CN107496423A - 2‑(苯甲基(乙基)氨基)‑5‑(4‑异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸或其盐的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了2‑(苯甲基(乙基)氨基)‑5‑(4‑异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸或其可药用盐在制备用于治疗HIV感染的疾病的药物中的用途；2‑(苯甲基(乙基)氨基)‑5‑(4‑异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸对IN二聚化具有明显的抑制活性，同时对IN与人晶状体上皮源性生长因子p75之间的蛋白相互作用也有明显的抑制活性，对整合酶没有明显的抑制活性，与IN的亲和力较好，达到613.5nM，具备IN二聚化抑制剂的功能，可用于制备治疗HIV感染的抗病毒药物。

Description

2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸 或其盐的用途
技术领域
本发明属于药物学技术领域，具体为2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸或其可药用盐在制备用于治疗HIV感染的疾病的药物中的用途。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的整合酶(Integrase，IN)是病毒复制的关键酶，已被证明是抗HIV药物研发的有效靶标。目前，临床上使用的3个IN抑制剂：雷特格韦(Raltegravir，RAL)、埃替格韦(Elvitegravir，EVG)和度鲁特韦(Dolutegravir，DTG)，均为IN链转移反应抑制剂。由于HIV的遗传多样性以及快速适应环境变化的能力，接受已上市整合酶抑制剂治疗的患者，其体内均很快出现了耐药性突变病毒株。因此，寻找新的作用机制靶点以开发新的IN抑制剂显得尤为迫切和重要。
HIV-1 IN在行使整合功能时不是以简单的单聚体形式存在的，而是处于单聚体、二聚体、四聚体和多聚体相互转化的动态平衡中。研究发现抑制IN二聚化可以有效抑制IN的活性，IN二聚化成为开发抗病毒药物的有效靶标。目前国外许多医药公司和科研机构正在开发新的具有干扰IN二聚化的整合酶抑制剂，但目前还没有成功上市的该类抑制剂。因此，积极寻找和设计新的IN二聚化抑制剂，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。
发明内容
为解决现有技术没有可以成功临床应用的IN二聚化的整合酶抑制剂的缺陷，本发明提供一种可用于制备用于治疗HIV感染的疾病的药物的2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸或其可药用盐。
其含有如下所示的结构通式I：
进一步的，所述的可药用盐包括(但不限于)2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸与无机酸或有机酸形成的酸加成盐。优选的，所述的无机酸为盐酸、磷酸或硫酸；所述的有机酸为醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富马酸或酒石酸。
进一步的，所述的HIV感染的疾病为获得性免疫缺陷综合征；所述的药物为HIV整合酶二聚化抑制剂。
有益效果：
本发明对2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸进行了生物学活性测定，同时对IN与人晶状体上皮源性生长因子p75之间的蛋白相互作用也有明显的抑制活性，对整合酶没有明显的抑制活性，说明2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸的选择性较好。此外，利用生物膜干涉技术测定发现，2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸与IN的亲和力较好，达到613.5nM。因此本发明中的2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸具备IN二聚化抑制剂的功能，因此可用于制备治疗HIV感染的抗病毒药物。
附图说明
图1为实施例1中2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸对IN二聚化抑制的曲线。
图2为实施例2中2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸对IN-LEDGF/p75相互作用抑制的曲线。
图3为实施例3中2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸对IN酶活性抑制的曲线。
图4为实施例4中2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸与IN亲和力的测定。
具体实施方式
实施例1：2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸对IN的二聚化的抑制活性测定。
实验原理：当C端带有His标签的IN蛋白和N端带有GST标签的IN蛋白相互作用时(空间距离小于10nm)，Anti-6His-XL665受体磁珠和Anti-GST Cryptate供体磁珠也会相应靠近，从而发生共振能量转移(FRET)现象。供体磁珠荧光分子的激发将诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。当抑制剂分子阻断IN分子间的二聚化作用时，FRET现象减弱。因此，FRET现象的强弱可以反映抑制剂分子对两个蛋白相互作用抑制作用的强弱。
实验试剂的准备：在原核体系中，可溶性表达纯化不同融合标签的IN，即有N端融合有谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase)整合酶GST-IN和C端融合有六组氨酸标签的整合酶IN-His6。用于HTRF实验的试剂：Eu3+Cryptate conjugated mousemonoclonal antibody anti-glutathione S-transferase和XL665-conjugated mousemonoclonal antibody Anti-6Histidine，均购买自法国浠思公司(Cisbio Assays)。
实验步骤：反应在384孔板中进行，将以下成分加入板孔中：30nM GST-IN、30nMIN-His6、化合物、反应buffer，混匀。室温，200rpm，反应1.5h。将用0.45nM的Eu3+Cryptateconjugated mouse monoclonal antibody anti-glutathione S-transferase和10nM的XL665-conjugated mouse monoclonal antibody Anti-6Histidine加入板孔，室温反应1.5h。使用珀金埃尔默仪器有限公司(PerkinElmer Life Sciences)的多功能酶标仪Envision 2102multilabel reader，以320nm为激发光，读取665nm和615nm处的发射光，测试数据是根据两束不同波长光的信号比计算得到:(Signal 665nm/Signal 620nm)*10000。
实验结果：2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸的起始浓度为20μM，倍比稀释至0.01μM，进行抑制整合酶二聚化的活性实验，发现其具有较好的抑制活性，其半抑制浓度IC50为0.88μM，曲线图参见图1。
实施例2：2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸对IN-LEDGF/p75之间相互作用的抑制活性测定。
实验原理：当C端带有His标签的IN蛋白和N端带有GST LEDGF/p75蛋白相互作用时(空间距离小于10nm)，Anti-6His-XL665受体磁珠和Anti-GSTCryptate供体磁珠也会相应靠近，从而发生共振能量转移(FRET)现象。供体磁珠荧光分子的激发将诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。当抑制剂分子阻断IN和LEDGF/p75的相互作用时，FRET现象减弱。因此，FRET现象的强弱可以反映抑制剂分子对两个蛋白相互作用抑制作用的强弱。
实验步骤：反应在384孔板中进行，将以下成分加入板孔中：30nM GST-LEDGF/p75、30nM IN-His6、化合物、反应buffer，混匀。室温，200rpm，反应1.5h。将用0.45nM的Eu3+Cryptate conjugated mouse monoclonal antibody anti-glutathione S-transferase和10nM的XL665-conjugated mouse monoclonal antibody Anti-6Histidine加入板孔，室温反应1.5h。使用珀金埃尔默仪器有限公司(PerkinElmer Life Sciences)的多功能酶标仪Envision 2102multilabel reader，以320nm为激发光，读取665nm和615nm处的发射光，测试数据是根据两束不同波长光的信号比计算得到：(Signal 665nm/Signal 620nm)*10000。
实验结果：2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸的起始浓度为20μM，倍比稀释至0.01μM，进行抑制IN-LEDGF/p75的活性实验，发现其具有较好的抑制改相互作用的活性，其半抑制浓度IC50为1.51μM，曲线图参见图2。
实施例3：2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸对IN酶活性抑制的测定
实验原理：IN能够切割靶DNA，将其供体DNA整合至靶DNA。基于此，在靶DNA3末端标记地高辛(digxin)，在供体DNA5′端标记生物素(biotin)。由于IN能够切割靶DNA，将其供体DNA整合至靶DNA。因此，会形成5′生物素-3′地高辛双标记DNA产物。加入链霉亲和素磁珠(SA-MB)，DNA产物通过5′生物素与链霉亲和素的特异性反应被捕获到磁珠表面。再加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(AP-anti-DIG AB)，通过抗体与地高辛的免疫反应将碱性磷酸酶(AP)连接到磁珠上。最后通过ELISA对AP检测以检测IN催化的整合反应。
反应实验步骤：反应在96孔透明微孔板中进行。用无MnCl2的反应缓冲液洗板一次。加入5μl用DSMO配制的待测样品至微孔板中，与IN在无MnCl2的反应缓冲液中37℃温育20min。每孔加入浓度为10mM的MnCl2最后加入1.5pM供体DNA和15pM靶DNA底物，混匀后37℃反应1h。加入1.5μl链霉亲和素磁珠和51.5μl结合缓冲液彻底振荡混匀，20℃孵育15min，每隔5min振荡混匀一次。收集磁珠，弃上清液。用100μl PBST洗磁珠三次，弃上清液。加入100μl用PBS按照1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的地高辛抗体，振荡混匀后于37℃孵育30min。100μl PBST洗磁珠三次以除去未结合的抗体，将磁珠转移到新的微孔板中，加入100μl显色底物缓冲液，避光显色30min，加入2M NaOH溶液20μl终止显色，用酶标仪测定405nm处的吸光值(A405)。
实验结果：2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸的起始浓度为200μM，倍比稀释至1.56μM，进行抑制IN活性的实验，发现其抑制IN酶催化的活性较差，其半抑制浓度IC50为43.52μM，曲线图参见图3。
实施例4：2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸与IN作用亲和力的测定。
实验原理：在光纤制成的生物传感器底端覆盖生物分子相容层，偶联IN后形成生物膜层，进而用配体与小分子反应。小分子结合传感器底端偶联的配体时会导致生物膜层厚度增加，反射光干涉光谱曲线将产生迁移，仪器可以实时监测相位移的变化，并将其转化为可衡量分子间相互作用大小的参数。
实验步骤：生物膜干涉实验(Bio-Layer Interferometry，BLI)在Octet RED96系统中完成。实验采用与仪器匹配的96孔板(Fluotrace 600，LOT E110103S)，反应体积为200μl。将生物素化的IN于固定化到链霉亲和素标记的探针上，在缓冲液中浸泡10min。进行第一次基线(Baseline)步骤，时间100s；将探针依次转移至含有终浓度分别为X的化合物中，结合，时间60s；最后将探针转移至缓冲液中进行解离步骤，时间40s。结合动力学参数利用Data analysis(ForteBio，version 7.1)进行数据分析。
实验结果：2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸与IN的亲和力较好，达到613.5nM。

Claims (6)

1.含有结构通式I所示的2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸或其可药用盐在制备用于治疗HIV感染的疾病的药物中的用途：
。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的可药用盐为2-(苯甲基(乙基)氨基)-5-(4-异丁基苯磺酰氨基)尼古丁酸与无机酸或有机酸形成的酸加成盐。
3.如权利要求2所述的的用途，其特征在于，所述的无机酸为盐酸、磷酸或硫酸。
4.如权利要求2所述的的用途，其特征在于，所述的有机酸为醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富马酸或酒石酸。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的HIV感染的疾病为获得性免疫缺陷综合征。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物为HIV整合酶二聚化抑制剂。
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