000个细胞/ml接种到具有15ml的新鲜生长培养基的新鲜T75烧瓶中，使得细胞传递。为测定细菌组分对报告基因表达的影响，以90μl生长培养基中100,000个细胞接种96孔板中的孔。将10μl的细胞壁和膜组分，或加热灭活全细菌加入每个孔中。在37℃和5％CO2下培养18小时之后，用可商购获得的测定试剂盒量化分泌型荧光素酶和SEAP(对于荧光素酶，QUANTI-Luc，Invivogen，San Diego，California；对于SEAP，SEAP报告基因测定，Cayman Chemical Co.，Ann Arbor，MI)。
如图12所示，利用LPS的三种不同制剂处理DHP1-双报告细胞。所有三种LPS(ng/ml)以剂量依赖性方式活化NFkB-SEAP报告基因的产生。此外，Pg 1690LPS和大肠杆菌LPS也刺激IRF-荧光素酶报告基因的表达。在结合到TLR4受体时，TLR4配体活化至少两个信号通路。一种是通用通路NFkB-SEAP，其可在所有TLR配体结合到其特异性受体时被TLR配体活化。例如，TLR2配体-LTA，可与TLR2受体结合并激活NFkB-SEAP信号通路。类似地，在结合到TLR4受体时，TLR4配体，LPS，也能够激活NFkB-SEAP信号转导。如图12所示，大肠杆菌LPS是比牙龈卟啉单胞菌1690LPS对活化NFkB-SEAP和IRF-荧光素酶信号转导两者均更具效能的配体。THP-1细胞产生了多种功能性TLR受体。并且所有TLR受体可活化NFkB通路，因此促进NFkB-SEAP报告基因的表达。NFkB-SEAP的阅读是所有TLR受体(诸如TLR2、TLR1、TLR6和TLR4)的集体行为。来自不同细菌的所有LPS均刺激NFkB-SEAP报告基因。另一方面，IRF-荧光素酶报告基因受有限数的TLR受体，主要是TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9驱动。牙龈卟啉单胞菌LPS 1690和大肠杆菌LPS以剂量依赖性方式刺激IRF-荧光素酶的表达。
实施例12—细胞培养和来自不同细菌和生物膜的LTA在THP1双报告细胞中的毒力 测定
THP1双报告细胞还表达TLR2、TLR1和TLR6受体。细菌细胞壁和一些膜组分由TLR2、TLR1和TLR6识别。TLR2识别微生物基序PGN(肽聚糖)/脂蛋白/dectin和LPS。为确定来自不同细菌的LTA是否对刺激NFkB-SEAP报告基因在THP1双报告细胞中表达具有不同作用，以与实施例11所述的相同规程制备并处理细胞。如图13所示，来自枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌两者的LTA促进报告基因在THP1双报告细胞中表达方面具有相似效能。
实施例13—区分来自人原齿龈上皮细胞中不同细菌的细菌组分
原人齿龈上皮细胞购自Zen-bio(Research Triangle Park，NC)，并且在37℃下在5％CO2气氛下保持在T75烧瓶中的15ml生长培养基中(补充有CellnTec生长添加剂的CellnTec培养基中，购自CellnTec Advanced Cell Systems AG，Bern，Switzerland)。在实验进行到24h、48h和72h时间点时，并且在测定培养基、单独的CellnTec培养基或添加剂的情况下，在37℃下在5％CO2气氛下，在100μl的CELLnTEC生长培养基中，以7,500个细胞/孔接种六个96孔板。将生长培养基更换为测定培养基，然后立即添加LPS或细菌DNA。例如，如果测定培养基为不具有添加剂的CellnTec培养基，则在每个孔中添加100μl的CellnTec培养基但不加入添加剂。如果测定培养基为生长培养基，则将100μl的生长培养基加入每个孔中。将牙龈卟啉单胞菌LPS和细菌DNA加入细胞中。在24h、48h和72h时，收集培养基用于分析。根据制造商的说明书，使用得自Meso Scale Discovery(Rockville,MD)的Elisa试剂盒测量细胞因子。
如表4中所示，用牙龈卟啉单胞菌DNA以0μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml和2μg/ml处理人原齿龈上皮细胞。该培养基在处理之后的24小时和48小时收集，并且使用得自Meso ScaleDiscovery的ELISA试剂盒分析六个促炎细胞因子(干扰素-γ、IL-1β、IL-2、IL-10、IL-12p70和TNF-α)。如表4所示，干扰素-γ、IL-1β、IL-2、IL-10、IL-12p70和TNF-α的表达低或几乎不可检测(每个值是一个实验中三次重复测量的平均值)。它们不是区分细菌DNA的活生物标记。表4中的结果示出缺乏来自人齿龈上皮细胞的炎性反应，因此展示需要使用工程化细胞。
表4：对于用牙龈卟啉单胞菌DNA处理的炎性标记物筛选人齿龈上皮细胞
以上述规程，利用牙龈卟啉单胞菌LPS以0μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml和2μg/ml用处理人原齿龈上皮细胞。如表5所示，同样干扰素-γ、IL-1β、IL-2、IL-10、IL-12p70和TNF-α的表达低或几乎不可检测。它们不是区分原人齿龈上皮细胞中的细菌LPS的活生物标记。表5中的结果还示出人齿龈细胞对用于测定的细菌毒力因子不够敏感的原因，因此需要利用能够展示对毒力因子的剂量依赖性反应的细胞系。
表5：对于用牙龈卟啉单胞菌LPS处理的炎性标记物筛选人齿龈上皮细胞
在利用牙龈卟啉单胞菌LPS处理的原人齿龈上皮细胞中产生细胞因子(pg/ml)。
实施例14—在六周齿龈炎治疗中，富含齿龈炎的细菌的丰度减少
由69名专门小组成员进行了随机的两组临床研究(35名在阴性对照组中，并且34名在测试方案组中)。专门小组成员平均年龄为39岁，范围从20岁至69岁，并且46％的专门小组成员是女性。使治疗组良好平衡，因为对于齿龈出血指数(GBI)(平均值＝29.957并且至少20个出血位点)和改性齿龈指数(MGI)(平均值＝2.086)而言，人口统计特征(年龄、种族、性别)或者起始测量值没有统计学上的显著(p≥0.395)差异。所有六十九个专门小组成员均参加每次访问并完成治疗过程。经过6周时间段比较以下治疗组：
测试方案：Pro-Health Clinical菌斑控制(0.454％氟化亚锡)牙粉、具有精准清洁型刷头的专业护理1000和Pro-Health清新爽洁薄荷(0.07％CPC)漱口水。对照方案：口腔保护(0.243％氟化钠)牙粉和Indicator软手动牙刷。
如实施例2所述，在临床研究室在测试方案中从相同专门小组成员收集牙菌斑。用无菌刮匙从每个小组成员的牙齿/齿龈界面处获取龈上样品，小心避免与口腔软组织接触。菌斑从所有可用天然牙齿(仅上牙弓)中取样，直至菌斑不可见。在取样之后，将菌斑样品置于预标记的(专门小组成员ID、样品缩写、访问和日期)具有1ml的PBS/甘油缓冲液和约50个无菌1mm玻璃珠的Eppendorf管中，储存在冰上直至收集所有样品。然后将样品转移到-70℃冷冻机用于储存直至进一步加工。根据制造商的说明，使用基因组DNA试剂盒(Qiagen，Germany)从龈上菌斑样品分离基因组DNA。在BGI Americas Corporation(Cambridge，MA)进行元测序。在Global Biotech，Procter&Gamble Company(Mason，Ohio)分析所有数据。
临床测量：与对照方案相比，在第1周、第3周和第6周，测试方案中的出血位点(GBI)显著减少(图14)。类似地，测试方案中的炎症(MGI)等级也降低(图14)。
从包含人宿主细胞和细菌细胞的龈缘菌斑中分离DNA样品。在元测序之后，鉴定并量化细菌DNA和人DNA序列。如图15所示，有助于菌斑样品的人DNA从基线到治疗的第6周为约5-10ng/μl。然而，微生物DNA从基线到治疗的第1周、第3周和第6周显著减少。
细菌属的相对丰度在治疗期间经历显著变化(表6A)。Capnoytophaga和Campylobactor在治疗期间增加。普雷沃菌属是革兰氏阴性细菌属，其存在于口腔、阴道和呼吸道的微生物群中。该细菌属可引起感染，包括吸入性肺炎、肺脓肿、脓胸、慢性中耳炎和鼻窦炎。普雷沃菌在基线是丰富的。其数量在第1周、第3周和第6周减少。
表6A：从基线到方案治疗的第6周，龈上菌斑中细菌属的相对丰度的变化。
在六周治疗中龈上菌斑中特定细菌的丰度变化如表6B和图16A所示。特定细菌在第1周、第3周或第6周减少。那些微生物包括：格雷费尼茨放线菌(Actinomyces_graevenitzii)、Acitnomyces_massiliensis、Actinomyces_sp_ICM47、极小阿托波氏菌(Atopobium_parvulum)、简明弯曲菌(Campylobacter_concisus)、卡托纳菌(Catonella_morbi)、短真杆菌(Eubacterium_brachy)、娇弱真杆菌(Eubacterium_infirmum)、具核梭杆菌(Fusobacterium_nucleatum)、牙周梭杆菌(Fusobacterium_periodonticum)、毛绒厌氧杆菌(Lachnoanaerobaculum_saburreum)、毛螺科菌口腔分类_082(Lachnospiraceae_bacterium_oral_taxon_082)、巨球形菌(Megasphaera_micronuciformis)、光冈菌属_未分类(Mitsuokella_unclassified)、微黄奈瑟球菌(Neisseria_subflava)、Oribacterium_sinus、微小微单胞菌(Parvimonas_micra)、微单胞菌_未分类(Parvimonas_unclassified)、口炎消化链球菌(Peptostreptococcus_stomatis)、消化链球菌_未分类(Peptostreptococcus_unclassified)、长颈鹿瘟病毒_1(Pestivirus_Giraffe_1)、牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas_endodontalis)、卟啉单胞菌属_口腔分类_279(Porphyromonas_sp_oral_taxon_279)、栖组织普雷沃菌(Prevotella_histicola)、斑点普雷沃菌(Prevotella_maculosa)、产黑普雷沃菌(Prevotella_melaninogenica)、Prevotella_nanceiensis、口普雷沃菌(Prevotella_oris)、苍白普雷沃菌(Prevotella_pallens)、Prevotella_salivae、普雷沃菌属__C561(Prevotella_sp_C561)、真口普雷沃菌(Prevotella_veroralis)、龋齿罗氏菌(Rothia_dentocariosa)、粘滑罗氏菌(Rothia_mucilaginosa)、福氏新月形单胞菌(Selenomonas_flueggei)、生痰新月形单胞菌(Selenomonas_sputigena)、Solobacterium_moorei、长口腔杆菌(Stomatobaculum_longum)、咽峡炎链球菌(Streptococcus_anginosus)、Streptococcus_australis、星座链球菌(Streptococcus_constellatus)、嵴链球菌(Streptococcus_cristatus)、寡发酵链球菌(Streptococcus_oligofermentans)、副血链球菌(Streptococcus_parasanguinis)、血链球菌(Streptococcus_sanguinis)、非典型韦荣菌(Veillonella_atypica)、异韦荣菌(Veillonella_dispar)、小韦荣球菌(Veillonella_parvula)、韦荣球菌属_未分类(Veillonella_unclassified)。在治疗的四个时间段内对每种细菌物种的量作图。在六周治疗期间，某些细菌诸如口炎消化链球菌和中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)的量减少，如图16A所示。在治疗的三个时间段内对每种细菌物种的相对量作图(图16B)。在三周治疗期间，特定细菌，诸如Actinomyces massiliensis、内氏放线菌、牙龈二氧化碳噬纤维菌和纤细弯曲菌增加，然而苍白普雷沃菌、产黑普雷沃菌(Prevetella malaninogenica)和卟啉单胞菌属_口腔分类_279减少。
表6B：在6周方案治疗期间，龈上菌斑中与齿龈炎相关的细菌减少。
实施例15—在6周治疗期间，随着齿龈炎症状减轻，细胞因子、趋化因子和其它生 物活性蛋白质的产生减少
在与实施例14所述的相同临床研究中，从与实施例14相同的专门小组成员收集齿龈-刷样品。在取样之前，专门小组成员用水漱口30秒。然后牙科卫生员用颊面拭子刷(Epicentre Biotechnologies目录号MB100SP)对齿龈线正上方的区域取样。将拭子立即置于1.5ml Eppendorf管的1ml提取缓冲液[PBS，0.25M NaCl，1X HaltTM蛋白酶抑制剂一次性混合物(Lifetechnologies，Grand Island，NY)]中涡旋30秒，并在干冰上立即冷冻并储存在-80C冷冻机中直至分析。从冷冻机中取出样品、解冻并通过在4℃下将样品置于试管振荡器上30分钟进行提取。所述管在Eppendorf离心机5417R(Eppendorf，Ontario，Canada)中以15000RPM离心10min，以将任何碎屑制成粒料。使用Bio-Rad蛋白质测定(BioRad，Hercules，CA)分析提取物(800μl)的蛋白质浓度。
使用V-PLEX人生物标记40-Plex试剂盒(Meso Scale Diagnostics Rockville，Maryland)测量齿龈样品中的四十种蛋白质。按照制造商的说明进行所述测定。
在齿龈样品中测量的蛋白质中，促炎组1(人)、细胞因子组1(人)、趋化因子组1(人)、血管新生组1(人)、和血管损伤组2(人)中的大部分蛋白质在6周治疗期间在其丰度方面显著变化(表6)。那些包括FN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、TNF-α、GM-CSF、IL-5、IL-16、IL-7、IL-12/IL-23p40、IL-1α、VEGF-A、IL-17A、IL-15、TNF-β、IL-8(HA)、MCP-1、MCP-4、嗜酸细胞活化趋化因子、IP-10、MDC、嗜酸细胞活化趋化因子-3、TARC、MIP-1α、MIP-1β、VEGF-C、VEGF-D、Tie-2、Flt-1/VEGFR1、PlGF、FGF(碱性)、SAA、CRP、VCAM-1、和ICAM-1。
表6C：齿龈-刷样品中蛋白质丰度的变化
实施例16—鉴定齿龈样品中的一百七十种代谢物
将与实施例15中所述的相同齿龈-刷样品用于代谢组学分析。十四名专门小组成员随机选自每个治疗组以确定在治疗的前3周期间齿龈样品中的任何代谢物浓度是否变化。将基线和第3周样品均送至Metabolon,Inc.(Durham，NC)用于代谢组学测量。鉴定并量化170种代谢物。如表7中所示，在前3周治疗期间一些代谢物浓度变化。在治疗方案组中在三周治疗后，齿龈样品中的瓜氨酸浓度降低。类似地，在三周治疗后，治疗方案组中的鸟氨酸也减少。瓜氨酸和鸟氨酸的减少可能与齿龈炎的减轻相关。
表7：在基线和齿龈炎治疗期间的第3周之间齿龈刷样品中的代谢物的比较结果
实施例17—在6周内方案治疗中的瓜氨酸减少
齿龈-刷样品提取物中的瓜氨酸和鸟氨酸的量化使用梯度亲水性相互作用液相色谱与串联质谱(HILIC/MS/MS)进行。从与实施例14中所述临床研究相同的人专门小组成员获得齿龈-刷样品，然后将其置于如实施例15所述的提取缓冲液中。上清液经历HILIC/MS/MS和BCA分析两者。就游离的瓜氨酸和鸟氨酸分析而言，将齿龈-刷样品的提取物直接(50μl未稀释样品溶液)在50/50乙腈/超纯水与0.754％甲酸中分析或稀释五倍分析。就总瓜氨酸和鸟氨酸分析而言，将齿龈-刷样品的提取物首先使用6N HCl(50μL的提取物与450μL的6NHCl)水解，不振摇，并置于110℃下的热板上16小时。然后在室温下在真空中干燥水解样品(Savant speedvac of Lifetechnology，Grand Island，NY)，然后在1ml的稀释溶液(50/50乙腈/超纯水与0.754％甲酸)中重构用于分析。标准品和样品使用亲水梯度性相互作用液相色谱与串联质谱(HILIC/MS/MS)进行分析。使用表8所示的选择的反应监测方案，通过电喷雾电离(ESI)以正离子模式来监测分析物和对应ISTD(稳定同位素标记的内标)。通过给信号绘图构建标准曲线，本文将其定义为每个标准品与对应标准品的每个分析物质量的峰面积比率(峰面积分析物/峰面积ISTD)。然后使用生成的回归公式返算在校准基准和齿龈-刷提取样品中的每个分析物质量。作为分别从总瓜氨酸或鸟氨酸的浓度中减去游离瓜氨酸或鸟氨酸的浓度的结果，来计算蛋白质结合的瓜氨酸或鸟氨酸的浓度。所述结果记录为瓜氨酸或鸟氨酸的浓度，或者结果通过除以瓜氨酸或鸟氨酸的量乘以存在于提取物的总蛋白量来标准化。
表8：分析物及其对应的稳定同位素标记的内标的多反应监测(MRM)转换
分析物 MRM 内标 MRM
瓜氨酸 176→159 d7-瓜氨酸 181→164
鸟氨酸 133→70 d6-鸟氨酸 139→76
分析来自测试方案的专门小组成员的所有样品[Pro-Health Clinical菌斑控制(0.454％氟化亚锡)牙粉、具有精准清洁型刷头的 专业护理1000和Pro-Health清新爽洁薄荷(0.07％CPC)漱口水]。如图17所述，在治疗的第一周瓜氨酸含量快速减少，并且然后在治疗的第3周和第6周持续梯度下降。这些结果与临床观察结果一致，其中齿龈出血位点(GBI)和齿龈炎症(MGI)在6周治疗阶段内减少。
实施例18—经过6周治疗包含鸟氨酸的蛋白质含量减少
使用如实施例17中所述的规程分析与实施例17所述相同的样品。治疗齿龈炎并持续6周。基线(BL)代表疾病状态。从第1周至第6周治疗，齿龈炎的症状减轻。如图18所示，齿龈炎中的蛋白质结合鸟氨酸(总鸟氨酸和游离鸟氨酸之间的差)较高。随着齿龈炎的严重性下降，蛋白质结合鸟氨酸逐渐减少。
实施例19-在6周治疗期间齿龈样品中的鸟氨酸-瓜氨酸-精氨酸循环中的酶表达 变化
如实施例15所述，从与实施例15相同的专门小组成员收集齿龈样品，并在测试方案[Pro-Health Clinical菌斑控制(0.454％氟化亚锡)牙粉、具有精准清洁型刷头的专业护理1000和Pro-Health清新爽洁薄荷(0.07％CPC)漱口水]和对照方案[口腔保护(0.243％氟化钠)牙粉和Indicator软手动牙刷]情况下，将其用于检查在6周治疗期间的基因表达。
收集样品后，将刷完全浸入RNAlater溶液(1.5ml Eppendorf管中的1ml)，以避免RNA在运输和储存期间降解(Qiagen，Valencia，CA)。将微量离心管涡旋/混合30秒，立即在干冰上冷冻，储存并从干冰上转移到实验室用于生物标记分析。RNA分析和微阵列分析如先前在出版物中所述(Offenbacher S、Barros SP、Paquette DW、Winston JL、Biesbrock AR、Thomason RG、Gibb RD、Fulmer AW、Tiesman JP、Juhlin KD、Wang SL、Reichling TD、ChenKS、Ho B.J Periodontol.2009年12月；80(12)：1963-82.doi：10.1902/jop.2009.080645.Gingival transcriptome patterns during induction andresolution of experimental gingivitis in humans)。
鸟氨酸-瓜氨酸-精氨酸循环由四种酶组成(图19)。循环的主要特征在于三种氨基酸(精氨酸、鸟氨酸、和瓜氨酸)可彼此转换。第一酶为鸟氨酸转氨基甲酰酶，其将氨基甲酰基团从氨基甲酰磷酸酯转移到鸟氨酸以产生瓜氨酸。该反应在线粒体的基质中发生。鸟氨酸转氨基甲酰酶的表达在治疗时减少(图20)。第二酶为精氨酸琥珀酸合成酶。该酶使用ATP以通过形成瓜氨酰基-AMP中间体来活化瓜氨酸，其被天冬氨酸残基的氨基基团攻击以产生精氨基琥珀酸酯。这个反应和后续两个反应在胞质溶胶中发生。同样，精氨酸琥珀酸合成酶的表达在治疗期间减少。第三酶为精氨基琥珀酸裂合酶，其催化精氨基琥珀酸酯裂解成富马酸和精氨酸。最后的酶为精氨酸酶。精氨酸酶裂解精氨酸以产生尿素和鸟氨酸。与鸟氨酸转氨基甲酰酶和精氨基琥珀酸合成酶基因的表达减少相比，精氨酸酶I(肝)和II增加(图20)。
精氨酸也是一氧化氮合成酶的底物，其氧化精氨酸以产生瓜氨酸和一氧化氮。一氧化氮合成酶基因的表达也增加(图20)。
实施例20—在实验齿龈炎中齿龈样品中的瓜氨酸增加
实验齿龈炎：进行另一临床研究以确定健康人专门小组成员中的实验诱导性齿龈炎中的瓜氨酸是否增加。这是招募了60名专门小组成员的病例对照研究。研究群包括以下两组：组1或高出血者组，具有至少20个出血位点的三十(30)名专门小组成员，其中出血是基线处的GBI现场得分为1或2。组2或低出血者组，具有至少2个或更少个出血位点的三十(30)名专门小组成员，其中出血是GBI现场得分为1或2。
研究由两个阶段组成：具有牙疾病预防、抛光和严格的口腔卫生的健康/严格卫生阶段；和不具有口腔卫生的诱导性齿龈炎阶段。在筛选访问时，专门小组成员进行口腔软组织评估，并具有齿龈炎评价(改性的齿龈指数(MGI)和齿龈出血指数(GBI))。在访问时，2名具有资格的专门小组成员接受口腔软组织检查之后接受齿龈炎评价，并收集齿龈菌斑和齿龈拭子以进行qPCR、蛋白质和RNA宿主生物标记分析。在此之后，所有专门小组成员接受牙疾病预防，并进入健康/严格卫生阶段，持续两周。在严格的卫生两周之后，专门小组成员进行诱导性齿龈炎阶段，持续三周。重新评价口腔软组织检查和齿龈炎，并且在基线、第0周和第2周收集所有样品(齿龈拭子)。
齿龈样品收集—使用如实施例15所述的规程从上牙弓的每一侧收集齿龈拭子。仅从颊面位点接近齿龈线(优选从四个相邻的牙齿-优选地从前磨牙和磨牙区域)收集齿龈拭子。专门小组成员用15ml的Listerine漱口水漱口30秒以清洁取样区域的表面。在Listerine漱口水之后，专门小组成员利用20ml水冲洗30秒。之后，用棉棒分离所选位点并且用空气注射器温和干燥，并从靠近所选牙齿的齿龈线的齿龈区域用收集刷/拭子获取两个齿龈拭子。将样品置于预标记的(专门小组成员ID、样品ID、访问和日期)1.5ml微离心管中，所述微离心管包含800ul DPBS(Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水)(Lifetechnologies，Grand Island，NY)与蛋白酶抑制剂，包括AEBSF(4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐)2mM、抑肽酶0.3μM、苯丁抑制素130μM、EDTA(乙二胺四乙酸)1mM、E-64 1μM和亮抑酶肽1μM。将小瓶涡旋/混合30秒，立即在干冰上冷冻，储存并从干冰上转移到实验室用于生物标记分析。使用实施例17中所述的规程分析来自三次访问的样品，并且示于图21中。那三次访问为基线、第0周(正好在健康/严格卫生阶段之后和在诱导性齿龈炎阶段之前)和第2周(在诱导性齿龈炎阶段结束时)。在基线和第0周时，高出血者组和低出血者组两者中的游离瓜氨酸水平均较低，但在第2周时两组中的诱导性齿龈炎均迅速上升。
实施例21—实验诱导性齿龈炎中的包含瓜氨酸的蛋白质含量减少
使用如实施例17所述的相同规程。样品与实施例20中所述相同。在高出血者组和低出血者组中，齿龈组织中的蛋白质结合瓜氨酸在基线处比在第0周时更低，如图22所示。在第2周时两个组中的实验性齿龈炎较低。
实施例22—在实验齿龈炎中齿龈样品的包含鸟氨酸的蛋白质含量增加
使用实施例17中所述的规程分析来自实验齿龈炎(实施例20)的相同临床样品。在两组中结合的鸟氨酸在第0周均最低(图23)。其在基线处的含量高于在第0周时的那些。当在第2周时在两组中诱导齿龈炎时，结合的鸟氨酸达到峰值。另外，值得注意的是在两个组中在诱导性齿龈炎中总鸟氨酸(游离的和蛋白结合的鸟氨酸)增加(图24)。
实施例23—在实验诱导性齿龈炎中齿龈样品中的包含精氨酸的蛋白质含量减小
使用如实施例17所述的相同规程。样品与实施例20中所述相同。在两组中在诱导性齿龈炎中，蛋白质结合的精氨酸均最低(图25)。在两组中，其含量在第0周时比在基线处更高。齿龈刷样品中的总精氨酸显示与蛋白结合的精氨酸相同的模式(图26)。
实施例24—瓜氨酸抑制LPS刺激人THP-1细胞中促炎性细胞因子的产生
瓜氨酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。THP1-DualTM细胞购自Invivogen(SanDiego，California)。按照制造商的说明培养细胞，如实施例11所述。就治疗而言，首先将0.3mM至9mM的瓜氨酸加入培养基中。然后，在60分钟后加入300ng/ml牙龈卟啉单胞菌LPS1690。在治疗24小时之后，收集培养基并使用9-plex试剂盒(Meso Scale DiagnosticsRockville，Maryland)分析细胞因子产生。
牙龈卟啉单胞菌LPS 1690刺激细胞因子产生，如图27中所示。瓜氨酸以剂量依赖性方式抑制牙龈卟啉单胞菌LPS 1690对促炎性细胞因子产生的作用。那些细胞因子包括IL-6、TNF-α、IL-12p70、IL-10、IL-2、IFN-r和IL-1β。
实施例25—BODIPY-TR-尸胺与细菌及其产物的结合
细菌及其产物可活化TLR2和TLR4报告基因，如实施例5和实施例8所述。本文中，以如实施例4所述的规程，进行实验以确定不同的细菌及其产物在降低BODIPY-TR-尸胺的荧光强度(下文称为BC)方面是否具有不同的IC50。简而言之，高通量筛选利用荧光染料BODIPY-TR-尸胺5-(((4-(4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-基)苯氧基)乙酰基)氨基)戊胺盐酸盐(BC荧光染料)，购自Life Technologies(Carlsbad，CA)，如先前由Wood、Miller和David(2004)所述的(Comb Chem High Throughput Screen，2004年5月；7(3)：239-49。Anti-endotoxin agents.1.Development of a fluorescentprobe displacement method optimized for the rapid identification oflipopolysaccharide-binding agents)。所述实验在室温下进行。在96孔实心黑色平底板(Corning Incorporated,Corning,NY)的孔中将大肠杆菌LPS(15μg/ml)与pH 7.4下的30μl的50mM Tris缓冲液中的SnF2和氯化十六烷基吡啶鎓混合并持续10min，然后添加20μl的60μM BC荧光染料，紧接着在21℃或室温下进行荧光测量。在SpectraMax M3自动96孔板分析仪中进行荧光测量(Molecular Device，Sunnyvale，CA)。激发波长为580nM，并且荧光发射在620nM下测量。半最大抑制浓度(IC50)是细菌产物抑制BC发射荧光的有效性的量度。其通过使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，La Jolla，CA)指示抑制一半BC荧光所需的细菌物质量。如图28和图29所示，每种细菌产物以剂量依赖方式降低BC的荧光强度。类似地，全细菌细胞和细菌生长的上清液也以剂量依赖性方式减少BC的荧光(图30和31)。
实施例26—化学靶向LPS和LTA：使用MALDI-TOF质谱检测氟化亚锡与大肠杆菌LPS 的结合。
氟化亚锡为P&G牙膏产品的主要的抗齿龈炎技术。进行测试以理解氟化亚锡是否可结合LPS，从而中和LPS促炎活性。
使用MALDI-TOF质谱分析大肠杆菌LPS和氟化亚锡LPS结合：基质辅助激光解吸电离(MALDI)是用于质谱的软电离技术。MALDI质谱可用于分析生物分子诸如肽、蛋白、多糖以及较大的有机分子诸如聚合物。在MALDI中，分析物首先与紫外线吸收基质诸如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)共结晶，然后经受脉冲YAG激光辐射。这导致分析物/基质晶体解吸并产生发射到检测用的质谱仪中的离子。在MALDI-TOF中，使用飞行时间质谱仪。MALDI-TOF数据可以以MS模式采集来生成分子量信息以及以MS/MS模式获得结构信息。典型的MALDI质谱采集需要少于一分钟，因此其可用于快速筛选目标样品中的分子种类。在该研究中，研究了大肠杆菌LPS分子量特征及其与SnF2的相互作用。将等体积的具有或不具有SnF2的大肠杆菌LPS溶液与10μl MALDI基质CHCA(80％乙腈/20％水中的10mg/ml)混合。将0.7ul样品溶液点样在MALDI板上、风干、并使用MALDI-TOF/TOF 4800plus系统(AB-Sciex，Framingham，MA，USA)以负离子模式进行分析。典型数据采集使用的质量扫描范围为500-3000Da且激光功率的4500。在样品点上利用随机化采样以自动方式采集数据，其中250次发射/子谱和共2500次发射/光谱。
图32所示的数据示出大肠杆菌LPS是异质的，原子质量范围为1130至1220。该观察结果与文件报道一致。一些LPS确实与一个锡分子结合，如箭头所示。类似地，锡是具有最大数的稳定同位素的元素，其原子质量范围为112至124。最丰富的是120Sn、118Sn和116Sn，然而最少的是115Sn。在样品中鉴定出三种不同的同位素，其中116Sn最丰富。
实施例27—化学靶向LPS和LTA：鉴定从荧光染料BODIPY-TR-尸胺中置换LPS结合 的物质。
毒力因子对宿主细胞和组织有毒性，从而造成损害、损伤、死亡或严重衰弱。解毒剂能够靶向、结合并中和细菌毒力因子，诸如LPS和LTA。在某些实施方案中，解毒剂可以按所述口腔护理组合物的重量计约0.001％至约2.0％的量存在。为了开发诸如LPS和LTA螯合作用或者解毒剂技术，使用高通量筛选(如实施例4中简述的)来鉴定破坏由LPS和LTA和其它毒力因子对toll样受体的活化的分子。高通量筛选利用荧光染料BODIPY-TR-尸胺5-(((4-(4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-基)苯氧基)乙酰基)氨基)戊胺盐酸盐(BC荧光染料)，购自Life Technologies(Carlsbad，CA)，如先前由Wood、Miller和David(2004)所述的(Comb Chem High Throughput Screen，2004年5月；7(3):239-49.Anti-endotoxin agents.1.Development of a fluorescent probedisplacement method optimized for the rapid identification oflipopolysaccharide-binding agents)。将大肠杆菌LPS(15μg/ml)与据信在美容上对人类安全的测试材料在pH 7.4的30μl 50mM Tris缓冲液中混合10min，并且然后加入20μl 60μMBC荧光染料，紧接着在21℃下荧光测量。荧光测量在自动化96孔板读数器SpectraMax M3(Molecular Device，Sunnyvale，CA)上进行。激发波长为580nM，并且荧光发射在620nM下测量。
为了鉴定避免LPS结合到BODIPY TR尸胺的技术，对内部化学库进行了筛选。认为置换15％的LPS结合的化合物是命中的；其中再次测试初始命中。
如表9所示，某些物质示出强置换活性。
表9：从结合到BODIPY TR尸胺置换LPS的化合物
实施例28—化学靶向LPS和LTA：使用最近邻相似性检索鉴定LPS结合物质。
将表9中列出的化合物用作最近邻相似性检索的原料，而不是被认为在美容上对人类是安全的测试材料。用于最邻近相似性检索的软件是Pipeline Pilot软件(版本8.5.0.2，得自BIOVIA，San Diego，CA)，其包括化学信息学组件。
最邻近相似性检索涉及4个基本步骤-结构生成；由结构生成指纹；计算两个指纹之间的距离；和应用截止值来过滤结果。
1.结构生成–使用ChemBioDraw Ultra版本14手动绘制6种先导化合物的结构，如下所示(氯己定、阿来西定、Yan-673、DS-176、氯化十六烷基吡啶鎓、DS-347)，并且转换成SMILES字符串(结构的1D表示)。目标ListNet数据库已经包含SMILES字符串形式的结构。将所有先导结构和目标结构均输入Pipeline Pilot，并且将“SMILES中的分子”组件用于将所有SMILES转换成2D分子结构。
2.指纹生成–FCFP_6指纹法用于生产所有分子指纹。
功能类延伸-连接性指纹(Functional Class Extended-ConnectivityFingerPrint)是用于形成分子中所有重(非氢)原子的原子特征代码的方法。其将以下快速功能作用代码施用于每个原子：氢键受体、氢键供体、正离子化或可正离子化、负电离化或可负离子化、芳族和卤素。下划线后面的数字表示扩展连接性的最大距离。在这种情况下，FCFP_6指示连接性扩展至多6个键直径。
FCFP由Accelrys Inc.开发，并且结合到其Pipeline Pilot软件中(“Extended-Connectivity Fingerprints”，D.Rogers和M.Hahn,J.Chem.Inf.Model.,2010,50(5)，第742–754页)。如Accelrys的Pipeline Pilot使用者手册中所述运行方案(AccelrysSoftware Inc.,Chemistry Collection:Basic Chemistry User Guide,Pipeline Pilot,San Diego:Accelrys Software Inc.，2011)。
3.计算距离-使用Tanimoto相似系数来计算每个数据库分子与使用PilelinePilot的“查找相似分子指纹”组件由上述FCFP_6分子指纹编码的先导分子之间的相似性值。
Tanimoto相似系数由以下公式定义：
其中：
SA＝目标物和参照物两者中限定的字节数
SA＝目标物而不是参照物中限定的字节数
SC＝参照物而不是目标物中限定的字节数
Tanimoto相似性范围从零(参照分子和目标分子之间没有共同的“字节”)到一(参照物和目标分子具有完全相同的“字节”)
4.截止和过滤–施用截止距离0.3来过滤结果。这导致在4456种物质中选出76种物质。手动/目视分析所述76种化合物以去除自匹配、多种盐形式和重复，并将其缩小到推荐用于实验室测试的29种顶级候选物。在LPS置换测定中，确认29种物质中的10种命中。
使用最近邻相似性检索，发现与表9中列出的与LPS结合物共享结构相似性的化合物列表(表10)。
表10：与LPS结合物共享结构相似性的物质
概述的使用方法：(1)LAL试剂盒用于量化存在的总LPS并检测抑制LAL测定的技术(实施例1-3)；(2)使用toll样受体测定以测定纯毒力和口腔牙菌斑的效能，并且测量中和毒力因子毒性的技术的功效(实施例4-12)；和(3)高通量筛选和最近邻相似性检索以鉴定新LPS和LTA缓解技术(实施例25-30)；令人惊奇地导致降低龈上菌斑毒力的分子，这导致菌斑毒性的降低。这种毒性降低是由于经鉴定化学物质对龈下环境解毒，其令人惊奇地导致更好的口腔健康，如表现为齿龈炎减少。
表11：经由鲎变形细胞裂解物测定的LPS抑制
表11中的数据显示了如通过LAL方法测量的脂多糖抑制的等级。脂多糖抑制>50％的分子将提供足够的脂多糖抑制，从而对在体内治疗应用时减少脂多糖具有作用，例如当牙粉或牙膏递送时。然而，测试的分子中的一些可与LAL方法中的酶相互作用以产生假阳性读数，使用BODIPY方法来进一步证实解毒剂在结合到毒力因子如LPS和LTA方面的活性。
表12：经由BODIPY法的LPS抑制
表12示出通过使用BODIPY方法抑制LPS的分子。一些分子，诸如棕榈酰胺单乙醇胺、亚油酸钾、和氯化十四烷基-γ-甲基吡啶鎓导致大于100％置换。这可能是由于其增强了BODIPY染料的荧光度。验证性测试是使用BODIPY和LAL两者示出置换，其如下表13所示。
表13：经由BODIPY和LAL交叉比较的LPS抑制
结构_名称 LAL抑制％ BODIPY％LPS置换
氯化十四烷基-γ-甲基吡啶鎓 95.96 262.64
亚油酸钾 98.92 153.94
十六烷基硫酸钠 89.44 124.89
fenugreek 90.00 107.75
司吡氯铵 100.13 102.04
.α.-甘油一油酸酯 48.98 92.32
四氯化锡 86.74 89.26
氯化铁六水合物 58.13 82.16
硬脂基二乙醇胺 88.09 78.64
二甲氨基丙基月桂酰胺 99.40 74.49
硬脂基酰氨基丙基二甲基胺 83.77 72.47
薰衣草桉树混合物 44.25 70.84
月桂基聚氧乙烯醚-9 99.92 70.45
亚油酰胺 75.25 66.62
熏衣草油 58.69 64.00
双甘油一油酸酯 67.01 63.16
二乙基氨基乙基硬脂酰胺 97.42 60.23
月桂基聚氧乙烯醚-6 100.44 59.27
N-氯化十二烷基吡啶鎓 96.53 57.72
N-肉豆蔻酰甘氨酸 91.40 56.24
N-十二烷基二乙醇胺 100.05 55.07
溴化十二烷基异喹啉鎓； 97.41 52.58
甲基苄索氯铵 92.98 47.52
二甲基十二烷基苄基氯化铵 98.25 47.47
东北天南星块茎 56.66 45.85
二辛基二甲基氯化铵 93.30 44.16
杜灭芬 95.54 43.50
氯化十四烷基-γ-甲基吡啶鎓 96.23 41.80
硬脂基三甲基氯化铵 71.27 40.81
使用LAL法和BODIPY法，表13所示的化合物具有抑制。这些分子是用于抑制生物体系如齿龈腔洞中的LPS从而预防或抑制齿龈炎或牙周炎的理想候选物质。
实施例29—氟化亚锡与细菌细胞壁组分结合
细菌由发育良好的细胞壁包被，所述细胞壁负责其许多独特的生物结构。细胞壁的主要功能是使细胞免受内部膨胀压力，所述内部膨胀压力由与其外部环境相比，细胞内蛋白质和其它分子的高得多的浓度导致。细菌细胞壁由位于细胞质膜外侧的肽聚糖、脂磷壁酸(LTA)、脂多糖(LPS)等组成。
示出氟化亚锡(SnF2)与大肠杆菌LPS结合，如图33所示。以实施例11所述的规程进行实验，以确定SnF2是否抑制由来自不同细菌的LPS和LTA刺激的，THP-1双细胞中NFkB-SEAP和IRF-荧光素酶报告基因的表达。在实验中，将各种浓度的SnF2施用于THP-1双报告细胞。如图33所示，SnF2以剂量依赖性方式抑制由LPS和LTA表达NFKB-SEAP受体基因。仅大肠杆菌LPS刺激IRF-荧光素酶报告基因在THP-1双细胞中的强表达。如图33所示，SnF2抑制由大肠杆菌LPS刺激的THP-1双细胞中的荧光素酶产生。
为确定SnF2是否能够抑制人原单核细胞中LPS-刺激的促炎性细胞因子的产生，在100ng大肠杆菌LPS或牙龈卟啉单胞菌LPS1690存在下，将各种浓度的SnF2施用于单细胞培养中并持续24小时。原人单细胞购自Astarte Biologics(Bothell，WA)。将细胞(200,000个细胞)在补充有9.1％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的200μl DMEM+glutaGRO中培养，并用LPS和各种浓度的SnF2进行处理。在添加LPS和SnF2之后在24小时收获培养基，并且按照制造商的说明(Meso Scale Diagnostics，Rockville，Maryland)在试剂盒中分析促炎性细胞因子。如图34所示，SnF2以剂量依赖性方式抑制由LPS刺激的细胞因子产生。令人惊奇地，大肠杆菌LPS和牙龈卟啉单胞菌LPS 1690在100ng/ml下均不刺激原人单核细胞中的IL-8产生，如图35所示。相反，其抑制IL-8的产生。SnF2以剂量依赖的方式逆转LPS对IL-8产生的抑制作用，如图35所示。
实施例30—氟化亚锡阻断荧光标记的大肠杆菌LPS与TLR4受体结合。
规程：绿色荧光Alexa Fluor 488共轭LPS购自Thermo Fisher，Waltham，MA。HEK-Blue-hTLR4细胞系购自InvivoGen，如实施例5中所述。氟化亚锡、氯化十六烷基吡啶鎓(CPC)和三氯生购自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO。在37℃培养箱，95％湿度和5％CO2下，使细胞生长并保持在具有15ml生长培养基的75cm2烧瓶中。生长培养基：DMEM，具有4.5g/l葡萄糖、补充的10％胎牛血清、50U/ml青霉素和链霉素、100μg/ml Normocin和2mM L-谷氨酰胺，购自Thermo Fisher，Waltham，MA。
LPS-TLR4结合：
A.制备溶液A(细胞生长培养基中的3倍浓度的测试化合物溶液)。
B.制备溶液B(细胞生长培养基中的3x(3ug/ml)LPS+0.15ug/mlLPS结合蛋白)。
C.取一烧瓶HEK-蓝-TRL4，通过手动摇动将细胞从生长培养基中直接分离，将悬浮的细胞转移至50μl管中，在低速(800rpm)离心3分钟后，将细胞重新悬浮于1.5-2ml细胞生长培养基中。
D.在微量离心管中，加入100μl溶液B，加入100μl溶液A(测试化合物：SNF2、CPC和三氯生)，加入相同量的培养基，加入100μl HEK-蓝-TRL4。
E.将微量离心管放置在35℃下的培养箱中，轻轻振摇1小时
F.以低速(<1000rpm)将微量离心管离心1-2min以沉淀细胞
G.移除上清液并且添加测定缓冲液(1x HBSS，20mM HEPES，pH 7.4)以重新悬浮细胞。
H.重复规程F和H一次。
I.将细胞重新悬浮于310μl的测定缓冲液中
J.将来自规程I的微量离心管的100μl细胞等分试样置于96孔测定板中(黑壁和透明底)。
K.使用ImageXpress和MetaXpress软件(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)成像和分析。
结果：在对照样品(没有测试化合物)中在HEK-蓝-hTLR4的表面上观察到强绿色荧光，如图36所示，这指示标记的LPS与位于细胞表面上的TLR4受体结合。氟化亚锡和CPC显著降低荧光强度(表14)。
表14：由SnF2和CPC抑制大肠杆菌LPS与HEK-蓝-TLR4细胞结合
实施例31—脂多糖(LPS)和细菌刺激人外周血单核细胞(PBMC)中促炎细胞因子的 产生。
使用Histopaque 1077(Sigma Aldrich Co.，St.Louis，MO，USA)和Leucosep管(Greiner Bio-One，Monroe，N.Carolina，USA)从墨西哥湾沿岸地区血液中心(Houston，TX，USA)获得的血液中分离人外周血单核细胞(PBMC)。在37℃和5％二氧化碳气氛下，在90孔板(ThermoFisher Scientific,Inc.，Grand Island，NY，USA)的每个孔中在200μlRPMI 1640培养基中培养细胞，所述培养基包含10％胎牛血清和1％霉素/霉素抗生素。牙龈卟啉菌LPS和大肠杆菌LPS购自Invivogen(San Diego，CA)。牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌、和F.alocis如实施例1所述生长。
人PBMC细胞在以每孔200,000个细胞接种到96孔板上并用临床细菌和LPS处理，每个孔(ThermoFisher Scientific,Inc.，Grand Island，NY，USA)中具有200μl RPMI 1640培养基，所述培养基包含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素抗生素。然后将细胞在37℃和5％CO2气氛下培养24小时。在实验结束时收集调理的培养基，并按照制造商的说明(MesoScale Diagnostics，Rockville，Maryland)分析ELISA试剂盒中的促炎细胞因子。如图37A、B、C、D和E所示，所有细菌均刺激促炎细胞因子的产生。类似地，大肠杆菌LPS和牙龈卟啉菌LPS 1690也促进人PBMC中的促炎细胞因子的产生(图38A、B、C、D和E)。
实施例32-将脂多糖缓解化学物质施用于口腔牙带
使用方法：
本文还设想了使用美白递送体系(诸如可商购获得的美白条带产品如CRESTWHITESTRIPS)之前或之后，使用本文所述脱敏递送体系治疗口腔(或其部分)的方法。
根据本发明，施用于牙齿条带的脂多糖失活组合物的示例见于下表15A、15B、15C和15D中。使用Ross双行星式混合机LDM-2或Ross双行星式混合机DPM-40，将组合物配混。将甘油称重并且加入到干净的Ross混合槽中。将水称重并且加入到配备有lightning混合器和4”直径涡轮混合叶片的单独不锈钢混合槽中。将羧甲基纤维素和CARBOPOL称重并且加入到干净的塑性聚乙烯桶中。将封盖施加于桶上，并且用手旋转粉末，以将粉末一起共混10分钟。将山梨酸钾、苯甲酸钾、和草酸钾称重并且加入到不锈钢混合槽中的水中。然后使用lightning混合器以使加入的盐完全溶解。将氢氧化钠称重并且加入到不锈钢混合槽中的山梨酸钾/苯甲酸钠/草酸钾溶液中。然后混合溶液直至澄清。将共混的羧甲基纤维素和CARBOPOL粉末混合物小心地手动加入到甘油中，以均匀地覆盖Ross混合槽中的甘油的表面。启动Ross搅拌器，并且以速率设置5运行30分钟。然后将得自不锈钢槽的溶液加入到Ross搅拌器中，并且以速率设置5持续混合45分钟。该混合阶段后，对所述组合物进行可见团块的检查。如果存在团块，则将所述组合物以速率设置5再混合20分钟。
一旦所述组合物的配混完成后，通过采用连续层压方法，将所述组合物槽式涂布在以商品名SCOTCHPACK 9741剥离衬件(可从3M(Minnesota，USA)商购获得)出售的由含氟聚合物涂覆的聚丙烯膜制得的剥离衬件片上，然后与聚乙烯膜材料、HDPE/LDPE共混聚乙烯膜(可自Clopay(Cincinnati，USA)以压印的聚乙烯膜–32GSM Sof-flex商购获得)结合，制得条带型递送体系。然后使该所得层合体通过旋转吻刀模，以将条带形状切至1cm×3cm。移除条带周边之外的聚乙烯材料，并且将具有纤维网上间隔1cm×3cm的条带的所得剥离衬件切成测量为3cm×9cm的单独剥离衬件。将具有条带的单独剥离衬件放入箔层压袋中，并且热封。
对所得递送体系进行剥离衬件剥离和凝胶流动的测试，并且根据本文所述方法测量和计算复合模量和δ。对一些产品进一步进行体内粘附性的测试，并且将结果包括于下文中。为测定自衬垫的剥离，将条带自箔层压袋取出，并且将条带和层压组合物抓持于两个手指之间，并且以约3cm/s的速率自剥离衬件拉出。目视分析并且记录保留在剥离衬件上的组合物的量的百分比。由佩戴小组确定体内粘附性。
具有表15中所示组合物的递送体系如本发明所述。可从下表中列出的数据看出，发现组合物15a至15E在测试的所有类别上均表现可接受。
表15–脱敏口腔护理组合物
羧甲基纤维素7M8SF、9H和7H是可从Hercules商购获得的AQUALON系列的一部分。
CARBOPOL 956可从Lubrizol商购获得。
*没有对样品收集数据点。
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个这样的量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
除非明确排除或以其他方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。任何文献的引用不是对其相对于任何本发明所公开的或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其单独地或以与任何其它参考文献或多个参考文献的组合提出、建议或公开了任何此类发明的认可。此外，如果此文献中术语的任何含义或定义与以引用方式并入本文的文献中相同术语的任何含义或定义相冲突，将以此文献中赋予该术语的含义或定义为准。
虽然已经举例说明和描述了本发明的特定实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种其它变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
序列表
<110> 宝洁公司
<120> 口腔中微生物毒力因子的解毒
<130> 13838M
<160> 9
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 786
<212> PRT
<213> 人类
<400> 1
Met Thr Ser Ile Phe His Phe Ala Ile Ile Phe Met Leu Ile Leu Gln
1 5 10 15
Ile Arg Ile Gln Leu Ser Glu Glu Ser Glu Phe Leu Val Asp Arg Ser
20 25 30
Lys Asn Gly Leu Ile His Val Pro Lys Asp Leu Ser Gln Lys Thr Thr
35 40 45
Ile Leu Asn Ile Ser Gln Asn Tyr Ile Ser Glu Leu Trp Thr Ser Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Leu Ser Lys Leu Arg Ile Leu Ile Ile Ser His Asn Arg
65 70 75 80
Ile Gln Tyr Leu Asp Ile Ser Val Phe Lys Phe Asn Gln Glu Leu Glu
85 90 95
Tyr Leu Asp Leu Ser His Asn Lys Leu Val Lys Ile Ser Cys His Pro
100 105 110
Thr Val Asn Leu Lys His Leu Asp Leu Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ala
115 120 125
Leu Pro Ile Cys Lys Glu Phe Gly Asn Met Ser Gln Leu Lys Phe Leu
130 135 140
Gly Leu Ser Thr Thr His Leu Glu Lys Ser Ser Val Leu Pro Ile Ala
145 150 155 160
His Leu Asn Ile Ser Lys Val Leu Leu Val Leu Gly Glu Thr Tyr Gly
165 170 175
Glu Lys Glu Asp Pro Glu Gly Leu Gln Asp Phe Asn Thr Glu Ser Leu
180 185 190
His Ile Val Phe Pro Thr Asn Lys Glu Phe His Phe Ile Leu Asp Val
195 200 205
Ser Val Lys Thr Val Ala Asn Leu Glu Leu Ser Asn Ile Lys Cys Val
210 215 220
Leu Glu Asp Asn Lys Cys Ser Tyr Phe Leu Ser Ile Leu Ala Lys Leu
225 230 235 240
Gln Thr Asn Pro Lys Leu Ser Asn Leu Thr Leu Asn Asn Ile Glu Thr
245 250 255
Thr Trp Asn Ser Phe Ile Arg Ile Leu Gln Leu Val Trp His Thr Thr
260 265 270
Val Trp Tyr Phe Ser Ile Ser Asn Val Lys Leu Gln Gly Gln Leu Asp
275 280 285
Phe Arg Asp Phe Asp Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Lys Ala Leu Ser Ile
290 295 300
His Gln Val Val Ser Asp Val Phe Gly Phe Pro Gln Ser Tyr Ile Tyr
305 310 315 320
Glu Ile Phe Ser Asn Met Asn Ile Lys Asn Phe Thr Val Ser Gly Thr
325 330 335
Arg Met Val His Met Leu Cys Pro Ser Lys Ile Ser Pro Phe Leu His
340 345 350
Leu Asp Phe Ser Asn Asn Leu Leu Thr Asp Thr Val Phe Glu Asn Cys
355 360 365
Gly His Leu Thr Glu Leu Glu Thr Leu Ile Leu Gln Met Asn Gln Leu
370 375 380
Lys Glu Leu Ser Lys Ile Ala Glu Met Thr Thr Gln Met Lys Ser Leu
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Gln Gln Leu Asp Ile Ser Gln Asn Ser Val Ser Tyr Asp Glu Lys Lys
405 410 415
Gly Asp Cys Ser Trp Thr Lys Ser Leu Leu Ser Leu Asn Met Ser Ser
420 425 430
Asn Ile Leu Thr Asp Thr Ile Phe Arg Cys Leu Pro Pro Arg Ile Lys
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Val Leu Asp Leu His Ser Asn Lys Ile Lys Ser Ile Pro Lys Gln Val
450 455 460
Val Lys Leu Glu Ala Leu Gln Glu Leu Asn Val Ala Phe Asn Ser Leu
465 470 475 480
Thr Asp Leu Pro Gly Cys Gly Ser Phe Ser Ser Leu Ser Val Leu Ile
485 490 495
Ile Asp His Asn Ser Val Ser His Pro Ser Ala Asp Phe Phe Gln Ser
500 505 510
Cys Gln Lys Met Arg Ser Ile Lys Ala Gly Asp Asn Pro Phe Gln Cys
515 520 525
Thr Cys Glu Leu Gly Glu Phe Val Lys Asn Ile Asp Gln Val Ser Ser
530 535 540
Glu Val Leu Glu Gly Trp Pro Asp Ser Tyr Lys Cys Asp Tyr Pro Glu
545 550 555 560
Ser Tyr Arg Gly Thr Leu Leu Lys Asp Phe His Met Ser Glu Leu Ser
565 570 575
Cys Asn Ile Thr Leu Leu Ile Val Thr Ile Val Ala Thr Met Leu Val
580 585 590
Leu Ala Val Thr Val Thr Ser Leu Cys Ser Tyr Leu Asp Leu Pro Trp
595 600 605
Tyr Leu Arg Met Val Cys Gln Trp Thr Gln Thr Arg Arg Arg Ala Arg
610 615 620
Asn Ile Pro Leu Glu Glu Leu Gln Arg Asn Leu Gln Phe His Ala Phe
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Ile Ser Tyr Ser Gly His Asp Ser Phe Trp Val Lys Asn Glu Leu Leu
645 650 655
Pro Asn Leu Glu Lys Glu Gly Met Gln Ile Cys Leu His Glu Arg Asn
660 665 670
Phe Val Pro Gly Lys Ser Ile Val Glu Asn Ile Ile Thr Cys Ile Glu
675 680 685
Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser Pro Asn Phe Val Gln Ser
690 695 700
Glu Trp Cys His Tyr Glu Leu Tyr Phe Ala His His Asn Leu Phe His
705 710 715 720
Glu Gly Ser Asn Ser Leu Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Pro Gln
725 730 735
Tyr Ser Ile Pro Ser Ser Tyr His Lys Leu Lys Ser Leu Met Ala Arg
740 745 750
Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Lys Glu Lys Ser Lys Arg Gly Leu Phe
755 760 765
Trp Ala Asn Leu Arg Ala Ala Ile Asn Ile Lys Leu Thr Glu Gln Ala
770 775 780
Lys Lys
785
<210> 2
<211> 784
<212> PRT
<213> 人类
<400> 2
Met Pro His Thr Leu Trp Met Val Trp Val Leu Gly Val Ile Ile Ser
1 5 10 15
Leu Ser Lys Glu Glu Ser Ser Asn Gln Ala Ser Leu Ser Cys Asp Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Cys Lys Gly Ser Ser Gly Ser Leu Asn Ser Ile Pro Ser
35 40 45
Gly Leu Thr Glu Ala Val Lys Ser Leu Asp Leu Ser Asn Asn Arg Ile
50 55 60
Thr Tyr Ile Ser Asn Ser Asp Leu Gln Arg Cys Val Asn Leu Gln Ala
65 70 75 80
Leu Val Leu Thr Ser Asn Gly Ile Asn Thr Ile Glu Glu Asp Ser Phe
85 90 95
Ser Ser Leu Gly Ser Leu Glu His Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Tyr Leu
100 105 110
Ser Asn Leu Ser Ser Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ser Ser Leu Thr Phe
115 120 125
Leu Asn Leu Leu Gly Asn Pro Tyr Lys Thr Leu Gly Glu Thr Ser Leu
130 135 140
Phe Ser His Leu Thr Lys Leu Gln Ile Leu Arg Val Gly Asn Met Asp
145 150 155 160
Thr Phe Thr Lys Ile Gln Arg Lys Asp Phe Ala Gly Leu Thr Phe Leu
165 170 175
Glu Glu Leu Glu Ile Asp Ala Ser Asp Leu Gln Ser Tyr Glu Pro Lys
180 185 190
Ser Leu Lys Ser Ile Gln Asn Val Ser His Leu Ile Leu His Met Lys
195 200 205
Gln His Ile Leu Leu Leu Glu Ile Phe Val Asp Val Thr Ser Ser Val
210 215 220
Glu Cys Leu Glu Leu Arg Asp Thr Asp Leu Asp Thr Phe His Phe Ser
225 230 235 240
Glu Leu Ser Thr Gly Glu Thr Asn Ser Leu Ile Lys Lys Phe Thr Phe
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Arg Asn Val Lys Ile Thr Asp Glu Ser Leu Phe Gln Val Met Lys Leu
260 265 270
Leu Asn Gln Ile Ser Gly Leu Leu Glu Leu Glu Phe Asp Asp Cys Thr
275 280 285
Leu Asn Gly Val Gly Asn Phe Arg Ala Ser Asp Asn Asp Arg Val Ile
290 295 300
Asp Pro Gly Lys Val Glu Thr Leu Thr Ile Arg Arg Leu His Ile Pro
305 310 315 320
Arg Phe Tyr Leu Phe Tyr Asp Leu Ser Thr Leu Tyr Ser Leu Thr Glu
325 330 335
Arg Val Lys Arg Ile Thr Val Glu Asn Ser Lys Val Phe Leu Val Pro
340 345 350
Cys Leu Leu Ser Gln His Leu Lys Ser Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Ser
355 360 365
Glu Asn Leu Met Val Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Ser Ala Cys Glu Asp
370 375 380
Ala Trp Pro Ser Leu Gln Thr Leu Ile Leu Arg Gln Asn His Leu Ala
385 390 395 400
Ser Leu Glu Lys Thr Gly Glu Thr Leu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Thr
405 410 415
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Gln Trp Pro Glu Lys Met Lys Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Thr Arg Ile
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Ser Asn Asn Asn Leu Asn Leu Phe Ser Leu Asn Leu Pro Gln Leu Lys
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Glu Leu Tyr Ile Ser Arg Asn Lys Leu Met Thr Leu Pro Asp Ala Ser
485 490 495
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580 585 590
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610 615 620
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645 650 655
Asn Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn Phe Asn Pro Pro Phe Lys Leu
660 665 670
Cys Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro Gly Lys Trp Ile Ile Asp Asn
675 680 685
Ile Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys Thr Val Phe Val Leu Ser
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705 710 715 720
His Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp Ala Ala Ile Leu Ile Leu
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Leu Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile Pro Gln Arg Phe Cys Lys Leu
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755 760 765
Ala Gln Arg Glu Gly Phe Trp Val Asn Leu Arg Ala Ala Ile Lys Ser
770 775 780
<210> 3
<211> 904
<212> PRT
<213> 人类
<400> 3
Met Arg Gln Thr Leu Pro Cys Ile Tyr Phe Trp Gly Gly Leu Leu Pro
1 5 10 15
Phe Gly Met Leu Cys Ala Ser Ser Thr Thr Lys Cys Thr Val Ser His
20 25 30
Glu Val Ala Asp Cys Ser His Leu Lys Leu Thr Gln Val Pro Asp Asp
35 40 45
Leu Pro Thr Asn Ile Thr Val Leu Asn Leu Thr His Asn Gln Leu Arg
50 55 60
Arg Leu Pro Ala Ala Asn Phe Thr Arg Tyr Ser Gln Leu Thr Ser Leu
65 70 75 80
Asp Val Gly Phe Asn Thr Ile Ser Lys Leu Glu Pro Glu Leu Cys Gln
85 90 95
Lys Leu Pro Met Leu Lys Val Leu Asn Leu Gln His Asn Glu Leu Ser
100 105 110
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115 120 125
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Ser Thr Lys Leu Gly Thr Gln Val Gln Leu Glu Asn Leu Gln Glu Leu
165 170 175
Leu Leu Ser Asn Asn Lys Ile Gln Ala Leu Lys Ser Glu Glu Leu Asp
180 185 190
Ile Phe Ala Asn Ser Ser Leu Lys Lys Leu Glu Leu Ser Ser Asn Gln
195 200 205
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210 215 220
Gly Leu Phe Leu Asn Asn Val Gln Leu Gly Pro Ser Leu Thr Glu Lys
225 230 235 240
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275 280 285
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Leu Gly Leu Asn Asn Leu Asn Thr Leu Pro Ala Ser Val Phe Asn Asn
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Val Glu Lys Lys Val Phe Gly Pro Ala Phe Arg Asn Leu Thr Glu Leu
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<213> 人类
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Ser Ser Ser Thr Ser Arg Thr Met Glu Ser Glu Ser Leu Arg Thr Leu
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Glu Phe Arg Gly Asn His Leu Asp Val Leu Trp Arg Glu Gly Asp Asn
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Arg Tyr Leu Gln Leu Phe Lys Asn Leu Leu Lys Leu Glu Glu Leu Asp
645 650 655
Ile Ser Lys Asn Ser Leu Ser Phe Leu Pro Ser Gly Val Phe Asp Gly
660 665 670
Met Pro Pro Asn Leu Lys Asn Leu Ser Leu Ala Lys Asn Gly Leu Lys
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Ser Phe Ser Trp Lys Lys Leu Gln Cys Leu Lys Asn Leu Glu Thr Leu
690 695 700
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<211> 1041
<212> PRT
<213> 人类
<400> 8
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Val Thr Glu Leu Asp Leu Ser Asp Asn Phe Ile Thr His Ile Thr Asn
65 70 75 80
Glu Ser Phe Gln Gly Leu Gln Asn Leu Thr Lys Ile Asn Leu Asn His
85 90 95
Asn Pro Asn Val Gln His Gln Asn Gly Asn Pro Gly Ile Gln Ser Asn
100 105 110
Gly Leu Asn Ile Thr Asp Gly Ala Phe Leu Asn Leu Lys Asn Leu Arg
115 120 125
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Asn Gln Leu Pro Gln Ile Pro Ser Gly Leu
130 135 140
Pro Glu Ser Leu Thr Glu Leu Ser Leu Ile Gln Asn Asn Ile Tyr Asn
145 150 155 160
Ile Thr Lys Glu Gly Ile Ser Arg Leu Ile Asn Leu Lys Asn Leu Tyr
165 170 175
Leu Ala Trp Asn Cys Tyr Phe Asn Lys Val Cys Glu Lys Thr Asn Ile
180 185 190
Glu Asp Gly Val Phe Glu Thr Leu Thr Asn Leu Glu Leu Leu Ser Leu
195 200 205
Ser Phe Asn Ser Leu Ser His Val Pro Pro Lys Leu Pro Ser Ser Leu
210 215 220
Arg Lys Leu Phe Leu Ser Asn Thr Gln Ile Lys Tyr Ile Ser Glu Glu
225 230 235 240
Asp Phe Lys Gly Leu Ile Asn Leu Thr Leu Leu Asp Leu Ser Gly Asn
245 250 255
Cys Pro Arg Cys Phe Asn Ala Pro Phe Pro Cys Val Pro Cys Asp Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Ile Asn Ile Asp Arg Phe Ala Phe Gln Asn Leu Thr Gln
275 280 285
Leu Arg Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Thr Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ala
290 295 300
Ala Trp Phe Lys Asn Met Pro His Leu Lys Val Leu Asp Leu Glu Phe
305 310 315 320
Asn Tyr Leu Val Gly Glu Ile Ala Ser Gly Ala Phe Leu Thr Met Leu
325 330 335
Pro Arg Leu Glu Ile Leu Asp Leu Ser Phe Asn Tyr Ile Lys Gly Ser
340 345 350
Tyr Pro Gln His Ile Asn Ile Ser Arg Asn Phe Ser Lys Leu Leu Ser
355 360 365
Leu Arg Ala Leu His Leu Arg Gly Tyr Val Phe Gln Glu Leu Arg Glu
370 375 380
Asp Asp Phe Gln Pro Leu Met Gln Leu Pro Asn Leu Ser Thr Ile Asn
385 390 395 400
Leu Gly Ile Asn Phe Ile Lys Gln Ile Asp Phe Lys Leu Phe Gln Asn
405 410 415
Phe Ser Asn Leu Glu Ile Ile Tyr Leu Ser Glu Asn Arg Ile Ser Pro
420 425 430
Leu Val Lys Asp Thr Arg Gln Ser Tyr Ala Asn Ser Ser Ser Phe Gln
435 440 445
Arg His Ile Arg Lys Arg Arg Ser Thr Asp Phe Glu Phe Asp Pro His
450 455 460
Ser Asn Phe Tyr His Phe Thr Arg Pro Leu Ile Lys Pro Gln Cys Ala
465 470 475 480
Ala Tyr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Leu Asn Ser Ile Phe Phe Ile
485 490 495
Gly Pro Asn Gln Phe Glu Asn Leu Pro Asp Ile Ala Cys Leu Asn Leu
500 505 510
Ser Ala Asn Ser Asn Ala Gln Val Leu Ser Gly Thr Glu Phe Ser Ala
515 520 525
Ile Pro His Val Lys Tyr Leu Asp Leu Thr Asn Asn Arg Leu Asp Phe
530 535 540
Asp Asn Ala Ser Ala Leu Thr Glu Leu Ser Asp Leu Glu Val Leu Asp
545 550 555 560
Leu Ser Tyr Asn Ser His Tyr Phe Arg Ile Ala Gly Val Thr His His
565 570 575
Leu Glu Phe Ile Gln Asn Phe Thr Asn Leu Lys Val Leu Asn Leu Ser
580 585 590
His Asn Asn Ile Tyr Thr Leu Thr Asp Lys Tyr Asn Leu Glu Ser Lys
595 600 605
Ser Leu Val Glu Leu Val Phe Ser Gly Asn Arg Leu Asp Ile Leu Trp
610 615 620
Asn Asp Asp Asp Asn Arg Tyr Ile Ser Ile Phe Lys Gly Leu Lys Asn
625 630 635 640
Leu Thr Arg Leu Asp Leu Ser Leu Asn Arg Leu Lys His Ile Pro Asn
645 650 655
Glu Ala Phe Leu Asn Leu Pro Ala Ser Leu Thr Glu Leu His Ile Asn
660 665 670
Asp Asn Met Leu Lys Phe Phe Asn Trp Thr Leu Leu Gln Gln Phe Pro
675 680 685
Arg Leu Glu Leu Leu Asp Leu Arg Gly Asn Lys Leu Leu Phe Leu Thr
690 695 700
Asp Ser Leu Ser Asp Phe Thr Ser Ser Leu Arg Thr Leu Leu Leu Ser
705 710 715 720
His Asn Arg Ile Ser His Leu Pro Ser Gly Phe Leu Ser Glu Val Ser
725 730 735
Ser Leu Lys His Leu Asp Leu Ser Ser Asn Leu Leu Lys Thr Ile Asn
740 745 750
Lys Ser Ala Leu Glu Thr Lys Thr Thr Thr Lys Leu Ser Met Leu Glu
755 760 765
Leu His Gly Asn Pro Phe Glu Cys Thr Cys Asp Ile Gly Asp Phe Arg
770 775 780
Arg Trp Met Asp Glu His Leu Asn Val Lys Ile Pro Arg Leu Val Asp
785 790 795 800
Val Ile Cys Ala Ser Pro Gly Asp Gln Arg Gly Lys Ser Ile Val Ser
805 810 815
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820 825 830
Phe Phe Thr Phe Phe Ile Thr Thr Met Val Met Leu Ala Ala Leu Ala
835 840 845
His His Leu Phe Tyr Trp Asp Val Trp Phe Ile Tyr Asn Val Cys Leu
850 855 860
Ala Lys Val Lys Gly Tyr Arg Ser Leu Ser Thr Ser Gln Thr Phe Tyr
865 870 875 880
Asp Ala Tyr Ile Ser Tyr Asp Thr Lys Asp Ala Ser Val Thr Asp Trp
885 890 895
Val Ile Asn Glu Leu Arg Tyr His Leu Glu Glu Ser Arg Asp Lys Asn
900 905 910
Val Leu Leu Cys Leu Glu Glu Arg Asp Trp Asp Pro Gly Leu Ala Ile
915 920 925
Ile Asp Asn Leu Met Gln Ser Ile Asn Gln Ser Lys Lys Thr Val Phe
930 935 940
Val Leu Thr Lys Lys Tyr Ala Lys Ser Trp Asn Phe Lys Thr Ala Phe
945 950 955 960
Tyr Leu Ala Leu Gln Arg Leu Met Asp Glu Asn Met Asp Val Ile Ile
965 970 975
Phe Ile Leu Leu Glu Pro Val Leu Gln His Ser Gln Tyr Leu Arg Leu
980 985 990
Arg Gln Arg Ile Cys Lys Ser Ser Ile Leu Gln Trp Pro Asp Asn Pro
995 1000 1005
Lys Ala Glu Gly Leu Phe Trp Gln Thr Leu Arg Asn Val Val Leu
1010 1015 1020
Thr Glu Asn Asp Ser Arg Tyr Asn Asn Met Tyr Val Asp Ser Ile
1025 1030 1035
Lys Gln Tyr
1040
<210> 9
<211> 1032
<212> PRT
<213> 人类
<400> 9
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1 5 10 15
Ala Ile Met Leu Ala Met Thr Leu Ala Leu Gly Thr Leu Pro Ala Phe
20 25 30
Leu Pro Cys Glu Leu Gln Pro His Gly Leu Val Asn Cys Asn Trp Leu
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Val Pro His Phe Ser Met Ala Ala Pro Arg Gly Asn
50 55 60
Val Thr Ser Leu Ser Leu Ser Ser Asn Arg Ile His His Leu His Asp
65 70 75 80
Ser Asp Phe Ala His Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Trp
85 90 95
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100 105 110
Thr Ile Glu Pro Ser Thr Phe Leu Ala Val Pro Thr Leu Glu Glu Leu
115 120 125
Asn Leu Ser Tyr Asn Asn Ile Met Thr Val Pro Ala Leu Pro Lys Ser
130 135 140
Leu Ile Ser Leu Ser Leu Ser His Thr Asn Ile Leu Met Leu Asp Ser
145 150 155 160
Ala Ser Leu Ala Gly Leu His Ala Leu Arg Phe Leu Phe Met Asp Gly
165 170 175
Asn Cys Tyr Tyr Lys Asn Pro Cys Arg Gln Ala Leu Glu Val Ala Pro
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Gly Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Ser Leu Lys Tyr
195 200 205
Asn Asn Leu Thr Val Val Pro Arg Asn Leu Pro Ser Ser Leu Glu Tyr
210 215 220
Leu Leu Leu Ser Tyr Asn Arg Ile Val Lys Leu Ala Pro Glu Asp Leu
225 230 235 240
Ala Asn Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Val Gly Gly Asn Cys Arg
245 250 255
Arg Cys Asp His Ala Pro Asn Pro Cys Met Glu Cys Pro Arg His Phe
260 265 270
Pro Gln Leu His Pro Asp Thr Phe Ser His Leu Ser Arg Leu Glu Gly
275 280 285
Leu Val Leu Lys Asp Ser Ser Leu Ser Trp Leu Asn Ala Ser Trp Phe
290 295 300
Arg Gly Leu Gly Asn Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Glu Asn Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Ile Thr Lys Thr Lys Ala Phe Gln Gly Leu Thr Gln Leu
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Arg Lys Leu Asn Leu Ser Phe Asn Tyr Gln Lys Arg Val Ser Phe Ala
340 345 350
His Leu Ser Leu Ala Pro Ser Phe Gly Ser Leu Val Ala Leu Lys Glu
355 360 365
Leu Asp Met His Gly Ile Phe Phe Arg Ser Leu Asp Glu Thr Thr Leu
370 375 380
Arg Pro Leu Ala Arg Leu Pro Met Leu Gln Thr Leu Arg Leu Gln Met
385 390 395 400
Asn Phe Ile Asn Gln Ala Gln Leu Gly Ile Phe Arg Ala Phe Pro Gly
405 410 415
Leu Arg Tyr Val Asp Leu Ser Asp Asn Arg Ile Ser Gly Ala Ser Glu
420 425 430
Leu Thr Ala Thr Met Gly Glu Ala Asp Gly Gly Glu Lys Val Trp Leu
435 440 445
Gln Pro Gly Asp Leu Ala Pro Ala Pro Val Asp Thr Pro Ser Ser Glu
450 455 460
Asp Phe Arg Pro Asn Cys Ser Thr Leu Asn Phe Thr Leu Asp Leu Ser
465 470 475 480
Arg Asn Asn Leu Val Thr Val Gln Pro Glu Met Phe Ala Gln Leu Ser
485 490 495
His Leu Gln Cys Leu Arg Leu Ser His Asn Cys Ile Ser Gln Ala Val
500 505 510
Asn Gly Ser Gln Phe Leu Pro Leu Thr Gly Leu Gln Val Leu Asp Leu
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580 585 590
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595 600 605
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645 650 655
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Leu His Phe Leu Pro Lys Leu Glu Val Leu Asp Leu Ala Gly Asn Gln
675 680 685
Leu Lys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Leu Pro Ala Gly Thr Arg Leu Arg
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Arg Leu Asp Val Ser Cys Asn Ser Ile Ser Phe Val Ala Pro Gly Phe
705 710 715 720
Phe Ser Lys Ala Lys Glu Leu Arg Glu Leu Asn Leu Ser Ala Asn Ala
725 730 735
Leu Lys Thr Val Asp His Ser Trp Phe Gly Pro Leu Ala Ser Ala Leu
740 745 750
Gln Ile Leu Asp Val Ser Ala Asn Pro Leu His Cys Ala Cys Gly Ala
755 760 765
Ala Phe Met Asp Phe Leu Leu Glu Val Gln Ala Ala Val Pro Gly Leu
770 775 780
Pro Ser Arg Val Lys Cys Gly Ser Pro Gly Gln Leu Gln Gly Leu Ser
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Pro Met Leu His His Leu Cys Gly Trp Asp Leu Trp Tyr Cys Phe His
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850 855 860
Glu Asp Ala Leu Pro Tyr Asp Ala Phe Val Val Phe Asp Lys Thr Gln
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Ser Ala Val Ala Asp Trp Val Tyr Asn Glu Leu Arg Gly Gln Leu Glu
885 890 895
Glu Cys Arg Gly Arg Trp Ala Leu Arg Leu Cys Leu Glu Glu Arg Asp
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Trp Leu Pro Gly Lys Thr Leu Phe Glu Asn Leu Trp Ala Ser Val Tyr
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Gly Ser Arg Lys Thr Leu Phe Val Leu Ala His Thr Asp Arg Val Ser
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Gly Leu Leu Arg Ala Ser Phe Leu Leu Ala Gln Gln Arg Leu Leu Glu
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Asp Arg Lys Asp Val Val Val Leu Val Ile Leu Ser Pro Asp Gly Arg
965 970 975
Arg Ser Arg Tyr Val Arg Leu Arg Gln Arg Leu Cys Arg Gln Ser Val
980 985 990
Leu Leu Trp Pro His Gln Pro Ser Gly Gln Arg Ser Phe Trp Ala Gln
995 1000 1005
Leu Gly Met Ala Leu Thr Arg Asp Asn His His Phe Tyr Asn Arg
1010 1015 1020
Asn Phe Cys Gln Gly Pro Thr Ala Glu
1025 1030

Claims (8)

1.一种用于鉴定用于对口腔毒力因子解毒的试剂的方法，所述方法包括：
a)提供表达TLR2或TLR4中的至少一种的报告细胞；
b)提供口腔毒力因子；
c)提供潜在解毒剂；
d)将口腔毒力因子和潜在解毒剂与报告细胞混合；
e)测定毒力因子的EC50。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述毒力因子为脂多糖，优选地其中所述脂多糖来自革兰氏阴性菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述毒力因子为脂磷壁酸，优选地其中所述脂磷壁酸来自革兰氏阳性菌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述潜在解毒剂为下列中的至少一种：氯化十四烷基-γ-甲基吡啶鎓、亚油酸钾、十六烷基硫酸钠、fenugreek、N-吡啶鎓氯化物、α-甘油单油酸酯、硬脂基二乙醇胺、二甲氨基丙基十二烷基酰胺、硬脂基酰氨基丙基二甲基胺、亚油酰胺、N-十二烷基二乙醇胺、硬脂基三甲基氯化铵、六聚乙二醇单癸醚、月桂基聚氧乙烯醚-6、月桂基聚氧乙烯醚-9、季铵-17、溴烯醇内酯、油胺、十六烷基三甲基氯化铵、或棕榈酰胺单乙醇胺。
5.一种鉴定与脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种结合的解毒剂的方法，所述方法包括：
a)提供表达TLR2或TLR4中的至少一种的报告细胞；
b)提供脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种；
c)使脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种和潜在解毒剂与报告细胞混合；
d)使用低EC50脂多糖或脂磷壁酸的BODIPY法或LAL法中的至少一种测量潜在解毒剂的结合；以及
e)测定脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种的EC50。
6.一种口腔护理组合物，所述口腔护理组合物包含：
解毒剂，所述解毒剂为下列中的至少一种：氯化十四烷基-γ-甲基吡啶鎓、亚油酸钾、十六烷基硫酸钠、fenugreek、N-吡啶鎓氯化物、α-甘油单油酸酯、硬脂基二乙醇胺、二甲氨基丙基十二烷基酰胺、硬脂基酰氨基丙基二甲基胺、亚油酰胺、N-十二烷基二乙醇胺、硬脂基三甲基氯化铵、六聚乙二醇单癸醚、月桂基聚氧乙烯醚-6、月桂基聚氧乙烯醚-9、季铵-17、溴烯醇内酯、油胺、十六烷基三甲基氯化铵、或棕榈酰胺单乙醇胺。
7.根据权利要求6所述的口腔护理组合物，其中所述解毒剂以按所述口腔护理组合物的重量计约0.001％至约2.0％的量存在。
8.根据权利要求6或7所述的口腔护理组合物，其中所述口腔护理组合物为条带。
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