CN107532192A - 用于设计靶向高化学计量复合物从而治疗疾病的化合物和组合物的方法 - Google Patents

用于设计靶向高化学计量复合物从而治疗疾病的化合物和组合物的方法 Download PDF

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Abstract

描述了一种用于鉴别多亚基生物复合物药物靶点的方法。该方法包括鉴别执行生物学功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被灭活以阻止该生物学功能。该方法还包括选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物。该方法还包括使用二项分布描述所述药物的抑制效率与所述一个或多个亚基的总数之间的关系，其中所述抑制效率包括所递送的药物阻止所述生物学功能的概率。该方法还包括使用实验靶点来经验证实所述关系。该方法包括将所述药物施用于所述靶点以治疗多重耐药性疾病，其中，所述靶点包含哺乳动物受试者中的生物复合物。

Description

用于设计靶向高化学计量复合物从而治疗疾病的化合物和组 合物的方法
本申请要求于2015年5月7日提交的专利申请号62/158,114的美国临时专利申请的优先权，该申请的“整体披露”通过引用整体并入本文。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物通过引用整体并入本文。这些出版物的全部内容通过引用并入本申请中，以便更全面地描述本领域技术人员在本文描述和要求保护的本发明的日期所已知的现有技术状态。
该专利公开包含受版权保护的材料。版权所有者不反对在美国专利商标局专利文件或记录中出现的任何专利文献或专利披露的任何人的传真复制，否则保留任何和所有版权。
政府利益
本发明是在由国立卫生研究院授予的EB012135、EB003730和CA151648政府支持下进行。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
细菌、病毒和细胞含有由多个亚基组成的生物复合物和纳米机器，所述亚基例如生物马达(biomotors)[1，2，3，4]、泵[5]、外来体[6，7，8]、瓣膜[9，10，11]、膜孔[12，13，14，15]、伴侣蛋白[16]、PCNA[17]、ATP酶[18，19]和管[20]。从纳米生物技术的角度来看，这些纳米机器可以被使用和转换，以构建复杂的纳米器件，包括分子传感器[21，22，23]、图案阵列、致动器[24]、芯片、微机电系统(MEMS)[25]、分子分类机[26]、单孔DNA测序装置[12，13，21，27]或其他革命性的电子和光学装置[28，29]。从药物观点来看，这些多亚基生物复合物或纳米机器具有用作药物靶点的潜力，用于治疗以及诊断应用，例如病原体检测、疾病诊断、药物递送和疾病治疗[22，23，30，31]。在包括AAA+(与不同细胞活性相关的ATP酶)的ASCE(附加链催化E)家族以及细菌、病毒和细胞中的FtsK-HerA超家族中，存在具有广泛功能的纳米马达(nanomotors)[19，32，33]，其对染色体分离、细菌二分裂、DNA/RNA和细胞成分转运、膜分选、细胞重组、细胞分裂、RNA转录以及DNA复制、骑乘、修复和重组至关重要[1，34，35，36]。NIH路线图的一个方向是利用这些细胞纳米机器和生物复合物进行生物医学应用。
获得性耐药性已经成为一系列疾病(即癌症、细菌或病毒感染的化疗)治疗失败的主要原因。癌症的耐药性升高，并在2012年在美国造成了600,000人死亡[37]。艾滋病毒耐药性也已经成为主要问题[38]。许多常贝的病原体会对当前的药物治疗产生抗药性，新型传染病越来越多。在生物武器中使用多重耐药制剂造成了以前未实现的挑战[39]。因此，需要制定新的治疗策略，以新的药物开发方法对抗耐药性。
第一个FDA批准的用于治疗多重耐药结核病的药物，贝达喹啉(bedaquiline)，遵循抑制结核分枝杆菌和其他分枝杆菌种细菌ATP合成酶的新机制，但对其他细菌几乎没有活性[40]。为了对抗癌症中的多重耐药性，已经探索了几种方法。一种方法是针对生物实体生长高度重要的成分[41，42]为靶点。另一种方法使用纳米药物递送载体，期望该载体增强药物对癌细胞的结合效率[43，44，45，46]，或使用鸡尾酒疗法[47]。第三种方法是开发新的组合药物，通过作用于多个靶点而具有更高的效力[48，49]。这涉及在治疗时识别多个靶点以产生协同效应，还涉及优化多靶点配体的设计[50]。
通过靶向具有高化学计量的蛋白质或RNA复合物来开发高效药物的方法未见报道，因为在比较两种药物的效力方面存在挑战，可能会将靶点必需性(essentiality)与结合亲和力相混淆。例如，如果两种药物靶向两个化学计量不同的靶点，则难以证明药物效能的差异是否是由于靶点结合亲和力的差异所致还是由于其生物有机体生长中的基本水平的差异所致。为了量化针对不同化学计量的生物复合物的效应，需要经过充分研究的多组分系统，其允许实验比较由不同数量的亚基组成的各组分的功能抑制。
一个纳米机器人的例子是双链DNA(dsDNA)易位马达，其中ATP酶蛋白质是组装成六聚体环结构的关键组分，并将ATP结合和水解的作用转化为机械运动以物理位移DNA。噬菌体phi29(图1A)[9，51，52，53]的DNA包装马达由三个基本的同轴环组成：1)位于病毒原壳体的顶点的十二聚体连接环；2)结合到连接器的N端的六聚体包装RNA(pRNA)环[52]，以及3)连接到pRNA的螺旋区域的ATP酶gp16的六聚体环[10，19，55]，通过ATP的水解导致DNA包装。1997年首次报道了使用杨辉(Yang Hui)三角形(图1B)或二项分布来确定pRNA的化学计量[56]。近来已经报道了使用类似的数学方法来确定蛋白质亚基的化学计量[51]。包装一个完整的phi29基因组dsDNA所需的ATP分子的拷贝数预测为10000[57]。最近已经表明，这种六聚体马达利用无自转的公转机制来易位其基因组DNA[10，19，33，35，36，58，59]。
在此，本发明人提出药物的抑制效率与其靶向的生物复合物的化学计量相关；目标复合物的化学计量越高，药物越有效。这可以导致开发以高化学计量生物机器或生物复合物作为药物靶点的有效治疗方法。
在此所描述的本发明所采用的方法，使用突变体亚基作为药物化的无活性靶标，通过二项分布计算理论抑制效率，并与来自所定义的体外病毒装配系统的实验数据进行比较。由于生物马达具有一定的共同结构和操作机制[1，36，59，60]，本文报道的药物开发方法尤其适用于开发新一代药物以抵抗病毒、细菌和癌症中日益增长的获得性耐药性[38，61，62]。
发明内容
对于本领域普通技术人员来说，在研究了本文中提供的信息之后，显然本公开的主题满足上述一些或所有需求。
本文公开了一种方法，用于设计通过靶向高化学计量复合物来治疗病症的化合物，其可用于例如设计抵抗具有获得耐药性的病毒、细菌和癌症的药物。
如本文所述，使用Phi29DNA包装马达组分来测试与不同化学计量的靶点相关的使用方法。杨辉三角测定病毒组装效率：
其中Z＝化学计量，M＝每个生物复合物中被药物化的亚基，p和q代表群体中被药物化的和非药物化的亚基的分数。
如本文所报道，抑制效率遵循幂函数。当抑制生物复合物功能的药物化亚基数K＝1时，不受抑制的生物复合物的分数等于qZ。因此，化学计量对抑制具有乘法效应。具有一千个亚基的测试靶点显示出最高的抑制作用，其次是具有六个亚基和单个亚基的那些。当Z＝6时，发现完全抑制病毒复制。
如本文所公开的，药物抑制效力取决于所靶向的生物复合物或纳米机器的组分的化学计量。抑制效应遵循靶点生物复合物的化学计量的幂函数。
附图简要说明
本发明的特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考下面的详细描述，可以更好地理解本发明的特征和优点，详细描述了使用本发明的原理的说明性实施例，附图中：
图1A-1F显示病毒DNA包装马达的化学计量
图1A是Phi29DNA包装马达的图示，由以下组成：1份通过通道壁旋转的基因组DNA(左图)，6个拷贝的pRNA，6个拷贝的ATP酶gp 16和一个连接子通道。
图1B是杨辉三角。
图1C是Z＝6和K＝1的图示，靶向复合物的任何一个亚基的药物将阻止其活性。
图1D是六聚体重新设计的pRNA环的AFM图像。
图1E是六聚体pRNA环的3D结构，从3WJ晶体结构观察的顶视图和侧视图(PDB ID：pRNA 3WJ，4KZ2)。
图1F是AAA+蛋白质CbbX的晶体六聚体结构，示出了顶视图和侧视图[85](PDB ID：CbbX，3Zuh，http：//www，ebi.ae.uk/pdbe/emdb/)。
图1G是具有衔接蛋白MecA的六聚体AAA+分子机器CIpC的结构。(PDB ID：MecA-ClpC，3PXG)。
图2A-2C显示了一个理论图(具有变量Z)和实验数据，说明靶向基因组DNA的药物的抑制效率(Z-1)。
图2A是显示用内切核酸酶EcoR1处理的phi29基因组DNA的凝胶。
图2B是衍生自二项式分布方程式2的病毒体组装的图，其显示DNA的化学计量为1。
图2C是Z＝1时突变体DNA作为药物化组分模型的病毒组装抑制作用，以低斜率呈现与p的线性关系。
图3A-3C是理论图(K＝1到6)和实验数据，说明靶向pRNA的药物的抑制效率(Z＝6)。
图3A是phi29DNA包装马达的野生型pRNA的序列和二级结构(上图)，以及无活性突变体pRNA(下图)，其在DNA易位区的5′端有4个碱基突变，作为被药物作用的无活性pRNA的模型。
图3B是通过无活性突变体pRNA获得的噬菌体组装抑制结果与从方程式2导出的理论图的拟合，符合Z＝6和K＝1。
图3C比较了不同浓度的被药物作用的pRNA与具有相同稀释因子的未被药物作用的pRNA的病毒组装抑制作用。
图4A-4B显示了由突变体pRNA作为被药物作用的复合物的模型在体内对病毒装配的完全抑制(Z＝6)。
图4A显示通过在3′末端引入4核苷酸突变而使pRNA失活。
图4B显示由野生型phi29感染导致的病毒体产生，使用携带表达突变体pRNA的质粒、携带野生型pRNA或仅携带质粒的宿主细胞枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
图5A-5C显示了使用具有不同Z值的靶点的抑制效率的比较。
图5A显示不同浓度突变体gp16(Z＝6)的病毒体产生抑制作用。
图5B显示y-s-ATP与具有高Z值的ATP的抑制效率。
图5C比较了DNA、pRNA、gp16和ATP的被药物作用的组分的病毒组装抑制作用，化学计量分别为1、6、6、10000。
图6显示了化学计量(Z)和达到抑制作用(IC)的药物靶向水平之间的关系(药物结合效力和药物浓度的综合结果)。
图7A-7C显示了Phi29DNA包装马达的形态和化学计量。
图7A示出了Phi29DNA包装马达，其由以下组成：1拷贝的通过由三个同轴环组成的通道的基因组DNA、12亚基连接子、6亚基pRNA、6亚基ATP酶gp16。
图7B显示了二项式分布方程，其系数由杨辉三角显示。
图7C显示Z＝6和K＝1时，靶向六聚体复合物的任何亚基阻止其功能。
图8显示了同源靶点复合物的化学计量(Z)和靶点复合物抑制作用(IC)之间的关系。
图9比较了Phi29病毒组装抑制效率，通过靶向具有不同化学计量的系统的组分(左图)、化学计量为1的DNA、化学计量为6的ATP酶gp16(右上图)、化学计量为6的pRNA(右下图)和化学计量为10,000的ATP。参考文献[13]经许可。
图10A-10D显示由多亚基复合物组成的广泛的生物马达或纳米机械。
图10A示出了自转纳米机器DnaB解旋酶，其是六聚体[69](PDB ID：4ESV)。
图10B显示自转纳米机械RecA马达蛋白，其是六聚体[72](PDB ID：1N03)。
图10C显示公转(revolution)Phi29DNA包装马达，其含有六聚体pRNA[58]。
图10D显示公转DNA马达蛋白FtsK，其是六聚体[87](PDB ID：21UU)。
图11A-11D显示了同源(homomeric)多亚基复合物作为药物靶点用于开发有效药物的实例。
图11A显示了四聚体bpFabl。四聚体bpFablis是细菌脂肪酸合成中的关键酶，抑制剂PT155与BpmFabI[31](PDB ID：4BKU)形成四聚体复合物。
图11B显示肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)[32](PDB ID：1AK5)。肌苷单磷酸脱氢酶是鸟嘌呤核苷酸生物合成途径的关键酶，已经开发出靶向四聚体IMPDH的抑制剂。
图11C显示细菌多药外排转运体AcrB，其形成同型三聚体[91](PDB ID：IIWG)。
图11D显示了来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的多药输出体MexB，其形成同型三聚体[92](PDB ID：2V50)。
图12A-12F显示病毒DNA包装马达的化学计量。
图12A是Phi29DNA包装马达的图示，其由以下组成：旋转通过通道壁的1拷贝的基因组DNA(左图)、6拷贝的pRNA、6拷贝的ATP酶gp16和连接子通道。
图12B是杨辉三角形。
图12C是Z＝6和K＝1时，靶向复合物的任何一个亚基的药物将阻断其活性的图示。
图12D是六聚体重新设计的pRNA环的AFM图像。
图12E是六聚体pRNA环的3D结构，从3WJ晶体结构观察的顶视图和侧视图(PDB ID：pRNA 3WJ，4KZ2)。
图12F是AAA+蛋白质CbbX的晶体六聚体结构，示出了顶视图和侧视图(PDB ID：CbbX，3Zuh，http：//www.ebi.ae.uk/pdbe/emdb/)。
图12G是具有衔接蛋白MecA的六聚体AAA+分子机器C1pC的结构。(PDB ID：MecA-C1pC，3PXG)。
图13A-13C示出了理论图(具有变量Z)和实验数据，说明靶向基因组DNA的药物的抑制效率(Z-1)。
图13A是显示用内切核酸酶EcoR1处理的phi29基因组DNA的凝胶。
图13B是从二项式分布方程式2得到的病毒体组装的图，其显示DNA的化学计量为1。
图13C是Z＝1时突变体DNA作为被药物作用组分的模型的病毒组装抑制作用，以低斜率呈现与p的线性关系。
图14A-14C是理论图(K＝1到6)和实验数据，说明靶向pRNA的药物的抑制效率(Z＝6)。
图14A是phi29DNA包装马达的野生型pRNA的序列和二级结构(上图)，和无活性突变体pRNA(下图)，其在DNA易位区的5′端具有4个碱基突变，作为被药物作用的无活性pRNA的模型。
图14B是通过无活性突变体pRNA导致的噬菌体组装抑制结果与从方程式2导出的理论图的拟合，符合Z＝6和K＝1。
图14C比较了不同浓度的被药物作用的pRNA与具有相同稀释因子的未被药物作用的pRNA的病毒组装抑制作用。
图15A-15B显示了由突变体pRNA作为药物化复合物的模型对体内病毒装配的完全抑制(Z＝6)。
图15A显示通过在3′末端引入4核苷酸突变而使pRNA失活。
图15B显示由野生型phi29感染导致的病毒体产生，使用携带表达突变型pRNA的质粒、携带野生型pRNA或仅携带质粒的宿主细胞枯草芽孢杆菌。
图16A-16C显示了使用具有不同Z值的靶标的抑制效率的比较。
图16A显示不同浓度突变体gp16(Z＝6)的病毒体产生抑制作用。
图16B显示具有高Z值的ATP的y-s-ATP抑制效率。
图16C比较了DNA、pRNA、gp16和ATP的被药物作用的组分的病毒组装抑制作用，化学计量分别为1、6、6、10000。
图17显示化学计量(Z)与达到抑制作用(IC)的药物靶向水平(药物结合效率与药物浓度的综合结果)之间的关系。
示例性实施方式详述
下面的公开内容包括第1节(其包括上述引言和图1-6的描述)，第2节(其包括上述图7-11的描述)和第3节(其包括上述图12-17的描述)。各部分公开了用于设计化合物和组合物的系统、装置和方法，如下文进一步描述。
第1节
本文中阐述了本公开主题的一个或多个实施例的细节。在对本文档中提供的信息进行研究之后，本文档和其他实施例中描述的实施例的修改对于本领域普通技术人员将是显而易见的。本文档中提供的信息，特别是所描述的示例性实施例的具体细节主要用于清楚理解，并且不从其中理解不必要的限制。发生冲突的情况下，受本文件的说明书(包括定义)的控制。
目前公开的主题包括用于设计化合物或组合物的方法，所述化合物或组合物用于治疗具有获得性耐药性的病毒、细菌或癌症，所述方法涉及识别所述病毒或细菌的多亚基生物复合物，其与主体物种中的其他生物复合物不同，或者选择癌症的含有突变的多亚基生物复合物；并设计药物以靶向所述生物复合物的亚基。本发明人惊奇地确定药物的抑制效率与其所靶向的生物复合物的化学计量相关；目标复合物的化学计量越高，药物效率越高。
这可以导致开发以高化学计量生物机器或生物复合物为药物靶标的有效疗法。使用本文所述的方法，使用突变亚基作为被药物作用的无活性靶标，通过二项分布计算理论抑制效率，并与从定义的体外病毒装配体系获得的实验数据进行比较。
本文报道的药物开发方法具有一般应用，特别是用于开发新一代药物以抵抗病毒、细菌和癌症中日益增长的获得性耐药性。
本文公开了一种用于设计可通过靶向高化学计量复合物来治疗病症的化合物的方法，其可用于例如设计用于抵抗具有获得性耐药性的病毒、细菌和癌症的药物。
其中Z＝化学计量，M＝每个生物复合物中的药物化亚基，p和q代表群体中药物化和非药物化的亚基的分数。
本文公开了用于设计和/或鉴定对于可以通过靶向高化学计量复合物来治疗病症有用的化合物的方法，其可用于例如设计和/或鉴定抵抗具有获得性耐药性的病毒、细菌和癌症的药物。在一些实施方案中，本文所设计或鉴定的化合物可以是抗体、反义寡核苷酸、miRNA、短发夹RNA、小肽等，预期其针对纳米机器(例如，生物马达或生物复合物)的组分或亚基。可用于结合目标化合物的其他试剂包括：蛋白质、适体、LNA、化合物和多糖。
在一个实施方案中，提供了用于鉴定多亚基生物复合药物靶点的方法。在一个实施例中，该方法包括：
(a)鉴定执行生物学功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被灭活以抑制所述生物学功能；
(b)选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物，其中所述目标概率包括对于每个亚基来说递送至所述靶点的所述药物灭活所述亚基的共同概率；
(c)使用二项分布描述所述药物的抑制效率与所述一个或多个亚基的总数之间的关系，其中所述抑制效率包括所递送的药物阻断所述生物学功能的概率，其中所述抑制效率是根据所述最小数量和所述总数来计算的；
(d)使用实验靶点来经验证实所述关系，其中所述靶点包括所述实验靶点；和
(e)使所述药物与所述靶点接触以治疗多重耐药性疾病，其中所述靶点包含哺乳动物受试者中的生物复合物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物受试者被施用根据本发明的方法鉴定或设计的药物。
在一个实施方案中，提供了提高多聚体生物复合物的抑制效率的方法。在一个实施例中，该方法包括：
(a)识别执行生物功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被灭活以抑制所述生物学功能；
(b)选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物，其中所述目标概率包括对于每个亚基来说递送至所述靶点的所述药物灭活所述亚基的共同概率；
(c)使用二项式分布描述所述药物的抑制效率与所述一个或多个亚基的总数之间的关系，其中所述抑制效率包括所递送的药物阻断所述生物学功能的概率，其中所述抑制效率是根据所述最小数量和所述总数来计算的；
(d)使用实验靶点来经验证实所述关系，其中所述靶点包括所述实验靶点；和
(e)使所述药物与所述靶点接触以治疗多重耐药性疾病，其中所述靶点包含哺乳动物受试者中的生物复合物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物受试者被施用根据本发明的方法鉴定或设计的药物。
在一个实施方案中，提供了优化方法，用于优化以生物复合物化学计量为基础的药物开发。在一个实施例中，该方法包括：
(a)识别执行生物学功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被灭活以抑制所述生物学功能；
(b)选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物，其中所述目标概率包括对于每个亚基来说递送至所述靶点的所述药物灭活所述亚基的共同概率；
(c)使用二项式分布描述所述药物的抑制效率与所述一个或多个亚基的总数之间的关系，其中所述抑制效率包括所递送的药物阻断所述生物学功能的概率，其中所述抑制效率是根据所述最小数量和所述总数来计算的；
(d)使用实验靶点来经验证实所述关系，其中所述靶点包括所述实验靶点；和
(e)使所述药物与所述靶点接触以治疗多重耐药性疾病，其中所述靶点包含哺乳动物受试者中的生物复合物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物受试者被施用根据本发明的方法鉴定或设计的药物。
在一个实施方案中，提供了靶向高化学计量生物复合物以提高药物靶向效率的方法。在一个实施例中，该方法包括：
(a)识别执行生物学功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被灭活以抑制所述生物学功能；
(b)选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物，其中所述目标概率包括对于每个亚基来说递送给所述靶点的所述药物使所述亚基失活的共同概率；
(c)使用二项式分布描述所述药物的抑制效率与所述一个或多个亚基的总数之间的关系，其中所述抑制效率包括所递送的药物阻断所述生物学功能的概率，其中所述抑制效率是根据所述最小数量和所述总数来计算的；
(d)使用实验靶点来经验证实所述关系，其中靶点包括所述实验靶点；和
(e)使所述药物与所述靶点接触以治疗多重耐药性疾病，其中所述靶点包含哺乳动物受试者中的生物复合物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物受试者被施用根据本发明的方法鉴定或设计的药物。
在一个实施方案中，提供了治疗患有多重耐药性疾病的受试者的方法。在一个实施例中，该方法包括：
(a)识别执行生物学功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被灭活以抑制所述生物学功能；
(b)选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物，其中所述目标概率包括对于每个亚基来说递送给所述靶点的所述药物灭活所述亚基的共同概率；
(c)使用二项分布描述所述药物的抑制效率与所述一个或多个亚基的总数之间的关系，其中所述抑制效率包括所递送的药物阻断所述生物学功能的概率，其中所述抑制效率是根据所述最小数量和所述总数来计算的；
(d)使用实验靶标来经验证实所述关系，其中所述靶点包括所述实验靶标；和
(e)使所述药物与所述靶点接触以治疗多药耐药性疾病，其中所述靶点包含哺乳动物受试者中的生物复合物。在另一实施例中，所述哺乳动物受试者被施用根据本发明的方法鉴定或设计的药物。
在本发明的一些实施方案中，所述实验靶点包括多聚体生物复合物的组分或亚基。
多聚体生物复合物的非限制性实例包括受体、通道、酶和转运蛋白。在其他实施例中，所述实验靶点包括生物纳米马达的组分或亚基。生物纳米马达的非限制性实例包括线性马达、自传(rotation)马达和公转(revolution)马达。在另外的实施方案中，所述生物纳米马达还包含ATP酶组分。在一些实施方案中，生物纳米马达是噬菌体Phi29DNA包装马达。如本文所讨论的，所述噬菌体Phi29DNA包装马达包含基因组dsDNA组分、包装RNA组分、ATP酶gp16组分、ATP组分或其组合。
在一个实施方案中，所述生物马达或多聚体生物复合物是同源的。在另一个实施方案中，所述生物马达或多聚体生物复合物包含二聚体、异低聚物(hetero-oligomer)或均低聚物(homo-oligomer)。在一些实施方案中，包含所述生物马达或多聚体生物复合物的组分或亚基的数量为至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，80，90或100。在一些实施例中，包含所述生物马达或多聚体生物复合物的组分或亚基的数量为至少100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000，9000或10,000。在一些实施方案中，包含所述生物马达或多聚体生物复合物的组分或亚基的数量为至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12。例如，所述噬菌体Phi29DNA包装马达包含1拷贝的基因组双链DNA，并且这种拷贝包含亚基(例如，1个靶点亚基)。例如，所述噬菌体Phi29DNA包装马达包含6个拷贝的包装RNA，并且这些拷贝包含亚基(例如6个靶点亚基)。例如，所述噬菌体Phi29DNA包装马达包括6拷贝的gp16，并且这样的拷贝包含亚基(例如，6个靶点亚基)。例如，所述噬菌体Phi29DNA包装马达包含10,000拷贝的ATP，并且这样的拷贝包含亚基(例如，10,000个靶点亚基)。
如本文所用并且如本领域中所熟知的那样，“治疗”是一种获得有益或期望的结果的方法，包括临床结果。有益或期望的临床结果可以包括但不限于一种或多种症状或病症的缓解或改善，疾病程度的减少，疾病的稳定状态(即不恶化)，预防疾病传播，延迟或减缓疾病进展，疾病状态的改善或减轻以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以指延长生存期，与不接受治疗的预期生存期相比。
术语“有需要”是指病症的有症状或无症状的缓解的需要，所述病症是与多药耐药相关的病症，例如癌症，和/或与多重耐药性生物体引起的多药耐药性疾病相关的病症。有需要的受试者可能正在接受或未接受针对病症的治疗，所述病症涉及例如癌症，和/或与多重耐药性生物体引起的多重耐药性疾病相关的病症。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者。在一些方面，哺乳动物受试者是人，狗，猫，鸟，猪，马或牛。在某些实施方案中，哺乳动物受试者是人。
多药耐药性疾病可由多重耐药性生物体引起。该多重耐药性生物体不再对以下治疗起反应：抗生素组合物治疗，抗真菌组合物治疗，抗病毒组合物治疗或抗寄生虫组合物治疗。在一个实施方案中，所述多重耐药性生物体是细菌，真菌，维生素或寄生虫。多重耐药细菌的非限制性实例包括葡萄球菌(staphylococcus)，肠球菌属(enterococcus)，球菌属种(gonococcus)，链球菌属(streptococcus)，不动杆菌属(Acinetobacter)，肠杆菌属(enterobacter)，克雷伯氏菌属(klebsiella)，沙门氏菌属(salmonella)，埃希氏菌属(Escherichia)，假单胞菌属(pseudomonas)和分枝杆菌属(mycobacterium)。多重耐药真菌的非限制性实例包括念珠菌属(candida)和丝孢菌属(scedosporium)。多重耐药病毒的非限制性实例包括HIV，流感，巨细胞病毒和单纯疱疹病毒。多重耐药寄生虫的非限制性实例包括疟原虫种类，弓形虫种和蛔虫种。
本公开一般涉及可用于的小分子治疗剂，用于治疗由多重耐药性生物体引起的多重耐药性癌症或多重耐药性疾病。在一个实施方案中，将根据本文所述的方法鉴定或设计的药物施用于受试者以预防或治疗与多重耐药性生物体引起的多重耐药性癌症或多重耐药性疾病相关的疾病或病症。在一个实施方案中，将有效量的根据本文所述方法鉴定或设计的药物施用于受试者。在一些实施方案中，根据本文所述的方法鉴定或设计的药物包含药物组合物，其通过药学上可接受的载体被施用于受试者。在一些实施方案中，根据本文所述的方法鉴定或设计的药物可以用作治疗多药耐药性癌症或由多重耐药性生物体引起的多重耐药性疾病的治疗方法。
本发明的实施方案可用于治疗多重耐药性癌症或由多重耐药性生物体引起的多重耐药性疾病。可能受益于本发明实施方案的疾病、病症和/或疾病的非限制性实例可包括由万古霉素抗性肠球菌引起的疾病，结核病，肺炎，由耐甲氧西林葡萄球菌引起的疾病，癌症，食物中毒，军团病，酵母菌感染，疟疾和蠕虫病。
根据本文所述的方法鉴定或设计的药物可以在药物组合物中使用，通过向合适的药学上可接受的稀释剂或载体中加入有效量的化合物。本发明的药物化合物和方法的使用也可以是预防用途。
本文使用的“有效量”，“足够量”或“治疗有效量”为足以产生有益或期望结果的组合物的量，所述结果包括临床结果。因此，有效量可以是足够的，例如，以减轻或改善痛苦或病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间，防止与痛苦或病症相关的病症的进展，防止复发、发展或发生一种或多种与病痛或病症相关的症状，或增强或以其他方式改善另一种疗法的预防或治疗效果(一种或多种)。有效量还包括避免副作用或基本上减弱不期望的副作用的组合物的量。
术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介。这种药物载体的非限制性实例包括液体，例如包括石油、动物、植物或合成来源的水和油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物载体也可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。此外，可以使用辅助剂，稳定剂，增稠剂，润滑剂和着色剂。合适的药物载体的其它实例描述于Remington：“药学科学与实践”，第21版(费城科学大学，编辑Lippincott Williams Wilkins，2005)；和“药用辅料手册(Handbook of PharmaceuticalExcipients)”，第7版(Raymond Rowe等人，ed.，Pharmaceutical Press 2012)；其全部内容通过引用并入本文。
术语“药学上可接受的盐”是指生理上和药学上可接受的本发明化合物的盐：即保留母体化合物所需的生物活性并且不会对其产生不希望的毒理作用的盐。药学上可接受的载体可以包含与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的使用是本领域公知的。可以使用与活性化合物相容的任何常规介质或试剂。补充的活性化合物也可以并入组合物中。对于寡核苷酸化合物，药学上可接受的盐及其用途的实例进一步描述于美国专利6,287,860，其全部内容通过引用并入本文。
本发明的实施方案可以单独施用，也可以是以治疗性鸡尾酒或药物组合物施用。例如，药物组合物可以包括本发明的实施方案和包含磷酸盐缓冲液的盐溶液。本发明的实施方案可以使用本文所述的方法和剂量进行施用。本发明的实施方案可以与合适的载体组合施用。在一个实施方案中，根据本文所述的方法鉴定或设计的药物包括任何药学上可接受的盐，酯或这些酯的盐，或任何其它化合物，其在施用给予受试者时提供(直接或间接)生物活性的代谢物或其残基。
将本发明的药物组合物配制成与其预期的给药途径相容。给药途径的实例包括肠胃外(例如静脉内)，皮内，皮下，口服(例如吸入)，透皮(局部)，经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水，盐水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调整张力的试剂如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱调节pH，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以包封在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多剂量小瓶中。
适用于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中为水溶性)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水，抑菌水，克列莫佛(cremophor)EMTM(BASF，帕西波尼市，N.J。)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是易于注射的程度的流体。在制造和储存的条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是例如含有以下物质的溶剂或分散介质：水、乙醇、药学上可接受的多元醇如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇及其合适的混合物。可以通过例如使用诸如卯磷脂的涂层来维持适当的流动性，或在分散体的情况下通过维持所需的粒度来维持适当的流动性，以及使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸和硫柳汞来实现。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂是有用的，所述等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂来实现，例如，单硬脂酸铝和明胶。
无菌可注射溶液可以这样制备：将所需量的化合物掺入在适当的溶剂中，根据需要使用本文列举的成分之一或组合，然后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体来制备分散体，所述无菌载体含有碱性分散介质和来自本文列举的所需的其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，有用的制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥，其从预先无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以封闭在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗给药的目的，活性化合物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。也可以使用用作漱口水的流体载体制备口服组合物，其中流体载体中的化合物被口服施用并漱口和吐出或吞咽。
药学上相容的结合剂和/或辅助材料可以作为组合的一部分。片剂，丸剂，胶囊剂，锭剂等可以含有以下成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如藻酸、凝胶或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁；助滑剂例如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂。
全身给药也可以通过经粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适合渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的，并且例如对于经粘膜给药，包括洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于透皮给药，将活性化合物配制成本领域通常已知的软膏，药膏，凝胶或霜剂。
用于局部给药的制剂包括这样的制剂：在该制剂中根据本文所述的方法鉴定或设计的药物与外用递送剂混合，外用递送剂如脂质，脂质体，脂肪酸，脂肪酸酯，类固醇，螯合剂和表面活性剂。示例性脂质和脂质体包括中性的(例如二醇乙酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，二焦磷酸胆碱胆碱)，阴性的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG))和阳离子型的(例如二醇乙酰基四乙基一氨基丙基(DOTAP))和二醇乙酰基-磷脂酰乙醇胺(DOTMA))。对于局部或其他给药，根据本文描述的方法鉴定或设计的药物可以包封在脂质体内或者可以与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体形成复合物。或者，根据本文所述的方法鉴定或设计的药物可以与脂质，特别是与阳离子脂质复合。示例性的脂肪酸和酯，其药学上可接受的盐及其用途进一步描述于美国专利6,287,860，其全部内容通过引用并入本文。
治疗组合物的制剂及其随后的给药(剂量)被认为在本领域技术人员能力范围之内。剂量取决于待治疗的疾病状态的严重性和反应性，治疗过程持续数天至数月，或直至治愈或疾病状态减少为止。最佳剂量方案可以通过患者体内药物积累的测量结果来计算。普通技术人员可以容易地确定最佳剂量，给药方法和重复率。最佳剂量可以根据本文所述的方法鉴定或设计的药物的相对效力而变化，并且通常可以基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC 50来估计。在一些实施方案中，治疗有效量为至少约0.1mglkg体重，至少约0.25mg/kg体重，至少约0.5mg/kg体重，至少约0.75mg/kg体重，至少约1mg/kg体重，至少约2mg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约4mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，至少约6mg/kg体重，至少约7mg/kg体重，至少约8mg/kg体重，至少约9mg/kg体重，至少约10mg/kg体重，至少约15mg/kg体重，至少约20mg/kg体重，至少约25mg/kg体重，至少约30mg/kg体重，至少约40mg/kg体重，至少约50mg/kg体重，至少约75mg/kg体重，至少约100mg/kg体重，至少约200mg/kg体重，至少约250mg/kg体重，至少约300mg/kg体重，至少约350mg/kg体重，至少约400mg/kg体重，至少约450mglkg体重，或至少约500mg/kg体重。
在一个实施方案中，根据本文所述的方法鉴定或设计的药物可以一次给予受试者(例如，作为单次注射或沉积)。或者，向有需要的受试者每天给药一次或两次，给药持续约2至28天，或约7至10天，或约7至约15天。也可以每天向受试者给药一次或两次，给药持续时间为每年1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12次或其组合。例如，剂量可以每天、每周、每月或每年一次或更多次，甚至每2至20年一次。在一个实施方案中，根据本文所描述的方法鉴定或设计的药物的两种或更多种组合、治疗剂等可以组合使用或依次使用。剂量可以根据已知的因素而变化，例如：活性成分的药效学特征及其施用方式和途径；活性成分的给药时间；受试者的年龄，性别，健康和体重；症状的性质和程度；并行的治疗方法，治疗频率和预期效果；和排泄率。基于测量药物在体液或者组织中的停留时间和浓度，本领域普通技术人员可以容易地预估剂量的重复率。治疗成功后，可能需要使患者进行维持治疗以预防疾病状态的复发，其中根据本文所述方法鉴定或设计的药物以维持剂量施用，范围为至少约0.1mg/kg体重至约10mg/kg体重，从至少约0.1mg/kg体重至约20mg/kg体重，从至少约0.1mg/kg体重至约30mg/kg体重，至少约0.1mg/kg体重至约40mg/kg体重，至少约0.1ng/kg体重至约50mg/kg体重，至少约0.1mg/kg体重至约60mg/kg体重，至少约0.1mg/kg体重至约70mg/kg体重，至少约0.1mg/kg体重至约80mg/kg体重，至少约0.1mg/kg体重至约90mg/kg体重，从至少约0.1mg/kg体重至约100mg/kg体重，每天一次或多次，每2-20年一次。
虽然本文所使用的术语被认为是本领域普通技术人员所熟知的，但是仍然阐述了一些定义以便于解释本发明所公开的主题。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
尽管可以使用与本文所描述的方案相似或等同的任何方法、设备和材料来实践或测试实本公开的主题，现在描述代表性的方法、装置和材料。
在某些情况下，本文公开的核苷酸和多肽包括于公开的数据库，如和SWISSPROT。包括在这些可公开获得的数据库中的信息，包括这些核苷酸和多肽的序列和其他相关信息在内，通过引用并入本文。除非另有说明或显而易见，否则对这些可公开提供的数据库的引用可参考本申请提交日期之前的最新版本的数据库。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的含义相同。除非另有说明，否则本文全文中提及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列数据库网站和其他已出版材料均通过引用整体并入。如果对于本文中的术语存在多种定义，以本节为准。在引用URL或其他此类标识符或地址的情况下，可以理解，这种标识符可以改变，并且因特网上的特定信息可能会来来去去，但通过搜索因特网可以找到等效的信息。参考文献证明了这种信息的可用性和公开传播。
根据长期的专利法公约，当在本申请中包括权利要求书中使用时，术语“a”，“an”和“所述(the)”指的是“一个或多个”。因此，例如，对于“细胞(a cell)”，其包括多个这样的细胞，等等。
除非另有说明，所有表示成分数量的数字，在说明书和权利要求书中使用的诸如反应条件等的性质应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据由本发明公开的主题获得的期望性质而变化。
如本文所使用的，在提及质量重量、时间、体积、浓度或百分比的数值或量时，术语“约”意在涵盖从指定量起的变化，在一些实施方案中的变化为±20％，在一些实施方案中为±10％，在一些实施方案中为±5％，在一些实施方案中为±1％，在一些实施方案中为0.5％，在一些实施方案中为±0.1％，因为这些变化适于执行所公开的方法。
本文中所使用的术语“动物”，“受试者”和“患者”包括动物王国的所有成员，包括但不限于哺乳动物，动物(例如猫，狗，马，猪等)和人类。
如本文所使用的，范围可以表示为从一个“约”的特定值，和/或至另一个“约”的特定值。还应当理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中被公开为该值本身以及该特定值的“约”。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11，12，13和14。
目前公开的主题通过以下具体但非限制性示例进一步说明。以下示例可能包括在与本发明相关的开发和实验过程中的不同时间收集的数据中的代表性数据的汇编。
实施例
材料和方法
突变基因组dsDNA的制备
通过CsCl梯度超速离心从枯草芽孢杆菌SpoA12细胞中纯化Phi29基因组DNA-gp3，如先前所述[63]。在快速消化缓冲液(Fermentas)中于37℃下用EcoR1限制性内切酶消化phi29基因组dsDNA 1小时，然后乙醇沉淀来制备突变体dsDNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳测试突变体DNA，用溴化乙锭(Sigma)染色并通过Typhoon(GE)成像。
突变型pRNA的制备
通过体外转录制备野生型phi29p RNA和作为药物化pRNA的无活性突变体。在无活性突变体pRNA中，位于5′末端的前四个碱基“UUCA”(SEQ ID NO：1)被突变为“GGGG”(SEQ IDNO：2)。在两个RNA的PCR反应中使用BglII消化的质粒pRT71作为DNA模板[64]。寡核苷酸5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG TGG TAC-3′(SEQ ID NO：3)和5′-TTA TCAAAG TAG CGTGCA C-3′(SEQ ID NO：4)用作突变体pRNA的引物。然后使用由PCR产生的双链DNA，由T7RNA聚合酶转录RNA，如先前所述[65]。通过8M尿素8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化来自体外转录的RNA，如先前所述[64]。
突变型ATP酶gp16的制备
野生型gp16的纯化已经在之前描述[63]。通过在gp16基因中引入突变来构建Walker B突变体gp16。gp16的Walker B基序中的氨基酸残基D255和E256分别突变为E255和D256。使用适当的引物，用Strata基因Quick Change定点诱变试剂盒引入突变。按照公开的方法进行蛋白质的表达和纯化。
反义寡核苷酸
反义寡核苷酸P3和P15被设计为与pRNA分子上的不同区域反向互补且通过IDT化学合成。P3寡核苷酸(5′-TTGCCATGATTGACAAC-3′(SEQ ID NO：5))靶向pRNA3′端的83-99核苷酸区域，P15寡核苷酸(5′-AAGTACCGTACCATTGA-3′(SEQ ID NO：6))靶向pRNA的5′末端1-17核苷酸区域。在测试中，将P8寡核苷酸(5′-TAATACGACTCACTATAGGGGTGGTAC-3(SEQ IDNO：7)′)设计为非靶向对照。将1μL浓度为100μM的各寡核苷酸与1μL浓度为4μM的pRNA混合，并在0.025靶向的混合纤维素酯VSWP过滤膜(Millipore Corp)上用TBE缓冲液(89mM Tris-HCl，pH 8.3，89mM硼酸，2.5mM EDTA)在室温下透析15分钟。纯化的RNA复合物用于体外phi29装配测定。
体外phi29装配测定
纯化的组分进行体外病毒装配测定，如先前所述[66]。简言之，将10μg纯化的原壳体与5μl反应缓冲液(10mMATP，6mM 2-巯基乙醇，和3mM的在TMS缓冲液中的亚精胺)中的100ng pRNA在室温下的混合30分钟。然后加入纯化的DNA-gp3和gp16，并将反应混合物在室温下孵育1小时以启动DNA包装。最后，用10μl来自大肠杆菌的含有质粒pARgp8.5-9的gp8.5-9提取物和20μl来自大肠杆菌的gp 11-14提取物来孵育DNA填充的原壳体，以完成感染性噬菌体组装。
用接种的枯草芽孢杆菌Su+44细胞将新组装的感染性病毒铺到覆盖有顶部琼脂的半LB板上。在37℃温育12小时后，通过计数形成的斑块数来计算病毒装配效率(斑块形成单元，PFU)。将不同比例的突变体与野生型成分混合，同时保持所有其他成分相同，病毒装配效率(PFU)与突变成分比率给出了病毒组装抑制试验的经验曲线，并将其与来自二项式分布方程的理论曲线进行比较。
体内病毒组装测定
根据先前所描述的方法[67]，将编码pRNA序列和T7启动子的片段与pRB381-L550载体(由M.Wang和H.Zalkin修饰并亲自提供的)结合，构建了在T7启动子下含有pRNA编码序列的质粒pRBwtRNA。质粒pRBmutRNA在其天然启动子PE1序列下含有突变型pRNA，并且突变将其3′端的序列5′UUGA-3′(SEQ ID NO：8)改变为5′GGGG-3′(SEQ ID NO：9)。如先前所述[67]，通过PCR制备编码突变型pRNA序列和PE1序列的DNA片段，并用HindIII-BglII限制性酶消化。将突变型pRNA序列编码片段与来自pRB381-L550的6.0kb片段进一步连接，该pRB381-L550片段用HindIII消化并用BglII部分消化。
将质粒pRBmutRNA，pRBwtRNA和pRB381-L550按照先前描述的方法转化到枯草芽孢杆菌细胞中[67]。将含有转化质粒的枯草芽孢杆菌细胞在含有10mg/ml新霉素的416培养基中在37℃下温育3小时，然后铺在LB-新霉素(10mg/ml)板上用于斑块形成分析。
结果
“化学计量”的定义
本报告中化学计量的定义与传统的用于评估药物效率的化学计量的定义不同。通常，化学计量的概念是指与每个靶点分子结合的药物的数量，其也称为Bmax。在这项研究中，化学计量的定义是指在作为药物靶点的生物复合体内或纳米机器内的亚基的拷贝数。
“K值”的定义，以及K＝1是超高抑制效率的一个关键
假设生物复合物药物靶点含有Z个拷贝的亚基，则K是抑制复合物或纳米机械功能所需的被药物化的亚基的拷贝数(K≤Z)。与并联电路和串行电路的区别类似，当圣诞灯布置在并联电路中时，任何被烧毁的灯泡都不会影响其他灯泡。但是在串行电路中，任何一个坏掉的灯泡都会导致整个照明系统的停止，这就是K＝1。因此，K值是所有亚基的组合和置换对非活性纳米机器或生物复合物的概率的影响。K等于1对于这种超高抑制效应是至关重要的。本报告中的方法的基础是使用组合和置换算法在不同K值系统中抑制生物复合物的概率差异。生物系统显示复杂的反应。许多反应涉及多个亚基按顺序或逐步合作来完成一个重要的生物学功能[33，68，69，70，71，72，73，74，75]。在病毒装配系统中已经报道了单一装配途径[76，77]。在大多数连续、协同和进程的情况下，任何一个(不必全部)亚基的失活将导致其功能的抑制，因此，K-1，药物协同作用被用于多靶点药物治疗；简而言之，药物组合可以同时作用于疾病网络中的多个靶点从而产生协同效应[50，78]。然而，我们在这里报告的设计与传统的协同方法不同。我们建议使用多亚基生物复合物作为药物靶点可能导致超高效药物的开发。在传统的六组分系统中，例如一种药物被设计成靶向组分#3以停止整个系统，因为药物只能靶向组分#3，该情形符合Z＝1和K＝1的模型。因此，药物的抑制效率和底物靶向效率(p)将呈线性关系。然而，在本报告的系统中，当药物靶向六聚体的任何亚基时，整个系统将被阻止，该情形为Z＝6和K＝1。因此，剩余的未被药物结合的靶点的概率将为q6，其中q表示六聚体的非靶点的亚基的分数；换句话说，药物抑制效率将为1-q6，与常规单一亚基方法的线性相比，药物抑制效率以幂函数的方式增加。
假设需要至少K拷贝的药物化亚基去灭活纳米机器或生物复合物，则在存在不同比例的被抑制的亚基和野生型亚基的情况下，可以从方程式2中预测功能性生物复合物的概率。当K＝1时，意味着与一个亚基结合的药物将使该亚基失活，每个多亚基复合物的一个药物化亚基足以抑制复合物的整体功能。靶向化学计量为Z的多亚基生物复合物的药物的抑制效率将等于1-qZ，如表2所示。当Z＝6和K＝1时，这种概率计算的一个例子如下：由于假设发挥功能需要每个元素的6(Z＝6)个亚基，则一个药物化的亚基(K＝1)足够阻止其活性，具有1至5个拷贝的药物化亚基的所有元素将是无功能的(图1C)。只有具有6个拷贝的正常亚基的复合物才能起作用。在一个群体中含有6个未受影响的亚基的复合物的机会是q6，抑制效率将为1-q6。
选择多亚基生物复合物作为有效的药物靶点的理由
药物抑制生物体生长的机制是阻止或停止基本的生物元素起作用。当药物被设计成以靶向效率p靶向复合物的亚基时，一部分亚基将不与药物相互作用(百分位数记为q，p+q＝1)，并且将保持活跃并发挥其功能。一些生物元素是仅含有一个亚基的单体，而其他生物元素，例如六聚体AAA+家族的生物马达，由多亚基构成[19，34]。传统药物被设计为通过靶向单个亚基分子(例如病毒的结构蛋白或酶)来抑制发病机制。在这种情况下，抑制效率与底物靶向效率p成正比，效应与p的一阶成正比。如上所述，在多个亚基复合物中的顺序作用或配合作用的大多数情况下，一个亚基而不是全部亚基的失活将导致其功能的抑制。因此，如果含有Z个亚基的复合物以顺序和协同的方式运行其功能，则K＝1，并且未抑制活性的生物复合物的分数将为qZ，相对于化学计量比较高。抑制比例将等于1-qz。
在这项调查中，使用了明确的体外phi29病毒装配系统来表示多亚基纳米机器靶点，突变成分代表已被有效药物灭活的靶点组分。然后，通过靶向具有不同化学计量的phi29DNA包装马达的不同元素，来比较抑制效率。病毒组装竞争测定与二项式分布分析结合说明，靶向具有较高化学计量的功能生物复合物的药物与作用于单个亚基靶点的药物相比具有更高效率。
当靶点元素是仅含有一个亚基的单体时，可以通过二项式分布(方程式1)计算抑制效率，其中p和q分别是药物化亚基(底物靶向效率)和未被药物化的亚基(正常活性元素)的分数，(p+g＝1)。
X＝(p+q)1 (1)
然而，当目标元素包含多个亚基时，应用高阶二项分布(方程式2)，通过找到所得到的活性和非活性复合物的比例来计算药物抑制作用，其中Z代表一个生物复合物中亚基的总数(化学计量)，M表示一个生物复合物中被药物结合的亚基的数目。
注意，等式2中所示的二项式分布也可以表示如下：
本文阐述了基于二项式方程的计算结果。结果的上下文决定了使用哪种形式的方程。
例如，如果Z是3，则可以通过等式2的扩展来确定给定生物复合物实体中药物化亚基(M)和未药物化亚基(N；M+N＝Z)的所有组合的概率：(p+q)3＝p3+3p2q+3pq2+q3＝1。也就是说，复合物元素在群体中具有三份药物化亚基的概率是p3，具有两份药物化和1份未药物化或野生型亚基的概率为3p2q，具有一份药物化亚基和两份未药物化亚基的概率为3pq2，具有3份未药物化亚基的概率为q3。假设群体中通过结合药物被灭活的亚基为70％(p＝0.7)，30％(q＝0.3)的亚基未受影响，则具有至少两个拷贝的正常亚基的元素的百分比将为具有一份药物化亚基和两份未药物化野生型亚基的那些元素，3pq2，与具有三份天然亚基的那些元素，q3，之和。那么3pq2+q3＝3(0.7)(0.3)2+(0.3)3＝0.216＝21.6％。在另一个例子中，如果一个复合物含有6个亚基，且6个亚基中的5个需要按顺序保持不受限制以具有生物功能，群体中的活性复合物比例将为以下概率之和：1)每个元素含有5个未被药物作用的亚基的概率，以及2)每个元素含有6个未被药物作用的亚基的概率。
可以通过二项式分布来预测显示群体中已被药物作用的亚基和未被药物作用的亚基的某一组合的概率X，如等式2所示。表1显示了在群体中被药物作用的亚基的百分比增加时，具有M个被药物作用的亚基和N个未被药物作用的亚基的给定元素的概率，一个元素中的总亚基数(Z)为3或12。使用公式(来自方程2)来计算每种组合的概率值，该方程中的系数可以使用杨辉三角(也称作Pascal三角)或二项分布来计算(图1B)[79]。
用于测试所述假定的体外病毒组装系统
使用高度灵敏的体外phi29装配系统来确定药物靶向多亚基复合物的抑制效果[56，66，76，80]。噬菌体phi29DNA包装马达含有一份基因组dsDNA，6份包装RNA，6份ATP酶蛋白gp 16和超过10000份的ATP拷贝。phi29中的RNA的化学计量已经通过广泛的研究证实，这样的研究包括单分子研究[81]，AFM图像(图1D)[82，83]，pRNA晶体结构测定(图11)[84]和数学研究[56]。phi29中的gp16的化学计量已经通过多种方法证实，这样的方法包括天然凝胶结合，毛细管电泳测定，Hill常数测定，以及使用二项分布的突变体亚基滴定[19，33]。还发现了许多其他AAA+超家族成员也是六聚体[85，86，87，88，89，90，91]，例如红色rubisco活化酶AAA+蛋白CbbX(图1F)[85]，MecA-C1pC分子机(图1G)[86]。基于以下事实计算ATP分子的拷贝数：6个ATP分子需要用10.5个碱基对(bp)包装一个节距的dsDNA[92]，因此使用1个ATP来包装1.7个bp。整个phi29基因组由19.4kbp组成，因此，预计需要超过10000个ATP分子来包装整个phi29基因组。将整个基因组DNA包装入原壳体的phi29DNA纳米马达可以作为疾病模型用于药物抑制效率分析。
使用化学计量为1的DNA元素在体外测试所述假定
通过突变基因组dsDNA的体外phi29组装抑制来测试靶向单个亚基底物的药物的抑制效率(图2A)。在体外病毒装配测定中，各种比例的突变型DNA与野生型DNA混合。病毒组装效率与被药物作用的突变型DNA比例之间的经验曲线与Z＝1和K＝1二项分布的理论曲线吻合良好(图2B)。这表明当设计靶向phi29纳米马达中的基因组DNA的药物时，预期其是一级抑制反应。比较体外phi29组装抑制，通过加入药物突变DNA，以简单稀释的野生型DNA浓度作为对照，显示药物突变DNA没有产生太大差异(图2C)。结果表明，以化学计量为1的底物为靶点的药物的抑制作用最小。
使用化学计量为6的RNA元素在体外测试所述假定
phi29的pRNA含有两个结构域；一个是对于原壳体结合至关重要的结构域，一个是对于DNA易位至关重要的结构域(图3A，上图)[30，93，94]。两对pRNA分子的右手循环和左手循环可以相互作用互补碱基配对。广泛的研究得出结论：6个拷贝的pRNA形成六聚体环，其结合到原壳体上用于病毒活性[81，82，83，84]。通过在pRNA的5′端区域突变4个核苷酸序列构建药物突变型pRNA(图3A，下图)，已显示其与野生型pRNA的原壳体结合进行竞争，但发现其缺乏DNA包装的发生[67]。图3B示出了总亚基数Z为6，K值由1变化至6时，使用二项式分布方程的扩展产生的理论曲线。将不同比例的药物突变型pRNA的噬菌体组装效率的经验数据与理论曲线拟合，经验数据符合Z＝6和K＝1的理论曲线。这表明pRNA寡聚体环由6个拷贝的pRNA亚基组成，pRNA多聚体中一个亚基的阻断足以阻断噬菌体组装活性。比较病毒装配效率与药物突变型pRNAs的不同比例和野生型pRNA浓度稀释对照的经验曲线，添加药物突变型pRNA显示出更强的抑制作用(图3C)。
为了进一步证明药物靶向具有高化学计量的生物复合物引起更强抑制作用的概念，设计了可以与pRNA分子结合的的反义寡核苷酸作为病毒装配测定中的模拟药物。设计寡核苷酸P15和P3分别靶向pRNA上的5′端和3′端区域。通过凝胶移位测定法，证实反义寡核苷酸可以与pRNA杂交(数据未显示)。当将反义寡核苷酸与野生型pRNA混合用于体外phi29组装测定时，反义寡核苷酸P15和P3显示完全抑制作用，但不与非靶向对照寡核苷酸P8[95]显示。通过将非靶向寡核苷酸P8与pRNA混合，其在板上产生4.4×106PFU的斑块。
使用化学计量为6的RNA元素在体内测试所述假定
已经通过生化和结构研究[52，81，84，96，97，98，99，100，101，102，103]和活性测定[94，104]发现，在phi29dsDNA包装马达中形成pRNA的六聚体环。通过药物突变型pRNA在体外phi29组装观察到的高抑制效率是惊人的[67，105]。为了测试是否可以在体内获得这种高水平的抑制，在3′端表达具有4个碱基突变的pRNA的pRBmutRNA质粒被转化到枯草芽孢杆菌DE1细胞中。质粒pRBwtRNA含有pRNA编码序列，但在枯草芽孢杆菌DE1细胞中不表达pRNA，引入载体pRB381-L550以及阴性对照。结果表明，只有携带pRBmutRNA质粒的细胞才能完全抵抗由野生型phi29病毒感染导致的斑块形成。对照组细胞，包括单独的枯草芽孢杆菌12A细胞、单独携带载体pRB381-L550的枯草芽孢杆菌DE1细胞和携带野生型pRNA编码序列但不表达质粒pRBwtRNA的细胞，对于斑块形成均呈阳性(图4B)。通过质粒pRBmutRNA在细胞中产生的突变型pRNA的能力完全抑制斑块形成，表明DNA包装纳米马达中的六聚体pRNA可能是开发有效的抗病毒剂的潜在靶点。
使用化学计量为6的ATP酶进行体外检测
phi29dsDNA包装马达中ATP酶gp 16蛋白的六聚体折叠已被发现[1，19，33，35]。六聚体gp 16蛋白复合物像许多其他AAA+超家族成员一样起着ATP酶的作用。ATP结合到gp16的一个亚基，刺激ATP酶将其构象从具有较低亲和力的构象改变为对dsDNA具有较高亲和性的构象。
通过体外噬菌体组装试验，基于野生型和Walker B突变型gp16的二项式分布，来进行gp16化学计量的测定[51]。将不同比例的药物化WalkerB突变型gp16与未受药物作用的gp16混合，以测试gp16突变对phi29DNA包装马达的抑制效果。假设K等于1，并且gp16的总拷贝数(Z)在1和12之间，则根据方程式2，产生了phi29病毒粒子相对于Walker B突变体的比例的12个理论曲线，对应于化学计量(Z)1至12。实验数据几乎完全与Z＝6，K＝1的理论曲线重叠[51]。该数据表明，phi29DNA包装马达的ATP酶gp16组分的化学计量为6，仅仅一拷贝的被药物作用的gp16即可以阻断phi29马达功能。比较以不同浓度添加突变体gp16与野生型gp16的抑制效果，表明添加突变体gp16与野生型gp16浓度稀释对照相比具有更强的抑制作用(图5A)。比较突变对六聚体gp16的抑制作用与突变对单个亚基靶点DNA的作用，gp16突变与相同比例的DNA突变相比显示出更强的对病毒组装的抑制作用，说明病毒组装系统的六聚体ATP酶蛋白复合物也应成为产生高效新型抗病毒药物的有效靶点。
使用化学计量超过10000的ATP进行体外测试
据报道，需要使用6个ATP分子来包装一个间距的具有10.5个碱基对的dsDNA[90]，因此1个ATP用于包装1.7个碱基对。由于整个phi29基因组DNA具有19,000个碱基对，预计需要超过10000个ATP分子来包装整个phi29基因组。由于关于ATP，图5中显示的功能单元是病毒生产，表达为斑块形成单元(PFU)，因此PFU的一个功能单元的产生需要10000个ATP亚基来包装一个基因组DNA。因此，一个phi29纳米马达中的ATP可以被认为化学计量是10000。对一种不可水解的ATP类似物y-S-ATP进行处理作为药物化的亚基，其与ATP以不同比例混合，以测试y-S-ATP对phi29装配效率的抑制作用。发现，突变ATP的抑制曲线符合Z＝100，K＝1至Z＝60，K＝1之间的理论曲线(图5B)。从二项分布测定得出的实验ATP值与实际情况不同，由于二项分布方程基于的条件是每个亚基对所靶向的纳米马达中的生物复合物具有相同结合亲和力，但是由于yS-ATP结构的变化，其对于ATP酶gp16的结合亲合力低于正常的ATP。此外，每个亚基中的亲和力差异在纳米马达的活性中具有乘法效应。因此，预测的Z值和实验的Z值的曲线之间存在很大的差异。
使用不同组分比较病毒组合抑制作用，y-S-ATP表现出严重的抑制作用(图5C)。
加入20％的γ-ATP几乎完全抑制病毒组装。比较靶向化学计量分别为10000、6、6和1的ATP、pRNA、ATP酶gp16和DNA抑制作用，yS-ATP显示出最强的抑制作用，而药物突变型pRNA和突变型gp 16与突变体DNA相比则表现出更强的抑制作用(图.5C)。例如，添加20％的突变体DNA在病毒装配中引起20％的抑制作用，而添加20％的药物突变型pRNA则对病毒组装产生74％的抑制作用，20％的y-S-ATP几乎完全抑制病毒组装，表明化学计量越高，抑制效果越强。
增加抑制功效的数学推理
使用具有较高化学计量的生物复合物作为药物靶点将显着降低未被抑制的复合物的比例。对于K＝1，未被抑制的复合物的比例为qz。表3比较了当K＝1时，具有Z＝6和Z＝1的两个群体的未被抑制的复合物的比例与不同的底物靶向效率(p)。例如，当q＝0.4时，对于Z＝1，K＝1，被抑制的复合物的比例为qz＝0.41＝0.4。因此，只有1-0.4＝60％的复合物被抑制。相反，对于Z＝6，K＝1，未被抑制的复合物的比例为qz＝0.46＝0.0041。因此，1-0.0041＝99.59％的复合物被抑制。未被抑制的复合物的比例等于0.0041/0.4＝0.0102，表明未被抑制的复合物的比例降低1/0.0102＝98倍。另一个例子是使用药物靶向效率p＝0.9比较Z＝6和Z＝1的两组之间的抑制效率。对于Z＝6，K＝1，被抑制复合物的比例为1-qz＝1-0.16＝0.999999。未被抑制的复合物的比例为qz＝0.16＝1E-6。对于Z＝1，K＝1，被抑制复合物的比例为1-qz＝1-0.1＝0.9。未被抑制的复合物的比例为qz＝0.1。抑制效率的比等于1E-6/0.1＝1E-5，表示抑制效率增加10000倍(表3)。
该方程式显示具有化学计量幂函数的抑制效应，因为当K＝1时，群体中未受抑制的生物复合物的百分比等于qZ。由于(P+q)＝1，因此q≤1，因此Z越大，qZ的值越小，也就是说，化学计量越高，不受限制的背景的数量就越小。以相同的底物靶向功效p，抑制效率由z确定，即方程组分的幂。抑制效应是关于化学计量的幂函数。因此，化学计量越高，与具有相同结合亲和力的药物进行比较越有效。
半数最大抑制浓度(IC50)通常用于评估药物作用，其定量表明特定药物需要多少量来抑制给定的生物过程一半。如果我们将PIC50表示为在定义的系统中在体外测定中达到50％抑制所需的药物亚基的百分比，因此1-(1-PIC50)Z＝50％。求解这个方程，PIC50＝1-0.51/Z。图6显示化学计量(Z)和达到抑制作用(IC)的药物靶向水平p之间的关系，其中p是药物结合功效和药物浓度(剂量)的组合结果。当使用Z化学计量的生物复合物作为药物靶点时，达到IC50，IC25或IC75的药物剂量或由药物化亚基的百分数所表示的该药物的结合亲和力降低。这清楚地表明，随着Z增加，减少(图6)，因此药物更有效。
讨论
为了寻找一种开发具有超高效能药物的方法，我们提出给定药物的抑制效率取决于用作药物靶点的生物复合体或生物机器的化学计量。在这里，化学计量的定义不同于用于评估药物效率的化学计量的常规定义。药物开发中的常规思考强调化学计量，其指每个靶分子的药物结合数，也称为Bmax。在这项研究中，化学计量的定义是指作为药物靶点的生物复合物内亚基的拷贝数。我们使用Phi29病毒组分与一系列可变但已知的化学计量作为模拟药物靶点来测试假设。使用体外和体内病毒粒子装配测定法来比较具有不同数量亚基化学计量的组分的抑制效率。用杨辉(Pascal)三角形(或称为二项分布)分析病毒抑制效率。已经发现，病毒复制的抑制效率与作为药物靶点的纳米机器的组分化学计量相关。它表现出幂规律的抑制效应，因为当K＝1时，群体中不受抑制的生物复合物的百分比等于qz。以相同的q和相同的K值，抑制效率由z确定，即作为药物靶点的生物复合物或生物机器中的亚基数。这里z作为方程中的幂，因此，抑制作用是化学计量的幂。实验数据表明，具有上千个亚基的靶点显示出比具有6个亚基的靶点更高的抑制作用，反过来高于只具有单个亚基的靶点。
在药物作用评估中，常用两个参数。一个是半最大抑制浓度(IC50)，其定量地表明需要多少特定的药物以将给定的生物过程抑制一半程度。它被普遍用作药物研究中药物效力的量度。另一个重要参数是中位数致死量(LD50)，也称为致死浓度的50％(LC50)。LD50常用来表示物质的急性毒性。显然，药物的有用性将取决于LD50与IC50的比例。这个比例越大，药物越安全。通过靶向高化学计量的组分来提高抑制效率，药物的IC50将降低。因此，为了达到期望的效果，需要较低浓度的药物，导致药物的毒性降低。
目前大多数抗癌、抗病毒或抗细菌药物都针对单一酶或单一蛋白质。我们的数据显示，选择用于靶向具有高拷贝数的组分、生物复合物或纳米机的药物，可以导致更高的疗效，并且可能潜在地解决药物低效和多药耐药性的问题。
结论
靶向具有更高化学计量的功能性生物单位将具有更高的抑制效率。抑制效果是幂，而不是比例，所述幂即是机器的被药物靶向的组分的拷贝数。本文开发的新理论表明，通过靶向具有高化学计量的生物复合物可以开发有效的药物，如果鉴定出具有高化学计量的生物机器，则可以完全抑制病毒、细菌或癌症。由于生物马达与其病毒、细菌和细胞具有一定的共同结构和运行机制，因此在药物开发中应具有一般应用。
生命系统包含许多优雅的阵列、马达和纳米机器，其都是多亚基的复合物。如本文所报道的，这些生物复合物具有高拷贝数的组分，可以作为有效的药物靶标。例如，AAA+家族的大部分成员都是六聚体[19，87，88，106，107，108]。然而，这些机器在生命系统中是常见的，因此特异性和毒性是一个问题。对于细菌和病毒，由于我们的目标是非唯一的杀死它们，只要靶点生物复合物与人体不同，特异性和毒性就不是问题。对于癌症药物，只要在多亚基生物复合物中发现突变，它将是有效药物的理想靶标。
披露方法
本文公开了用于开发有效药物的方法。药物抑制效力取决于所靶向的生物复合物的化学计量。
方法：
使用具有不同化学计量的Phi29病毒组分作为模型证明假设。使用杨辉三角来测定和分析病毒装配效率：
结果：
抑制效率显示靶点生物复合物的化学计量的幂函数。群体中未受抑制的生物复合物可以等于qZ。因此，抑制作用是化学计量的幂。具有上千个亚基的靶点比具有六个亚基的靶点显示更高的抑制作用，反过来高于具有单个亚基的靶点。当使用具有高化学计量的靶点作为目标时，证明完全抑制病毒、细菌或癌症。
结论
药物抑制效力取决于生物复合物或纳米机器的被靶向的成分的化学计量。抑制效应显示了靶点生物复合物的化学计量的面函数。由于生物马达在病毒、细菌和细胞中具有一定的共同结构和运行机制，因此在药物开发中应具有一般应用。
第2节
多药耐药性和不可治愈疾病的出现激发了对有效治疗的追求。
通过靶向Z＞1和K＝1的多亚基同源生物马达、机器或复合物，开发了用于设计有效药物的新方法，其中Z是靶点的化学计量，K是阻断复合物功能所需的药物亚基数。该情况类似于圣诞装饰品的串联电路；一个灯泡的故障导致整个照明系统的断电。在大多数多亚基同源生物系统中，利用顺序协调或协同作用机制，因此K等于1。药物抑制取决于被药物作用的复合物与未被药物作用的复合物的比例。当K＝1和Z＞1时，抑制效应相对于Z遵循幂规律，导致药物效力增强。药物抑制效能取决于所靶向的生物复合物的化学计量的假说最近由杨辉三角(或二项分布)量化，并使用高度灵敏的体外phi29病毒DNA包装系统进行了证明。讨论了靶向高化学计量的同源生物复合物来发现高效药物的实例。
具有多个亚基的生物马达广泛存在于病毒、细菌和细胞中，使这种方法普遍适用于高效率抑制药物的开发。
耐药性持续升高一直威胁着人类健康和生命，即包括细菌、病毒甚至癌细胞在内的许多微生物正在发展对当前化学疗法的抗性。2012年，美国的耐药性部分促成了60万人死亡[1]。为了对抗不断上升的耐药性，已经开发出不同的开发新药的方法。一种方法是开发针对新机制的药物。已经探索了对癌细胞生长非常重要的成分，作为治疗多重耐药性癌症的药物靶点[2，3]。第一个被FDA批准用于治疗多药耐药性结核病的药物，贝达喹啉，遵循抑制结核分枝杆菌和其他分枝杆菌菌种的细菌ATP合成酶的新机制[4]。另一种方法是使用纳米药物载体来增强药物对癌细胞的结合效率[5-8l。第三种方法是开发新的组合药物作用于多个靶点，以提高其功效[9，10]，包括鸡尾酒疗法[11]。这涉及在治疗的同时鉴定多个靶点，以导致协同治疗效果和优化多靶配体的设计[12]。然而，治疗多重耐药性疾病尚未得到满足。因此，需要采取新的药物开发方法来对抗耐药性。
最近报道了一种新的假设，即通过靶向具有高亚基化学计量的蛋白质或RNA复合物可以开发有效药物[13]。测试这个假设的主要挑战是评估靶点化学计量和药物分子与其功效的结合亲和力的重要性。为了获得药物抑制功效与靶点生物复合物的化学计量之间的定量关系，需要一个经过深入研究的多组分体系，其允许对具有不同数量的亚基的各个组分的功能抑制效率的经验比较。
噬菌体phi29的DNA包装马达是测试这一理论的理想模型。phi29DNA包装马达中各组分的形态和化学计量学得到了很好的研究。Phi29生物马达(图1A)由三个基本的同轴堆叠环组成[14-17]：位于病毒原壳体的顶点的十二聚体连接环；连接到连接体N末端的六聚体包装RNA(pRNA)环[16，18]，以及连接在pRNA螺旋区上的ATP酶gp16六聚体环[19-21]。在1997年利用杨辉三角(或二项分布)首次确定了pRNA的化学计量[22]，并应用类似的数学方法来确定蛋白质亚基的化学计量[14]。此外，双链DNA包装利用无自转的公转机制，通过水解ATP来驱动其基因组DNA[20，21，23-28]。包装一个完整的Phi29基因组双链DNA所需的ATP分子的拷贝数已被预测为10,000[20，21，23-27，29]。因此，Pi29DNA包装提供了测试上述概念的理想平台：抑制药物效能对其所靶向的生物复合物的化学计量的依赖性。
虽然近来报道和验证了靶向多亚基复合物开发有效药物的理论[13]，已经实施了靶向多亚基复合物用于新药开发的真实病例[30-32]。由于多组分生物马达在自然界中广泛传播[26，27，33，34]，本文讨论的靶向多亚基复合物开发强效药物的方法是普遍使用的，特别是在开发新一代药物以抵抗病毒、细菌和癌症中日益增长的耐药性[35-37]。
选择多亚基生物复合物作为有效药物靶点的理由
抑制性药物通常被设计成选择性结合靶点位，从而阻止该位点与其他生物分子的相互作用，导致生物靶点的基本活性丧失。该靶点可以是仅由一个亚基组成的单个元素，或由多个亚基组成的复合体，例如六聚体ASCE(Additional Strand Catalytic E)超家族的生物马达[20，38]。传统药物被设计为通过靶向单个亚基分子(例如病毒的结构蛋白或酶)来抑制发病机制。如下所述，设计有效药物的关键在靶向作为药物靶标的多亚基生物马达、机器或复合物，其遵循顺序协调或配合机制。复合物的化学计量Z比1大，阻止目标复合物的活性所需的被药物作用的亚基的数量等于1(Z＞1和K＝1)。类似于串联连接的装饰圣诞灯，其中一个破碎的灯泡将关闭整个链，一个被药物作用的亚基将抑制整个复合物并因此抑制生物活性。多亚基复合物的顺序作用或协同作用已在生物系统中广泛报道[39-43]；抑制任何亚基将导致整个复合物的抑制，换句话说，K等于1。
对于抑制单一亚基靶点(Z＝1)的效率为p的常规药物，未受药物作用的靶点分子的分数q为1-p；并且那些未受药物作用的靶点分子将保持活性以维持其生物学功能。在这种情况下，抑制效率与底物靶向效率p[39-41]成正比。当靶向二聚体复合物(Z＝2)时，例如，使任何亚基失活导致整个复合物的抑制。对于底物靶向效率p＝0.9(90％)的靶向二聚体复合物的药物，仅有10％的第一亚基和10％的第二亚基在药物靶向后保持活性。因此，未与药物结合的复合物的分数将有效降低至0.01，仅剩余1％的复合物活跃。由于药物抑制取决于被药物作用的复合物与未与药物结合的复合物之间的比例，抑制效果与各亚基的抑制产物成正比，换句话说，其相对于Z遵循的幂规律。
因此，由Z个亚基组成的复合体，抑制该复合物活性所需阻断的亚基的最小数量(K)是1，当p百分比的亚基与药物相互作用时，不受抑制的生物复合物的分数将为qZ，受抑制的分数等于1-qZ。
2.1二项分布模型预测药物抑制效果
上述情况遵循二项分布，因此可用其概述药物抑制效率与靶点化学计量之间的一般关系。当靶点元素是单体时，可以使用公式1计算抑制效率，其中p和q分别是被药物结合的亚基的分数(底物靶向效率)和未被药物结合的亚基的分数(正常活性元素)(p+q＝1)。
X＝(p+q)1 (1)
然而，当靶点元素包含多个亚基时，需要较高阶二项分布(方程2)来计算活性复合物的比例，其中Z表示亚基的总数(化学计量)，M表示一个生物复合体中被药物结合的亚基的数量。
注意，等式2中所示的二项分布也可以表示如下：
本文阐述了基于二项式方程的计算结果。结果的上下文决定了使用哪种形式的方程。
任何给定的生物复合物中被药物作用的亚基(M)和未被药物作用的亚基(N；M+N＝Z)的概率可以通过方程式2的扩展来确定。当Z＝3时，方程式2的扩展形式，(p+q)3＝p3+3p2q+2pq2+q3＝1，显示均三元复合物的被药物作用的亚基和未被药物作用的亚基的所有可能组合的概率，由三个被药物作用的亚基组成(P3)、二个被药物作用的亚基组成(p2q)、一个被药物作用的亚基组成(Pq2)或无被药物作用的亚基(q3)；总和等于1。假设70％(p＝0.7)的亚基通过结合的药物被灭活，留下30％(q＝0.3)的亚基不受影响，那么具有至少两个拷贝的正常亚基的复合物的百分比，将是那些具有一个拷贝的与药物结合的亚基的复合物和具有两个拷贝的未与药物结合的野生型亚基的复合物的百分比，3pq2，与那些具有三个天然亚基的复合物的百分比，q3，之总和，即3pq2+q3＝3(0.7)(0.3)2+(0.3)3＝0.216。在另一个实例中，如果复合物含有6个亚基，并且生物活性需要6个亚基中的5个保持不受抑制，则总体群体中活性复合物的比例等于获得以下数量的亚基的概率的总和：1)5个未被药物结合的亚基和2)6个未被药物结合的亚基。
使用二项分布，可以预测一个群体包含未被药物结合的亚基和被药物结合的亚基的任何组合的概率。靶向效率p对于获得具有M个被药物结合的亚基和N个未被药物结合的亚基的定复合物的概率的影响如表1所示。使用方程式2来计算概率，其中系数从杨辉三角获得，其也称为帕斯卡三角，或二项分布(图1B)[44]。对于RNA组分，使用杨辉三角形和二项分布来确定生物马达的化学计量于1997年发表在Guo Lab[22，45]，并在2014年重申了对于phi29DNA包装马达中的蛋白质组分的化学计量的测定[14]。
多亚基生物复合物中的协同作用导致高的抑制效率
多亚基生物复合物的协同作用是高药物抑制效率的关键。协同意味着多个亚基顺序地或渐进地完成一个重要的生物反应[23，40-42，46-50]。阻断复合物的任何亚基抑制整个复合物的活性。涉及多个亚基的许多反应以协同的方式工作，例如病毒装配系统中的组装途径[39，51]。类似于这样的生物反应机制由并联电路和串联电路之间的差异给出。当一串灯泡布置在并联电路中时，烧掉一个灯泡不会影响其他灯泡，而在串联电路中，断开任何一个灯泡会关闭整个照明系统。因此，为了抑制轻链的功能，K值是需要抑制的亚基的最小数目，因此，K＝1。因此，K值是通过所有亚基的组合和排列来估计获得无活性纳米机器或生物复合物的概率的关键因素。
K＝1对于获得超高抑制作用至关重要。本报告所述方法的基础是具有相同比例的与药物结合的靶点亚基但不同K值的生物复合物的抑制概率的差异。生物系统显示复杂的反应，涉及几个步骤和以串联或并联方式相互作用的多个组分。基于二项数学模型和生物反应的协同性质，我们建议靶向多亚基生物复合物可以作为开发高效药物的工具。在传统的六组分系统中，当一种药物被设计成仅靶向组件#3以停止整个系统时，这种情况类似于方程式2中Z＝1和K＝1的模型。因此，抑制效率与药物的底物靶向效率(p)成线性关系。然而，在均六聚体组分系统中，当药物靶向六聚体的任何亚基时，整个复合物被阻断，表示Z＝6和K＝1。因此，活性靶点复合物的概率等于q6(q＝1-p)。换句话说，药物抑制效率等于1-q6，其与q的6次幂成比例，而常规的单一亚基方法中其与q呈线性关系(参见表1)。
靶向具有较高化学计量的生物复合物基本上降低了未受抑制的复合物的分数。K＝1意味着药物与一个亚基的结合使该亚基失活，其中一个被药物结合的亚基足以抑制整个复合物的功能。作为示例，下面给出Z＝6和K＝1的概率计算。由于需要所有6(Z＝6)个亚基来保持功能，而一个与药物结合的亚基(K＝1)足以阻断活性，具有1至5拷贝的与药物结合的亚基的所有元件是无功能的(图1C)。只有具有6拷贝未与药物结合的亚基的复合物才是功能性的。复合物含有6个未受影响的亚基的概率为q6，因此抑制效率为1-q6[12，23，39，46，51，52]。
因此，对于结合效率为p的药物，靶点复合物的较大化学计量显著提高了抑制效率。为了说明，我们比较了Z＝6和Z＝1的未受抑制的复合物的分数，同时保持两个目标系统的q＝0.4和K＝1。对于Z＝1，未受抑制的复合物的分数为qZ＝0.41＝0.4，导致1-0.4＝60％的受抑制复合物。与之相比，对于Z＝6，未受抑制的复合物的分数为qZ＝0.46＝0.0041，因此1-0.0041＝99.59％的复合物被抑制。与Z＝1相比，Z＝6时剩余的未受抑制的复合物的比例(0.4/0.0041＝98)降低了98倍。在靶向效率p＝0.9时，Z＝6的抑制效率为1-qZ＝1-0.16＝0.999999，与Z＝1相比，抑制效率提高10,000倍(0.1/0.16＝105，见表1)。二项分布表明抑制效应相对与靶点的化学计量遵循幂定律。因此，对于K-1，不受抑制的生物复合物的分数等于qZ；Z越大，qZ越小(因为0＜q＜1)。也就是说，当开发与其靶点具有相同结合亲和力的药物时，其多聚体靶点的化学计量越高，剩余的不受限制的靶点将越少，药物的效率越高。
2.3ICs0随着靶点复合物的化学计量的增加而降低
半最大抑制浓度(IC50)是用于评估药物功效的一个参数。它定量表明需要多少特定药物来将给定生物过程的活性降低一半程度。它被广泛用作药物研究中药物效力的测量。中值致死剂量LD50(也称为致死浓度的50％)是评估药物的安全性，即急性毒性的重要参数。最重要的是，LD50与IC50的比例越大，导致更安全的药物。通过靶向具有高化学计量的组分提高抑制效率，有效药物计量被大大降低，从而降低IC50。结果，LD50与IC50的比值增加，导致药物的治疗窗口扩大。
如果我们将PIC50表示为达到50％抑制的所需要的被药物结合的亚基的百分比，则1-(1-PIC50)Z＝50％。求解该方程，PIC50＝1-0.51/Z。图8显示化学计量(Z)和达到抑制作用(IC)的药物靶向水平p之间的关系，其中p是药物结合功效和药物浓度(剂量)的组合结果。当多聚体药物靶点的化学计量Z增加时，达到IC50、IC20或IC80的药物剂量降低，以药物亚基的百分比表示。这清楚地表明，当Z增加时，PIC50降低，因此药物更有效。
关注靶点复合物的化学计量进行药物开发与传统方法不同。常规药物分子需要对靶点具有高结合亲和力，这意味着我们预期更多的药物分子与一个靶分子结合。这里的化学计量是指用作药物靶标的生物复合物或纳米机器内的亚基的拷贝数。这个想法与预测临床药物功效(受体占有率)的较新模型一致。受体占有率作为人体药效学和抗组胺药功效的预测因子，考虑了药物对其受体的亲和力及其游离血浆浓度[53]。
Phi29病毒装配系统证实抑制效率为靶点化学计量的幂函数
已经使用Phi29病毒装配系统证明了药物抑制效率相对于靶点化学计量遵循幂函数的假设[54]。这种明确的体外装配系统由四个组分组成，每个组分由可以作为纳米机器靶点的不同亚基组成。使用代表药物靶点组分的突变成分实现病毒装配的抑制。用杨辉三角形分析了靶向各种Phi29DNA包装马达组分的抑制效果。这些病毒组装竞争测定的二项分布分析证实了靶向具有较高化学计量的生物复合物的药物与作用于单个亚基靶标的药物相比具有更高效率的概念。
使用高度灵敏的体外Phi29装配系统来确定靶向多亚基复合物的药物的抑制效力[22，39，45，55]，从而验证了开发有效药物的新方法。噬菌体Phi29DNA包装马达含有一份基因组双链DNA，6拷贝的包装RNA，6拷贝的ATP酶蛋白gp16，并在基因组包装中消耗超过10,000个拷贝的ATP。已经使用单分子技术[54]、AFM成像[56，57]、pRNA晶体结构测定[58]和统计学评价[22]揭示了Phi29pRNA的六聚体化学计量。已经通过天然凝胶结合、毛细管电泳测定、Hill常数测定和通过使用二项分布滴定突变体亚基来证明Phi29gp16的六聚体化学计量[20，23]。基于以下事实计算ATP分子的拷贝数，其中需要6个ATP分子来封装含有10.5个碱基对的dsDNA的一个间距[59]，因此需要使用一个ATP来封装dsDNA的1.7个碱基对。整个Phi29基因组由19,400个碱基对组成，因此，预计需要超过10,000个ATP分子来包装整个Phi29基因组。具有多个明确定义和特征的组分的马达系统的可用性，是用于分析药物抑制效率相对于本测定中各个亚组分的亚基化学计量学的理想疾病模型。
对ATP、pRNA、ATP酶gpl6和DNA作为化学计量分别为10,000、6、6和1的药物靶点的抑制效率进行测定。在这些组分中，靶向ATP显示出最强的抑制作用，而药物突变体pRNA和突变体gp16仍然显示比突变DNA更强的抑制作用(图3)。例如，加入20％的突变体DNA导致20％的病毒装配抑制，而20％的药物突变型pRNA对病毒装配产生74％的抑制作用，20％的y-S-ATP几乎完全抑制病毒组装，表明更高的化学计量导致更强的抑制效果。
具有一万个亚基的靶标与具有6个亚基的靶点相比显示出更高的抑制能力，这反过来说明与单个亚基的靶点相比具有更高的抑制能力。总之，这些结果表明，抑制效率相对于靶点生物复合物的化学计量显示幂函数。药物抑制效力取决于生物复合物或纳米机器的被靶向的组分的化学计量。由于生物马达在病毒、细菌和其他细胞之间具有一定的共同结构和操作机制，因此这种方法在药物开发中具有一般应用。
具有多个亚基或高阶化学计量的生物马达的广泛分布
生物系统包含各种具有高度有序化学计量的纳米机器，这对于DNA复制、DNA修复[60]、同源重组、细胞有丝分裂、细菌二分裂、假结节分解[61]、病毒基因组包装[62]、RNA转录、核孔运输以及细胞成分的运动、贩运和出口是必不可少的。在这里我们以生物马达为例来阐明Z＞1和K＝1的原理。这些生物马达通常可以根据其DNA运输机制分为三类：线性马达、自转马达和新发现的公转马达[23，27，34]。在生物马达中，特别是在自转和公转的马达中，高阶化学计量学被广泛地观察到。因此，生物马达是用于开发有效抑制药物的可行的靶点，该药物显示亚基化学计量的幂规律行为。
4.1自转(Rotation)纳米机器
FoF1 ATP合成酶和解旋酶是旋转马达的代表[63，64]。FoF1 ATP合成酶是一种普遍存在的膜酶，在生物能量代谢中起关键作用[65，66]。它由两个连接的旋转马达FI和Fo组成，其结构和功能不同。F1 ATP酶形成催化核心，显示出强的ATP水解活性。它由5个亚基组成(α3β3γ1δ1ε1)，三个α亚基和三个β亚基形成六聚体环，带有部分长卷曲螺旋γ亚基。Fo是嵌入膜中的质子孔，它由至少3个亚基(a1b1c8-15)组成，其中亚基c在物种之间不同。
解旋酶DnaB是一种六聚体纳米机器(图4A)，其在DNA复制过程中解开复制叉前面的dsDNA[67，68]。最近，基于与ssDNA和GDP-AIF4复合的DnaB六聚体的晶体结构，提出了一种DnaB的交叉转移机制[69]。在这种机制中，以两个核苷酸的步长的亚基的5′-3′易位与NTP的顺序水解相结合[70]。各个亚基的手拉手的迁移导致DNA易位。
RecA是依赖于ATP的重组酶家族，在古菌、细菌和真核生物的双链DNA修复和基因重组中起着重要的作用。它可以与单链DNA相互作用形成右旋螺旋状丝状物作为复合物，每转大约有6个RecA的单体(图4b)[71，72]。电子显微镜研究表明ATP结合诱导了RecAATP酶结构域之间的重新定位，从而导致在由ATP水解驱动的DNA转位过程中，DNA基质中蛋白质的相对旋转。
4.2公转纳米机器
已知的所有dsDNA病毒在复制过程中利用类似的机制将其基因组转运到预先形成的蛋白质壳中。例如，噬菌体phi29，HK97，SPP1，P22和T7对于dsDNA包装都采用共同公转机制，即采用六聚体ATP酶和主要是十二聚体的连接器通道来包装dsDNA。phi29DNA包装马达由三个同轴环组成：十二聚体通道环和ASCE六聚体ATP酶，由pRNA六聚体环连接(图4C)[20，54，58]。在基因组包装过程中，超过10000个ATP分子被六聚体ATP酶作为能源消耗来驱动一个拷贝的dsDNA基因组的移位[59]。
ASCE超家族，包括FtsK-HerA超家族和AAA+(与不同细胞活动相关的ATP酶)，是纳米机器的进化枝，其显示亚基的六聚体排列[73-76]。它们的生物功能是将来自ATP的化学能转化为机器运动[20，29，77，78]，通常与ATP酶的构象变化相关[20，79，80]。
FtsK属于ASCE超家族。它是一种多结构域蛋白，由以下组成：含有α、β和γ亚结构域的C-末端ATP酶结构域FtsK(C)、N末端跨膜结构域FtsK(N)和600-氨基酸连接子[81-83]。它负责细菌细胞与dsDNA双向易位之间的结合[84，85]。已经提出FtsK亚基以顺序的方式起作用，采用公转机制来转位dsDNA[86，87]。FtsK(C)的晶体结构和电子显微镜观察证明形成环状六聚体，DNA通过六聚体环(图4D)[87，88]。
靶向生物复合物开发有效药物
如上所述，药物效率遵循多聚体靶点生物复合物的亚基的化学计量的幂函数。因此，靶向具有较高化学计量的生物复合物可导致更有效的药物的开发。实验上，靶向受体二聚体、异源寡聚物和同源寡聚体用于药物筛选的方法为药物发现和开发创造了令人兴奋的可能性[89]。
靶向同源通道蛋白用于药物开发
在药物开发的历史上，大多数通道蛋白受体的一个重要特性已被忽视，即它们的化学计量。事实上，许多通道蛋白质在细胞膜上表达为二聚体或寡聚体，包括大多数G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白[89]。药物开发通常开始考虑靶向GPCR异源和同源寡聚体。因此，正在开发新的多亚基蛋白结合模型[89]。已经报道了配体和多亚基靶标之间的合作结合亲和力，并通过拟合Hill方程来计算协同作用因子[23，89]。
ATP敏感的同源三聚体P2X7受体(P2X7R)用作配体门控离子通道。它形成圣杯状通道，其三个ATP结合位点位于三个亚基的界面处。激活受体必需占有这三个位点中的至少两个，这导致通道孔的开放，允许小阳离子(Na+、Ca2+和K+)通过。P2X7R作为潜在的药物靶点受到了特别的关注，因为其广泛参与炎症性疾病且在中枢神经系统(CNS)病理学中具有关键作用[30]。这些概念将扩大靶向多亚基通道蛋白的药物的治疗潜力，包括副作用发生率较低的受体异聚选择性药物。他们还将帮助通过使用表达异聚受体的细胞模型，来鉴定新的药理学特征。
靶向同源酶用于抗生素开发
关键酶在基本生物合成途径中的靶向是抗生素开发的重要途径。发现脂肪酸合成途径和核苷酸合成途径中的许多关键蛋白质是多价的。生物合成途径中高度有序的低聚酶可能是开发更有效的抗菌药物的有希望的靶标。下面讨论通过靶向多亚基生物复合物开发有效药物的一些实例。
脂肪酸合成是革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中必不可少的脂肪生成过程。脂肪酸生物合成途径中的一个关键酶是脂肪酸生物合成1(FabI)，其是同源四聚体复合物，在勃氏霍奇金杆菌(Bpm)中作为主要烯酰基-ACP还原酶存在。最近的X射线结构研究揭示了抑制剂PT155与同源四聚体BpmFabI的结合模式[31](图5A)。底物BpmFabI是同源四聚体，与每个单体亚基结合的一个PT155分子已经显示了用于抗菌药物开发的显着前景[31]。靶向多亚基生物复合物作为药物靶点的另一个实例，是在鸟嘌呤核苷酸生物合成途径中发现的，以控制寄生虫感染。肌苷5′-单磷酸脱氢酶(IMPDH)是同源四聚体酶[32](图5B)，其重要作用在于在鸟苷酸(GMP)生物合成中催化氧化IMP为XMP[32]。具有化学抑制剂药物的IMPDH的结构表征表明，与重复单元的结合显示出更有效的抑制作用[90]。
这些以同源四聚体酶为靶点进行有效药物开发的成功实例进一步证明了靶点同源复合物的化学计量的重要性。当采用这种方法来搜索酶作为药物靶点时，测试复合物的化学计量(Z)是否＞1以及抑制生物功能所需的亚基数目(K)是否等于1是至关重要的。
靶向同源药物转运蛋白进行药物开发
药物转运蛋白的机制非常类似于公转马达的机制，涉及ATP的熵诱导转化。靶点复合物的高化学计量是药物效率的关键考虑因素。靶向化学计量高的多药物外排转运蛋白具有更好机会来开发用于治疗多重耐药性疾病的药物。细菌多药物外排转运蛋白AcrB的结构由三个α螺旋亚基组成，连接形成围绕中心腔的漏斗(图5C)[91]。来自绿脓假单胞菌的多药输出体MexB也形成同型三聚体(图5D)[92]。据报道，吡啶并嘧啶衍生物是有希望的用于治疗多药耐药病原体的药物，通过特异性抑制同源三聚体AcrB和MexB转运蛋白[117]。ABC转运蛋白的结构架构最少包含两个TMD和两个NBD。这四个单独的多肽链结合形成完整的转运蛋白，例如在大肠杆菌BtuCD中[93]。虽然异二聚体的化学计量不是非常高，但是每个转运蛋白的ATP的化学计量比较高。它涉及摄取维生素B12。ModBC-A和MalFGK2-E的TMD的每个亚基有六个螺旋。这些独特的结构特征可用于目标考虑。
结论和展望
靶向具有较高化学计量的功能性生物单元允许更高的抑制效率。当靶向多聚生物复合物时，抑制效力遵循关于亚基拷贝数的幂规律，与靶向单亚基底物时药物-靶点结合亲和力的线性效应相比。本文所述的这个新概念表明，通过靶向具有高化学计量的生物复合物可以开发有效的药物，具有完全抑制靶标活性的潜力。可能的是，该方法可以进一步应用于指导开发用于有效基因治疗的显性阴性蛋白质，其可以并入多聚体蛋白质纳米机器并导致其活性的变化[94]。由于生物马达与病毒、细菌和细胞之间具有一定的共同结构和操作机制，因此该方法在药物开发中具有普遍适用性。
生命系统包含许多精美的阵列、马达和纳米机器，它们由多个相同的亚基组成。如这里报道的，这些同源生物复合物可以作为有效的药物靶标。例如，大多数ASCE家族成员都是六聚体[20，95-99]。由于这些机器在生命系统中是常见的，因此需要考虑特异性和毒性。在抗菌和抗病毒药物的开发中，特异性和毒性是没有问题的，因为靶点生物复合物与人细胞中发现的不同，因此所有靶标旨在被非特异性地杀死。在抗癌药物的开发中，癌细胞的多亚基生物复合体中的突变将成为有效药物开发的理想靶点。
专家意见
药物发现是一门多学科的科学，包括医学，生物技术和药理学领域。为了寻找一种开发具有超高效能药物的方法，已经对筛选新药物进行了大量的努力，发现新的药物靶点和揭示功能通路，但对于设计和开发更有效的药物的新方法的探索却几乎没有受到重视。在这里，我们提出给定药物的抑制效率取决于用作药物靶标的生物复合物或生物机器的化学计量。这里的“化学计量”的概念与药物开发中的常规概念不同。通常，化学计量是指结合到每个底物或细胞膜的药物分子的数目。在目前的研究中，化学计量指的是组成靶点生物复合物的相同亚基的数量。具有一系列可变但已知化学计量的P2129病毒组分被评估为模拟药物靶点以测试该假设。使用体外和体内病毒粒子装配测定来比较具有不同亚基化学计量的靶点的抑制效率。使用杨辉(Pascal′s)三角形(也称为二项分布)(图1)分析了病毒抑制效率，如方程2所示。
观察到病毒复制的抑制效率与药物靶点的化学计量相关。抑制效力遵循幂规律行为，其中未受抑制的生物复合物的百分比等于qZ(参见方程式2)。因此对于具有固定q和K值的系统，抑制效率取决于Z，即靶点生物复合物或生物机器中的亚基(亚单位)数。实验经验数据支持这一假设：具有10个亚基的靶点显示比具有6个亚基的靶点具有更高的抑制作用，其反过来表现出比单亚基靶点更高的抑制(图3)。本文中描述的用于开发有效药物的非常规假说，即相对于靶点化学计量的幂函数行为，对于制药领域的主流力量来说可能是外来的或甚至是古怪的。通过靶向具有高化学计量的蛋白质、RNA或其他大分子复合物来开发高效药物的方法从未有报道，因为证明这一概念面临挑战。
传统上，通过比较两种药物的功效来证明这一概念几乎是不可能的，其中一种药物靶向具有多个亚基的生物复合物。当报告这种新方法的效率时，在生物功能上区分两个靶点的本质是非常困难的，将两种不同药物与两种不同靶标的结合亲和力进行比较也是非常有挑战性的。例如，如果两种药物靶向两种化学计量不同的复合物，证明药物效能的差异是由于其靶点结合亲和力的差异或是由于生物体内靶点的基本水平的差异是非常困难的。
药物抑制的机制主要依赖于阻止基本生物靶向元件的功能。靶点元素可以是单体或多个同源亚基的复合物；例如六聚体ASCE超家族的生物马达[20，38]。常规药物被设计成靶向单个亚基分子以抑制发病机制，例如病毒的酶或结构蛋白。设计有效药物的关键是靶向Z＞1且K＝1的多亚基生物马达、机器或复合物，其中Z是复合物的化学计量，K是阻止整个复合物的功能所需的被药物结合的亚基的数量。类似于在串联电路圣诞装饰灯链中，一个破碎的灯泡将关闭整个照明系统。
在大多数(如果不是全部)多亚基生物系统中，利用顺序协调或协同作用机制，因此K等于1。药物抑制取决于被药物结合的复合物与未被药物结合的复合物的比例。对于K＝1且Z＞1，抑制功效相对于Z遵循幂函数，导致药物的效力增加，因为任何亚基的抑制导致活性的完全抑制。对于以靶向效率p靶向单亚基的药物，未与药物结合的保持活性的靶点分子的分数q为1-p。在这种情况下，抑制效率与底物靶向效率p成正比，抑制效率为p的一阶。多亚基复合物中的顺序作用或协同作用已经在生物系统中广泛报道[39-41]。靶向具有多个亚基的复合物的药物可以抑制复合物的活性，只要目标物的任何同源亚基失活。因此，如果该合作型复合物的拷贝数为Z＞1，抑制复合物活性需要阻断的亚基的最小数量(K)为1，则不受抑制的生物复合物的分数为qZ，抑制效率为1-qZ，其中1-q是受药物作用的亚基的部分。
二项分布分析可以预测抑制效率。例如，在靶向K＝1的六亚基生物复合物的情况下，抑制效率由药物与六个同型亚基中的任何一个结合而决定。因此，抑制任意位置处的任何亚基的概率，比抑制单体底物的概率高倍。通过对于靶向协同型多同型亚基复合物的概念的阐明和理解，新一代有效药物可能在不久的将来出现。
我们的发现是一种方法，而不是药物。这种方法将对许多疾病如癌症、病毒或细菌感染的药物开发产生一般影响。在生物系统中，具有高化学计量且通过顺序协同作用或与Z＞1和K＝1的配位方式操作的生物机器或复合物是普遍存在的。这类生物机器涉及病毒、细菌和真核细胞存活的关键细胞过程的许多方面。例如，多亚基生物马达参与伴侣、ATP酶，ATP合成酶、细胞有丝分裂、细菌二分裂、DNA复制、DNA修复、同源重组、Holliday连接解析、核孔转运、RNA转录、药物转运蛋白、肌肉收缩、病毒基因组包装以及细胞组分的运动、贩运和输出。这些系统使用类似于圣诞节装饰照明链的串联电路的顺序机制。因此，我们的方法将在许多生物系统的药物开发中有广泛的应用。靶向这些马达的药物将是高效的。
属于多亚基ATP酶的生物马达广泛分布于生物体中，包括细菌、病毒和癌细胞。成功实施这种新方法将导致下一代有效药物的开发。实际上，第一个被批准用于治疗多重耐药性结核病的药物，贝哒喹啉[4]，作用于ATP合成酶，该酶是一种多亚基生物马达[100-111]。治疗多重耐药性结核病以前是非常具有挑战性的。虽然这种药物的发明人没有意识到靶向多亚基复合物用于有效的药物开发的概念，但是这种药物克服强韧的结核分枝杆菌生物体的成功支持了使用多亚基复合物作为有效药物靶标的概念。可以使用癌细胞或细菌突变体多亚基ATP酶作为靶标。药物开发者可以简单地检查已发表的文献，并鉴定出多亚基机器作为药物靶标。对于癌症治疗，是找到具有突变的多亚基机器。
对于K＝1的高效抑制的概念可能对基因或蛋白质治疗有影响。通过将显性阴性蛋白[94]或无活性突变蛋白引入至细胞，通过细胞内表达或直接引入蛋白质，其类似于用于phi29DNA包装运动马达的上述方法和机制[13，14，45，112](图9)。这涉及将细胞内表达或直接引入的突变蛋白掺入被鉴定为靶点单元的高度多聚体复合物中。为了用作小分子药物靶点，可以鉴定多聚体复合物，使得一个药物分子与复合物上的任何一个结合位点的结合将使整个复合物失活。由Z个亚基组成的复合物具有一个被药物作用的亚基将会起作用，因为药物浓度高。然而，如果该策略是表达一种显性阴性蛋白质，正如近来使用显性阴性磷脂酰胆碱治疗进行心脏基因疗法一样[94]，将获得高抑制效果。Z的值越大，显示性阴性蛋白质亚基或突变体亚基的影响越多。
另一种可能是使用同型药物转运蛋白[113，114]作为药物靶标(贝第5.3节)。药物转运蛋白的机制非常类似于公转马达的以ATP诱导的熵变化为特征的机制。靶点复合物的高化学计量是实现高药物效率的关键考虑因素。靶向具有高化学计量的多药物外排转运蛋白对于开发用于治疗多重耐药性疾病的药物具有更好机会。
虽然这种方法的假设在理论上可能看起来具有挑战性，但是该机制的阐明应该极大地促进了这种方法的应用。药物开发的两个因素是必不可少的：效率和特异性。本文描述的策略侧重于药物效率，而特异性与化学品和药物开发中的一般考虑相似。然而，仍然可以将有效药物设计到普通机器或一般靶点上。例如，如果在一种特定类型的癌细胞中发现致癌突变型六聚体ATP酶，则靶向该改变的ATP酶的该突变的药物不仅将是高效的而且是特异性的。
使用多亚基同源复合物如具有高化学计量的AAA+家族ATP酶、生物马达或药物转运蛋白，可导致高效药物的开发。
大多数多亚基复合物以顺序和协同的方式工作，即K＝1，这是这些复合物用作靶点开发有效药物的关键。
细菌病毒Phi29DNA包装马达含有许多具有不同化学计量的多亚基组分；阐明药物开发中化学计量的概念是一个很好的模式。
多亚基复合物如生物马达或ATP酶在自然界中广泛存在。因此，该方法应广泛应用于新药开发。例如，使用ATP合成酶作为药物靶点已经导致开发出用于治疗多药耐药性结核病的新药物。
第3节
摘要
目的：寻找一种开发有效药物的方法，并证明药物抑制效力取决于所靶向的生物复合物的化学计量的假说。
方法：使用Phi29DNA包装马达组分来测试该模型的不同化学计量。使用杨辉三角测定了病毒装配效率：
其中Z＝化学计量，M＝每个生物复合物中被药物结合的亚基，p和q代表群体中被药物结合的亚基的分数和未被药物结合的亚基的分数。
结果：抑制效率遵循幂函数。当阻断生物复合物功能的被药物结合的亚基的数量K＝1时，不受抑制的生物复合物的分数等于qZ。因此，化学计量对抑制具有乘法效应。具有一千个亚基的靶点具有最高的抑制作用，其次是具有六个亚基和单个亚基的那些。当Z＝6时，发现完全抑制病毒复制。
结论：药物抑制效率取决于所靶向的生物复合物或纳米机器的成分的化学计量。抑制效应遵循靶点生物复合物的化学计量的幂函数。
介绍
细菌、病毒和细胞含有由多个亚基组成的生物复合物和纳米机器，如生物马达，泵，外来体，瓣膜，膜孔，伴侣蛋白，PCNA，ATP酶和管。从纳米技术的角度来看，这些纳米机器可以被使用和转换，以构建复杂的纳米器件，包括分子传感器、图案化的阵列、致动器、芯片、微机电系统(MEMS)、分子分类器、单孔DNA测序装置或其他革命性的电子和光学器件。从制药的观点来看，这些多亚基生物复合物或纳米机器具有用作药物靶标的潜力，用于疗法以及诊断应用，例如病原体检测、疾病诊断、药物递送和疾病治疗。在细菌、病毒和细胞的ASCE(附加链催化E)家族中，包括AAA+(与不同细胞活性相关的ATP酶)和FtsK-HerA超家族，存在执行广泛功能的纳米马达，对于染色体分离、细菌二元裂变、DNA/RNA和细胞成分转运、膜分选、细胞重组、细胞分裂、RNA转录以及DNA复制、骑乘、修复和重组至关重要。NIH路线图的一个方向是利用这些细胞纳米机器和生物复合物进行生物医学应用。
获得性耐药性已成为一系列疾病(即化疗癌症，细菌或病毒感染)治疗失败的主要原因。癌症耐药性升高，是2012年美国死亡人数达到600,000人的部分原因。艾滋病毒耐药性也成为主要问题。许多常见的病原体已经变得抵抗目前的药物治疗，新的传染病越来越多。在生物武器中使用多重耐药制剂造成了以前未实现的挑战。因此，需要开发新的治疗策略，制定新的药物开发方法来抵抗耐药性。
FDA批准的首例用于治疗多重耐药性结核病的药物，贝哒喹啉，遵循抑制结核分枝杆菌和其他分枝杆菌种细菌ATP合成酶的新机制，但对其他细菌几乎没有活性。为了对抗癌症中的多重耐药性，已经探索了几种方法。一种方法是靶向对生物实体生长非常重要的成分。另一种方法使用纳米药物递送载体，其预期将增强药物对癌细胞的结合效率，或使用鸡尾酒疗法。第三种方法是开发新型组合药物，通过作用于多个靶点而具有更高的效力。这涉及确定多个靶点，治疗时导致协同效应和优化多靶点配体的设计。
通过靶向具有高化学计量的蛋白质或RNA复合物开发高效药物的方法从未报道，因为在比较两种药物的功效方面存在的挑战，即可能将靶点基本性与结合亲和力相混淆。例如，如果两种药物靶向两种化学计量不同的靶标，证明药物效能的差异是由于其靶点结合亲和力的差异还是由于生物有机体的生长中基本水平的差异是非常困难的。为了量化靶向不同化学计量的生物复合物的作用，需要经过充分研究的多组分系统，其允许实验性比较由不同数量的亚基组成的各组分的功能抑制。
一个纳米机器的例子是dsDNA易位马达，其ATP酶蛋白是组装成六聚体环结构的关键组分，并将ATP结合和水解的作用转化为机器运动以物理位移DNA。噬菌体phi29(图12A)的DNA包装马达由三个基本同轴的环组成：1)位于病毒原壳体的顶点的十二聚体连接环；2)与连接子的N末端结合的六聚体包装RNA(pRNA)环(图12A，B)，以及3)连接在pRNA螺旋区上的ATP酶gp16的六聚体环，通过ATP水解导致DNA包装。1997年首先报道了使用杨辉三角或二项分布来确定pRNA的化学计量。近来已经报道了使用类似的数学方法来确定蛋白质亚基的化学计量。包装一个完整的phi29基因组dsDNA所需的ATP分子拷贝数预测为10000。最近已经表明，这种六聚体马达使用公转而不自转的机制来转运其基因组DNA。
在本报告中，我们假设药物的抑制效率与其所靶向的生物复合物的化学计量相关；靶点复合物的化学计量越高，药物效率越高。这可以导致开发有效治疗剂，以高化学计量生物机器或生物复合物作为药物靶标。我们使用突变亚基作为受药物作用的无活性靶标通过二项分布计算理论抑制效率证明了这一假设，并与来自确定的体外病毒装配系统的实验数据进行比较。由于生物分子具有一定的共同结构和操作机制，这里报道的药物开发方法应该具有一般应用，特别是在开发新一代药物以抵抗病毒、细菌和癌症中日益增长的获得性耐药性。
材料和方法
突变基因组dsDNA的制备
如前所述，通过CsCl梯度超速离心从枯草芽孢杆菌SpoA12细胞纯化Phi29基因组DNA-gp3。通过在快速消化缓冲液(Fermentas)中，用EcoR1限制性内切酶在37℃下消化phi29基因组双链DNA1小时，然后乙醇沉淀，制备突变体dsDNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳测试突变体DNA，用溴化乙锭(Sigma)染色并通过台风(Typhoon)(GE)成像。
突变型pRNA的制备
通过体外转录制备野生型phi29pRNA和作为被药物化的pRNA的无活性突变体。在无活性突变体pRNA中，位于5′端的前四个碱基“UUCA”(SEQ ID NO：11)被突变为“GGGG”(SEQID NO：11)。在两个RNA的PCR反应中使用BgIII消化的质粒pRT71作为DNA模板。寡核苷酸5′-TAATAC GAC TCA CTATAG GGG TGG TAC-3′(SEQ ID NO：12)和5′-TTATCAAAG TAG CGT GCAC-3′(SEQ ID NO：13)用作突变型pRNA的引物。然后如前所述，使用由PCR产生的双链DNA，由T7RNA聚合酶转录RNA。如前所述，通过8M尿素8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化来自体外转录的RNA。
突变型ATP酶gp16的制备
之前已经描述了野生型gp16的纯化。通过在gp16基因中引入突变来构建Walker B突变体gp16。gp16的Walker B基序中的氨基酸残基D255和E256分别突变为E255和D256。使用适当的引物用Stratagene Quick Change定点诱变试剂盒引入突变。按照公开的方法进行蛋白质的表达和纯化。
反义寡核苷酸
反义寡核苷酸P3和P15被设计为与pRNA分子上的不同区域反向互补且通过IDT化学合成。P3寡核苷酸(5′-TTGCCATGATTGACAAC-3′(SEQ ID NO：14))靶向pRNA的3′端的83-99个核苷酸的区域，P15寡核苷酸(5′-AAGTACCGTACCATTGA-3′(SEQ ID NO：15))靶向pRNA的5′末端的1-17个核苷酸区域。P8寡核苷酸(5′-TAATACGACTCACTATAGGGGTGGTAC-3′(SEQ IDNO：16))被设计为测试中的非靶向对照。将100μM的各寡核苷酸lμl与4μM的pRNA1μl混合，并在0.025μm型VS滤膜(Millipore Corp)上针对TBE缓冲液(89mM Tris-HCl，pH 8.3，89mM硼酸，2.5mM EDTA)在室温下透析15分钟。纯化的RNA复合物用于体外phi29装配测定。
体外phi29装配测定
如前所述将纯化的组分进行体外病毒装配测定。简言之，将10g纯化的原壳体与在5μl反应缓冲液(10mM ATP，6mM 2-巯基乙醇和3mM亚胺在TMS缓冲液中)中的100ng pRNA于室温下混合30分钟。然后加入纯化的DNA-gp3和gp16，并将反应混合物在室温下温育1小时以引发DNA包装。最后，将DNA填充的原壳体与10μl来自大肠杆菌的含有质粒pARgp8.5-9的gp8.5-9提取物和20μl来自大肠杆菌的gp1-14提取物一起温育以完成感染性噬菌体组装。
用接种的枯草芽孢杆菌Su+44细胞将新组装的感染性病毒铺到覆盖有顶部琼脂的半LB板上。在37℃温育12小时后，通过计数形成的斑块数来计算病毒装配效率(斑块形成单元，PFU)。将不同比例的突变体与野生型成分混合，同时保持所有其他成分相同，病毒装配效率(PFU)与突变成分比率给出了病毒组装抑制试验的经验曲线，并将其与来自二项式分布方程的理论曲线进行比较。
体内病毒装配测定
根据先前所描述的方法，将编码pRNA序列和T7启动子的片段连接到pRB381-L550载体(由M.Wang和H.Zalkin修饰和亲和提供)，构建了在T7启动子下含有pRNA编码序列的质粒pRBwtRNA。质粒pRBmutRNA在其天然启动子PEI序列下含有突变型pRNA，并且突变将其3′端的序列5′UUGA-3′(SEQ ID NO：17)改变为5′GGGG-3′(SEQ ID NO：18)。如前所述，通过PCR制备编码突变型pRNA序列和PEI序列的DNA片段；并用HindIII-BglI限制性酶消化。将突变型pRNA序列编码片段与来自pRB381-L550的6.0kb片段进一步连接，该片段用HindIII消化并用BglII部分消化。
将质粒pRBmutRNA，pRBwtRNA和pRB381-L550按照前述方法转化到枯草芽孢杆菌细胞中。将含有转化质粒的枯草芽孢杆菌细胞在含有10mg/m1新霉素的416培养基中在37℃下温育3小时，然后铺在LB-新霉素(10mg/ml)板上用于斑块形成分析。
结果
“化学计量”的定义。
本报告中化学计量的定义与用于评估药物效率的化学计量的常规定义不同。通常，化学计量的概念是指与每个靶点分子结合的药物的数量，其也称为Bmax。在这项研究中，化学计量的定义是指作为药物靶标的生物复合物或纳米机器中亚基的拷贝数。
“K值”的定义，K＝1是超高抑制功效的一个关键
假设生物复合物药物靶标含有Z拷贝的亚基，则K是抑制复合物或纳米机器功能所需的被药物结合的亚基的拷贝数(K≤Z)。与并联电路和串行电路的区别类似，当圣诞灯布置在并联电路中时，任何被烧毁的灯泡都不会影响其他灯泡。但是在串行电路中，任何一个坏掉的灯泡都会导致整个照明系统的停止，这就是K＝1。因此，K值是所有亚基的组合和置换对非活性纳米机器或生物复合物的概率的影响。K等于1对于这种超高抑制效应是至关重要的。本报告中的方法的基础是使用组合和置换算法在不同K值系统中抑制生物复合物的概率差异。生物系统显示复杂的反应。许多反应涉及多个亚基按顺序或逐步协同工作以完成一个重要的生物学功能。在病毒装配系统中已经报道了单一装配途径。在大多数顺序、协同和进行的情况下，任何一个(不必全部)亚基的失活将导致其功能的抑制，因此K＝1，药物协同作用被用于多靶点药物治疗；简而言之，药物组合可以同时作用于疾病网络中的多个靶标以产生协同效应。然而，我们在这里报告的设计与传统的协同方法是不同的。我们建议使用多亚基生物复合物作为药物靶点可能导致超高效药物的开发。在常规六组分系统中，例如一种药物被设计成靶向组件#3以停止整个系统，因为该药物只能靶向组分#3，该情形符合Z＝1和K＝1的模型。因此，药物的抑制效率和底物靶向效率(p)将呈线性关系。然而，在本报告的系统中，当药物靶向六聚体的任何亚基时，整个系统将被阻止，该情形为Z＝6和K＝1。因此，剩余的未被药物结合的靶点的概率将为q6，其中q表示六聚体的非靶点的亚基的分数；换一种说法，药物抑制效率将为1-q6，与常规单亚基方法的线性相比，药物抑制效率以幂函数的方式增加。
假设需要至少K个拷贝的被药物结合的亚基以使纳米机器或生物复合物失活，则在存在各种比例的被抑制的亚基和野生型亚基的情况下，可以从方程式2预测功能性生物复合物的概率。当K＝1时，意味着与一个亚基结合的药物将使该亚基失活，并且多亚基复合物的一个药物化亚基足以抑制复合物的整体功能。靶向化学计量为Z的多亚基生物复合物的药物的抑制效率将等于1-qZ，如表2所示。当Z＝6和K＝1时，这种概率计算的一个例子如下：因为假设功能需要每个元素的6个(Z＝6)个亚基，则一个药物化的亚基(K＝1)足以阻止其活性，含有1至5个拷贝的药物化亚基的所有元素将是无功能的(图1C)。只有具有6个正常亚基的复合物才能起作用。在一个群体中含有6个未受影响的亚基的复合物的机会为q6，抑制效率为1-q6。
选择多亚基生物复合物作为有效药物靶标的理由
药物抑制生物体生长的机制是阻止或停止基本的生物元素起作用。当药物被设计成以靶向效率p靶向复合物的亚基时，一部分亚基将不与药物相互作用(百分位数记为q，p+q＝1)，并且将保持活性并发挥其功能。一些生物元素是仅含有一个亚基的单体，而其他生物元素，例如六聚体AAA+家族的生物马达，由多亚基组成。传统药物被设计为通过靶向单个亚基分子(例如病毒的结构蛋白或酶)来抑制发病机制。在这种情况下，抑制效率与底物靶向效率p成正比，效应与p的一阶成正比。如上所述，在多个亚基复合物中的顺序作用或配合作用的大多数情况下，一个亚基的失活将导致其功能的抑制。因此，如果含有Z个亚基的复合物以顺序和协同的方式运行其功能，则K＝1，并且未抑制活性的生物复合物的分数将为qZ，相对于化学计量比较高。抑制比例将等于1-qZ。
在这项调查中，使用了明确的体外phi29病毒装配系统来表示多亚基纳米机器靶点，突变成分代表已被有效药物灭活的靶点组分。然后，通过靶向具有不同化学计量的phi29DNA包装马达的不同元素，来比较抑制效率。病毒组装竞争测定与二项式分布分析结合说明，靶向具有较高化学计量的功能生物复合物的药物与作用于单个亚基靶点的药物相比具有更高的效率。
当靶点元素是仅含有一个亚基的单体时，可以通过二项式分布(方程式1)计算抑制效率，其中p和q分别是被药物结合的亚基(底物靶向效率)和未与药物结合的亚基(正常活性元素)的分数(p+q＝1)。
X＝(p+q)1 (1)
然而，当目标元素包含多个亚基时，应用高阶二项分布(方程式2)，通过找到所得到的活性和非活性复合物的比例来计算药物抑制作用，其中Z表示一个生物复合体中亚基的总数(化学计量)，M表示一个生物复合物中的被药物结合的亚基的数目。
注意，等式2中所示的二项分布也可以表示如下：
本文阐述了基于二项式方程的计算结果。结果的上下文决定了使用哪种形式的方程。
例如，如果Z为3，则可以通过等式2的扩展来确定给定生物复合物实体中药物化亚基(M)和未结合药物的亚基(N；M+N＝Z)的所有组合的概率：(p+q)3＝p3+3p2q+3pq2+q3＝1。也就是说，复合物元素在群体中具有三个药物化亚基的概率为p3，具有两个药物化和一个未药物化或野生型亚基的概率为3p2q，具有一份药物化亚基和两份未与药物结合的亚基的概率为3pq2，具有3个未与药物结合的亚基的概率是q3。假设群体中通过结合药物被灭活的亚基有70％(p＝0.7)，30％(q＝0.3)的亚基未受影响，那么具有至少两个拷贝的正常亚基元件的百分比将是具有一份药物化亚基和两个未药物化野生型亚基的那些元素，3pq2，与具有三个拷贝的天然亚基的那些元素，q3，之和。那么3pq2+q3＝3(0.7)(0.3)2+(0.3)3＝0.216＝21.6％。在另一个例子中，如果一个复合物含有6个亚基，并且6个亚基中的5个需要保持不受限制以具有生物功能性，群体中的活性复合物比例将是以下概率之和：1)每个元素含有5个未被药物结合的亚基的概率，2)每个元素含有6个未被药物结合的亚基的概率。
可以通过二项式分布来预测显示群体中已被药物作用的亚基和未被药物作用的亚基的某一组合的概率X，如等式2所示。表1显示了在群体中被药物作用的亚基的百分比增加时，具有M个被药物作用的亚基和N个未被药物作用的亚基的给定元素的概率，一个元素中的总亚基数(Z)为3或12。使用公式(来自方程2)来计算每种组合的概率值，该方程中的系数可以使用杨辉三角(也称作Pascal三角)或二项分布来计算(图12B)。
用于测试所述假设的体外病毒组装系统
使用高度灵敏的体外phi29装配系统来确定药物靶向多亚基复合物的抑制效率。噬菌体phi29DNA包装马达含有一个基因组双链DNA，6个拷贝的包装RNA，6个拷贝的ATP酶蛋白gp16和超过10000个拷贝的ATP。phi29中RNA的化学计量已经通过广泛的研究被证实，这样的研究包括单分子研究、AFM图像(图1D)、pRNA晶体结构测定(图1E)和数学研究。phi29中gp16的化学计量已经通过多种方法证实，这样的方法包括天然凝胶结合，毛细管电泳测定，Hill常数测定，以及使用二项分布的突变体亚基滴定。已经发现许多其他AAA+超家族成员也是六聚体，例如红色rubisco活化酶AAA+蛋白CbbX(图12F)，MecA-ClpC分子机(图12G)。基于以下事实计算ATP分子的拷贝数，6个ATP分子需要用10.5个碱基对(bp)包装一个间距的dsDNA，因此使用1个ATP包装1.7bp。整个phi29基因组由19.4kbp组成，因此，预计需要超过10000个ATP分子来包装整个phi29基因组。将整个基因组DNA包装入原壳体的phi29DNA纳米马达可以作为疾病模型用于药物抑制效率分析。
使用化学计量为1的DNA元素体外测试所述假定
通过突变基因组dsDNA的体外phi29组装抑制来测试靶向单个亚基底物的药物的抑制效率(图13A)。在体外病毒装配测定中，各种比例的突变型DNA与野生型DNA混合。病毒组装效率相对于药物突变型DNA比例的经验曲线与Z＝1和K＝1的二项分布的理论曲线吻合良好(图13B)。这表明当设计靶向phi29纳米马达中的基因组DNA的药物时，预期其是一级抑制反应。比较体外phi29组装抑制作用，通过添加药物突变体DNA，以简单稀释的野生型DNA浓度作为对照，显示药物化突变体DNA没有引起太大差异(图13C)。结果表明，以化学计量为1的底物为靶点的药物的抑制作用最小。
使用化学计量为6的RNA元素在体外测试所述假定
phi29的pRNA含有两个结构域；一个是对于原壳体结合必需的结构域，一个是对于DNA易位必需的螺旋结构域(图14A，上图)。两对pRNA分子的右手环和左手环可以通过互补碱基配对相互作用。广泛的研究已得出结论：6个拷贝的pRNA形成六聚体环，其结合到原壳体上用于病毒活性。通过在pRNA的5′末端区域突变4个核苷酸序列构建药物化突变型pRNA(图14A，下图)，已被证明其与野生型pRNA的原壳体结合进行竞争，但是发现其缺乏DNA包装的发生。图14B示出了总亚基数Z为6，K值由1变化至6时，使用二项分布方程的扩展产生的理论曲线。将不同比例的药物突变型pRNA的噬菌体组装效率的实验数据与理论曲线拟合，实验数据符合Z＝6和K＝1的理论曲线。这表明pRNA寡聚体环由6个拷贝的pRNA亚基组成，pRNA多聚体中一个亚基的阻断足以阻断噬菌体组装活性。比较病毒装配效率与不同比例的药物突变型pRNAs和野生型pRNA浓度稀释对照的经验曲线，添加药物突变型pRNA显示出更强的抑制作用(图3C)。
为了进一步证明药物靶向具有高化学计量的生物复合物导致更强的抑制作用的概念，设计了可以与pRNA分子结合的反义寡核苷酸作为病毒装配测定中的模拟药物。设计寡核苷酸P15和P3分别靶向pRNA上的5′端和3′端区域。通过凝胶移位测定法，证实反义寡核苷酸可以与pRNA杂交(数据未显示)。当将反义寡核苷酸与野生型pRNA混合用于体外phi29装配测定时，反义寡核苷酸P15和P3显示完全抑制作用，但不与非靶向对照寡核苷酸P8结合。通过将非靶向寡核苷酸P8与pRNA混合，其在板上产生4.4×106PFU的斑块
使用化学计量为6的RNA元素在体内测试所述假定
已经通过生物化学和结构研究和活性测定法发现phi29dsDNA包装马达中pRNA的六聚体环的形成。通过药物化突变型pRNA在体外phi29装配观察到的高抑制效率是惊人的。为了测试体内是否达到这样高的抑制水平，在3′端表达具有4个碱基突变的pRNA的pRBmutRNA质粒(图15A)被转化到枯草芽孢杆菌DEI细胞中。质粒pRBwtRNA含有pRNA编码序列，但不在枯草芽孢杆菌DEI细胞中表达pRNA，引入载体pRB381-L550以及阴性对照。结果表明，只有携带pRBmutRNA质粒的细胞才能完全抵抗由野生型phi29病毒感染导致的斑块形成。对照组细胞，包括单独的枯草芽孢杆菌12A细胞、单独携带载体pRB381-L550的枯草芽孢杆菌DE1细胞和携带野生型pRNA编码序列但没有表达质粒pRBwtRNA的细胞，对于斑块形成都是阳性的(图15B)。通过质粒pRBmutRNA在细胞中产生的突变型pRNA的能力完全抑制斑块形成，表明DNA包装纳米马达中的六聚体pRNA可能是开发有效的抗病毒剂的潜在靶标。
使用化学计量为6的ATP酶进行体外检测
已经发现phi29dsDNA包装马达中ATP酶gp16蛋白的六聚体折叠。六聚体gp16蛋白复合物像许多其他AAA+超家族成员一样起着ATP酶的作用。ATP结合到gpl6的一个亚基，刺激ATP酶将其构象从具有较低亲和力的构象改变为对dsDNA具有更高亲和力的结构。
通过体外噬菌体组装测定，基于野生型和Walker B突变型gp16的二项分布，进行gp16化学计量的测定。将不同比例的药物化Walker B突变型gp16与未与药物结合的gp16混合，以测试gp16突变对phi29DNA包装马达的抑制效率。假设K等于1，gp16的总拷贝数(Z)在1和12之间，则根据方程式2，产生了phi29病毒粒子相对于WalkerB突变体的比例的12个理论曲线，对应于化学计量(Z)为1至12。实验数据几乎完全与Z＝6，K＝1的理论曲线重叠。该数据表明，phi29DNA包装马达的ATP酶gp16成分的化学计量为6，仅仅一拷贝的被药物结合的gp16即可以阻断phi29马达功能。比较以不同浓度添加突变体gp16与野生型gp16的抑制效果，表明添加突变体gp16与野生型gp16浓度稀释对照相比具有更强的抑制作用(图16A)。比较突变对六聚体gp16的抑制作用与突变对单亚基靶点DNA的影响，gp16突变与相同比例的DNA突变相比显示出更强的对病毒组装的抑制作用，说明病毒组装系统的六聚体ATP酶蛋白复合物也应该是产生具有高效力的新型抗病毒药物的有效靶点。
使用化学计量超过10000的ATP进行体外测试
据报道，需要使用6个ATP分子来包装一个间距的具有10.5bp的dsDNA[90]，因此1个ATP用于包装1.7bp。由于整个phi29基因组DNA具有19,000个碱基对，预计需要超过10000个ATP分子来包装整个phi29基因组。由于关于ATP，图5中显示的功能单元是病毒生产，表达为斑块形成单元(PFU)，因此PFU的一个功能单元的产生需要10000个ATP亚基来包装一个基因组DNA。因此，一个phi29纳米马达中的ATP可以被认为化学计量是10000的。将一种不可水解的ATP类似物yS-ATP进行处理作为药物化的亚基，其与ATP以不同比例混合，以测试yS-ATP对phi29的装配效率的抑制作用。发现，突变ATP的抑制曲线符合Z＝100，K＝1至Z＝60，K＝1之间的理论曲线(图16B)。从二项分布测定得出的实验ATP值与实际情况不同，因为二项分布方程基于的条件是每个亚基对所靶向的纳米马达中的生物复合物具有相同结合亲和力，但是由于yS-ATP结构的变化，其对于ATP酶gp16的结合亲合力低于正常的ATP。此外，每个亚基中的亲和力差异在纳米马达的活性中具有乘法效应。因此，预测的Z值和实验Z值的曲线之间存在很大的差异。
使用不同组分比较病毒组合抑制作用，y-S-ATP显示出严重的抑制作用(图16C)。加入20％的γ-ATP几乎完全抑制病毒组装。比较靶向化学计量分别为10000、6、6和1的ATP、pRNA、ATP酶gp16和DNA抑制作用，yS-ATP显示出最强的抑制作用，而药物突变型pRNA和突变体gp16与突变体DNA相比则显示更强的抑制作用(图5C)。例如，加入20％的突变体DNA在病毒装配中引起20％的抑制作用，而添加20％的药物突变型pRNA则对病毒组装产生了74％的抑制作用，20％的y-S-ATP几乎完全抑制了病毒组装，表明化学计量越高，抑制效果越强。
增加抑制功效的数学推理
使用具有较高化学计量的生物复合物作为药物靶标将显着降低未被抑制的复合物的比例。对于K＝1，未被抑制的复合物的比例为qZ。表3比较了当K＝1时，具有Z＝6和Z＝1的两个群体的未被抑制的复合物的比例与不同的底物靶向效率(p)。例如，当q＝0.4时，对于Z＝1，K＝1，未被抑制的复合物的比例为qz＝0.41＝0.4。因此，只有1-0.4＝60％的复合物被抑制。相反，对于Z＝6，K＝1，未被抑制的复合物的比例为qz＝0.46＝0.0041。因此，1-0.0041＝99.59％的复合物被抑制。未被抑制的复合物的比例等于0.0041/0.4＝0.0102，表明未被抑制的复合物的比例降低1/0.0102＝98倍。另一个例子是使用药物靶向效率p＝0.9来比较Z＝6和Z＝1的两组之间的抑制效率。对于Z＝6，K＝1，被抑制的复合物的比例为1-qZ＝1-0.16＝0.999999。未被抑制的复合物的比例为qz＝0.16＝1E-6。对于Z＝1，K＝1，被抑制复合物的比例为1-qZ＝1-0.1＝0.9。未被抑制的复合物的比例是qz＝0.1。抑制效率的比等于1E-6/0.1＝IE-5，表明抑制效率增加10000倍(表3)。
该方程式显示具有化学计量幂函数的抑制效应，因为当K＝1时，群体中不受抑制的生物复合物的百分比等于qZ。由于(P+q)＝1，因此q≤1，因此Z越大，qZ的值就越小，即化学计量越高，不受限制的背景数越少。以相同的底物靶向功效p，抑制效率由z确定，即方程组分的幂。抑制效应是关于化学计量的幂函数。因此，化学计量越高，与具有相同结合亲和力的药物比较效果越好。
半数最大抑制浓度(IC50)通常用于评价药物作用，其定量地表明需要多少特定的药物以将给定的生物过程抑制一半程度。如果我们将PlC50表示为在所定义的系统中在体外测定中达到50％抑制所需的药物亚基的百分比，则1-(1-PIC 50)Z＝50％。求解这个方程，PIC50＝1-0.51/z。图17显示化学计量(Z)和达到抑制作用(IC)的药物靶向水平p之间的关系，其中p是药物结合功效和药物浓度(剂量)的组合结果。当使用Z化学计量的生物复合物作为药物靶点时，达到IC50，IC25或IC75的药物剂量或由药物化亚基的百分数所表示的该药物的结合亲和力降低。这清楚地表明，当Z增加时，减少(图17)，因此药物更有效。
讨论
为了寻找一种开发具有超高效能药物的方法，我们提出给定药物的抑制效率取决于用作药物靶标的生物复合体或生物机器的化学计量。在这里，化学计量的定义不同于用于评估药物效率的化学计量的常规定义。药物开发中的常规思考强调化学计量，其指每个靶分子的药物结合数，也称为Bmax。在这项研究中，化学计量的定义是指作为药物靶点的生物复合物内亚基的拷贝数。我们使用Phi29病毒组分与一系列可变但已知的化学计量作为模拟药物靶点来测试假设。采用体外和体内的病毒组装试验来比较具有不同数目的亚基化学计量的组分的抑制效率。用杨辉(Pascal′s)三角形(或称为二项分布)分析病毒抑制效率。发现病毒复制的抑制效率与作为药物靶标的纳米机器的组分化学计量相关。它表现出幂规律抑制效应，因为当K＝1时，群体中不受抑制的生物复合物的百分比等于qz。以相同的q和相同的K值，抑制效率由z确定，即作为药物靶点的生物复合物或生物机器中的亚基数确定。这里z作为方程中的幂，因此，抑制作用是化学计量的幂。实验数据表明，具有上千个亚基的靶标显示出比具有六个亚基的靶标更高的抑制作用，反过来高于具有单个亚基的靶标。
在药物作用评估中，常用两个参数。一个是半最大抑制浓度(IC50)，其定量地表明需要多少特定的药物以将给定的生物过程抑制一半程度。它被普遍用作药物研究中药物效力的量度。另一个重要参数是中位数致死量(LD50)，也称为致死浓度的50％(LC50)。LD50经常用于表示物质急性毒性。显然，药物的有用性将取决于LD50与IC50的比例。这个比例越大，药物越安全。通过靶向高化学计量的组分提高抑制效率，药物的IC50将降低。因此，为了达到期望的效果，需要较低浓度的药物，导致药物的毒性降低。
目前大多数抗癌、抗病毒或抗菌药物都是针对单一酶或单一蛋白质。我们的数据显示，选择用于靶向具有高拷贝数的组分、生物复合物或纳米机器的药物，可导致更高的疗效，可以解决药物低效和多药耐药的问题。
结论
靶向具有更高化学计量的功能生物单位将具有更高的抑制效率。抑制效果是幂，而不是比例，所述幂即是机器的被药物靶向的组分的拷贝数。本文开发的新理论表明，通过靶向具有高化学计量的生物复合物可以开发有效的药物，如果鉴定出具有高化学计量的生物机器，则可以完全抑制病毒、细菌或癌症。由于生物马达在病毒、细菌和细胞中具有一定的共同结构和操作机制，因此在药物开发中应具有一般应用。
未来展望
生命系统包含许多优雅的阵列、马达和纳米机器，其都是多亚基的复合物。如这里报道的，这些生物复合物具有高拷贝数的组分，可以作为有效的药物靶标。例如，AAA+家族的大部分成员都是六聚体。然而，这些机器在生命系统中是常见的，因此特异性和毒性是一个问题。对于细菌和病毒，由于我们的目标是非唯一地杀死它们，只要靶点生物复合物与人体不同，特异性和毒性就不是问题。对于癌症药物，只要在多亚基生物复合物中发现突变，它将是有效药物的理想靶标。
执行摘要
目的
寻求开发有效药物的方法。
不受理论的约束，药物抑制效力取决于所靶向的生物复合物的化学计量。
方法：
使用具有不同化学计量的Phi29病毒组分作为模型来证明该假设。
使用杨辉三角测定和分析病毒组装效率：
结果：
抑制效率显示了靶点生物复合物的化学计量的幂函数。不受抑制的生物复合物可以等于qz。因此，抑制作用是化学计量的幂。
具有上千个亚基的靶标比具有六个亚基的靶标显示更高的抑制作用，反过来高于单个亚基的靶标。
当使用具有高化学计量的靶作为目标时，证明完全抑制病毒、细菌或癌症。
结论：
药物抑制效率取决于所靶向的生物复合物或纳米机器的成分的化学计量。
抑制效应显示了靶点生物复合物的化学计量的幂函数。
由于生物马达在病毒、细菌和细胞中具有一定的共同结构和操作机制，这种方法应该在药物开发中有一般应用。
最后，为了进一步说明本发明的特征、益处和优点，特此提供附件A-F，其全部内容通过引用并入本文中，包括附件A-F中所引用的参考文献。
以下两个出版物(下文第00295和00296段阐述)通过引用整体并入本文。
利用所靶向的纳米机器或生物复合物的化学计量的幂函数开发超高抑制药物的新方法。出版期刊和日期：Nanomedicine(Lond).2015年7月；10(12)：1881-97.doi：10.2217/nnm.15.37。
利用同源生物复合物或生物纳米马达的化学计量的幂函数开发有效药物的新方法的发现。出版期刊和日期：Expert Opin Drug Deliv.2016年1月；13(1)：23-36。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请，包括以下列表中列出的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同各个出版物、专利或专利申请被具体地和单独地表示为通过引用并入本文。
附件A
该附件A中的文献编号对应于第1节(和图1-6)中的文献编号
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附件B
该附件中的表格对应于第1节中的表格
表1
复合物含有M个被药物结合的亚基和N个未被药物结合的亚基的概率
表2靶向生物复合物的药物的预期抑制效率，K＝1
表3当K＝1但具有相同药物靶向效率时，Z＝6与Z＝1之间未受抑制的复合物占比的比较
附件C
该附件中对于附件A中的某些文献提供概要
1**.Guo P，Zhao Z.Haak J，Wang S，Weitao T.Common Mechanisms of DMAtranslocation motors in Bacteria and Viruses Using One-way RevolutionMechanism without Rotation.Biotechnology Advances.32，853-872(2014).
概要：本综述报道了细菌和病毒中普遍使用公转机制，其避免在易位冗长基因组双链DNA螺旋时发生DNA卷绕。
19*.Schwartz C，De Donatis GM，Fang H，Guo P.The ATPase of the phi29DMA-packaging motor is a member of the hexameric AAA+superfamily.Virology 443，20-27(2013).
概要：本文证实了phi29马达中ATP酶的化学计量是六聚体，并提供了数据表明phi29马达ATP酶属于经典的六聚体AAA+超家族。
33*.Schwartz C，De Donatis GM，Zhang H，Fang H，Guo P.Revolution rather thanrotation of AAA+hexameric phi29nanoniotor for viral dsDNA packaging withoutcoiling.Virology 443，28-39(2013).
概要：本文介绍了phi29中的纳米马达如何利用六份拷贝的ATP酶进行公转机制。
36**.De-Donatis G，Zhao Z，Wang S et al.Finding of widespread viral andbacterial revolution dsDNA translocation motors distinct from rotation motorsby channel chirality and size.Cell&Bioscience 4，30(2014).
概要：本文报道了公转马达纳米机器在生物系统中广泛存，可以通过通道大小和手性与自传马达进行区分。
51**.Fang H，Zhang P.Huang LP et al. Binomial distribution forquantification of protein subunits in biological nanoassemblies andfunctional nanomachines.Nanomedicine.10(7)，1433-40(2014).
概要：本文首次报道描述了如何利用杨辉三角(二项分布)来确定生物复合物中蛋白质亚基的化学计量。本文精确地证实了phi29马达包含6份ATP酶gpl6，一个突变亚基会引起马达停止。
52*.Guo P，Zhang C，Chen C，Trottier M，Garver K.Inter-RNA interaction ofphage phi29pRNA to form a hexameric complex for viral DNAtransportation.Mol.Cell.2，149455(1998).
概要：本论文首次揭示了phi29DNA包装马达的pRNA形成六聚体环，证明RNA纳米技术的概念，因为本论文表明，使用来自pRNA phi29马达pRNA的重新设计的RNA片段，通过自下而上的装配，可以构建RNA纳米粒子的二聚体、三聚体和六聚体。
*56.Trottier M，Guo P.Approaches to determ ne stoichiometry of viralassembly components.J.Virol.71，487-494(1997).
概要：本论文首次报道描述了如何使用杨辉三角(二项分布)来确定生物复合或纳米机器的化学计量。
81*Shu D，Zhang H，Jin J，Guo P.Counting of six pRNAs of phi29DNA-packagingmotor with customized single molecule dual-view system.EMBO J.26，527-537(2007).
概要：本论文首次报道描述了使用单荧光光带浸出技术在生物复合物中计数亚基，以及“眼见为实”的文档，以确认phi29DNA包装马达包含6份包装pRNA。
附件D
该附件D中的文献对应于第2节(和图7-11)中的文献编号
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**这是第一篇研究文章，提出并证明了靶向具有高化学计量的纳米机器或生物复合物来开发高效药物的概念。
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*这篇文章证实了phi29的DNA包装马达的ATP酶是六聚体复合物。
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**这篇综述报道了生物系统中广泛存在公转生物马达。这种靶向纳米马达开发高效药物的新方法应该具有广泛的应用。
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附件E
本附件中的表对应于第2节内容中的表
附件F
本附件中的表对应于第3节内容中的表
表1
表2靶向生物复合物的药物的预期抑制效率，K＝1
表3当K＝1但具有相同药物靶向效率时，Z＝6与Z＝1之间未受抑制的复合物占比的比较

Claims (36)

1.一种鉴定多亚基生物复合物药物靶点的方法，所述方法包括：
鉴定执行生物学功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被失活以抑制所述生物学功能；
选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物，其中所述目标概率包括对于每个亚基来说传递给所述靶点的药物灭活所述亚基的共同概率；
使用二项分布描述所述药物的抑制效率与所述一个或多个亚基的总数之间的关系，其中所述抑制效率包括所递送的药物阻止所述生物学功能的概率，其中所述抑制效率是根据所述最小数量和所述总数来计算的；
使用实验靶点经验证实所述关系，其中所述靶点包括所述实验靶点；
将所述药物施用于所述靶点以治疗多重耐药性疾病，其中所述靶点包含哺乳动物受试者中的生物复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用变量K表示所述最小数量。
3.根据权利要求2所述的方法，其中使用变量Z表示所述总数。
4.根据权利要求3所述的方法，其中使用变量M表示所述一个或多个亚基中被失活的亚基。
5.根据权利要求4所述的方法，其中使用变量N表示所述一个或多个亚基中的活性亚基，其中Z＝M+N。
6.根据权利要求5所述的方法，其中使用变量p表示所述目标概率。
7.根据权利要求6所述的方法，其中q＝1-p。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述靶点包括M个失活的亚基和N个有效亚基的概率由二项式表达式给出：
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述抑制效率由二项式方程给出：
10.根据权利要求9所述的方法，其中K＝1且Z＞1。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抑制效率由1-qZ给出。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述实验靶点包含多聚体生物复合物或生物纳米马达的组分或亚基。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述纳米马达包括线性马达、自传马达或公转马达。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述纳米马达包含ATP酶组分。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述多聚体生物复合物包含受体、通道、酶或转运蛋白。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述多聚体生物复合物包含同源生物复合物。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述多聚体生物复合物包含二聚体、异低聚物或均聚物。
18.根据权利要求12所述的方法，其中组分或亚基的数目为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述纳米马达是噬菌体Phi29DNA包装马达。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述噬菌体Phi29DNA包装马达包含基因组双链DNA组分、包装RNA组分、ATP酶gp16组分、ATP组分或其组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中每个Phi29DNA包装马达组分包含所述实验靶点。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述噬菌体Phi29DNA包装马达包含1拷贝的基因组双链DNA，并且该拷贝包含亚基。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述噬菌体Phi29DNA包装马达包含6拷贝的包装RNA，且这些拷贝包含亚基。
24.根据权利要求19所述的方法，其中所述噬菌体Phi29DNA包装马达包含6拷贝的gp16，且这些拷贝包含亚基。
25.根据权利要求19所述的方法，其中所述噬菌体Phi29DNA包装马达包含10,000拷贝的ATP，并且这些拷贝包含亚基。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人，狗，猫，鸟，猪，马或牛。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述多重耐药性疾病是由多重耐药性生物体引起的。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述多重耐药性生物体是细菌、真菌、病毒或寄生虫。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述细菌包括葡萄球菌属，肠球菌属，淋球菌属，链球菌属，不动杆菌属，肠杆菌属，克雷伯杆菌属，沙门氏菌属，埃希氏菌属，假单胞菌属或分枝杆菌属。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述真菌包含念珠菌或丝孢菌的种类。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述病毒是HIV、流感、巨细胞病毒或单纯疱疹病毒。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述寄生虫包括疟原虫、弓形虫或蛔虫的种类。
33.一种优化基于生物复合物化学计量的药物开发的方法，所述方法包括：
鉴定执行生物学功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被灭活以抑制所述生物学功能；
选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物，其中所述目标概率包括对于每个亚基来说传递给所述靶点的药物灭活所述亚基的共同概率；
使用二项分布描述所述药物的抑制效率与所述一个或多个亚基的总数之间的关系，其中所述抑制效率包括所递送的药物阻断所述生物学功能的概率，其中根据所述最小数量和所述总数来计算抑制效率；
使用实验靶点来经验证实所述关系，其中所述靶点包括所述实验靶点；
将所述药物施用于所述靶点以治疗多重耐药性疾病，其中所述靶点包含哺乳动物受试者中的生物复合物。
34.一种用于靶向高化学计量生物复合物以增加药物靶向的方法效率，该方法包括：
鉴定执行生物学功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被灭活以抑制所述生物学功能；
选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物，其中所述目标概率包括对于每个亚基来说传递给所述靶点的药物灭活所述亚基的共同概率；
使用二项分布描述所述药物的抑制效率与所述一个或多个亚基的总数之间的关系，其中所述抑制效率包括所递送的药物阻止所述生物学功能的概率，其中根据所述最小数量和所述总数来计算所述抑制效率；
使用实验靶点经验证实所述关系，其中所述靶点包括所述实验靶点；
将所述药物施用于所述靶点以治疗多重耐药性疾病，其中所述靶点包含哺乳动物受试者中的生物复合物。
35.一种提高多聚体生物复合物的抑制效率的方法，所述方法包括：
鉴定执行生物学功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被灭活以抑制其生物学功能；
选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物，其中所述目标概率包括对于每个亚基来说传递给所述靶点的药物灭活所述亚基的共同概率；
使用二项分布描述所述药物的抑制效率与所述一个或多个亚基的总数之间的关系，其中所述抑制效率包括所递送的药物阻止所述生物学功能的概率，其中根据所述最小数量和所述总数来计算所述抑制效率；
使用实验靶点来经验证实所述关系，其中所述靶点包括所述实验靶点；
将所述药物施用于所述靶点以治疗多重耐药性疾病，其中所述靶点包含哺乳动物受试者中的生物复合物。
36.一种治疗患有多重耐药性疾病的受试者的方法，所述方法包括：
鉴定执行生物学功能的靶点，其中所述靶点包含一个或多个亚基，其中所述一个或多个亚基的最小数量被灭活以抑制所述生物学功能；
选择以目标概率与所述一个或多个亚基中的每个亚基特异性结合的药物，其中所述目标概率包括对于每个亚基来说传递给所述靶点的药物灭活所述亚基的共同概率；
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