CN107636151A - 乙酰乳酸脱羧酶 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了包含具有更好的稳定性和/或活性的ALDC酶的方法、组合物、装置和试剂盒，并且任选地，从微生物中可以回收的ALDC酶的产率得以改善。在一些实施例中，本披露提供了使用金属离子以增加稳定性和/或活性的方法、装置、组合物和试剂盒，并且所述方法、装置、组合物和试剂盒还可用于以改善的产率从微生物中回收所述酶。

Description

乙酰乳酸脱羧酶
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年5月22日提交的美国临时专利申请号62/165671；于2015年5月26日提交的美国临时专利申请号62/166610；以及于2015年5月29日提交的美国临时专利申请号62/168406；题为“ALDC”的每个临时申请的优先权和权益。
通过引用并入序列表
将于2016年5月5日创建并同时提交的、以大小为16,666字节、名称为“20160505_NB40736_PCT_SEQS_ST25.txt”的文件形式提供的序列表通过引用以其全文并入本文。
发明背景
有时，二乙酰是含碳水化合物物质(例如，麦芽汁或葡萄汁)在发酵过程中不希望产生的副产物。二乙酰的形成是最不利的，因为二乙酰具有强烈且难闻的气味，并且在啤酒发酵过程中，即使少量的约0.10至0.15mg/升的二乙酰对啤酒的风味和味道也具有负面影响。在啤酒成熟期间，二乙酰被酵母细胞中的还原酶转化成乙偶姻。关于啤酒中可接受的味道和风味，乙偶姻的浓度要高于二乙酰。
乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)也可以用作酶，以防止形成二乙酰。可以通过在发酵过程中添加ALDC酶，将α-乙酰乳酸转化成乙偶姻。然而，ALDC在发酵条件下可能不稳定，特别是那些麦芽含量低的发酵麦芽汁的ALDC。
本发明的目的是提供具有更好的稳定性和/或活性的ALDC酶，并且任选地，从微生物中可以回收的ALDC酶的产率得以改善。
发明内容
本披露提供了针对ALDC酶的组合物和方法。
在以下分别编号的段落中阐述了组合物和方法的多个方面和实施例。
1.一种组合物，其包含乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)和锌，其中所述锌以约1μM至约200mM的浓度存在。
2.如段落1所述的组合物，其中所述锌以如下浓度存在：约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约25μM至约50μM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约500μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约10mM、或约1mM至约5mM。
3.如任何前述段落所述的组合物，其中所述锌以约100μM至约10mM的浓度存在。
4.如任何前述段落所述的组合物，其中所述锌以约1mM至约5mM的浓度存在。如任何前述段落所述的组合物，其中锌与ALDC酶的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
5.如任何前述段落所述的组合物，其中所述ALDC酶是ALDC衍生物。
6.如段落5所述的组合物，其中所述ALDC衍生物是用戊二醛处理过的ALDC酶。
7.如段落6所述的组合物，其中以对应于约0.1g至约5g戊二醛/g纯ALDC酶的浓度用戊二醛处理所述ALDC酶。
8.如任何前述段落所述的组合物，其中所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质的范围内。
9.如任何前述段落所述的组合物，其中所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。
10.如任何前述段落所述的组合物，其进一步包含选自由以下各项组成的组中的至少一种另外的酶或酶衍生物：乙酰乳酸还原异构酶、乙酰乳酸异构酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、内切葡聚糖酶和相关β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶、木聚糖酶辅助酶(例如，阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和木聚糖乙酰酯酶)和蛋白酶。
11.如任何前述段落所述的组合物，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、乳酸乳球菌DX(Lactococcuslactis DX)、或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
12.如任何前述段落所述的组合物，其中所述ALDC酶来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
13.如任何前述段落所述的组合物，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
14.根据任何前述段落所述的组合物在发酵(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵)中的用途。
15.一种用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法，所述方法包括添加浓度为约1μM至约200mM的锌。如段落15所述的用于增加ALDC酶在包含ALDC的组合物中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括将锌添加到所述组合物中的步骤，以使所述锌以约1μM至约200mM的浓度存在于所述组合物中。
16.如段落15所述的方法，其中所述锌以如下浓度存在于所述组合物中：约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约50μM、或约1μM至约25μM、或约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约25μM至约50μM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约500μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约10mM、或约1mM至约5mM。
17.如段落15或16所述的方法，其中所述锌以约100μM至约10mM的浓度存在于所述组合物中。
18.如段落15或16所述的方法，其中所述锌以约1mM至约5mM的浓度存在于所述组合物中。如段落15或16所述的方法，其中锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
19.如段落15所述的方法，其中在由产ALDC的宿主细胞生产所述ALDC酶期间，向培养介质中添加所述锌作为补充剂。一种用于增加ALDC酶在包含产ALDC的宿主细胞的培养介质中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括在由所述产ALDC的宿主细胞生产所述ALDC酶期间，向所述培养介质中添加锌作为补充剂的步骤。
20.如段落19所述的方法，其中以1μM至约1mM的浓度添加所述锌。
21.如段落20所述的方法，其中以25μM至约150μM、或约60μM至约150μM的浓度添加所述锌。
22.如段落19-21中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是芽胞杆菌属(Bacillus)宿主细胞。
23.如段落22所述的方法，其中所述芽胞杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
24.如段落15所述的方法，其中在饮料发酵(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵)期间将所述锌添加到发酵介质和/或成熟介质中。一种用于增加ALDC酶在包含产ALDC的宿主细胞的发酵介质和/或成熟介质中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括在饮料发酵(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵)期间将锌添加到所述发酵介质和/或成熟介质中的步骤。
25.如段落24所述的方法，其中以如下浓度添加所述锌：约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约50μM、或约1μM至约25μM。
26.如段落24、25以及当前段落中任一项所述的方法，其中将所述锌作为包含ALDC和锌的组合物添加，其中所述锌以1mM至约5mM的浓度存在于所述组合物中。如段落24、25以及当前段落中任一项所述的方法，其中将所述锌作为包含ALDC和锌的组合物添加，其中锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
27.一种用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约1μM至约1mM的锌；优选地，所述培养介质包含产ALDC的宿主细胞。
28.如段落27所述的培养介质，其包含浓度为约25μM至约150μM的锌。
29.如段落27所述的培养介质，其中以60μM至约150μM的浓度添加所述锌。
30.一种啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其包含ALDC酶和浓度为约0.1μM至约200mM的锌，一种啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其包含含有ALDC酶和锌的组合物，其中所述组合物包含浓度为约0.1μM至约200mM，优选地1μM至约200mM的锌。
31.如段落30所述的啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其中所述组合物包含浓度为约0.1μM至约300μM，优选地1μM至约300μM的锌。如段落30所述的啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其中所述组合物包含具有以下浓度的锌：约6μM至约300μM、或约1μM至约50μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM。如段落30和当前段落所述的啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其中将所述锌和所述ALDC酶以组合物进行添加，其中所述锌以约1mM至约20mM，例如1mM至约5mM的浓度存在于所述组合物中。如段落30或当前段落所述的啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其中将所述锌和所述ALDC酶以组合物进行添加，其中锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
32.如段落30或31所述的啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其中所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。
33.如段落30-32中任一项所述的啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其进一步包含选自由以下各项组成的组中的至少一种另外的酶或酶衍生物：乙酰乳酸还原异构酶、乙酰乳酸异构酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、内切葡聚糖酶和相关β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶、木聚糖酶辅助酶(例如，阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和木聚糖乙酰酯酶)和蛋白酶。
34.一种包含ALDC酶的组合物，其中所述ALDC酶在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。
35.如段落34所述的组合物，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。
36.如段落34所述的组合物，其中所述ALDC酶来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
37.如段落34-36中任一项所述的组合物，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
38.如段落34-37中任一项所述的组合物，其中锌以约1μM至约200mM，优选地约100μM至约200mM的浓度存在。如段落34-37中任一项所述的组合物，其中锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
39.一种用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括在所述啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产过程中添加ALDC酶和锌，其中所述锌以约0.1μM至约300μM，优选地约1μM至约300μM的浓度存在。如段落39所述的用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括在所述啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产过程中向用于所述啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加ALDC酶并添加锌，使得所述锌以约0.1μM至约300μM，例如约6μM至约300μM的浓度存在于所述介质中。
40.如段落39所述的方法，其中所述锌以约0.1μM至约50μM的浓度存在于所述介质中。如段落39所述的方法，其中所述锌以如下浓度存在于所述介质中：约6μM至约300μM、或1μM至约50μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM。
41.如段落39所述的方法，其中将所述锌和所述ALDC酶以组合物进行添加，其中锌以约1mM至约5mM的浓度存在于所述组合物中。如段落39所述的方法，其中将所述锌和所述ALDC酶以组合物进行添加，其中锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。一种用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括在所述啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产过程中向用于所述啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加包含ALDC酶和锌的组合物，其中(i)锌以约1μM至约200mM，优选地约1mM至约5mM的浓度存在于所述组合物中；或者(ii)锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
42.如段落39-41中任一项所述的方法，其中在发酵过程或成熟过程中添加所述ALDC酶和所述锌。
43.如段落39-42中任一项所述的方法，其中以约0.5g至约10g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加所述ALDC酶。
44.如段落39-43中任一项所述的方法，其中以约1g至约5g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加所述ALDC酶。
45.如段落39-44中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。
46.如段落39-45中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。
47.如段落39-45中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
48.如段落39-45中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
49.一种用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法，所述方法包括以约1μM至约200mM，优选地约100μM至约200mM的浓度添加金属离子。如段落49所述的用于增加ALDC酶在包含ALDC的组合物中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括以约1μM至约200mM，优选地约100μM至约200mM的浓度向所述组合物中添加金属离子的步骤。
50.如段落49所述的方法，其中所述金属离子的原子半径为约140pm至约165pm。
51.如段落50所述的方法，其中所述金属离子的原子半径为约140pm至约150pm。
52.如段落51所述的方法，其中所述金属离子的原子半径为约142pm至约146pm。
53.如段落49所述的方法，其中所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2 +、Co2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+和Fe2+，及其组合。
54.如段落53所述的方法，其中所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。
55.如段落54所述的方法，其中所述金属离子是Zn2+。
56.如段落49-55中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。
57.如段落49-55中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
58.如段落49-55中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
59.一种组合物，其包含乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)和金属离子，其中所述金属离子以约1μM至约200mM，优选地约100μM至约200mM的浓度存在。
60.如段落59所述的组合物，其中所述金属离子的原子半径为约140pm至约165pm。
61.如段落59所述的组合物，其中所述金属离子的原子半径为约140pm至约150pm。
62.如段落61所述的组合物，其中所述金属离子的原子半径为约142pm至约146pm。
63.如段落59所述的组合物，其中所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+和Fe2+，及其组合。
64.如段落63所述的组合物，其中所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。
65.如段落64所述的组合物，其中所述金属离子是Zn2+。
66.一种用于分解乙酰乳酸的方法，所述方法包括用ALDC酶和金属离子处理底物的步骤，其中所述金属离子以约1μM至约200mM的浓度存在。如段落66所述的用于分解乙酰乳酸的方法，所述方法包括用包含ALDC酶和金属离子的组合物处理底物的步骤，使得所述金属离子以约1μM至约200mM的浓度存在于所述组合物中。优选地，所述底物是含有碳水化合物的底物，如麦芽汁或果汁。优选地，所述底物是发酵和/或成熟介质。
67.如段落66所述的方法，其中所述金属离子以如下浓度存在于所述组合物中：约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约5mM。
68.如段落66所述的方法，其中所述金属离子以如下浓度存在于所述底物(例如发酵和/或成熟介质)中：约1μM至约500μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或约1μM至约25μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM、或约25μM至约50μM。
69.如段落66所述的方法，其中将所述金属离子和所述ALDC以组合物进行添加，其中所述金属离子以约1mM至约5mM的浓度存在于所述组合物中。如段落66所述的方法，其中将所述金属离子和所述ALDC以组合物进行添加，其中所述金属离子与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
70.如段落66-69中任一项所述的方法，其中所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+和Fe2+，及其组合。
71.如段落66-70中任一项所述的方法，其中所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。
72.如段落66-71中任一项所述的方法，其中所述金属离子是Zn2+。
73.如段落66-72中任一项所述的方法，其中在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或者成熟过程中处理所述底物。
74.如段落66-72中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。
75.如段落66-72中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
76.如段落66-72中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
附图简要说明
通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1显示了用于表达乙酰乳酸脱羧酶，aldB的alrA(CB)RIHI-aldB的质粒图谱。
图2显示了描绘ALDC相对于0mM锌的活性与以mM计的锌的浓度的图。
图3显示了具有含不同浓度ZnSO4的aldB样品的SDS-PAGE。凝胶A-泳道1)分子量标记；泳道2-7)BSA标准品；泳道8-9)具有0mM ZnSO4的AldB；泳道10-11)具有0.25mM ZnSO4的AldB；泳道12-13)具有0.5mM ZnSO4的AldB；泳道14-15)具有1.0mM ZnSO4的AldB；泳道16-17)具有2mM ZnSO4的AldB；泳道18-19)具有5mM ZnSO4的AldB；泳道20-21)具有7.5mM ZnSO4的AldB；泳道22-23)具有10mM ZnSO4的AldB以及泳道24-25)具有20mM ZnSO4的AldB。凝胶B-泳道1)分子量标记；泳道2-7)BSA标准品；泳道8-11)具有0mM ZnSO4的AldB；泳道12-15)具有20mM ZnSO4的AldB；泳道16-17)具有40mM ZnSO4的AldB；泳道18-19)具有60mM ZnSO4的AldB；泳道20-21)具有80mM ZnSO4的AldB；泳道22-23)具有100mM ZnSO4的AldB以及泳道24-25)具有120mM ZnSO4的AldB。
图4显示了具有产生于枯草芽孢杆菌的纯化的aldB的SDS-PAGE。泳道1)粗制aldB发酵物；2-3)从Source15Q纯化的aldB。分子量标记显示在泳道1和2之间的左侧和中间。
图5显示了在存在或不存在具有不同比活性(A)919U/mg，B)1103U/mg和C)1552U/mg aldB)的0.03U/mL麦芽汁aldB酶变体下，在基于麦芽的发酵过程中邻位二酮(VDK)的发展。在14℃下发酵7天的过程中，跟踪VDK的发展(二乙酰和2,3-戊二酮的总和)。由重复样品计算平均VDK值，并且标签作为插入物示于图中。
图6显示了在麦芽汁中具有不同水平的Zn2+的基于麦芽的发酵过程中，在存在aldB酶(0.04U/mL麦芽汁)下VDK的发展(参见标签)。在14℃下发酵7天的过程中，跟踪VDK的发展(二乙酰和2,3-戊二酮的总和)。由重复样品计算平均VDK值，并且标签作为插入物示于图中。
具体实施方式
本披露提供了包含具有更好的稳定性和/或活性的ALDC酶的方法、组合物、装置和试剂盒，并且任选地，从微生物中可以回收的ALDC酶的产率得以改善。在一些实施例中，本披露提供了使用金属离子以增加稳定性和/或活性的方法、装置、组合物和试剂盒，并且任选地，所述方法、装置、组合物和试剂盒还可以用于以更高的产率从微生物中回收酶(例如ALDC酶)。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第20版，John Wiley and Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本披露中所使用的许多术语的通用词典。
本披露并不受本文披露的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本披露的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指明，否则分别地，任何核酸序列都从左向右以5'到3'方向书写；氨基酸序列都从左向右以氨基到羧基方向书写。
本文提供的标题并不是对本披露的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此，把说明书作为一个整体参考时，以下立即定义的术语得以更全面地定义。
必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如在此和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。因此，例如提及“蛋白酶”包括多个这样的酶，并且提及“饲料”包括提及一种或多种饲料以及本领域技术人员已知的其等效物，等等。
本文讨论的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的披露内容而提供。本文中的内容都不应理解为承认此类出版物构成所附权利要求书中的现有技术。
本文中所引用的所有专利和公开物均通过引用并入。
ALDC
在一些方面，本发明提供了具有更好的稳定性和/或活性的ALDC酶，并且任选地，从微生物中可以回收的ALDC酶的产率得以改善。本文所用的术语“更好的稳定性”和“增加的稳定性”是指，当存在金属离子(例如Zn2+)时，当与不存在所述金属离子情况下的ALDC酶活性相比，其ALDC活性维持较长时间的ALDC酶。本文所用的术语“更好的活性”和“增加的活性”是指，当存在金属离子(例如Zn2+)时，当与不存在所述金属离子情况下的ALDC酶活性相比，具有增加的ALDC活性的ALDC酶。关于ALDC酶的产量的术语“得以改善”是指，与当宿主微生物中不存在金属离子时产生的ALDC活性相比，当宿主微生物中存在金属离子(例如Zn2+)时产生的ALDC活性的增加。不希望受理论束缚，可以在培养过程(例如ALDC生产)中和/或之后添加金属离子(例如Zn2+)，以增加ALDC酶的稳定性和/或活性和/或产量。术语“宿主细胞”、“宿主微生物”、“菌株”和“微生物”在本文中可以互换使用。
乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)是属于羧基裂解酶家族的酶，这种酶负责切割碳-碳键。乙酰乳酸脱羧酶催化2-乙酰乳酸酯(也称为2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯)转化为2-乙偶姻的并释放CO2。术语“ALDC”和“ALDC酶”在本文中可以互换使用。
乙酰乳酸脱羧酶催化归属于EC 4.l.l.5(乙酰乳酸脱羧酶活性)和基因本体(GO)术语ID为GO：0047605的酶促反应。GO术语ID规定，任何特征为具有该相关GO术语的蛋白质编码具有催化性乙酰乳酸脱羧酶活性的酶。
编码乙酰乳酸脱羧酶的各种乙酰乳酸脱羧酶基因(如alsD或aldB)是本领域已知的。编码ALDC酶的alsD基因可以衍生自枯草芽孢杆菌或可从其衍生得到。编码ALDC酶的aldB基因可以衍生自短芽孢杆菌或可从其衍生得到。编码ALDC酶的alsD基因可以衍生自地衣芽孢杆菌或可从其衍生得到。UNIPROT登录号Q65E52.1是ALDC酶的实例。UNIPROT登录号Q65E52.1是衍生自地衣芽孢杆菌或可从其衍生得到的ALDC酶的实例。乙酰乳酸脱羧酶基因的实例包括但不限于gi|375143627|ref|YP_005006068.1|乙酰乳酸脱羧酶[Niastellakoreensis OR20-10]；gi|361057673|gb|AEV96664.1|乙酰乳酸脱羧酶[Niastellakoreensis OR20-10]；gi|218763415|gb|ACL05881.1|乙酰乳酸脱羧酶[Desulfatibacillum alkenivorans AK-01]；gi|220909520|ref|YP_002484831.1|乙酰乳酸脱羧酶[蓝丝菌属PCC 7425]；gi|218782031|ref|YP_002433349.1|乙酰乳酸脱羧酶[Desulfatibacillum alkenivorans AK-01]；gi|213693090|ref|YP_002323676.1|乙酰乳酸脱羧酶[长双歧杆菌亚种婴儿双歧杆菌ATCC 15697＝JCM 1222]；gi|189500297|ref|YP_001959767.1|乙酰乳酸脱羧酶[Desulfatibacillum alkenivorans BS1]；gi|189423787|ref|YP_001950964.1|乙酰乳酸脱羧酶[Desulfatibacillum alkenivorans SZ]；gi|172058271|ref|YP_00181473l.1|乙酰乳酸脱羧酶[Exiguobacterium sibiricum 255-15]；gi|163938775|ref|YP_001643659.1|乙酰乳酸脱羧酶[韦氏芽孢杆菌KBAB4]；gi|158522304|ref|YP_001530174.1|乙酰乳酸脱羧酶[Desulfococcus oleovorans Hxd3]；gi|57371670|ref|YP_001479659.1|乙酰乳酸脱羧酶[变形斑沙雷菌568]；gi|150395111|ref|YP_001317786.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌亚种aureus JHl]；gi|150394715|ref|YP_001317390.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌亚种aureus JHl]；gi|146311679|ref|YP_001176753.1|乙酰乳酸脱羧酶[肠杆菌属638]；gi|109900061|ref|YP_663316.1|乙酰乳酸脱羧酶[假别单胞菌T6c]；gi|219866131|gb|ACL46470.1|乙酰乳酸脱羧酶[蓝丝菌属PCC 7425]；gi|213524551|gb|ACJ53298.1|乙酰乳酸脱羧酶[长双歧杆菌亚种婴儿双歧杆菌ATCC 15697＝JCM 1222]；gi|189420046|gb|ACD94444.1|乙酰乳酸脱羧酶[Desulfatibacillum alkenivorans SZ]；gi|158511130|gb|ABW68097.1|乙酰乳酸脱羧酶[Desulfococcus oleovorans Hxd3]；gi|157323434|gb|ABV42531.1|乙酰乳酸脱羧酶[变形斑沙雷菌568]；gi|145318555|gb|ABP60702.1|乙酰乳酸脱羧酶[肠杆菌属638]；gi|1499475631gb|ABR53499.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌亚种aureus JHl]；gi|149947167|gb|ABR53103.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌亚种aureus JHl]；gi|163860972|gb|ABY42031.1|乙酰乳酸脱羧酶[韦氏芽孢杆菌KBAB4]；gi|109702342|gb|ABG42262.1|乙酰乳酸脱羧酶[假别单胞菌T6c]；gi|189495738|gb|ACE04286.1|乙酰乳酸脱羧酶[Desulfatibacillum alkenivorans BS1]；gi|171990792|gb|ACB61714.1|乙酰乳酸脱羧酶[Exiguobacterium sibiricum 255-15]；gi|223932563|ref|ZP_03624564.1|乙酰乳酸脱羧酶[猪链球菌89/1591]；gi|194467531|ref|ZP_03073518.1|乙酰乳酸脱羧酶[罗伊氏乳杆菌100-23]；gi|223898834|gb|EEF65194.1|乙酰乳酸脱羧酶[猪链球菌89/1591]；gi|194454567|gb|EDX43464.1|乙酰乳酸脱羧酶[罗伊氏乳杆菌100-23]；gi|384267135|ref|YP_005422842.1|乙酰乳酸脱羧酶[解淀粉芽孢杆菌亚种plantarum YAUB9601-Y2]；gi|375364037|ref|YP_005132076.1|乙酰乳酸脱羧酶[解淀粉芽孢杆菌亚种plantarum CAU B946]；gi|34079323|ref|YP_004758694.1|乙酰乳酸脱羧酶[变异棒杆菌DSM 44702]；gi|336325119|ref|YP_004605085.1|乙酰乳酸脱羧酶[Corynebacteriumresistens DSM 45100]；gi|148269032|ref|YP_001247975.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌亚种aureus JH9]；gi|148268650|ref|YP_001247593.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌亚种aureus JH9]；gi|1485433721|ref|YP_001270742.1|乙酰乳酸脱羧酶[罗伊氏乳杆菌DSM 20016]；gi|380500488|emb|CCG51526.1|乙酰乳酸脱羧酶[解淀粉芽孢杆菌亚种plantarum YAU B9601-Y2]；gi|371570031|emb|CCF06881.1|乙酰乳酸脱羧酶[解淀粉芽孢杆菌亚种plantarum CAU B946]；gi|340533141|gb|AEK35621.1|乙酰乳酸脱羧酶[变异棒杆菌DSM 44702]；gi|336101101|gb|AE108921.1|乙酰乳酸脱羧酶[Corynebacteriumresistens DSM 45100]；gi|148530406|gb|ABQ82405.1|乙酰乳酸脱羧酶[罗伊氏乳杆菌DSM 20016]；gi|147742101|gb|ABQ50399.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌亚种aureusJH9]；gi|147741719|gb|ABQ50017.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌亚种aureus JH9]；gi|392529510|ref|ZP_10276647.1|乙酰乳酸脱羧酶[Carnobacterium maltaromaticumATCC 35586]；gi|366054074|ref|ZP_09451796.1|乙酰乳酸脱羧酶[Lactobacillussuebicus KCTC 3549]；gi|339624147|ref|ZP_08659936.1|乙酰乳酸脱羧酶[Fructobacillus jructosus KCTC 3544]；以及gi|336393727|ref|ZP_08575126.1|乙酰乳酸脱羧酶[棒状乳杆菌亚种torquens KCTC 3535]。UNIPROT登录号P23616.1(Diderichsen等人，J Bacteriol.[细菌学杂志](1990)172(8):4315)是ALDC酶的实例。UNIPROT登录号P23616.1是衍生自短芽孢杆菌或可从其衍生得到的ALDC酶的实例。将与前述登录号相关联的每个序列通过引用并入本文。
在一些实施例中，本发明涉及ALDC酶，其来自干酪乳杆菌(Godtfredsen，1984)、乙酰短杆菌(Oshiro，1989)、乳酸乳球菌(Vincent Phalip，1994)、乳明串珠菌(O sulivan，2001)、产气肠杆菌(Blomquist，1993)、枯草芽孢杆菌(Renna，1993)、短芽孢杆菌(Svendsen，1989)和乳酸乳球菌DX(Yuxing，2014)。在一些实施例中，所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。如本文所用，术语“ALDC酶来自”是指ALDC酶衍生自或可衍生自。
应当理解，根据本发明，可以使用任何合适的ALDC酶，即由活性依赖于金属离子的任何微生物产生的ALDC。在一些实施例中，本文所述的方法和组合物中所使用的ALDC是来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的ALDC。
根据本发明所述的酶组合物的ALDC活性通过如本文所述的ALDC测定或本领域已知的任何合适的测定来测量。通常，标准测定在pH 6.0下进行，并且对于另外的特征和规格的酶测定法可以在不同pH值和温度下进行。
将一个单位的ALDC活性定义为在测定条件(例如，pH 6.0(或按照说明)和30℃)下产生1μmol乙偶姻/分钟的酶的量。
在一些实施例中，所述ALDC是ALDC衍生物。在一些实施例中，所述ALDC衍生物的特征在于，用或已用戊二醛处理水性介质中的ALDC。在一些实施例中，以对应于0.1g至5g戊二醛/g纯ALDC蛋白质、优选地对应于0.25g至2g戊二醛/g纯ALDC蛋白质的浓度，用或已用戊二醛处理所述ALDC。
在一些实施例中，ALDC酶包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。本发明的一方面涉及展示ALDC活性的酶，该酶包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。在一些实施例中，ALDC酶由与SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段编码。
在一些实施例中，该酶具有在5℃-80℃范围内的最适温度，例如在5℃-40℃或15℃-80℃的范围内、例如在20℃-80℃的范围内，例如在5℃-15℃、10℃-40℃、10℃-50℃、15℃-20℃、45℃-65℃、50℃-65℃、55℃-65℃或60℃-80℃的范围内。在一些实施例中，该酶的最适温度为约60℃。
在一些实施例中，该酶的氨基酸总数小于350、例如小于340、例如小于330、例如小于320、例如小于310、例如小于300个氨基酸，例如在200至350个氨基酸的范围内，例如在220至345个氨基酸的范围内。
在一些实施例中，该酶的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8中的任一个氨基酸序列或其任何功能片段相比具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。
在一些实施例中，该酶的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8中的任一个氨基酸序列或其任何功能片段相比具有最多一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。
在一些实施例中，该酶包含通过SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8中任一个所鉴定的氨基酸序列或其任何功能片段。
在一些实施例中，根据本发明所述的组合物、介质和方法包含任何一种或多种另外的酶。在一些实施例中，所述一种或多种另外的酶选自由以下各项组成的列表：乙酰乳酸还原异构酶、乙酰乳酸异构酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、内切葡聚糖酶和相关β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶、木聚糖酶辅助酶(例如，阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)和蛋白酶。
在一些实施例中，根据本发明所述的组合物、介质和方法包含展现ALDC活性的酶，其中所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，根据本发明所述的组合物、介质和方法包含展现ALDC活性的酶，其中所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，根据本发明所述的组合物、介质和方法包含展现ALDC活性的酶，其中所述ALDC酶的活性在1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，展示ALDC活性的酶是包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段的酶。在一些实施例中，展示ALDC活性的酶由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段编码。
金属离子
一方面，本发明提供了包含具有更好的稳定性和/或活性的ALDC酶的方法和组合物。在另一方面，本发明提供了包含ALDC酶的方法和组合物，所述ALDC酶可以以更高的产率从微生物中回收。
令人意外的是，本发明的诸位发明人已经发现，用一定浓度的某些金属离子处理ALDC组合物提供了具有更好的稳定性和/或活性的ALDC酶，并且任选地，从微生物中可以回收的ALDC酶的产率得以改善。
在一些实施例中，所述金属离子的原子半径为约140pm至约255pm。在一些实施例中，所述金属离子的原子半径为约140pm至约165pm。在一些实施例中，所述金属离子的原子半径为约140pm至约150pm。在一些实施例中，所述金属离子的原子半径为约142pm至约146pm。
在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。本文所用的术语“锌”可以与术语“Zn2+”互换。本文所用的术语“金属”可以与术语“金属离子”互换。本文所用的术语“金属”可以指包含选自由以下各项组成的组中的金属的化合物：锌、镁、锰、钴、铜、钡、钙和铁；包含这些金属的化合物是各自离子的来源。本文所用的术语“锌”是指包含锌的化合物，这种化合物是Zn2+离子源。硫酸锌(ZnSO4)是如本文所提及的锌的实例，并且是Zn2+离子源的实例。硫酸镁(MgSO4)是如本文所提及的镁的实例，并且是Mg2+离子源的实例。硫酸锰(II)(MnSO4)是如本文所提及的锰的实例，并且是Mn2+离子源的实例。氯化钴(II)(CoCl2)是如本文所提及的钴的实例，并且是Co2+离子源的实例。硫酸铜(II)(CuSO4)是如本文所提及的铜的实例，并且是Cu2+离子源的实例。硫酸钡(BaSO4)是如本文所提及的钡的实例，并且是Ba2+离子源的实例。硫酸钙(CaSO4)是如本文所提及的钙的实例，并且是Ca2+离子源的实例。硫酸铁(II)(FeSO4)是如本文所提及的铁的实例，并且是Fe2+离子源的实例。
本发明的诸位发明人已经发现，金属离子，例如Zn2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、和Fe2+提高了不同配制品中ALDC酶的稳定性(参见实例)，并且当在所述培养介质中生产所述酶期间使用所述金属离子时，还可以提高回收自微生物的产率。因此，在一些实施例中，本发明提供了增加ALDC酶的回收率、稳定性和/或活性的方法和组合物，所述ALDC酶然后可以用于，例如生产发酵产物(如在酿造中)。
一方面，本披露提供了包含具有增加的稳定性和/或活性的ALDC酶的组合物。
在一些实施例中，所述ALDC酶具有如通过本文所述的测定或本领域已知的任何合适的测定所测量的至少约900单位/mg蛋白质(U/mg)、至少约1000U/mg、至少约1500U/mg、至少约2000U/mg、至少约3000U/mg、至少约5000U/mg、至少约6000U/mg、至少约7000U/mg、至少约8000U/mg、至少约8500U/mg、至少约9000U/mg、至少约9500U/mg或至少约10000U/mg的比活性。在一些实施例中，所述ALDC酶具有如通过本文所述的测定或本领域已知的任何合适的测定所测量的在约950至2500单位/mg蛋白质(U/mg)、约1000至2500U/mg、或约1500至2500U/mg的范围内的ALDC活性。在一些实施例中，根据本发明所述的ALDC组合物包含具有如通过本文所述的测定或本领域已知的任何合适的测定所测量的ALDC活性的ALDC酶，所述ALDC活性为至少约900单位/mg产品、至少约1000U/g、至少约1500U/g、至少约2000U/g、至少约3000U/g、至少约5000U/g、例如至少约6000U/g、例如至少约7000U/g、例如至少约8000U/g、例如至少约8500U/g、例如至少约9000U/g、例如至少约9500U/g、例如至少约10000U/g。在一些实施例中，使用不同的ALDC活性，例如取决于乙酰乳酸含量和例如针对酿造的条件要求。在一些实施例中，根据本发明所述的ALDC组合物包含具有至少约8000U/g的ALDC活性的ALDC酶。
在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和金属离子，其中所述金属离子以如下浓度存在：约0.1μM至约200mM，例如约1μM至约200mM、或约1μM至约500μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约10μM至约100μM、或约15μM至约50μM、或约1μM至约150mM、或约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约25μM至约50μM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约5mM。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和金属离子，其中所述锌以如下浓度存在：约1μM至约300μM，例如约6μM至约300μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和金属离子，其中所述金属离子以约60μM至约150μM、或约25μM至约150μM的浓度存在。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和金属离子，其中所述金属离子以约100μM至约200mM的浓度存在。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和金属离子，其中所述金属离子以约100μM至约20mM的浓度存在。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和金属离子，其中所述金属离子以约1mM至约5mM的浓度存在。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2 +，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。
在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中所述锌以如下浓度存在：约1μM至约200mM，例如约1μM至约500μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约10μM至约100μM、或约15μM至约50μM、或约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约25μM至约50μM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约500μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约10mM、或约1mM至约5mM、或约5mM至约20mM、或约5mM至约10mM。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中所述锌以约1μM至约300μM，例如约6μM至约300μM、或约6μM至约25μM的浓度存在。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中所述锌以约25μM至约150μM、或约60μM至约150μM的浓度存在。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中所述锌以约100μM至约20mM的浓度存在。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中所述锌以约100μM至约10mM的浓度存在。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中所述锌以约1mM至约5mM的浓度存在。
在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中所述锌以如下浓度存在：约1mM至约3mM、或约0.75mM至约4mM、或约0.5mM至约5mM、或约0.25mM至约7.5mM、或约0.1mM至约10mM。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质、或1000至2500单位/mg蛋白质、或1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。
在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中锌与酶的摩尔比高于1，例如是2:1、或3:1、或5:1、或10:1、或20:1、或30:1、或50:1、或60:1、或100:1、或150:1、或200:1、或250:1、或500:1。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中锌与酶的摩尔比是2:1或更高。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中锌与酶的摩尔比是5:1或更高。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中锌与酶的摩尔比是10:1或更高。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中锌与酶的摩尔比是20:1或更高。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中锌与酶的摩尔比是30:1或更高。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中锌与酶的摩尔比是60:1或更高。例如Zn2+、Mn2+、Co2+或其他金属离子在溶液中的摩尔浓度可以通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)或类似技术来确定。可以使用标准SDS-PAGE系统(如实例中所述)和氨基酸序列来确定ALDC酶的摩尔浓度。
在一些实施例中，所述ALDC酶是ALDC衍生物。在一些实施例中，所述ALDC衍生物是用戊二醛处理过的ALDC酶。在一些实施例中，以对应于约0.1至约5g戊二醛/g纯ALDC酶的浓度用戊二醛处理所述ALDC酶。
在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。因此，在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶，其中所述ALDC酶在950至2500单位/mg蛋白质、或1000至2500单位/mg蛋白质、或1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。
在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶和锌，其中所述锌以约100μM至约20mM的浓度存在，并且所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，这些组合物包含ALDC酶或ALDC衍生物和锌，其中所述锌以约250μM至约20mM的浓度存在，并且所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。
在一些实施例中，所述ALDC酶组合物进一步包含选自由以下各项组成的组中的至少一种另外的酶或酶衍生物：乙酰乳酸还原异构酶、乙酰乳酸异构酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、内切葡聚糖酶和相关β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶、木聚糖酶辅助酶(例如，阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和木聚糖乙酰酯酶)和蛋白酶。
在一些实施例中，在饮料制备工艺(例如啤酒和葡萄酒)的发酵和/或成熟期间使用本文所述的ALDC酶组合物来降低二乙酰水平。术语“ALDC酶组合物”、“包含ALDC酶的组合物”和“包含ALDC的组合物”在本文中是指包含ALDC酶的组合物。所述组合物可以是溶液的形式。如本文所用，术语“ALDC酶组合物”和“包含ALDC的组合物”与包含表达ALDC和/或在允许表达所述酶的条件下培养时能够表达ALDC的微生物的介质(例如培养介质、发酵介质或成熟介质)相排斥。ALDC酶组合物和包含ALDC的组合物的实例包括包含纯化形式的ALDC的组合物。可以从包含能够表达ALDC的微生物的介质中纯化ALDC，其中所述介质已经在允许ALDC表达的条件下进行培养。术语“纯化的”意指ALDC以高水平存在。优选地，ALDC是所述组合物中存在的主要组分。优选地，ALDC以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。在一些实施例中，ALDC酶组合物还包含金属离子(如锌)。
如本文所使用的，术语“饮料”和“饮料产品”包括诸如以下的形成泡沫的发酵饮料：用100％麦芽酿造的啤酒、在不同类型的条规下酿造的啤酒、浓啤酒、干啤酒、薄啤酒、低度啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性黑啤酒、麦芽酒、无醇啤酒、无醇麦芽酒等。术语“饮料”或“饮料产品”还包括不起泡啤酒和替代性的麦芽饮料，例如水果风味的麦芽饮料，例如柑橘风味的(例如柠檬风味的、橙子风味的、酸橙风味的或浆果风味的)麦芽饮料，酒风味的麦芽饮料(例如伏特加酒风味的、朗姆酒风味的或龙舌兰酒风味的麦芽酒)，或咖啡风味的麦芽饮料(例如咖啡因风味的麦芽酒)等等。术语“饮料”或“饮料产品”还包括用除大麦麦芽以外的替代材料制成的啤酒，例如黑麦、玉米、燕麦、稻、粟、黑小麦、木薯、高粱、大麦、小麦及其组合。术语“饮料”或“饮料产品”还包括其他发酵产品，如葡萄酒或苹果酒或梨酒或清酒。
啤酒传统上被称为来源于麦芽(例如来源于大麦谷粒的麦芽)和任选地辅料(例如含淀粉的植物材料(例如谷物颗粒))和任选地调味的(例如用啤酒花调味的)的酒精饮料。在本发明的上下文中，术语“啤酒”包括通过发酵/酿造含淀粉的植物材料生产的任何发酵麦芽汁，因此，特别是仅由辅料、或麦芽和辅料的任何组合生产的啤酒。可以通过基本上相同的方法从各种含淀粉的植物材料制成啤酒，其中淀粉主要由葡萄糖均聚物组成，其中葡萄糖残基通过α-1,4-键或α-1,6-键连接，前者占主导地位。啤酒可以由替代性材料，例如黑麦、玉米、燕麦、大米、粟、黑小麦、木薯、高粱、小麦、大麦、或其组合制成。
在一些实施例中本发明提供了包含ALDC酶和具有如下浓度的金属离子的发酵介质(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质)：约0.1μM至约200mM、或约1μM至约200mM，例如约1μM至约500μM、或约0.1μM至约300μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM。在一些实施例中本发明提供了包含ALDC酶和具有如下浓度的金属离子的发酵介质(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质)：约0.1μM至约100mM，例如约0.1μM至约10μM、或1μM至约100mM、或1μM至约10μM、或6μM至约10μM、或约10μM至约200μM、或约50μM至约1mM、或约100μM至约10mM、或约100μM至约50mM、或约100μM至约100mM、或约100μM至约200mM、或约250μM至约120mM、或约500μM至约100mM、或约1mM至约50mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约5mM。在一些实施例中本发明提供了包含ALDC酶和具有如下浓度的金属离子的发酵介质(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质)：约0.1μM至约200mM、或约1μM至约200mM，例如约1μM至约500μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM。在一些实施例中本发明提供了包含ALDC酶和具有如下浓度的金属离子的发酵介质(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质)：约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质、或1000至2500单位/mg蛋白质、或1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，所述发酵介质(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质)进一步包含选自由以下各项组成的组中的至少一种另外的酶或酶衍生物：乙酰乳酸还原异构酶、乙酰乳酸异构酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、内切葡聚糖酶和相关β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶、木聚糖酶辅助酶(例如，阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和木聚糖乙酰酯酶)和蛋白酶。
在一些实施例中，本发明提供了包含ALDC酶和具有如下浓度的金属离子的成熟介质(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质)：约0.1μM至约200mM、或1μM至约200mM，例如约1μM至约500μM、或约0.1μM至约300μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM。在一些实施例中，本发明提供了包含ALDC酶和具有如下浓度的金属离子的成熟介质(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质)：约0.1μM至约100mM、或1μM至约100μM，例如约0.1μM至约10μM、或1μM至约10μM、或6μM至约10μM、或约10μM至约200μM、或约50μM至约1mM、或约100μM至约10mM、或约100μM至约50mM、或约100μM至约100mM、或约100μM至约200mM、或约250μM至约120mM、或约500μM至约100mM、或约1mM至约50mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约5mM。在一些实施例中，本发明提供了包含ALDC酶和具有如下浓度的金属离子的成熟介质(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质)：约1μM至约500μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM。在一些实施例中，本发明提供了包含ALDC酶和具有如下浓度的金属离子的成熟介质(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质)：约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2 +、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质、或1000至2500单位/mg蛋白质、或1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，所述成熟介质(例如，啤酒和/或葡萄酒成熟介质)进一步包含选自由以下各项组成的组中的至少一种另外的酶或酶衍生物：乙酰乳酸还原异构酶、乙酰乳酸异构酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、内切葡聚糖酶和相关β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶、木聚糖酶辅助酶(例如，阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和木聚糖乙酰酯酶)和蛋白酶。
在一些实施例中，在ALDC生产期间和/或之后，将金属离子，例如Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合物添加到培养和/或发酵介质中以增加从微生物的回收率。
本文所用的术语“培养介质”是指支持微生物，诸如产ALDC的宿主细胞的生长的介质。培养介质的实例包括：基于MOP缓冲液的介质，例如以尿素为主要氮源并且以马尔特灵(maltrin)为主要碳源；和TSB肉汤。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约1μM至约1mM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约25μM至约150μM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约25μM至约50μM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约30μM至约40μM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约40μM至约150μM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约60μM至约150μM的金属离子。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质、或1000至2500单位/mg蛋白质、或1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。
可以将材料添加到含酶的组合物中以改善所述组合物的性质。这些添加剂的非限制性实例包括：盐(例如碱金属盐、碱土金属盐、另外的氯化物盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐，其中示例性的抗衡离子是钙、钾和钠)；无机矿物或粘土(例如沸石、高岭土、膨润土、滑石和/或硅酸盐)；碳水化合物(例如蔗糖和/或淀粉)；着色颜料(例如二氧化钛)；杀生物剂(例如，)；分散剂；消泡剂；还原剂；酸剂；碱剂；酶稳定剂(例如多元醇如甘油、丙二醇、山梨糖醇、无机盐、糖、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，及其组合)；酶抑制剂；防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸酯、山梨酸酯或其他食品认可的防腐剂)；及其组合。可用于所述组合物、或其制剂的赋形剂包括麦芽糖、麦芽糖浆、蔗糖、葡萄糖(包括葡萄糖浆或干葡萄糖浆)、预煮的淀粉、糊化淀粉、L-乳酸、抗坏血酸棕榈酸酯、生育酚、卵磷脂、柠檬酸、柠檬酸盐、磷酸、磷酸盐、藻酸钠、角叉菜胶、刺槐豆胶、瓜尔胶、黄原胶、果胶、羧甲基纤维素钠、甘油单酯和甘油二酯、甘油二酯和甘油二酯的柠檬酸酯、蔗糖酯、二氧化碳、氩气、氦气、氮气、一氧化二氮、氧气、氢气和辛基琥珀酸淀粉钠。
方法
在一些方面，本发明提供了改善ALDC酶的稳定性和/或活性的方法。在某些方面，本发明提供了改善从微生物中回收ALDC的方法。
在一些实施例中，本发明提供了用于增加ALDC酶在包含ALDC的组合物中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括将金属离子添加到所述组合物中的步骤，以使所述金属离子以如下浓度存在于所述组合物中：约1μM至约200mM，例如约1μM至约500μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约25μM至约50μM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约500μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约10mM、或约1mM至约5mM、或约5mM至约20mM、或约5mM至约10mM。在一些实施例中，本发明提供了增加ALDC酶在包含产ALDC的宿主细胞的培养介质中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括向所述介质中添加金属离子的步骤。使得所述金属离子以如下浓度存在于所述介质中：约1μM至约1mM，例如约1μM至约300μM、约6μM至约300μM、约25μM至约150μM、或约60μM至约150μM。在一些实施例中，本发明提供了增加ALDC酶在包含ALDC酶的发酵和/或成熟介质中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括向所述介质中添加金属离子的步骤。使得所述金属离子以如下浓度存在于所述介质中：约1μM至约300μM，例如约6μM至约300μM、约1μM至约100μM、约1μM至约50μM、约1μM至约25μM、或约6μM至约25μM。在一些实施例中，本发明提供了用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法，其包括向介质中添加浓度为约25μM至约150μM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法，其包括添加浓度为约100μM至约20mM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法，其包括添加浓度为约1mM至约5mM的金属离子。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。
在一些实施例中，本发明提供了用于增加ALDC酶在包含ALDC的组合物中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括将锌添加到所述组合物中的步骤，以使所述锌以如下浓度存在于所述组合物中：约1μM至约200mM，例如约1μM至约500μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约25μM至约50μM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约500μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约10mM、或约1mM至约5mM、或约5mM至约20mM、或约5mM至约10mM。在一些实施例中，本发明提供了用于增加ALDC酶在包含产ALDC的宿主细胞的培养介质中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括添加具有如下浓度的锌的步骤：约1μM至约1mM，例如约1μM至约300μM、约6μM至约300μM、约25μM至约150μM、或约60μM至约150μM。在一些实施例中，本发明提供了增加ALDC酶在包含ALDC酶的发酵和/或成熟介质中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括向所述介质中添加锌的步骤。使得所述锌以如下浓度存在于所述介质中：约1μM至约300μM，例如约6μM至约300μM、约1μM至约100μM、约1μM至约50μM、约1μM至约25μM、或约6μM至约25μM。在一些实施例中，用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法包括向介质中添加锌，使得锌在所述介质中的浓度为约25μM至约150μM。在一些实施例中，用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法包括添加浓度为约100μM至约20mM的锌。在一些实施例中，用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法包括添加浓度为约1mM至约5mM的锌。在一些实施例中，用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法包括添加锌，其中在所述组合物中锌与ALDC酶的摩尔比高于1，例如是2:1、或3:1、或5:1、或10:1、或20:1、或30:1、或50:1、或60:1、或100:1、或150:1、或200:1、或250:1。在一些实施例中，用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法包括添加锌，其中在所述组合物中锌与ALDC酶的摩尔比是5:1或更高。在一些实施例中，用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法包括添加锌，其中在所述组合物中锌与ALDC酶的摩尔比是10:1或更高。在一些实施例中，用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法包括添加锌，其中在所述组合物中锌与ALDC酶的摩尔比是20:1或更高。在一些实施例中，用于增加ALDC酶的活性和/或稳定性的方法包括添加锌，其中在所述组合物中锌与ALDC酶的摩尔比是30:1或更高。
在一些实施例中，在由产ALDC的宿主细胞产生所述ALDC酶期间，将所述金属离子(例如作为补充剂)添加到培养介质中。在一些实施例中，以如下浓度添加所述金属离子：约0.1μM至约1mM，例如约25μM至约150μM、或约40μM至约150μM、或约60μM至约150μM、或约25μM至约50μM、或30μM至约40μM。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2 +、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。因此，在一些实施例中，在由产ALDC的宿主细胞生产所述ALDC酶期间，以如下浓度向培养介质中添加锌(例如作为补充剂)：1μM至约1mM，例如25μM至约150μM、或约40μM至约150μM、或60μM至约150μM。
在一些实施例中，所述宿主细胞是芽胞杆菌属宿主细胞。在一些实施例中，芽胞杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，在生产发酵饮料期间将所述金属离子添加到发酵介质中。在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵期间将所述金属离子添加到发酵介质中。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2 +、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。因此，在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵期间将锌添加到发酵介质中。在一些实施例中，以如下浓度添加锌：约1μM至约1mM，例如约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或25μM至约50μM、或30μM至约40μM、或1μM至约50μM、或6μM至约50μM、或1μM至约25μM、或6μM至约25μM。在一些实施例中，将锌和ALDC酶以组合物进行添加，其中锌以如下浓度存在于所述组合物中：0.1μM至约200mM、或1μM至约200mM、或0.1mM至约120mM，例如1mM至约20mM、或1mM至约10mM、或1mM至5mM。在一些实施例中，将锌和ALDC酶以组合物进行添加，其中锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1，例如是2:1、或3:1、或5:1、或10:1、或20:1、或30:1、或50:1、或60:1。
在一些实施例中，在生产发酵饮料期间将所述金属离子添加到成熟介质中。在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵期间将所述金属离子添加到成熟介质中。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2 +、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。因此，在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵期间将锌添加到成熟介质中。在一些实施例中，以如下浓度添加锌：1μM至约1mM，例如1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或25μM至约50μM、或30μM至约40μM、或1μM至约50μM、或6μM至约50μM、或1μM至约25μM、或6μM至约25μM。在一些实施例中，将锌和ALDC以组合物进行添加，其中锌以如下浓度存在于所述组合物中：0.1μM至约200mM、或1μM至约200mM、或0.25mM至约120mM，例如1mM至约20mM、或1mM至约10mM、或1mM至约5mM。在一些实施例中，将锌和ALDC酶以组合物进行添加，其中锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1，例如是2:1、或3:1、或5:1、或10:1、或20:1、或30:1、或50:1、或60:1。
在一些实施例中，本披露提供了产生乙偶姻的方法。在一些实施例中，本披露提供了分解乙酰乳酸的方法。在一些实施例中，乙酰乳酸被分解成乙偶姻。这些方法涉及用ALDC酶和金属离子处理底物的步骤，其中所述金属离子以如下浓度存在：约1μM至约200mM，例如约1μM至约500μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或6μM至约50μM、或约6μM至约25μM、或约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约25μM至约50μM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约5mM。在一些实施例中，将所述金属离子和所述ALDC酶以组合物进行添加，其中所述金属离子以如下浓度存在于所述组合物中：0.1μM至约200mM、或1μM至约200mM、或0.25mM至约120mM，例如1mM至约20mM、或1mM至约5mM。在一些实施例中，将所述金属离子和所述ALDC酶以组合物进行添加，其中金属离子与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1，例如是2:1、或3:1、或5:1、或10:1、或20:1、或30:1、或50:1、或60:1。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。因此，在一些实施例中，这些方法涉及用ALDC酶和锌处理底物的步骤，其中所述锌以如下浓度存在：约1μM至约1mM，例如1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或1μM至约100μM、或6μM至约100μM、或6μM至约50μM、或6μM至约25μM。在一些实施例中，将锌和ALDC酶以组合物进行添加，其中锌以如下浓度存在于所述组合物中：0.1μM至约200mM、或1μM至约200mM、或0.25mM至约120mM，例如1mM至约20mM、或1mM至约5mM。在一些实施例中，将锌和ALDC酶以组合物进行添加，其中锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1，例如是2:1、或3:1、或5:1、或10:1、或20:1、或30:1、或50:1、或60:1。
在一些实施例中，本披露提供了在生产发酵饮料的过程中产生乙偶姻的方法。在一些实施例中，本披露提供了在生产发酵饮料的过程中分解乙酰乳酸的方法。在一些实施例中，乙酰乳酸被分解成乙偶姻。
发酵产品
一方面，本发明涉及通过用微生物发酵含碳水化合物的底物来生产具有低二乙酰含量的发酵醇类产品的方法。如本文所用，具有“低二乙酰含量”的发酵醇类产品是指，在金属离子(如锌)的存在下，通过用含有ALDC的组合物发酵含有碳水化合物的底物而产生的发酵醇类产品(例如啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒)，其中在相同的发酵条件(例如相同的温度和相同的时间长度)下，当与不存在金属离子(如锌)时，通过用含有ALDC的组合物发酵含有碳水化合物的底物而产生的发酵醇类产品相比，其二乙酰水平较低。具有低二乙酰含量的发酵醇类产品的实例是二乙酰水平低于约1ppm和/或二乙酰水平低于约0.5mg/L的发酵醇类产品。在一个实施例中，二乙酰水平小于约0.5ppm、或小于约0.1ppm、或小于约0.05ppm、或小于约0.01ppm、或小于约0.001ppm。在一个实施例中，二乙酰水平为约小于0.1mg/L、或约小于0.05mg/L、或约小于0.01mg/L、或约小于0.001mg/L。
当用酵母或其他微生物发酵含碳水化合物的底物如麦芽汁(例如低麦芽含量的麦芽汁)或果汁(如葡萄汁、苹果汁或梨汁)时，除醇类发酵之外，还可能发生各种过程，这可能引起不期望的副产物的产生，例如形成即使在非常低的浓度下仍然具有强烈且难闻气味的二乙酰。因此，如果二乙酰的含量显著地超过一定的限度，例如在一些啤酒中所述限度为约0.1ppm，酒精饮料，例如啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒可能因此具有不可接受的气味和风味。
二乙酰的形成在乙醇的工业生产中也是不利的，因为难以通过蒸馏从乙醇中分离二乙酰。无水乙醇(其中通过与苯共沸蒸馏对乙醇进行脱水)的制备中出现了特别的问题。在共沸蒸馏期间，二乙酰将在苯相中累积，这可能产生二乙酰和苯的混合物，这使得难以回收用于共沸蒸馏的苯。
啤酒的常规酿造包括用适当种类的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)或卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis))发酵麦芽汁。
通常在常规酿造中，发酵通常分两步进行，主要发酵持续时间通常为5至12天以及二次发酵-所谓的成熟过程-其可能需要长达12周。在主要发酵期间，麦芽汁中的大多数碳水化合物被转化为乙醇和二氧化碳。成熟通常在低残留量的酵母存在下在低温下进行。成熟的目的尤其是沉淀不需要的高分子量化合物，并将不期望的化合物转化成不影响风味和气味的化合物，例如二元醇。例如丁二醇，啤酒中α-乙酰乳酸和二乙酰转化的最终产物通常报道为具有中性感官特性的化合物。本文所用的术语“发酵介质”是指包含含有碳水化合物的底物的介质，所述底物可以通过酵母或其他微生物进行发酵以产生例如啤酒或葡萄酒或苹果酒或梨酒或清酒。发酵介质的实例包括：麦芽汁和果汁(如葡萄汁、苹果汁和梨汁)。实例9详细说明了合适的麦芽汁的实例。本文所用的术语“成熟介质”是指包含含有碳水化合物的底物的介质，所述底物已经通过酵母或其他微生物进行发酵以产生例如啤酒或葡萄酒或苹果酒或梨酒或清酒。成熟介质的实例包括：部分发酵的麦芽汁和果汁(如葡萄汁、苹果汁和梨汁)。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的发酵或成熟介质，其包含浓度为约1μM至约300μM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的发酵或成熟介质，其包含浓度为约6μM至约25μM的金属离子。
在一些方面，本发明涉及如本文所述的组合物在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵中的用途。在一些实施例中，本发明包括使用本文所述的ALDC组合物在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或成熟过程中分解乙酰乳酸。还有，本发明包括使用根据本发明所述的ALDC衍生物在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或成熟过程中分解乙酰乳酸。
因此，在一些实施例中，本发明的方法的特征在于通过在发酵工艺(例如，成熟)期间或之后用本文所述的包含ALDC或ALDC衍生物的组合物处理底物。
因此，在一些实施例中，乙酰乳酸被酶法脱羧为乙偶姻，结果是，避免了乙酰乳酸形成二乙酰(所不希望的)。在一些实施例中，将其他酶与ALDC组合用于α-乙酰乳酸的转化。这些酶的实例包括但不限于乙酰乳酸还原异构酶或乙酰乳酸异构酶。
在一些实施例中，将本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物与普通酵母一起用于批发酵中。
不使用处于游离状态的酶，而可以使用固化状态的酶，将固化酶在发酵期间或之后(例如，在成熟期间)添加到麦芽汁中。也可以将固定化酶保持在发酵麦芽汁或啤酒通过的柱中。可以单独固定酶，或可以使用共固定的酵母细胞和乙酰乳酸脱羧酶。
在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或成熟过程中使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将二乙酰水平降低至低于约1ppm、或约小于0.5ppm、或约小于0.1ppm、或约小于0.05ppm、或约小于0.01ppm、或约小于0.001ppm。在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或成熟过程中使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将二乙酰水平降低至低于0.1ppm。
在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或成熟过程中使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将VDK含量降低至低于0.1mg/L、或约小于0.05mg/L、或小于0.01mg/L、或小于0.001mg/L。总VDK是指二乙酰加上2,3-戊二酮的量。在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或成熟过程中使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将总VDK含量降低至低于0.1mg/L。
在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或成熟过程中使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将二乙酰水平降低至低于约0.5mg/L、或约小于0.1mg/L、或约小于0.05mg/L、或约小于0.01mg/L或约小于0.001mg/L。在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或成熟过程中使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将二乙酰水平降低至低于0.1mg/L。
在一些实施例中，在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或成熟过程中使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将其他邻位二酮(如2,3戊二酮)降低至低于0.1mg/L、或约小于0.05mg/L、或小于0.01mg/L、或小于0.001mg/L。
本发明的方法不仅可以用于相关的啤酒酿造中，而且还适用于生产任何合适的酒精饮料(例如葡萄酒、清酒、苹果酒、梨酒等)，其中需要减少二乙酰水平或其他邻位二酮。在一些实施例中，本发明的方法可用于生产可获得类似优点的葡萄酒，特别是成熟期的减少和方法的简化。在这方面特别感兴趣的是在相关的所谓的乳酸发酵中使用乙酰乳酸转化酶。这种受到微生物，如明串珠菌属、乳杆菌或足球菌物种影响的过程是在葡萄酒主发酵后进行的，以增加产品的pH及其生物稳定性，并引发出葡萄酒的风味。此外，因为它可以快速装瓶，所以进行发酵是非常需要的，从而大大提高了酿酒厂的现金流转。然而，不幸的是，该方法可能产生由二乙酰引起的异味，所述二乙酰的形成可以在乙酰乳酸转化酶的帮助下得到降低。
因此，在一些实施例中，本发明的方法提供了制备具有较低含量的二乙酰的酒精饮料，其中当与不使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比时，生产含有较少二乙酰的酒精饮料所需的时间减少了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。在一些实施例中，当与不使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比时，本发明的方法提供了制备具有较低含量的二乙酰的酒精饮料，其中完全除去成熟步骤。
在一些实施例中，在发酵工艺(例如，啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵)过程中使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物，使得当与不使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比时，所述发酵工艺所需的时间减少了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。在一些实施例中，当与不使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比时，本发明的方法提供了制备具有较低含量的二乙酰的酒精饮料，其中完全除去成熟步骤。
在一些实施例中，在成熟或调节工艺(例如，啤酒成熟/调节)过程中使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物，使得当与不使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比时，所述成熟或调节工艺所需的时间减少了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。在一些实施例中，当与不使用本文所述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比时，本发明的方法提供了制备具有较低含量的二乙酰的酒精饮料，其中完全除去成熟步骤。
另外，在一些实施例中，本文所述的这些方法可以有利地用于乙醇的工业制备，使得获得的发酵产物不含或几乎不含任何二乙酰，这简化了蒸馏过程，特别是在共沸制备无水乙醇(即纯无水乙醇)的情况下。
在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加包含ALDC酶和金属离子的组合物，使得所述金属离子以如下浓度存在于所述介质中：约0.1μM至约500μM、或约0.1μM至约300μM、或约0.1μM至约50μM、或约1μM至约500μM、或约1μM至约300μM、或约6μM至约300μM、或约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM、或约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约25μM至约50μM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约5mM。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加包含ALDC酶和锌的组合物，其中所述锌以如下浓度存在于所述组合物中：约0.25mM至约200mM，例如约1mM至约20mM、或约1mM至约5mM。在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加包含ALDC酶和锌的组合物，其中锌与ALDC酶的摩尔比高于1，例如是2:1、或3:1、或5:1、或10:1、或20:1、或30:1、或50:1、或60:1。在一些实施例中，在发酵过程和/或成熟过程期间添加所述ALDC酶和锌。在一些实施例中，以约0.01g至约10g、或约0.5g至约10g、或约1g至约5g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加所述ALDC酶。如本文所用，术语“啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物”可以与术语介质互换。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。
在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加包含ALDC酶和金属离子的组合物，其中所述金属离子以如下浓度存在于所述组合物中：约1μM至约200mM、或约100μM至约200mM，并且包含所述ALDC酶和金属离子的组合物以约0.01g至约10g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加。在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加包含ALDC酶和金属离子的组合物，其中所述金属离子以如下浓度存在于所述组合物中：约1μM至约200mM、或约100μM至约200mM，并且包含所述ALDC酶和金属离子的组合物以约0.5g至约10g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加。在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加包含ALDC酶和金属离子的组合物，其中所述金属离子以如下浓度存在于所述组合物中：约1μM至约200mM、或约100μM至约200mM，并且包含所述ALDC酶和金属离子的组合物以约1g至约5g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加。在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加包含ALDC酶和金属离子的组合物，其中所述金属离子以如下浓度存在于所述组合物中：约1μM至约200mM、或约100μM至约200mM，并且包含所述ALDC酶和金属离子的组合物以约1g至约2g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加。在一些实施例中，所述金属离子以如下浓度存在于所述组合物中：约1mM至约20mM、或约1mM至约10mM、或约1mM至约5mM。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质、或1000至2500单位/mg蛋白质、或1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。
在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中以组合物形式添加ALDC酶和金属离子，其中所述金属离子与ALDC酶的摩尔比高于1，并且包含所述ALDC酶和金属离子的组合物以约0.01g至约10g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加。在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中以组合物形式添加ALDC酶和金属离子，其中所述金属离子与ALDC酶的摩尔比高于1，并且包含所述ALDC酶和金属离子的组合物以约0.5g至约10g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加。在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中以组合物形式添加ALDC酶和金属离子，其中所述金属离子与ALDC酶的摩尔比高于1，并且包含所述ALDC酶和金属离子的组合物以约1g至约5g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加。在一些实施例中，本发明提供了用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括向啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中以组合物形式添加ALDC酶和金属离子，其中所述金属离子与ALDC酶的摩尔比高于1，并且包含所述ALDC酶和金属离子的组合物以约1g至约2g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加。在一些实施例中，所述金属离子与ALDC酶的摩尔比是2:1、或3:1、或5:1、或10:1、或20:1、或30:1、或50:1、或60:1、或更高。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2 +。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质、或1000至2500单位/mg蛋白质、或1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。
生产ALDC酶
在一方面，本说明书涉及能够编码本文所述的ALDC酶的核酸。在另外的方面，本说明书涉及包含这种核酸或能够表达本文所述的ALDC酶的表达载体或质粒。在一方面，所述表达载体或质粒包含衍生自木霉属(Trichoderma)的启动子，例如从里氏木霉(T.reesei)cbhI衍生的启动子。在另外的方面，所述表达载体或质粒包含衍生自木霉属的终止子，例如从里氏木霉cbhI衍生的终止子。在又另外的方面，所述表达载体或质粒包含一种或多种选择性标记，例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS和pyrG。在另一方面，所述表达载体或质粒包含允许在宿主细胞中进行非染色体质粒维持的一个或多个端粒区域。
在一方面，本说明书涉及具有如本文所述的ALDC酶的异源表达的宿主细胞。在另外的方面，所述宿主细胞是真菌细胞。在又另外的方面，所述真菌细胞属于木霉属。在又另外的方面，所述真菌细胞属于里氏木霉(Trichoderma reesei)物种或红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)物种。在另一方面，所述宿主细胞包含如本文所述的质粒或表达载体，优选地用其对所述宿主细胞进行转化。
在一些实施例中，所述宿主细胞是细菌性宿主细胞，例如芽胞杆菌属宿主细胞。在一些实施例中，通过培养含有编码和表达ALDC酶(例如短芽孢杆菌的ALDC)的基因的枯草芽孢杆菌菌株来产生ALDC酶。这种宿主细胞的实例及其培养在DK149335B中进行了描述。
如下文献中提供了合适的表达和/或整合载体的实例：Sambrook等人，(1989)见上文，和Ausubel(1987)见上文，和van den Hondel等人，(1991)，Bennett和Lasure(编辑)，More Gene Manipulations In Fungi[更多真菌中的基因操作]，学术出版社，第396-428页，以及美国专利号5,874,276。还参考美国真菌遗传资源中心菌株目录(FGSC，http://www.fgsc.net)以获取载体列表。特别有用的载体包括从例如英杰公司(Invitrogen)和普洛麦格公司(Promega)获得的载体。用于细菌细胞的合适质粒包括允许在大肠杆菌(E.coli)中复制的pBR322和pUC19，以及例如允许在芽孢杆菌属中复制的pE194。适用于大肠杆菌宿主细胞中的其他特异性载体包括如下载体，例如pFB6、pBR322、pUC18、pUC100、pDONRTM201、10pDONRTM 221、pENTRTM、3Z和4Z。
适用于真菌细胞的特异性载体包括pRAX，一种用于曲霉属(Aspergillus)的通用表达载体，具有glaA启动子的pRAX，并且在肉座菌属(Hypocrea)/木霉属中包括具有cbh1启动子的pTrex3g。
在一些实施例中，所述宿主细胞是真菌细胞并且任选地是丝状真菌宿主细胞。术语“丝状真菌”是指所有丝状形式的真菌亚门(参见Alexopoulos,C.J.(1962)，Introductory Mycology[菌物学概论]，威利出版社(Wiley)，纽约)。这些真菌的特征在于具有由几丁质、纤维素和其他复合多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本披露的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。在本披露中，所述丝状真菌亲本细胞可以是属于以下物种的细胞，但不限于：木霉属(例如，里氏木霉，红褐肉座菌的无性变形，以前分类为长梗木霉、绿色木霉、康氏木霉、哈茨木霉)(Sheir-Neirs等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物与生物技术]20:46-53(1984)；ATCC号56765和ATCC号26921)、青霉属、腐质霉属(例如特异腐质霉、绵毛状腐质菌和灰腐质霉)、金孢霉属(例如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense))、粘帚霉属、曲霉属(例如米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、和泡盛曲霉)(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物与生物技术]39:738-743(1993)和Goedegebuur等人，Curr.Genet.[现代遗传学]41:89-98(2002))、镰刀菌属(例如粉红镰孢菌、禾谷镰刀菌、禾谷镰孢、尖孢镰孢菌和镶片镰刀菌)、脉孢菌属(粗糙脉孢菌)、肉座菌属、毛霉菌属(米黑毛霉)、根霉属和翘孢霉属(还参见Innis等人，Science[科学]228:21-26(1985))。术语“木霉菌”或“木霉物种”或“木霉属”是指先前或目前归类为木霉菌的任何真菌属。
在一些实施例中，所述宿主细胞将是革兰氏阳性细菌细胞。非限制性实例包括链霉菌(例如，变铅青链霉菌(S.leividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)和灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌菌株。如本文所使用的，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽胞杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽胞杆菌和苏云金芽孢杆菌。据认识，芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)的此类生物体。
在一些实施例中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌菌株，例如大肠杆菌或假单胞菌属。在其他实施例中，宿主细胞可以是酵母细胞，例如酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属或假丝酵母属。在其他实施例中，宿主细胞将是基因工程化的宿主细胞，其中例如通过在细菌或真菌细胞中的缺失，天然基因已被灭活。在需要获得具有一个或多个灭活基因的真菌宿主细胞的情况下，可以使用已知的方法(例如，以下文献中公布的方法：美国专利号5,246,853、美国专利号5,475,101和WO 92/06209)。可以通过完全或部分缺失、通过插入性灭活或通过任何其他使基因对其预期目的不起作用的方式完成基因灭活(使得该基因无法表达功能性蛋白质)。在一些实施例中，当宿主细胞是木霉属细胞，并且特别是里氏木霉宿主细胞时，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因将被灭活和/或缺失。在美国专利号5,847,276和WO 05/001036中阐述和描述了具有quad缺失的蛋白的示例性里氏木霉宿主细胞。在其他实施例中，宿主细胞是蛋白酶缺陷或蛋白酶不足的菌株。本文所用的术语“蛋白酶缺陷”或“蛋白酶不足的菌株”是指衍生自或可衍生自亲本细胞的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含当与所述亲本细胞相比时使宿主细胞产生减少量的一种或多种蛋白酶(例如功能性蛋白酶)的一种或多种遗传改变；优选地，所述宿主细胞缺乏一种或多种选自由以下各项组成的组中的蛋白酶：WprA、Vpr、Epr、IspA、Bpr、NprE、AprE、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO、和ywaD。提供了衍生自亲本细胞的变体宿主细胞，所述变体宿主细胞包含当与所述亲本细胞相比时使变体菌株的细胞产生减少量的一种或多种蛋白酶的一种或多种遗传改变。
将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括技术例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如脂质转染介导的和DEAE-右旋糖酐介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀一起孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；和原生质体融合。一般转化技术是本领域已知的(参见例如，Ausubel等人，(1987)见上文，第9章；和Sambrook等人，(1989)见上文，以及Campbell等人，Curr.Genet.[现代遗传学]16:53-56(1989))。
众多参考文献中公开了芽孢杆菌的转化方法，所述文献包括：AnagnostopoulosC.和J.Spizizen，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:741-746(1961)和WO 02/14490。
以下文献中描述了曲霉属的转化方法：Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474(1984)；Berka等人，(1991)，在Applications of EnzymeBiotechnology[酶生物技术应用]中，Kelly和Baldwin编辑，纽约普莱纽姆出版社；Cao等人，Protein Sci.[蛋白质科学]9:991-1001(2000)；Campbell等人，Curr.Genet.[现代遗传学]16:53-56(1989)和EP 238 023。以下文献中描述了异源蛋白质在木霉属中的表达：美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；Harkki等人，Enzyme Microb.Technol.[酶微生物技术]13:227-233(1991)；Harkki等人，BioTechnol.[生物技术]7:596-603(1989)；EP244,234；EP 215,594；以及Nevalainen等人，“The Molecular Biology of Trichodermaand its Application to the Expression of Both Homologous and HeterologousGenes[木霉属的分子生物学及其在同源和异源基因表达中的应用]”，MolecularIndustrial Mycology[分子工业真菌学]，Leong和Berka主编，马塞尔德克尔公司，NY(1992)第129-148页)。关于镰刀菌菌株的转化还可以参考以下文献：W0 96/00787和Bajar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:8202-8212(1991)。
在一方面，本说明书涉及分离如本文所定义的ALDC酶的方法，所述方法包括如下步骤：在如本文所定义的宿主细胞中诱导ALDC酶的合成，所述宿主细胞具有所述ALDC酶的异源表达，并回收由所述宿主细胞分泌的细胞外蛋白，以及任选地纯化ALDC酶。在另外的方面，本说明书涉及用于产生如本文所定义的ALDC酶的方法，所述方法包括如下步骤：在如本文所定义的宿主细胞中诱导ALDC酶的合成，所述宿主细胞具有所述ALDC酶的异源表达，并任选地纯化ALDC酶。在另外的方面，本说明书涉及表达如本文所定义的ALDC酶的方法，所述方法包括如下步骤：获得如本文定义的宿主细胞，或本领域普通技术人员已知的任何合适的宿主细胞，并表达来自所述宿主细胞中的ALDC酶，以及任选地纯化ALDC酶。在另一方面，如本文所定义的ALDC酶是主要的分泌的蛋白。
在一些实施例中，在ALDC生产期间和/或之后，将金属离子，例如Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+，及其组合物添加到介质(例如培养和/或发酵和/或成熟介质)中以增加从微生物的回收率。
在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约1μM至约1mM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约25μM至约150μM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约25μM至约50μM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约30μM至约40μM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约40μM至约150μM的金属离子。在一些实施例中，本发明提供了用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约60μM至约150μM的金属离子。在一些实施例中，所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+和Fe2+，及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Cu2+、和Fe2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+、和Co2+组成的组。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+或Mn2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质、或1000至2500单位/mg蛋白质、或1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。当所述宿主细胞在允许编码ALDC的核酸序列表达的条件下培养时，本文所用的术语“产ALDC的宿主细胞”是指能够表达ALDC酶的宿主细胞。编码ALDC酶的核酸序列可以与宿主细胞异源或同源。在一些实施例中，产ALDC的宿主细胞是枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，产ALDC的宿主细胞是包含编码和表达ALDC酶的基因的枯草芽孢杆菌，其中所述ALDC酶包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。在一些实施例中，产ALDC的宿主细胞是包含编码ALDC的核酸序列，其中所述编码ALDC的核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6或其任何功能片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施例中，产ALDC的宿主细胞是包含编码衍生自短芽孢杆菌的ALDC的基因的枯草芽孢杆菌。
实例
本披露在以下实例中进一步详细描述，所述实例不意欲以任何方式限制本披露所要求保护的范围。附图意在被考虑为本披露说明书和描述的组成分。提供下列实例以说明但不限制所要求保护的披露内容。
实例1-乙酰乳酸脱羧酶，aldB的异源表达
之前鉴定了短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)(可能被称为短芽孢杆菌)乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)aldB基因(Diderichsen等人，J Bacteriol.[细菌学杂志](1990)172(8):4315)，其序列如UNIPROT登录号P23616.1所示。该基因aldB的序列描绘在SEQ ID NO:1中。粗体突出显示和加下划线的核苷酸是编码信号肽的核苷酸。
SEQ ID NO:1列出了aldB基因的核苷酸序列：
gctacaacggctactgtaccagcaccacctgccaagcaggaatccaaacctgcggttgccgctaatccggcaccaaaaaatgtactgtttcaatactcaacgatcaatgcactcatgcttggacagtttgaaggggacttgactttgaaagacctgaagctgcgaggcgatatggggcttggtaccatcaatgatctcgatggagagatgattcagatgggtacaaaattctaccagatcgacagcaccggaaaattatcggagctgccagaaagtgtgaaaactccatttgcggttactacacatttcgagccgaaagaaaaaactacattaaccaatgtgcaagattacaatcaattaacaaaaatgcttgaggagaaatttgaaaacaagaacgtcttttatgccgtaaagctgaccggtacctttaagatggtaaaggctagaacagttccaaaacaaaccagaccttatccgcagctgactgaagtaaccaaaaaacaatccgagtttgaatttaaaaatgttaagggaaccctgattggcttctatacgccaaattatgcagcagccctgaatgttcccggattccatctccacttcatcacagaggataaaacaagtggcggacacgtattaaatctgcaatttgacaacgcgaatctggaaatttctccgatccatgagtttgatgtacaattgccgcacacagatgattttgcccactctgatctgacacaagttactactagccaagtacaccaagctgagtcagaaagaaaataa
SEQ ID NO:6列出了编码乙酰乳酸脱羧酶的核苷酸序列的实例-粗体突出显示和加下划线的核苷酸是编码信号肽的核苷酸：
accatcaatgatctcgatggagagatgattcagatgggtacaaaattctaccagatcgacagcaccggaaaattatccgagctgccagaaagtgtgaaaactccatttgcggttactacacatttcgagccgaaagaaaaaactacattaaccaatgtgcaagattacaatcaattaacaaaaatgcttgaggagaaatttgaaaacaagaacgtcttttatgccgtaaagctgaccggtacctttaagatggtaaaggctagaacagttccaaaacaaaccagaccttatccgcagctgactgaagtaaccaaaaaacaatccgagtttgaatttaaaaatgttaagggaaccctgattggcttctatacgccaaattatgcagcagccctgaatgttcccggattccatctccacttcatcacagaggataaaacaagtggcggacacgtattaaatctgcaatttgacaacgcgaatctggaaatttctccgatccatgagtttgatgtacaattgccgcacacagatgattttgcccactctgatctgacacaagttactactagccaagtacaccaagctgagtcagaaagaaaataa
由aldB基因编码的酶原描绘在SEQ ID NO:2中。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP-NN(Emanuelsson等人，Nature Protocols[自然试验方案](2007)2:953-971)预测的长度为24个氨基酸的信号肽。该信号肽序列在SEQ ID NO:2中加下划线并以粗体显示。信号肽的存在表明该乙酰乳酸脱羧酶，aldB是分泌的酶。预测的完全加工的成熟链的序列(aldB，261个氨基酸)描绘在SEQ ID NO:3中。
SEQ ID NO:2列出了乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)前体aldB的氨基酸序列：
MKKNIITSITSLALVAGLSLTAFAATTATVPAPPAKQESKPAVAANPAPKNVLFQYSTINALMLGQFEGDLTLKDLKLRGDMGLGTINDLDGEMIQMGTKFYQIDSTGKLSELPESVKTPFAVTTHFEPKEKTTLTNVQDYNQLTKMLEEKFENKNVFYAVKLTGTFKMVKARTVPKQTRPYPQLTEVTKKQSEFEFKNVKGTLIGFYTPNYAAALNVPGFHLHFITEDKTSGGHVLNLQFDNANLEISPIHEFDVQLPHTDDFAHSDLTQVTTSQVHQAESERK
SEQ ID NO:7列出了乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)前体aldB的氨基酸序列的实例-所述信号肽序列带有下划线并且是粗体：
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SEQ ID NO:3列出了成熟乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)aldB(261个氨基酸)的预测氨基酸序列：
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SEQ ID NO:8列出了成熟乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)aldB(261个氨基酸)的预测氨基酸序列的实例：
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使用整合的表达盒在枯草芽孢杆菌中产生编码乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的来自短短芽孢杆菌菌株的aldB基因，所述整合的表达盒由枯草芽孢杆菌aprE启动子、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列、成熟的aldB和BPN’终止子组成。将该盒相对于表达盒以头对头方向克隆，并通过同源重组将aldB表达盒导入枯草芽孢杆菌中。
含有aldB基因(RIHI-aldB)的载体的图示于图1中。
质粒RIHI-aldB中的aldB基因的核苷酸成熟序列描绘于SEQ ID NO:4中。
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由质粒RIHI-aldB表达的aldB前体蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:5中。
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所述信号肽序列在SEQ ID NO:5中是粗体小写字母斜体。
小规模培养条件
为了生产aldB，将含有aldB表达盒的枯草芽孢杆菌菌株转化体在15mL福尔肯(Falcon)管子中在具有300ppmβ-氯-D-丙氨酸(CDA)的TSB(肉汤)中培养5小时，并且将300μL该预培养物添加到500mL烧瓶中，该烧瓶装有补充有300ppm CDA和50μM Zn2+的30mL培养介质(如下所述)。随着在180rpm下的持续转动混合，将这些烧瓶在33℃下孵育24小时、48小时和72小时。通过在锥形管中以14500rpm离心20分钟来收获培养物。将培养上清液用于蛋白质测定。所述培养介质是基于MOP缓冲液的富集的半定义介质，以尿素为主要氮源，以马尔特灵为主要碳源。
分批补料发酵条件
为了生产aldB，将含有aldB表达盒的枯草芽孢杆菌菌株转化体在250mL烧瓶中培养，该烧瓶含有30mL的具有300ppmβ-氯-D-丙氨酸(CDA)的复合介质。随着在180rpm下的持续转动混合，将该烧瓶在37℃下孵育6小时。
将培养物转移到含有7升如下表1中所述的无菌介质成分的搅拌发酵罐中。温度控制在37℃；使用氢氧化铵作为碱性滴定剂将pH控制为7.5；通过保持7升/分钟的气流、1巴的恒定过压并调节搅拌速率将溶解的氧保持在40％或更高。当初始葡萄糖耗尽时，启动进料曲线，向发酵罐中进料60％葡萄糖溶液(初始进料速率为20g/h，经7小时线性增加至32.8g/h，并保持恒定，直到发酵终止)。
总发酵时间为44小时。
表1 ALDC发酵的介质配方
实例2-蛋白质测定方法
通过标准无污渍成像仪(Stain Free Imager Criterion)进行蛋白质测定
使用Gel DocTM EZ成像系统通过SDS-PAGE凝胶和光密度法定量蛋白质。所述测定中使用的试剂：浓缩(2x)Laemmli样品缓冲液(伯乐公司(Bio-Rad)，目录号161-0737)；26孔XT 4％-12％Bis-Tris凝胶(伯乐公司(Bio-Rad)，目录号345-0125)；蛋白质标记“精密加蛋白质标准(Precision Plus Protein Standards)”(伯乐公司(Bio-Rad)，目录号161-0363)；蛋白质标准BSA(赛默科技公司(Thermo Scientific)，目录号23208)和SimplyBlueSafestain(英杰公司(Invitrogen)，目录号LC 6060)。测定如下进行：在96孔PCR板中，将50μL稀释的酶样品与50μL的含有2.7mg DTT的样品缓冲液混合。将该板用Bio-Rad的Microseal‘B’膜密封，并放入PCR机中加热至70℃持续10分钟。之后，通过运行缓冲液填充腔室，设置凝胶盒。然后将10μL的各个样品和标准品(0.125-1.00mg/mL BSA)装在凝胶上，并装入5μL的标记物。之后，在200V下运行电泳45分钟。电泳后，将凝胶在水中冲洗3次持续5分钟，然后在Safestain中染色过夜，并最后在水中脱色。然后，将凝胶转移到成像仪中。使用成像实验室(Image Lab)软件来计算每个条带的强度。通过已知标准样品的蛋白的量，可以制作校准曲线。样品的量可以通过带强度和校准曲线来确定。使用蛋白质定量方法制备用于后续实例中所示测定的aldB乙酰乳酸脱羧酶的样品。
实例3-活性测定方法
α-乙酰乳酸脱羧酶的分光光度法
α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)将α-乙酰乳酸脱羧催化为乙偶姻。可以用比色法定量反应产物乙偶姻。与α-萘酚和肌酸混合的乙偶姻形成在OD522nm处吸收红色的特征。基于OD522nm和乙偶姻校准曲线计算ALDC活性。如下进行所述测定：通过在10℃下将100μL乙基-2-乙酰氧基-2-甲基乙酰乙酸盐(西格玛公司(Sigma)，目录号220396)与3.6mL的0.5M NaOH混合10分钟来制备20mM乙酰乳酸底物。添加20mL的50mM MES(pH 6.0)，将pH调节至pH 6.0，并用50mM MES(pH 6.0)调节体积至25mL。将80μL的20mM乙酰乳酸底物与在50mM MES(pH 6.0)、0.6M NaCl、0.05％BRIJ 35和0.01％BSA中稀释的20μL的酶样品混合。将底物/酶混合物在30℃下孵育10分钟。然后将16μL底物/酶混合物转移到200μL的1M NaOH、1.0％α-萘酚(西格玛公司(Sigma)，目录号33420)和0.1％肌酸(西格玛公司(Sigma)，目录号C3630)中。将底物/酶/显色剂混合物在30℃下温育20分钟，并且然后读取OD522nm。将一个单位的ALDC活性定义为在测定条件下产生1μmol乙偶姻/分钟的酶的量。
实例4-锌对ALDC活性的影响
摇瓶发酵过程中Zn2+的存在
如实例1所述，以浓度范围为0mM至800μM aldB，将ZnSO4添加到用于小规模发酵的培养介质中。将含有aldB表达盒的枯草芽孢杆菌转化体在15mL福尔肯(Falcon)管子中在具有300ppmβ-氯-D-丙氨酸(CDA)的TSB(肉汤)中培养5小时，并且将300μL该预培养物添加到每个500mL烧瓶中，该烧瓶装有30mL的补充有300ppm CDA并含有0、5μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM和800μM Zn2+的培养介质。随着在180rpm下的持续转动混合，将这些烧瓶在33℃下孵育24小时和48小时。通过在锥形管中以14500rpm离心20分钟来收获培养物。将培养上清液用于蛋白质测定和ALDC活性测定(表2和表3)。显而易见，增加发酵介质中Zn2+的浓度增加了表达的aldB酶的总ALDC活性和比活性。
表2发酵24和48小时后具有不同Zn2+水平的aldB发酵样品的ALDC活性
表3发酵48小时后具有不同Zn2+水平的aldB发酵样品的ALDC活性、aldB蛋白和比活性
实例5-调整aldB样品的比活性
ALDC在50℃时的锌剂量反应
将ZnSO4添加到ALDC发酵样品中以产生在0mM至20mM范围内的浓度。将样品在50℃下保持60分钟，并且然后如实例3中所述测量活性。相对于没有添加锌的样品，具有>0.5mM锌的样品的活性高于200％。图2示出了结果。
实例6-调整aldB发酵物的比活性
如(实例1)中所述产生AldB活性，并如(实例3)中所述测定活性。将AldB发酵物样品在50mM MES(pH 6.0)、0.6M NaCl、0.05％Brij、0.01％BSA(牛血清白蛋白)中稀释至约1000U/mL，并且然后在下列步骤中用如下不同浓度的ZnSO4孵育：0、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、7.5mM、10mM、20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、120mM。将所有样品在4℃下孵育68小时，然后离心并通过标准SDS-PAGE分析对上清液进行活性和蛋白质分析。SDS-PAGE分析的结果如图3所示，以及测定的活性、蛋白质浓度和比活性见表4。可以看出，ALDC活性随着样品中ZnSO4浓度的增加而增加，直到ZnSO4浓度为大约5mM-10mM，此时随着更高浓度的ZnSO4，ALDC活性几乎保持恒定不变。样品中aldB蛋白的浓度在所有样品中被确定为几乎恒定，表明在孵育后比活性从在没有ZnSO4的样品中的968U/mg明显增加至在具有5mM ZnSO4或更多的样品中的2200U/mg-2400U/mg。
表4在4℃下用ZnSO4孵育68小时的aldB样品的ALDC活性、aldB蛋白浓度和比活性。
实例7-aldB的纯化
如实例(1)中所述进行枯草芽孢杆菌中的aldB的生产。通过离心(4000rpm，15分钟)和过滤(VacuCap 90，0.2μm)澄清发酵介质。将样品在PD10柱上脱盐，如制造商的描述进行制备并用20mM Tris/HCl(pH 8.0)进行平衡。然后将洗脱液保持在冰上，然后通过阴离子交换色谱法在Source 15Q XK26/15上进一步纯化。根据制造商(GE医疗集团，USA-目录号18-1112-41)描述的方法，将该柱配备到用于蛋白质纯化的 explorer系统上。
如制造商的描述制备所述柱并用20mM Tris/HCl(pH 8.0)(缓冲液A)进行平衡。将脱盐样品施加到流速为5mL/min的柱上，并将该柱用缓冲液A洗涤。用20mM Tris/HCl(pH8.0)中的0-0.30M NaCl的线性梯度洗脱结合蛋白(7mL/min，40min)。在整个运行期间，收集了大约10mL-20mL的级分。
根据制造商(英杰公司(Invitrogen)，USA-目录号EI0001)描述的方法(该方法使用Nu-PAGE凝胶(英杰公司，USA-目录号NP0321)、MES运行缓冲液(英杰公司，USA-目录号NP0002)、See Blue标准标记(英杰公司，USA-目录号LC5925)并用Coomasie Brilliant-Blue染色)和通过使用Xcell迷你细胞的SDS-PAGE来分析经纯化得到的级分。
观察到AldB在Source 15Q柱上结合，并用大约30mM NaCl洗脱。收集AldB级分，浓缩(在10kDa UF Vivaspin上)，并在含有150mM NaCl(pH 8.0)的25mM HEPES缓冲液中脱盐。估计aldB的纯度高于95％，并且经纯化的aldB的SDS-page分析结果如图4所示。
实例8-调整经纯化的aldB的比活性
通过在37℃下，将aldB(大约2mg/mL)与20mM EDTA在0.2x测定缓冲液(50mM MES(pH 6.0)、0.6M NaCl、0.05％Brij、0.01％BSA)中孵育过夜，除去经纯化的aldB蛋白质的二价离子。将经EDTA处理的物质在PD10柱上脱盐，所述PD10柱是如制造商所述进行制备的并用50mM MES(pH 6.0)、0.6M NaCl、0.05％Brij、0.01％BSA进行平衡。如实例(2和3)中所述测定EDTA处理前后样品中的ALDC活性和AldB蛋白浓度以及脱盐柱，并且结果如表5所示。
表5 EDTA-脱盐程序前后，经纯化的aldB的ALDC活性、aldB蛋白浓度和比活性。
在所述步骤中分别用不同浓度ZnSO4：0mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM和20mM，将50μL的经EDTA处理的并脱盐的aldB样品与450μL的0.2x测定缓冲液(50mMMES(pH 6.0)、0.6M NaCl、0.05％Brij、0.01％BSA)混合。将样品在37℃下孵育过夜。将样品以13000rpm离心10分钟，并在上清液中测定ALDC活性和AldB蛋白的浓度。结果见表6。可以看出，在孵育期间，ALDC活性随着ZnSO4浓度的增加而增加。样品中aldB蛋白的浓度在所有样品中被确定为恒定，表明在孵育后比活性从在没有ZnSO4的样品中的2U/mg aldB增加至在具有5mM ZnSO4或更多的样品中的1800U/mg aldB。
表6用ZnSO4孵育前后，经纯化的aldB的ALDC活性、aldB蛋白浓度和比活性。
此外，将20μL的经EDTA处理的和脱盐的aldB样品与分别补充有10mM ZnSO4、MnSO4或CoCl2的180μL的50mM MES(pH 6.0)混合。将样品在37℃下孵育并在45分钟、1天、2天和3天后测定。结果在表7中示出。与对照(添加H2O)相比，与所有三种二价离子以Zn2+、Mn2+和Co2 +的顺序孵育的活性增加。45分钟后，显示活性随着时间的推移而降低。与对照(添加H2O)相比，添加Zn2+、Mn2+和Co2+都导致了3天后稳定性(活性)增加。如表7中所示，与添加H2O所得到的56.0％相比，一经添加Zn2+、Mn2+和Co2，相对于开始3天后所测量的残余活性为76.9％、73.5％和70.7％。
表7在pH 6.0下，以不同次数与MnSO4、CoCl2或ZnSO4孵育后的ALDC活性。
实例9-通过使用具有不同ALDC比活性的aldB，在啤酒发酵期间，二乙酰和2,3-戊二酮的降低
该分析的目的是测试在14℃下、持续7天的发酵期间，aldB(乙酰乳酸脱羧酶)的不同配制品变体减少二乙酰和2,3-戊二酮(邻位二酮，VDK)发展的能力。
纯麦芽酿造分析
将1100g Munton's Light Malt Extract(批次XB 35189，到期日为2014年5月24日)提取物溶于3000mL温热自来水(45℃)中。将该浆液搅拌约10分钟，直到液体均匀，并用2.5M硫酸将pH调节至5.2。向该浆液中添加10粒来自Hopfenveredlung,St.Johann的苦味啤酒花(其中Alpha含量为16.0％(EBC 7.7 0特异性HPLC分析，2013年10月1日))，然后在500mL蓝盖瓶中分解并煮沸1小时，以确保蛋白质沉淀并避免潜在的微生物污染。对经过滤的麦芽提取物(麦芽汁)取样进行比重和游离氨基氮(FAN)测定。最终的麦芽汁的初始比重为1048(即12°Plato)。将200g经过滤的麦芽汁添加到500mL锥形瓶(发酵容器；FV)中，并且然后冷却至13℃。向每个锥形瓶中添加0.5％W34/70(唯森啤酒(Weihenstephan))新鲜生产的酵母(每200克麦芽汁1.0g酵母)。根据类似的ALDC活性(0.03U/mL麦芽汁，每200g麦芽汁中8单位的ALDC)对酶进行取量。没有酶的对照发酵容器接受与酶样品量相应的去离子水量。
在轨道培养箱中，在150rpm的温和搅拌下，在14℃下，在标准化实验室测试条件下，将麦芽汁样品在500mL锥形瓶中发酵。当24小时内重量减轻小于0.25g时，将发酵温度降至7℃。发酵总共7天后停止发酵。取出10mL样品，用于二乙酰和2,3-戊二酮分析，每天2次，最好两次分析之间间隔11至14小时；在发酵结束时，每天仅取出1个样品。取出前允许酵母静置，并且每个样品在10℃下冷却10分钟，并然后在8℃下以4000rpm离心10分钟以沉淀任何残留的酵母。将上清液从酵母沉淀物中分离出来，并且对于用于GC分析的样品，每mL样品中添加0.5g NaCl。在通过质谱气相色谱检测(GCMS)进行二乙酰和2,3-戊二酮分析之前，将该浆液转移到顶空小瓶中，并在65℃下热处理30分钟。
在具有CombiPAL顶空自动进样器以及MSChemStation采集和分析软件的安捷伦公司(Agilent)6890N/5973N GC上进行分析。将样品在70℃下平衡10分钟，然后将500μl样品上方的气相注入J&W 122-0763DB-1701柱(60m×0.25mmID×1μm)中。注射温度为260℃，并且系统以2mL/min的恒定氦气流操作。烤箱温度为：50℃(2分钟)，160℃(20℃/分钟)，220℃(40℃/分钟)，保持2分钟。以5:1的所选离子的分流比用500μL进行MS检测。所有样品一式两份进行运行，并且使用添加二乙酰或2,3-戊二酮的自来水制备标准品。
化合物的浓度计算如下
其中，
RF是乙酸的响应系数
面积是乙酸的GC面积
Ws是使用的样品量(以mL计)
二乙酰定量极限为0.016mg/L，并且2,3-戊二酮定量极限为0.012mg/L。
检测ALDC酶的添加是否不影响实际发酵度(RDF)和产生的酒精量：遵循标准指令酿造(Standard Instruction Brewing)，23.8580-B28，使用安东帕公司(DMA 5000)测量RDF，并遵循标准指令酿造，23.8580-B28，测量乙醇。
实际发酵度(RDF)值可根据下式计算：
其中：RE＝实际提取物＝(0.1808×°P初始)+(0.8192×°P最终)，°P初始是发酵前的标准化麦芽汁的比重并且°P最终是以Plato度表示的发酵的麦芽汁的比重。
在本上下文中，从所述比重和酒精浓度确定实际发酵度(RDF)。
使用Beer Alcolyzer Plus和DMA 5000密度计(均来自安东帕公司(Anton Paar)，格拉茨，奥地利)测定发酵样品的比重和酒精浓度。基于这些测量，根据下式计算实际发酵度(RDF)值：
其中：E(r)是以Plato度(°P)为单位的实际提取物并且OE是以°P为单位的初始提取物。
表8中给出了，通过添加具有不同ALDC比活性的aldB(通过改变样品中ZnSO4浓度获得)，研究在14℃下进行7天发酵过程中减少二乙酰和2,3-戊二酮(邻位二酮，VDK)发展的能力。aldB变体构成了：A)aldB的粗制剂，B)包括添加到澄清的肉汤中的20mM ZnSO4的aldB的粗制剂，和C)包括添加到发酵介质中的50μM ZnSO4和添加到澄清的肉汤中的20mM ZnSO4的aldB的粗制剂。
表8 aldB样品A、B和C的ALDC活性、aldB蛋白浓度以及比活性。
根据类似的ALDC活性0.03U/mL麦芽汁对酶变异体进行取量，导致麦芽汁中具有不同浓度的aldB蛋白，如表9所示。经计算，添加变体A、B和C的麦芽汁中aldB蛋白质浓度分别为33.4μg/L、28.0μg/L和19.9μg/L。
表9添加aldB变体A、B和C的麦芽汁中的ALDC活性和aldB蛋白。
如上所述进行发酵并分析VDK发展。将用酶进行的发酵与没有添加任何酶的对照进行比较。VDK的发展如图5所示。
与对照相比，所有三种aldB变体都减少了发酵过程中的VDK发展。数据表明，这三种变体的作用非常相似，然而，与A和B相比，在发酵期间第20小时至第40小时，变体C中的VDK增加较少，但是接近于分析的相对标准差(RSD为7.5％)。发酵40小时后，变体A、B和C中，VDK上相对降低分别为63.1％、58.8％和63.2％。此外，对于所有三种变体，观察到达到0.1mg/ml VDK阈值水平或更低所需的发酵时间为约112小时。因此，与A或B相比，变体C的较高比活性可使得能够以较少的aldB蛋白减少相似的VDK。
实例10-在啤酒发酵过程中在麦芽汁中用不同浓度的锌，通过aldB，二乙酰和2,3-戊二酮的降低。
该分析的目的是，在14℃下，在麦芽汁中存在不同水平的ZnSO4的情况下，在4天发酵期间，通过aldB测试二乙酰和2,3-戊二酮(邻位二酮，VDK)的降低。
酿造分析设置如实例9中所述。在冷却的麦芽汁(1000mL麦芽汁中0.686g)中制备ZnSO4的储备溶液，并在发酵前应用于麦芽汁样品(如实例9中所述制备)，产生分别为0ppm、0.1ppm、0.5ppm、0.75ppm、1ppm、2.5ppm、5.0ppm和20.0ppm的Zn2+浓度。随后将ALDC酶和酵母添加到样品中。对于所有样品，对ALDC酶制剂的取量(0.04U/mL麦芽汁，对应于每200g麦汁中8单位ALDC)是相似的。向每个锥形发酵瓶中添加0.5％W34/70(唯森啤酒(Weihenstephan))新鲜生产的酵母(每200g麦芽汁中1.0g酵母)并如实例9所述进行分析。将用酶进行的发酵与没有添加任何酶的对照进行比较。VDK的发展如图6所示。
与对照相比，所有经aldB处理的样品中，在发酵期间VDK发展的增加幅度较小。增加样品中Zn2+的浓度导致VDK产生的增加幅度越来越小。特别是将Zn2+浓度提高至0.5ppm或更多，极大地影响酶活性，以至于避免了VDK的产生。给麦芽汁补充1ppm或更多Zn2+，确保在整个发酵期间VDK水平低于0.1mg/L的风味阈值。
虽然已经显示并在本文描述了本发明的优选实施例，仅通过举例的方式来提供这样的实施例对本领域技术人员将是显而易见的。在不偏离本发明的情况下，许多变化、改变和替换将是本领域的技术人员能想到的。应该理解的是，在此说明的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实施本发明。旨在按照以下权利要求限定本发明的范围，并且在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也包括在本发明的范围内。

Claims (76)

1.一种组合物，其包含乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)和锌，其中所述锌以约1μM至约200mM的浓度存在。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述锌以约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约25μM至约50μM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约500μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约10mM、或约1mM至约5mM的浓度存在。
3.如任何前述权利要求所述的组合物，其中所述锌
(i)以约100μM至约10mM的浓度存在；或
(ii)以约1mM至约5mM的浓度存在。
4.如任何前述权利要求所述的组合物，其中锌与ALDC酶的摩尔比
(i)高于1；或者
(ii)是2:1或更高；或者
(iii)是10:1或更高；或者
(iv)是20:1或更高；或者
(v)是30:1或更高；或者
(vi)是60:1或更高。
5.如任何前述权利要求所述的组合物，其中所述ALDC酶是ALDC衍生物。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述ALDC衍生物是用戊二醛处理过的ALDC酶。
7.如权利要求6所述的组合物，其中以对应于约0.1g至约5g戊二醛/g纯ALDC酶的浓度用戊二醛处理所述ALDC酶。
8.如任何前述权利要求所述的组合物，其中所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质的范围内。
9.如任何前述权利要求所述的组合物，其中所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。
10.如任何前述权利要求所述的组合物，其进一步包含选自由以下各项组成的组中的至少一种另外的酶或酶衍生物：乙酰乳酸还原异构酶、乙酰乳酸异构酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、内切葡聚糖酶和相关β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶、木聚糖酶辅助酶(例如，阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和木聚糖乙酰酯酶)和蛋白酶。
11.如任何前述权利要求所述的组合物，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、乳酸乳球菌DX(Lactococcus lactis DX)、或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
12.如任何前述权利要求所述的组合物，其中所述ALDC酶来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
13.如任何前述权利要求所述的组合物，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
14.根据任何前述权利要求所述的组合物在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵中的用途。
15.一种用于增加ALDC酶在包含ALDC的组合物中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括将锌添加到所述组合物中的步骤，以使所述锌以约1μM至约200mM的浓度存在于所述组合物中。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述锌以如下浓度存在于所述组合物中：约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约25μM至约50μM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约500μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约10mM、或约1mM至约5mM。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述锌以如下浓度存在于所述组合物中
(i)约100μM至约10mM；或
(ii)约1mM至约5mM。
18.如权利要求15或16所述的方法，其中锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比
(i)高于1；或者
(ii)是2:1或更高；或者
(iii)是10:1或更高；或者
(iv)是20:1或更高；或者
(v)是30:1或更高；或者
(vi)是60:1或更高。
19.一种用于增加ALDC酶在包含产ALDC的宿主细胞的培养介质中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括在由所述产ALDC的宿主细胞生产所述ALDC酶期间，向所述培养介质中添加锌作为补充剂的步骤。
20.如权利要求19所述的方法，其中以1μM至约1mM的浓度添加所述锌。
21.如权利要求20所述的方法，其中以25μM至约150μM、或以60μM至约150μM的浓度添加所述锌。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为芽胞杆菌属(Bacillus)宿主细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述芽胞杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
24.一种用于增加ALDC酶在包含产ALDC的宿主细胞的发酵介质和/或成熟介质中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵期间，将锌添加到所述发酵介质和/或成熟介质中的步骤。
25.如权利要求24所述的方法，其中：
(i)以约1μM至约300μM，例如约6μM至约300μM的浓度添加所述锌；或
(ii)以约1μM至约50μM的浓度添加所述锌；或
(iii)以约1μM至约25μM，优选地约6μM至约25μM的浓度添加所述锌。
26.如权利要求24所述的方法，其中将所述锌作为包含ALDC和锌的组合物添加，其中所述锌以1mM至约5mM的浓度存在于所述组合物中。
27.一种用于产ALDC的宿主细胞的培养介质，其包含浓度为约1μM至约1mM的锌；优选地，所述培养介质包含产ALDC的宿主细胞。
28.如权利要求27所述的培养介质，其包含浓度为约25μM至约150μM的锌。
29.如权利要求27所述的培养介质，其中以60μM至约150μM的浓度添加所述锌。
30.一种啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其包含含有ALDC酶和锌的组合物，其中所述组合物包含浓度为约1μM至约200mM的锌。
31.如权利要求30所述的啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其中：
(i)锌以约1μM至约300μM，例如约6μM至约300μM的浓度存在于所述组合物中；或者
(ii)锌以约1μM至约50μM，例如约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM的浓度存在于所述组合物中；或者
(iii)将所述锌和所述ALDC酶以组合物进行添加，其中锌以约1mM至约20mM，例如1mM至约5mM的浓度存在于所述组合物中；或者
(iv)将所述锌和所述ALDC酶以组合物进行添加，其中锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
32.如权利要求30或31所述的啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其中所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。
33.如权利要求30-32中任一项所述的啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵介质和/或成熟介质，其进一步包含选自由以下各项组成的组中的至少一种另外的酶或酶衍生物：乙酰乳酸还原异构酶、乙酰乳酸异构酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、内切葡聚糖酶和相关β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶、木聚糖酶辅助酶(例如，阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和木聚糖乙酰酯酶)和蛋白酶。
34.一种包含ALDC酶的组合物，其中所述ALDC酶在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。
36.如权利要求34所述的组合物，其中所述ALDC酶来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
37.如权利要求34-36中任一项所述的组合物，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
38.如权利要求34-37中任一项所述的组合物，其中：
(i)锌以约1μM至约200mM的浓度存在；或者
(ii)锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
39.一种用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括在所述啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产过程中，向用于所述啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加ALDC酶并添加锌，使得所述锌以约1μM至约300μM，例如约6μM至约300μM的浓度存在于所述介质中。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述锌以如下浓度存在于所述介质中：约0.1μM至约50μM，例如约1μM至约50μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM。
41.一种用于啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产的方法，所述方法包括在所述啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒生产过程中，向用于所述啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒的介质(例如发酵和/或成熟介质)中添加包含ALDC酶和锌的组合物，其中
(i)锌以约1mM至约5mM的浓度存在于所述组合物中；或者
(ii)锌与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中在发酵过程或成熟过程中添加所述ALDC酶和所述锌。
43.如权利要求39-42中任一项所述的方法，其中以约0.5g至约10g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加所述ALDC酶。
44.如权利要求39-43中任一项所述的方法，其中以约1g至约5g/百升啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵物的浓度添加所述ALDC酶。
45.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。
46.如权利要求39-45中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。
47.如权利要求39-45中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
48.如权利要求39-45中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
49.一种用于增加ALDC酶在包含ALDC的组合物中的活性和/或稳定性的方法，其中所述方法包括以约1μM至约200mM，优选地约100μM至约200mM的浓度向所述组合物中添加金属离子的步骤。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述金属离子的原子半径为约140pm至约165pm。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述金属离子的原子半径为约140pm至约150pm。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述金属离子的原子半径为约142pm至约146pm。
53.如权利要求49所述的方法，其中所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+和Fe2+，及其组合。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+和Co2+组成的组。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述金属离子是Zn2+。
56.如权利要求49-55中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。
57.如权利要求49-55中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
58.如权利要求49-55中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
59.一种包含乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)和金属离子的组合物，其中所述金属离子以约1μM至约200mM，优选地约100μM至约200mM的浓度存在。
60.如权利要求59所述的组合物，其中所述金属离子的原子半径为约140pm至约165pm。
61.如权利要求59所述的组合物，其中所述金属离子的原子半径为约140pm至约150pm。
62.如权利要求61所述的组合物，其中所述金属离子的原子半径为约142pm至约146pm。
63.如权利要求59所述的组合物，其中所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+和Fe2+，及其组合。
64.如权利要求63所述的组合物，其中所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+和Co2+组成的组。
65.如权利要求64所述的组合物，其中所述金属离子是Zn2+。
66.一种用于分解乙酰乳酸的方法，所述方法包括用包含ALDC酶和金属离子的组合物处理底物的步骤，其中所述金属离子以约1μM至约200mM的浓度存在于所述组合物中；优选地，所述底物是含有碳水化合物的底物，如麦芽汁或果汁；优选地，所述底物是发酵和/或成熟介质。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述金属离子以如下浓度存在于所述组合物中：约10μM至约150mM、或约20μM至约120mM、或约25μM至约100mM、或约25μM至约50mM、或约25μM至约20mM、或约100μM至约20mM、或约250μM至约20mM、或约1mM至约20mM、或约1mM至约5mM。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述金属离子以如下浓度存在于所述底物中：
(i)约1μM至约500μM、或约1μM至约300μM，例如约6μM至约300μM，或者
(ii)约1μM至约100μM、或约1μM至约50μM，或者
(iii)约1μM至约25μM、或约6μM至约50μM、或约6μM至约25μM、或约25μM至约50μM。
69.如权利要求66所述的方法，其中将所述金属离子和ALDC以组合物进行添加，并且其中
(i)所述金属离子以约1mM至5mM的浓度存在于所述组合物中；或者
(ii)所述金属离子与ALDC酶在所述组合物中的摩尔比高于1；或者是2:1或更高；或者是10:1或更高；或者是20:1或更高；或者是30:1或更高；或者是60:1或更高。
70.如权利要求66-69所述的方法，其中所述金属离子选自由以下各项组成的组：Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+和Fe2+，及其组合。
71.如权利要求66-70中任一项所述的方法，其中所述金属离子选自由Zn2+、Mn2+和Co2+组成的组。
72.如权利要求66-71中任一项所述的方法，其中所述金属离子是Zn2+。
73.如权利要求66-72中任一项所述的方法，其中在啤酒和/或葡萄酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或清酒发酵或者成熟过程中处理所述底物。
74.如权利要求66-72中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。
75.如权利要求66-72中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自短芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
76.如权利要求66-72中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
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