CN107632008A - 用于探测芳香辅酶nad+/nadh的表面增强拉曼散射基底及其制备方法和应用 - Google Patents

用于探测芳香辅酶nad+/nadh的表面增强拉曼散射基底及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于光谱探测技术领域，提供了一种用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底及其制备方法和应用。所述制备方法包括：将柠檬酸三钠溶液、硼氢化钠溶液及模板剂溶液混合，得混合液；在搅拌下向混合液中逐滴加入硝酸银溶液；继续搅拌5～10min，获得所述用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底；所述模板剂为分子结构中含有苯环的聚合物。本发明制备的SERS基底对生物辅酶NAD+/NADH具有很强的吸附性，可以有效改善NAD+/NADH的吸附效率，进而改善SERS信号质量和探测时间，实现对NAD+/NADH的超灵敏探测。

Description

用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底及其制 备方法和应用
技术领域
本发明属于光谱探测技术领域，尤其涉及一种用于探测芳香辅酶 NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底及其制备方法和应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，氧化态，NAD+)及其还原态NADH是活体细胞内关键的辅酶对，其含量水平是新陈代谢的主要指标，它们广泛参与胞内多个氧化还原过程，如能量代谢、细胞分裂、细胞癌变、细胞凋亡、线粒体响应、钙离子运输以及基因转录等。此外，生物辅酶 NAD+/NADH含量及其比值的变化还与某些人类疾病(糖尿病、心脑血管疾病、帕金森神经退行性疾病、阿尔茨海默病、高血压、癌症等)的诱发和调控有着密切的联系。
目前，在生化探测技术领域，能够用于探测生物辅酶NAD+/NADH的含量水平的手段主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、以及酶循环表达法等，虽然这些方法具有较高的检测灵敏度，但是它们不仅需要复杂繁琐的样品预处理过程、费时费力、成本昂贵，而且某些毒性的化学试剂会污染大气以及水源，甚至对人体健康造成伤害。尤其是对这些具有活性的生物辅酶来说，复杂的样品预处理极可能影响和破坏它们原有的生物活性。
因此，现有技术存在缺陷，急需改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于探测芳香辅酶NAD+/NADH 的表面增强拉曼散射基底及其制备方法和应用，旨在发展出一种灵敏快捷、简单、低成本的生物辅酶NAD+/NADH的含量水平的探测方法。
本发明是这样实现的，一种用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底的制备方法，所述制备方法包括：
将柠檬酸三钠溶液、硼氢化钠溶液及模板剂溶液混合，得混合液；
在搅拌下向混合液中逐滴加入硝酸银溶液；继续搅拌5～10min，获得所述用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底；
所述模板剂为分子结构中含有苯环的聚合物。
进一步地，所述模板剂为聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐和聚茴脑-磺酸钠中的至少一种。
进一步地，所述聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)的平均分子量为20000，所述聚茴脑-磺酸钠的分子量为9000～11000。
进一步地，所述柠檬酸三钠、硼氢化钠及模板剂的摩尔比为 5～25:1.5～6:0.00375～0.04167。
进一步地，所述柠檬酸三钠溶液的浓度为1～5mM，所述硼氢化钠溶液的浓度为5～20mM，所述模板剂溶液的浓度为300～1500mg L-1。
进一步地，所述硝酸银溶液与所述混合液的摩尔比为 0.5～2.5:6.50375～31.04167；所述硝酸银溶液的浓度为0.1～0.5mM。
本发明还提供了一种表面增强拉曼散射基底，采用上述所述的表面增强拉曼散射基底的制备方法制成。
本发明还提供了一种表面增强拉曼散射基底的应用，所述应用为将上述所述的表面增强拉曼散射基底用于芳香辅酶NAD+/NADH的探测或探测仪器的制备。
本发明与现有技术相比，有益效果在于：本发明实施例提供的用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底(SERS基底)的制备方法，过程简单，易于操作，仅需一步就可以完成，节省了成本，易于推广和应用。本发明制得的表面增强拉曼散射基底——银溶胶为银纳米颗粒，其不仅具有良好的水溶性和颗粒稳定性，不易发生大范围纳米颗粒凝聚现象，而且具有超高的探测灵敏度，能够快速实现芳香族生物辅酶NAD+/NADH的超灵敏检测。
本发明实施例提供的制备方法，在银纳米颗粒合成过程中加入模版剂这一聚合物，该聚合物不但能发挥稳定剂的功效(阻止纳米颗粒发生凝聚)，而且它还携带丰富的芳香族基团，这些可以作为吸附NAD+/NADH的位点。本发明实施例制得的银溶胶在低探测浓度下，基于芳香族基团堆积吸附作用机制， NAD+/NADH的两大芳香族基团烟酰胺和腺嘌呤可以同时捕获2个邻近的纳米颗粒形成二聚体(dimer)。二聚体是一种优秀的SERS热点(hotspots)，它的出现为NAD+/NADH的超灵敏探测提供了有力保证。
附图说明
图1是本发明提供的SERS基底的透射电镜图；
图2是本发明实施例提供的生物辅酶NAD+诱导的纳米二聚体透射电镜图；
图3是本发明实施例1提供的随时间变化的NAD+的SERS (Surface-enhancedRaman spectroscopy，表面增强拉曼散射)光谱图；
图4是本发明实例2提供的不同探测浓度的4,4'-联吡啶的SERS光谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底的制备方法，包括：
将柠檬酸三钠溶液、硼氢化钠溶液及模板剂溶液混合，得混合液；
在搅拌下向混合液中逐滴加入硝酸银溶液；继续搅拌5～10min，获得所述用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底；
所述模板剂为分子结构中含有苯环的聚合物。
本发明实施例提供的用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底(SERS基底)的制备方法，过程简单，易于操作，仅需一步就可以完成，节省了成本，易于推广和应用。本发明制得的表面增强拉曼散射基底——银溶胶为银纳米颗粒，其不仅具有良好的水溶性和颗粒稳定性，不易发生大范围纳米颗粒凝聚现象，而且具有超高的探测灵敏度，能够快速实现芳香族生物辅酶 NAD+/NADH的超灵敏检测。
本发明实施例提供的制备方法，在银纳米颗粒合成过程中加入模版剂这一聚合物，该聚合物不但能发挥稳定剂的功效(阻止纳米颗粒发生凝聚)，而且它还携带丰富的芳香族基团，这些可以作为吸附NAD+/NADH的位点。本发明制得的银溶胶在低探测浓度下，基于芳香族基团堆积吸附作用机制， NAD+/NADH的两大芳香族基团烟酰胺和腺嘌呤可以同时捕获2个邻近的纳米颗粒形成二聚体(dimer)。二聚体是一种优秀的SERS热点(hotspots)，它的出现为NAD+/NADH的超灵敏探测提供了有力保证。
图1为本发明实施例制备的SERS基底的透射电镜图。从图中可以看出，借助于芳香族基团的堆积吸附机制，本发明实施例制备的SERS基底对生物辅酶NAD+/NADH具有很强的吸附性，可以有效改善NAD+/NADH的吸附效率，进而改善SERS信号质量和探测时间，实现对NAD+/NADH的超灵敏探测。此外，进行SERS光谱测量时，所需样品的量很少，仅需100μL样品就可以检测出分子的拉曼特征信号。
图2为本发明实施例中生物辅酶NAD+诱导的纳米二聚体透射电镜图，从图中可以看出其颗粒表征状况，也验证了纳米颗粒二聚体的存在。本发明实施例提供的表面增强拉曼散射基底的制备方法，制得的表面增强拉曼散射基底用于生物辅酶NAD+/NADH的探测时，生物分子NAD+的探测浓度达到纳摩尔量级(5nM)。其中，图3为在超低浓度下(5nM)，本发明实施例中的银纳米二聚体随时间变化的NAD+SERS光谱图，从图中也可以证明本发明实施例实现了生物辅酶NAD+/NADH的超灵敏探测。
具体地，所述模板剂为聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐和聚茴脑-磺酸钠中的至少一种。所述聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)的平均分子量为20000，所述聚茴脑-磺酸钠的分子量为 9000～11000。
具体地，所述柠檬酸三钠、硼氢化钠及模板剂的摩尔比为 5～25:1.5～6:0.00375～0.04167，优选为12.5:3:0.00625。
具体地，所述柠檬酸三钠溶液的浓度为1～5mM，所述硼氢化钠溶液的浓度为5～20mM，所述模板剂溶液的浓度为300～1500mg L-1。
具体地，所述硝酸银溶液与所述混合液的摩尔比为 0.5～2.5:6.50375～31.04167，优选为2.5:15.50625；所述硝酸银溶液的浓度为 0.1～0.5mM。
本发明实施例还提供了一种表面增强拉曼散射基底，采用上述所述的表面增强拉曼散射基底的制备方法制成。
芳香族生物辅酶(NAD+/NADH)是含有π电子系统的分子，其分子结构含有 2个芳香族基团(烟酰胺和腺嘌呤)，并且这两个芳香基团由一个柔性的磷酸酯键桥链接而成，这也就使生物辅酶(NAD+/NADH)分子架构具有一定的柔性，该柔性架构会诱使生物辅酶(NAD+/NADH)在纳米金属表面产生不同的构象。生物辅酶NAD+/NADH具有柔性分子结构，并且其两大特征官能团(烟酰胺和腺嘌呤)可以通过芳香族基团堆积吸附机制捕获2个邻近的纳米颗粒，进而形成银二聚体。该银二聚体物理模型作为优秀的表面增强拉曼散射基底，为生物辅酶NAD+/NADH的超灵敏探测提供了有力的保证。本发明针对生物辅酶 NAD+/NADH的自身特性，利用芳香族基团堆积吸附作用机制改善生物辅酶 NAD+/NADH的被吸附效率。
首先，芳香族基团堆积吸附作用作为发生于分子间的一种非共价相互作用，广泛存在于大量的生物与非生物系统之中。通过设计和制备SERS基底，即能够快速有效吸附生物辅酶NAD+/NADH的SERS基底。该SERS基底不仅具有良好的水溶性和颗粒稳定性，而且具有超高的探测灵敏度，能够快速实现芳香族生物辅酶NAD+/NADH的超灵敏检测。
本发明实施例还提供了一种表面增强拉曼散射基底的应用，所述应用为将上述所述的表面增强拉曼散射基底用于芳香辅酶NAD+/NADH的探测或探测仪器的制备。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
实施步骤如下：
1、新型SERS基底制备
在室温下，将5mL 2.5mM柠檬酸三钠溶液、300μL 10mM新鲜硼氢化钠溶液以及250μL 500mg L-1PSS-MA溶液混合均匀；在剧烈搅拌下，逐滴加入 5mL 0.5mM硝酸银溶液(5mL/2min)，滴加完毕以后，继续搅拌10分钟后至反应完全，制得黄色水溶性银胶。在此步骤，需要强调的是，所用的新鲜硼氢化钠溶液需现做现配，目的是保持硼氢化钠的还原性。
2、配置不同浓度NAD+水溶液
采用万分之一的电子天平准确一定量的NAD+固体样品溶于超纯水中，配制初浓度1mM NAD+溶液。为了减小实验误差，采用十倍稀释的方法分别配成 100μM、10μM、1μM、100nM、10nM等一系列不同浓度的溶液。
3、取200μL步骤1制备的纳米银颗粒分别与10nM NAD+溶液等体积混合，并且震荡混合均匀后，用涡旋震荡器震荡20s混合均匀后，静置黑暗环境中孵育20分钟。在低探测浓度下，由于纳米颗粒的数目多于生物辅酶分子NAD+的数目，因而两个邻近的银纳米颗粒会被一个生物辅酶分子桥接形成银纳米二聚体。
4、取100μL步骤3制备的混合液，利用透射电镜、原子力显微镜原位成像观测纳米二聚体的存在，并且通过SERS光谱测量实现生物辅酶NAD+的超灵敏探测,结果如图3。
实施例2
本发明的提供的表面增强拉曼散射基底用于芳香族杂环分子4,4'-联吡啶的灵敏探测
实施步骤如下：
1、新型SERS基底制备
在室温下，将5mL 2.5mM柠檬酸三钠溶液、300μL 10mM新鲜硼氢化钠溶液以及250μL 500mg L-1PSS-MA溶液混合均匀；在剧烈搅拌下，逐滴加入 5mL 0.5mM硝酸银溶液(5mL/2min)，滴加完毕以后，继续搅拌10分钟后至反应完全，制得黄色水溶性银胶。在此步骤，需要强调的是，所用的新鲜硼氢化钠溶液需现做现配，目的是保持硼氢化钠的还原性。
2、配置不同浓度4,4'-联吡啶水溶液
采用万分之一的电子天平准确一定量的4,4'-联吡啶固体样品溶于超纯水中，配制初浓度1mM 4,4'-联吡啶溶液。为了减小实验误差，采用十倍稀释的方法分别配成100μM、10μM、1μM、100nM等一系列不同浓度的4,4'-联吡啶溶液。
3、取200μL步骤1制备的纳米银颗粒分别与1mM、100μM、10μM、1μM、 100nM 4,4'-联吡啶溶液等体积混合，并且震荡混合均匀后，用涡旋震荡器震荡20s混合均匀后，静置黑暗环境中孵育20分钟。由于4,4'-联吡啶分子拥有 2个吡啶环，因此它易于该SERS基底发生芳香族基团相互作用，改善4,4'-联吡啶的吸附效率，进而提高其探测灵敏度。
4、取100μL步骤3制备的混合液，并且通过共聚焦拉曼光谱仪收集不同探测浓度下4,4'-联吡啶的SERS光谱,结果如图4所示，此基底可以探测到 50nM的4,4'-联吡啶分子。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将柠檬酸三钠溶液、硼氢化钠溶液及模板剂溶液混合，得混合液；
在搅拌下向混合液中逐滴加入硝酸银溶液；继续搅拌5～10min，获得所述用于探测芳香辅酶NAD+/NADH的表面增强拉曼散射基底；
所述模板剂为分子结构中含有苯环的聚合物。
2.如权利要求1所述的表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，所述模板剂为聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐和聚茴脑-磺酸钠中的至少一种。
3.如权利要求2所述的表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，所述聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)的平均分子量为20000，所述聚茴脑-磺酸钠的分子量为9000～11000。
4.如权利要求1所述的表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸三钠、硼氢化钠及模板剂的摩尔比为5～25:1.5～6:0.00375～0.04167。
5.如权利要求1所述的表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸三钠溶液的浓度为1～5mM，所述硼氢化钠溶液的浓度为5～20mM，所述模板剂溶液的浓度为300～1500mg L-1。
6.如权利要求1所述的表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，所述硝酸银溶液与所述混合液的摩尔比为0.5～2.5:6.50375～31.04167；所述硝酸银溶液的浓度为0.1～0.5mM。
7.一种表面增强拉曼散射基底，其特征在于，采用权利要求1至6任意一项所述的表面增强拉曼散射基底的制备方法制成。
8.一种表面增强拉曼散射基底的应用，其特征在于，所述应用为将权利要求7所述的表面增强拉曼散射基底用于芳香辅酶NAD+/NADH的探测或探测仪器的制备。
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