CN107468677A - 雨生红球藻虾青素在制备预防和治疗糖尿病脑组织氧化损伤药物中的应用 - Google Patents

雨生红球藻虾青素在制备预防和治疗糖尿病脑组织氧化损伤药物中的应用 Download PDF

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张波
贺青华
王文娟
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Abstract

本发明公开了雨生红球藻虾青素在制备预防和治疗糖尿病脑组织氧化损伤药物中的应用。本发明通过对II型糖尿病大鼠脑组织的GSH‑Px、SOD的活力和MDA的含量的变化，以及IL‑1β、TNF‑α的变化，证实雨生红球藻虾青素可以有效降低II型糖尿病大鼠脑组织的氧化应激和炎症反应。

Description

雨生红球藻虾青素在制备预防和治疗糖尿病脑组织氧化损伤 药物中的应用
技术领域
本发明涉及雨生红球藻虾青素的医药新用途，具体涉及雨生红球藻虾青素在制备预防和治疗糖尿病脑组织氧化损伤药物中的应用。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus，DM)，是由遗传因素和环境因素相互作用而引起的体内胰岛素分泌不足从而导致糖、脂质、蛋白质和继发的维生素、水、电解质的代谢紊乱，以及氧化平衡破坏的一种全身慢性终身性疾病，临床表现主要是糖代谢紊乱和脂代谢紊乱以及各种慢性并发症。目前在世界范围内，糖尿病患病率、发病率和糖尿病患者数量急剧上升，其常可引发一些严重的并发症，如肾病、眼病以及心血管系统病变等，严重危害人类的健康和生命。据国际糖尿病联盟(IDF)统计，目前全球糖尿病患者约为3.66亿，预计到2030年将增加至5.52亿。中国成人糖尿病患病率高达9.7％，已经取代印度，成为全球糖尿病患者最多的国家。其中，Ⅱ型糖尿病(T2DM)约占整个糖尿病患者的90％～95％。研究表明，Ⅱ型糖尿病出现糖、脂、蛋白质等多种物质代谢紊乱，其原因与各种氧化应激、炎症、细胞凋亡等多器官受损有密切的关系。
随着糖尿病及各种并发症的有效干预及治疗，患者的生存时间延长，大脑成为糖代谢异常作用的又一重要靶器官。认知损害及痴呆也成为T2DM糖尿病患者晚期的重要并发症。流行病学资料显示，T2DM患者发生痴呆的概率是非糖尿病患者的1.5～2.5倍。糖尿病是一种终身性疾病，需要长期服用药物，因此采用毒副作用小的药品来控制血糖以及并发症是非常重要的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供雨生红球藻虾青素在制备预防和治疗糖尿病脑组织氧化损伤药物中的应用。
其中，所述糖尿病脑组织氧化损伤来自II型糖尿病大鼠。
本发明还提供一种预防和治疗糖尿病脑组织氧化损伤药物，含有雨生红球藻虾青素。
其中，所述糖尿病脑组织氧化损伤来自II型糖尿病大鼠。
其中，所述雨生红球藻虾青素的给药剂量0.2g—0.6g/人/天。
虾青素(Astaxanthin，AST)全称为3,3、-二羟基-β胡萝卜素-4,4、-酮，是一种红色的类胡萝卜素及天然的脂溶性色素，广泛的分布在海洋的细菌、藻类、甲壳类和鱼类中等，其中雨生红球藻中虾青素的含量高达1.5％～3％，被公认为自然界中生产天然虾青素最好的原料之一。天然虾青素是迄今为止发现的自然界最强大的天然抗氧化剂之一，它能发挥强大的抗氧化作用，增强细胞的再生能力，维持机体的平衡和减少衰老细胞的堆积，在抗炎、抗癌、预防心血管疾病、增强机体的免疫、保护神经系统有着重要的作用。
糖尿病脑病患者脑内存在明显的氧化应激,而氧化应激参与糖尿病脑病发生发展的多个环节，即糖尿病脑病的“氧化应激学说”,认为高血糖引起线粒体中超氧阴离子生成过多,继而引发组织细胞发生氧化应激反应，最终导致糖尿病的各种并发症,即氧化应激启动并促进尿病脑病的发生发展。
氧化应激(oxidative stress)指机体自由基(free radical)、活性氧(reactiveoxygen species,ROS)或活性氮(reactive nitrogen species,RNS)产生过多和(或)机体抗氧化能力减弱，ROS或RNS清除不足，导致体内ROS或RNS增多，破坏了机体的氧化/还原的平衡，从而导致组织和细胞发生氧化损伤的病理过程。氧化应激属于细胞应激反应的范畴，具有应激反应的两重性：损伤与抗损伤。在氧化应激反应引起机体损伤的同时，机体产生一系列保护性反应以对抗氧化性损伤。机体在长期进化过程中已形成的抗氧化防御系统包括：①抗氧化酶：超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(glutathione S-transferase，GST)和血红素氧化酶(heme oxygenase，HO)等；非酶性抗氧化剂：还原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)、金属硫蛋白和褪黑素(melatonin)等。
本发明的有益效果在于：
本发明提供雨生红球藻虾青素在制备治疗和预防糖尿病脑组织氧化损伤药物中的应用，通过糖尿病大鼠脑组织中GSH-Px、SOD的活力提升和MDA的含量下降，以及对脑组织炎性因子细胞数量的下降，保持脑组织的正常结构，从而对糖尿病脑组织氧化损伤起到预防和治疗作用。
附图说明
图1为本发明提供的雨生红球藻虾青素对大鼠海马组织结构的保护作用。
具体实施方式
本发明通过测试糖尿病大鼠脑中氧化应激的关键指标GSH-Px、SOD的活力和MDA的含量，以及对脑组织炎症细胞因子含量的变化来确定雨生红球藻虾青素对于糖尿病脑组织氧化损伤的预防和治疗作用。
试剂与仪器
1.雨生红球藻虾青素购买自杭州鑫伟低碳技术研发公司。
2.链脲佐霉素(STZ)购买自美国Sigma公司。
3.盐酸二甲双胍购买自华裕制药有限公司。
4.0.1mmol/L柠檬酸缓冲溶液购买自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。
5.葡萄糖测定试剂盒购买自中生北控生物科技股份有限公司。
6.蛋白定量测试盒购买自南京建成生物工程研究所。
7.谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒购买自南京建成生物工程研究所。
8.总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒购买自南京建成生物工程研究所。
9.丙二醛(MDA)测试盒购买自南京建成生物工程研究所。
10.蛋白定量测试盒购买自南京建成生物工程研究所。
11.大鼠IL-1β免疫组化试剂盒购买自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。
12.大鼠TNF-α免疫组化试剂盒购买自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。
13.5804R型低温高速离心机购买自德国eppendorf公司。
14.电热恒温培养箱购买自上海一恒科学仪器有限公司。
15.电动匀浆器购买自常州朗越仪器制造有限公司。
16.移液枪购买自德国eppendorf公司。
17.紫外分光光度计购买自美国尤尼柯仪器有限公司。
18.电子天平(CP324S型)购买自德国Sartorius公司。
19.超级应用型纯水器:ZRXQ003T0购买自美国Millipore公司。
20.烘干箱购买自德国MMMMedcenter Einrichtungen。
实施例1
SPF级SD雄性大鼠(许可证编号:SCXK(京)2012-0001)，体质量(180±20)g，72只，购买自中国食品药品检定研究院。动物适应性饲养饲养3d，称重编号随机分为正常组、模型组、雨生红球藻虾青素低剂量组(50mg/kgBW)(简称：虾青素低剂量组)、雨生红球藻虾青素中剂量组(100mg/kg BW)(简称：虾青素中剂量组)、雨生红球藻虾青素高剂量组(200mg/kgBW)(简称：虾青素高剂量组)、降糖药物组(盐酸二甲双胍：0.0285g/100g BW)，每组12只。试验性大鼠在SPF屏障系统中饲养，温度控制在(20±2)℃之间，空气相对湿度50％～70％，光照周期为14h光照(6:00～20:00)/10h黑暗，自由取食、饮水。
正常组大鼠每日给予蒸馏水和普通饲料饲养4w。模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、降糖药物组每日给予蒸馏水和高脂高糖饲料饲养4w后，禁食不禁水12h，正常组腹腔注射0.1mmol/L柠檬酸缓冲液；模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、降糖药物组腹腔注射链脲佐菌素STZ(35mg/kgBW)加高糖高脂饲料，继续喂养4w，制备大鼠II型糖尿病模型，眼眶取血测空腹血糖大于11.1mmol/L为造模成功，并继续灌胃给予雨生红球藻虾青素4w。
每日观察大鼠的精神状况，活动情况。
实施例2
1.大鼠脑抗氧化指标的测定
12周后，10％水合氯醛麻醉处死大鼠，4℃下取其脑部，取大鼠1/4脑并称取重量制成10％匀浆，用于测GSH-Px、SOD的活力和MDA的含量。
GSH-Px、SOD的活力和MDA的含量的测定，采用谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒测定GSH-PX酶活性，氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒测定SOD酶活性，丙二醛(MDA)试剂盒测定MDA的含量。以上均按试剂盒说明书进行操作。
实验数据采用SPSS 19.0软件进行分析，各组数据结果以表示，并进行单因素方差分析，p<0.05表示有显著性差异，p<0.01表示有极显著性差异，如表1所示。
表1 AST对大鼠脑组织抗氧化指标的含量的影响(n＝12)
注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01
从表1可以看出，与正常组相比，模型组大鼠脑组织的MDA含量显著升高(p<0.01)，SOD和GSH-Px活性显著下降(p<0.01)；高剂量AST干预后与模型组相比，MDA含量显著下降(p<0.01)，SOD和GSH-Px活性显著增高(p<0.01)，中、低剂量组虾青素和降糖药物组与模型组相比没有显著性差异(p>0.05)。
从上述结果可以看出，高剂量的虾青素可有效抑制糖尿病大鼠脑的氧化应激水平，从而有效保护糖尿病大鼠脑的活性。降糖药物盐酸二甲双胍不能有效抑制糖尿病大鼠脑的氧化应激水平。
2.大鼠脑组织组织病理学及免疫组化测定
大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉后，打开胸腔，暴露心脏，从左心室插入灌注针头至主动脉，剪开右心耳，快速灌注生理盐水250～300ml，然后改用4％的多聚甲醛(pH7.2～7.4)200～250ml灌注，先快后慢。然后快速断头取脑，将脑组织置于4％多聚甲醛固定。将大鼠脑组织，乙醇系列脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，片厚约4μm。并按HE染色常规进行，然后在显微镜下观察大鼠脑组织形态。免疫组化测大鼠脑组织含IL-1β、TNF-α的细胞数量。
如图1所示，a为模型组(双箭头表示细胞肿胀)；b为正常组(单箭头表示正常细胞核)；c为虾青素高剂量组(单箭头表示正常细胞核)；d为虾青素中剂量组(双箭头表示细胞肿胀)；e为虾青素低剂量组(双箭头表示细胞肿胀)；f为降糖药物组(双箭头表示细胞肿胀)。
从图1中可以看出，与正常组相比，糖尿病模型组大鼠脑组织神经元结构层次不完整，细胞肿胀、细胞核固缩，说明II型糖尿病引起脑组织结构严重损害。与模型组相比，虾青素高剂量组大鼠脑组织神经元结构层次完整性显著改善，细胞肿胀以及细胞核固缩程度明显减轻，说明高剂量虾青素对II型糖尿病引起的脑组织结构损害有显著的改善作用。虾青素中剂量组和虾青素低剂量组对II型糖尿病引起的脑组织结构损害也有一定的改善作用。但是降糖药物组(盐酸二甲双胍)对II型糖尿病引起的脑组织结构损害并没有改善作用。
表2 AST对大鼠脑含IL-1β、TNF-α细胞数量的影响(n＝6)
注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01
炎症细胞因子中，起主要作用的是TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等，而IL-1β和TNF-α是机体内炎性状态反应最为敏感的两种炎症细胞因子，广泛参与了人体组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程。TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。IL-1β则能够直接进一步激活更多的炎性因子如COX-1、IL-6、一氧化氮合酶等，引起进一步的炎性反应，最终加快细胞凋亡，促进损伤。
从表2的研究结果可以看出，高剂量虾青素能够显著降低大鼠脑组织中炎症细胞因子IL-1β、TNF-α的含量，显示虾青素改善糖尿病脑病作用的机制与其降低炎性介质的分泌有关。
从上述实施例可以看出，使用雨生红球藻虾青素可以有效抑制糖尿病大鼠脑组织的氧化应激反应，同时还可以显著降低脑组织中的炎症因子的含量，保持脑组织的正常结构，从而有效预防和治疗糖尿病脑组织的氧化损伤。

Claims (4)

1.雨生红球藻虾青素在制备预防和治疗糖尿病脑组织氧化损伤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖尿病脑组织氧化损伤来自II型糖尿病大鼠。
3.一种预防和治疗糖尿病脑组织氧化损伤药物，其特征在于，含有雨生红球藻虾青素。
4.如权利要求3所述的药物，其特征在于，所述糖尿病脑组织氧化损伤来自II型糖尿病大鼠。
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