CN107454940A - 肝细胞癌(hcc)的血清生物标志物 - Google Patents

肝细胞癌(hcc)的血清生物标志物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肝病如肝细胞癌(HCC)的预后、诊断和监测的新型诊断程序。本发明提供了鞘脂类，特别是长链神经酰胺作为与肝硬化相比的HCC中显著且高度预后的血清生物标志物。因此，本发明特别提供了使用公开的生物标志物检测肝硬化患者中是否存在HCC的方法。还提供了通过监测所公开的血清生物标志物来监测HCC治疗的治疗成功的方法。最后，本发明涉及进行本发明所公开方法的诊断试剂盒。

Description

肝细胞癌(HCC)的血清生物标志物
发明领域
本发明涉及肝病如肝细胞癌(HCC)的预后、诊断和监测的新型诊断程序。本发明提供了鞘脂类，特别是长链神经酰胺作为与肝硬化相比的HCC中显著且高度预后的血清生物标志物。因此，本发明特别提供了使用公开的生物标志物检测肝硬化患者中是否存在HCC的方法。还提供了通过监测公开的血清生物标志物来监测HCC治疗的治疗成功的方法。最后，本发明涉及进行本发明所公开的方法的诊断试剂盒。
描述
肝细胞癌(HCC)构成了较多的健康负担，因为它代表了全世界第六较为常见的癌症和癌症相关死亡的第三大主要原因。在大多数情况下，HCC发生在肝硬化的背景下，成为这些患者中最常见的死亡原因。这敦促了基础型和转化型研究方法以改进当前的用于HCC的早期检测和监控的诊断工具。此外，晚期HCC的治疗选择的缺乏和潜在可治愈患者的可用的肝脏同种异体移植物的短缺使得新型靶标途径和生物标志物的鉴定成为明确的研究目标。
HCC通常与慢性肝损伤或疾病相关。任何病因的肝硬化为HCC发展的最常见风险因素。超过90％的HCC在由慢性乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染、酒精滥用或被称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的脂肪积聚造成的硬化肝脏上发展。因此，存在对在“风险”患者，即已有肝脏病况如肝硬化的那些患者中发展出临床症状之前检测HCC的分析的需求。在患有肝硬化的患者中，甲胎蛋白(AFP)被广泛地用作肝细胞癌(HCC)的监控和检测试验。然而，AFP对于早期HCC的检测没有效果(Sanyal等人,Oncologist 15):14-22,2010；Bruix和Sherman,Hepatology 42:1208-1236,2005；Di Bisceglie,Gastroenterology127:S104-S107,2004；Daniele等人,Gastroenterology127:S108-S112,2004)。除AFP之外，已经提出将凝集素结合的AFP(AFP-L3)、脱γ羧基凝血酶原(DCP)和磷脂酰肌醇聚糖-3作为HCC检测的标志物(Spangenberg等人,Semin.Liver Dis.26:385-390,2006)。然而，最近的研究显示对于早期HCC的诊断，DCP和AFP-L3均没有呈现出比AFP好的性能特征(Marrero等人,Gastroenterology 137:110-118,2009)以及在早期HCC的检测中，DCP和AFP对于补充超声均不是最佳的(Lok等人,Gastroenterology 138:493-502,2010)。因此，存在对开发早期检测和预测对象发展为HCC的风险以允许早期干预的新型生物标志物和分析的需求。
由于肿瘤的增殖和凋亡以及癌症药物抗性基本上由鞘脂(SL)调控，靶向癌症中的SL代谢已经在过去的二十年中获得极大的关注。许多研究已经提出神经酰胺(Cer)(多种复杂的SL的生物活性疏水性骨架)作为由常见的癌症治疗形式，如化疗和辐射激活的有效的肿瘤抑制分子，而在对治疗有抗性的肿瘤组织中观察到神经酰胺产生的消除。
过去几年改进的光谱测定方法的实施使得能够深入研究各种疾病中SL代谢物的变化。血清或血浆Cer同时构成肥胖和糖尿病(Haus JM,等人.Plasma ceramides areelevated in obese subjects with type 2 diabetes and correlate with theseverity of insulin resistance.Diabetes 2009；58:337-343)、急性期反应(Lightle S等人.Elevation of ceramide in serum lipoproteins during acute phase responsein humans and mice:role of serine-palmitoyl transferase.Arch Biochem Biophys2003；419:120-128)、肾脏病症(Mitsnefes M等人.,Ceramides and cardiac function inchildren with chronic kidney disease.Pediatr Nephrol 2014；29:415-422)和神经退行性病症(Mielke MM等人.Serum ceramides increase the risk of Alzheimerdisease:the Women's Health and Aging Study II.Neurology 2012；79:633-641)中明显的疾病生物标志物，而S1P涉及作为各种癌症疾病中的生物标志物(Nunes J,等人.Circulating sphingosine-1-phosphate and erythrocyte sphingosine kinase-1activity as novel biomarkers for early prostate cancer detection.Br J Cancer2012；106:909-915)。
尽管事实是在体外和在小鼠模型中的几项研究观察到Cer和S1P涉及作为对各种刺激物的肝细胞易感性以及肝癌发生的主要调控因子，但关于SL作为HCC的生物标志物，迄今没有可获得的数据。
鉴于现有技术，因此，本发明的一个目的为提供用于在罹患肝硬化的患者中检测HCC的新的诊断生物标志物。
在第一方面，上述问题通过预测、监测和/或诊断对象的肝病的非侵入性方法来解决，所述方法包括测定来自所述对象的生物样品中选自鞘脂类的一种或多种生物标志物的水平。
在一些实施方案中，所述方法可以包括以下步骤：
(a)提供来自所述对象的生物样品；
(b)测定所述生物样品中选自鞘脂类的一种或多种生物标志物的
水平；
(c)将所述生物样品中一种或多种生物标志物的水平与所述一种
或多种生物标志物的对照水平进行比较；
其中与所述对照水平相比，所述生物样品中生物标志物的不同水平指示所述对象中是否存在肝病。
在本发明的上下文中的“不同水平”应指增加的或降低的水平。例如，在一些实施方案中，增加的水平可以指示存在肝病。那么降低的或相同的水平指示不存在肝病。在其它实施方案中，相同的或增加的水平可以指示存在肝病。那么水平的降低指示不存在肝病。
术语“生物样品”意为来源于对象/患者的任何生物样品。此类样品的实例包括组织、细胞样品、细胞裂解物、活检切片等。生物样品可以选自肿瘤样品或活检切片，如肝脏肿瘤样品。其它生物样品为全血、血清或血浆。优选地，样品为全血样品。在本发明的上下文中最优选的是生物样品为血液样品，如血清样品。
在本发明的上下文中的“生物标志物”或“标志物”是指有机生物分子，特别是代谢物，如鞘脂，与取自未患有某一病况的对象(例如，阴性诊断、正常或健康对象、或非癌症患者，取决于患者是否进行癌症测试)的可比较样品相比，其有差别地存在于取自患有所述病况的对象的生物样品中。例如，标志物可以为多肽或脂质(具有特定的表观分子量)，与具有阴性诊断的患者的样品相比，其以升高的或降低的水平存在于癌症患者的样品中。阴性诊断并不排除存在其它相关疾病，如患有肝硬化的对象中HCC的阴性诊断。
本文使用的术语“测定”包括在参照或没有参照对照或预定值的情况下的定性和/或定量检测(即检测和/或测量表达水平)。“测定水平”应指本文公开的生物标志物的定量检测。为了测定生物样品和/或对照样品中鞘脂的水平，可以使用允许定量鞘脂浓度的任何方法。在优选的实施方案中，通过串联液相色谱质谱法(LC-MS/MS)、免疫学上使用鞘脂特异性抗体或通过薄层色谱法来测定待分析的样品中鞘脂类的含量。
在某些情况下，使用本发明的方法以诊断肝病、诊断HCC或诊断患有肝硬化的对象的HCC。所述方法可以用于监测疾病进展和消退。因此，术语“监测”可以指“监测HCC或肝硬化的进展或消退”并且包括使用所述方法和生物标志物谱来确定对象的疾病状态(例如，HCC的存在或严重程度)。在某些情况下，将统计学分析的结果与在较早时间针对同一对象获得的那些结果进行比较。
在一些方面，根据公开的方法，本文公开的生物标志物被用作预后(预测)生物标志物。在这方面，例如，通过基于样品中存在的至少一种生物标志物或样品中至少一种生物标志物的水平来测定个体中肝病快速或缓慢进展的可能性，本发明的方法也可以用于预测肝病的进展。在其它方面，根据本公开，例如，通过基于生物样品中存在的至少一种生物标志物或生物样品中至少一种生物标志物的水平来测定对象中肝病快速或缓慢消退的可能性，本发明的方法也可以用于预测肝病的消退。
在本发明的一些实施方案中，肝病为肝硬化或肝癌，优选肝细胞癌(HCC)。如本文所用，术语“肝细胞癌”(或简写为“HCC”)是指肝细胞来源的恶性肿瘤。HCC为一种类型的肝癌。
本文使用的术语“对象”描述哺乳动物，包括但不限于人、猿、黑猩猩、猩猩、猴子、狗、猫、马、猪、绵羊、山羊、小鼠、大鼠和豚鼠。然而，在一些实施方案中，对象优选为人。在某些实施方案中，在本发明的方法用于区分HCC和肝硬化的情况下，对象为罹患肝硬化，但可能同时患有HCC的对象。区分肝硬化和HCC在本发明的上下文中应意为HCC在肝硬化背景，换言之在患有肝硬化的对象中被诊断。
在一些优选的实施方案中，本文公开的方法在体外或离体严格进行。特别地，术语“提供来自对象的生物样品”不应被误解为明确地或隐含地包括从活的对象获得生物样品的侵入性方法步骤。术语“提供生物样品”应明确地排除从对象获得生物样品的任何步骤。
结合本公开的一种或多种生物标志物的术语“水平”应优选指各生物标志物的浓度。
在本发明的一些实施方案中，一种或多种生物标志物优选选自长链神经酰胺或长链二氢神经酰胺，优选C16至C24神经酰胺或C16至C24二氢神经酰胺。更优选地，生物标志物为C16至C20神经酰胺或C16至C20二氢神经酰胺。例如，一种或多种生物标志物可以为选自以下的鞘脂：C16Cer、C16DHC、C18DHC、S1P、C24DHC、C24:1DHC、C18Cer、C20Cer、C24Cer、C24:1Cer、鞘氨醇和SA1P。在本发明的最优选实施方案中，一种或多种生物标志物选自C16Cer、C16DHC、C18DHC和S1P，并且优选为C16Cer。
特别令人惊讶的是，虽然本发明的所有鞘脂生物标志物具有诊断价值，但相比当前现有技术用于HCC检测的标志物AFP，生物标志物C16DHC、C18DHC、C16Cer和S1P显示出甚至更好的预后价值，如通过AUC分析确定的。
神经酰胺包括经由酰胺键与脂肪酸结合的鞘氨醇。在使用术语“CnCer”、“Cn神经酰胺”或“CnDHC”、“Cn二氢神经酰胺”的情况下，n为整数，并且指脂肪酸残基中碳(C)的数目，例如，C16Cer是指具有16-碳脂肪酸残基，如棕榈酰基的神经酰胺核心，以及C18Cer是指具有18-碳脂肪酸残基，如硬脂酰基的神经酰胺核心。
此外，本发明的其它实施方案提供了本文所述的方法，其中步骤(b)包括测定选自以下的至少一种另外的生物标志物的水平：C16Cer、C16DHC、C18DHC、S1P、C24DHC、C24:1DHC、C18Cer、C20Cer、C24Cer、C24:1Cer、鞘氨醇和SA1P，其中第一生物标志物和另外的生物标志物不同。
本发明的一个另外的实施方案涉及前面所述的诊断方法，其包括测定生物标志物AFP的水平以及测定选自C16Cer或S1P的第二生物标志物的水平，或更优选地AFP以及测定选自C16DHC或C18DHC的第二生物标志物的水平。关于这点，优选的是测定AFP的水平，如果与对照样品或数值相比，样品中AFP的水平降低，则另外地，测定第二生物标志物。在优选实施方案中，降低的AFP水平的截止水平低于200ng/ml。
在一个实施方案中，待测试的第二生物标志物为C16DHC。测定与对照样品或数值相比样品中C16DHC的水平。与对照样品或数值相比，增加的C16DHC水平表明患者中存在肝病。优选地，样品中增加的C16DHC水平为55.2ng/ml或更高的水平。肝病的诊断优选为HCC的诊断，更优选为早期HCC的诊断，如BCLC A期HCC。
在另一实施方案中，待测试的第二生物标志物为C18DHC。测定与对照样品或数值相比样品中C18DHC的水平。与对照样品或数值相比，增加的C18DHC水平表明患者中存在肝病。优选地，样品中增加的C18DHC水平为64.2ng/ml或更高的水平。肝病的诊断优选为HCC的诊断，更优选为早期HCC的诊断，如BCLC A期HCC。
在另一实施方案中，待测试的第二生物标志物为C16Cer。测定与对照样品或数值相比样品中C16Cer的水平。与对照样品或数值相比，增加的C16Cer水平表明患者中存在肝病。优选地，样品中增加的C16Cer水平为147.5ng/ml或更高的水平。肝病的诊断优选为HCC的诊断，更优选为早期HCC的诊断，如BCLC A期HCC。
在另一实施方案中，待测试的第二生物标志物为S1P。测定与对照样品或数值相比样品中S1P的水平。与对照样品或数值相比，增加的S1P水平表明患者中存在肝病。优选地，样品中增加的S1P水平为215ng/ml或更高的水平。肝病的诊断优选为HCC的诊断，更优选为早期HCC的诊断，如BCLC A期HCC。
另外，在本发明诊断方法的上下文中，测定第二生物标志物的水平的组合是可能的。前面所述四种第二生物标志物的所有可能组合应形成本发明和公开的一部分。
本发明的另一实施方案涉及本发明的方法，其中诊断肝病包括诊断患有肝硬化的对象中是否存在HCC。肝硬化为HCC发展的主要因素，因此HCC患者通常具有肝硬化史。因此，经常监测肝硬化患者的HCC的发生是有利的。早期检测HCC大大提高了患者的预后和治疗成功。现在使用本发明的生物标志物，优选根据本文所述方法，进行此种监测是可能的。
在本发明的上下文中使用的术语“对照水平”可以指多种参照值，这取决于使用本发明方法的诊断背景。因此，对照水平可以为各生物标志物的任何参照值，其允许有意义地解释患者中肝病的状态或发展。通常，对照水平可以对应于未患有肝病的对象的生物样品中的生物标志物的水平。或者，对照水平可以对应于在较早时间点的对象，例如在所述对象经历治疗或医疗之前的生物样品中的生物标志物的水平。在本发明的某些实施方案中，对照水平为截止水平，并且与截止水平相比，生物样品中一种或多种生物标志物的增加的水平或相同的水平指示存在肝病。最优选地，与截止水平相比，生物样品中一种或多种生物标志物的增加的水平或相同的水平指示对象中存在HCC。
优选选择本发明的一种或多种生物标志物的截止水平，使得在接受者操作特征(ROC)分析中，在95％的置信区间时，曲线下面积(AUC)为至少0.6，更优选为0.7、0.8，并且最优选为至少0.9、0.95或更高。
根据实例，本发明的各种生物标志物的优选截止水平为：
(i)对于C16DHC，为约55.2ng/ml，
(ii)对于C18DHC，为约64.2ng/ml，
(iii)对于C24DHC，为约65.1ng/ml，
(iv)对于C24:1DHC，为约301ng/ml，
(v)对于C16Cer，为约147.5ng/ml，
(vi)对于C18Cer，为约67.7ng/ml，
(vii)对于C20Cer，为约78.6ng/ml，
(viii)对于C24Cer，为约953ng/ml，
(ix)对于C24:1Cer，为约431ng/ml，
(x)对于鞘氨醇，为约4.83ng/ml，
(xi)对于S1P，为约215ng/ml，和
(xii)对于SA1P，为约30.8ng/ml。
尽管示出本发明广泛范围的数值范围和参数为近似值，但具体实例中示出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地含有由各个测试测量值中存在的标准差所必然造成的某些误差。另外，如本文所用，术语“约”通常意为在给定数值或范围的20％、15％、10％、5％、1％或0.5％内。上文的截止值优选在提及数值的+/-15％的范围内。或者，当由本领域普通技术人员考虑时，术语“约”意为在平均值的可接受标准误差内。除非相反指出，本公开和所附权利要求中示出的数值参数为可以根据需要而变化的近似值。在最低限度，至少应当根据报道的有效数字个数并通过应用普通舍入技术解释每个数值参数。
由于本发明的生物标志物对于HCC的检测具有高度预后价值，本发明的替代实施方案涉及这样的方法，其中对照水平是未患有肝病的健康对象中一种或多种生物标志物的水平，并且与对照水平相比，生物样品中一种或多种生物标志物的增加的水平表明对象中存在肝病。在该实施方案中，本发明的方法提供关于对象中是否存在肝病的信息。优选地，所述肝病为HCC。
本发明的一些实施方案提供前述方法，其还包括使用AFP作为另外的生物标志物。AFP为目前现有技术中用于检测肝硬化患者中HCC的生物标志物。因此，本发明提供了这样的诊断方法，其中例如首先根据现有技术的方法测试对象的生物样品中的生物标志物AFP，然后用本文前面所述的诊断方法进一步测试，或反之亦然。特别优选的是如图6和相应实施例中所述的诊断算法。
此外，在另一方面，本发明的上述问题通过监测对象中肝病的治疗的非侵入性方法而解决，所述方法包括：
(a)提供在治疗的第一时间点获取的所述对象的第一生物样品，
(b)提供在治疗的第二时间点获取的所述对象的第二生物样品，
其中所述第二时间点晚于所述第一时间点，
(c)测定所述第一生物样品和所述第二生物样品中选自鞘脂类的
一种或多种生物标志物的水平，
(d)将所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平与所述
第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较，
其中与所述第一生物样品相比，所述第二生物样品中一种或多种生物标志物水平的增加指示治疗成功。如本文前面所述，所述方法优选为体外或离体方法。关于本发明方法的非侵入性特性的相同的一般描述同样适用于该方面。
一种或多种生物标志物可以选自C16Cer、C16DHC、C18DHC、S1P、C24DHC、C24:1DHC、C18Cer、C20Cer、C24Cer、C24:1Cer、鞘氨醇和SA1P。
本发明的另一方面涉及用于进行根据本公开的方法的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包含用于测定生物样品中一种或多种生物标志物的水平的装置。
现将参考附图和序列在下述实施例中进一步描述本发明，然而，本发明不限于此。出于本发明的目的，本文引用的所有参考文献通过引用整体并入。在图中：
图1：HCC患者中的血清二氢神经酰胺被上调：相比肝硬化患者，在HCC患者血清中的长链DHC(C16DHC和C18DHC)以及极长链DHC(C24DHC和C24:1DHC)均显示显著更高的浓度(对于C16DHC、C18DHC和C24DHC，P<0.001；对于C24:1DHC，P<0.05)。DHC：二氢神经酰胺。
图2：在HCC患者的血清中神经酰胺累积：相比肝硬化患者，在HCC患者的血清中，除了C24Cer、C24:1Cer(2E)的不饱和衍生物以外，所评估的所有血清Cer均被上调(P<0.001)。Cer：神经酰胺。
图3：HCC患者中的鞘氨醇、S1P和SA1P：相比肝硬化患者，HCC患者中的血清鞘氨醇、S1P和SA1P被大大提高(P<0.001)。S1P：鞘氨醇-1-磷酸，SA1P：二氢鞘氨醇-1-磷酸。
图4：血清SL参数和BCLC分期：该研究中没有观察到各SL参数的血清浓度和HCC的BCLC分期之间的显著变化。SL：鞘脂；BCLC：巴塞罗纳临床肝癌(Barcelona Clinic LiverCancer)；HCC：肝细胞癌；Cer：神经酰胺；DHC：二氢神经酰胺；S1P：鞘氨醇-1-磷酸。
图5：在由肝硬化分化的HCC中的血清鞘脂类的诊断性能和其他生化参数：相比普通生化标志物以及唯一广泛可用的HCC血清学标志物AFP(4A-4D)，ROC分析确定血清SL参数(4E-4H)具有更优的诊断准确性。ROC：接受者操作曲线；SL：鞘脂；AFP：甲胎蛋白；AUC：曲线下面积；HCC：肝细胞癌。
图6：通过C16Cer或S1P非侵入性诊断HCC的诊断算法：根据在所有HCC患者(A、C)和在早期BCLC A HCC患者(B、D)中的AFP、C16Cer或S1P，以及根据在所有HCC患者(E、G)和在早期BCLC A HCC患者(F、H)中的AFP、C16DHC或C18DHC，实施非侵入性HCC诊断的诊断算法。HCC：肝细胞癌；Cer：神经酰胺；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；BCLC：巴塞罗纳临床肝癌。
实施例
材料和方法
HCC患者
2009年2月至2013年4月期间，在德国法兰克福的约翰·沃尔夫冈歌德大学医院内科，将随访的122位HCC患者的血清样品常规储存并用于本研究。患者被纳入到此前公布的前瞻性群组。根据EASL实践指南，通过组织病理学或通过在动脉相特征性血管增多和在门静脉相洗脱的动态成像，来进行HCC的诊断。排除标准为：18岁以下，过去5年除HCC以外的癌症史，实体器官移植史和过去28天针对HCC的局部或全身治疗。在研究纳入当天评估了SL参数的诊断潜力。在纳入该研究中时，通过临床检查、实验室参数和腹部超声检查、计算机断层扫描或磁共振成像的结果，评估巴塞罗纳临床肝癌(BCLC)分期、终末期肝病模型(MELD)评分和Child-Pugh分期。
肝硬化患者
具有可比较的肝功能的127位患者的年龄和性别匹配的对照组，来自此前公开的肝硬化患者群组(其得到治疗且最初从2009年3月至2011年6月参加到前瞻性群组研究中)。从这个群组中选出的本次研究的患者如下：对于本研究中纳入的每位HCC患者，根据年龄和性别将每位肝硬化患者进行随机匹配。在匹配之前，两组患者群组按年龄分组(18-29、30-39、40-49、50-59和>60)。在这些组中，将患者按性别随机匹配。基于随机识别号的数字顺序进行随机化，该随机识别号已经在纳入所有肝硬化患者的初始前瞻性研究中被分配。纳入标准为肝硬化(通过肝活检材料的组织病理学检查或肝硬化在超声、计算机断层扫描或磁共振成像中的明确形态学标准来证明)，并且年龄≥18岁。排除标准是过去五年恶性病史，以及此前的实体器官或骨髓移植。
通过高效液相色谱/串联质谱测定SL浓度
如之前所述(Grammatikos G等人.Variations in serum sphingolipid levelsassociate with liver fibrosis progression and poor treatment outcome inhepatitis C virus but not hepatitis B virus infection.Hepatology 2015；61:812-22)，通过高效液相色谱/串联质谱(LC-MS/MS)进行血清SL的定量。为了定量SL，用甲醇/氯仿/HCl(15:83:2)萃取20mL血清。
之后，通过LC-MS/MS分析C16:0Cer、C18:0Cer、C20:0Cer、C24:1Cer、C24:0Cer、C16:0dhCer、C18:0dhCer、C24:0dhCer、C24:1dhCer和内标(C17:0Cer)以及鞘氨醇、S1P、SA1P和内标(鞘氨醇-D7、二氢鞘氨醇-D7和鞘氨醇-1-磷酸-D7)的量。将所有血清样品在-80℃储存直到测定。
统计分析
采用Windows的GraphPad Prism(v5.01；GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)对所呈现的散点图和盒型图进行统计分析。通过采用Windows的BiAS软件(版本10.11；Epsilon-Verlag,Darmstadt,Germany)进行进一步的统计计算。使用非参数曼-惠特尼U检验和克鲁斯卡尔-沃利斯检验来进行连续变量的统计比较，以确定患者组之间的差异。视情况通过相依表(曼特-赫斯则检验)来评估二分变量。除非另有说明，数据表示为均值±标准误差。显著性水平设为＝0.05，代表95％置信区间(CI)。统计学显著性差异在相应的图中指出(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。通过使用BiAS软件中提供的斯皮尔曼相关性来计算相关系数Rho。接受者操作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)值也由BiAS软件计算。
患者特征
按照上述标准，本研究共纳入249位肝硬化患者。122位患者被诊断患有HCC，并且评估了血清SL的变化，如上所述将其与未患有HCC的127位肝硬化患者的年龄和性别匹配系列进行比较。所纳入的患者的基线特征如表1所示。为了排除由肝硬化和HCC的并发症或治疗引起的血清SL的变化，该分析集中在两个之前的前瞻性研究群组的研究纳入当天获得的血清样品。慢性酒精滥用、慢性HCV和慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是两个患者组中慢性肝病的主要病因(表1)。
表1：肝硬化患者和HCC患者的人口统计学、生物化学和临床特征
中值带范围或患者数量在括号中有百分比。缩写：HCC：肝细胞癌；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；γGT：γ-谷氨酰转移酶；ALP：碱性磷酸酶；CRP：C-反应蛋白；INR：国际标准化比例；AFP：甲胎蛋白；NASH：非酒精性脂肪性肝炎；MELD：终末期肝病模型；BCLC：巴塞罗纳临床肝癌。
实施例1:HCC中的血清长链和极长链(二氢-)神经酰胺以及SA1P和S1P均被上调。
评估了HCC患者和肝硬化患者中的长链(C16-C20)和极长链(≥C24)的Cer及其合成的前体二氢神经酰胺(DHC)的血清浓度。相比肝硬化，观察到HCC中的DHC(图1)和Cer(图2)的累积。
除了C24:1Cer和C24:1DHC，C24Cer和C24DHC各自的不饱和衍生物以外，所分析的所有Cer和DHC显示，与肝硬化相比，在HCC中有非常显著的累积(图1A、1B、1C和2A、2B、2C和2D，P<0.001)。在HCC患者的血清中，鞘氨醇(SL的生物活性氨基醇骨架)也被上调(图3A，P<0.001)。与肝硬化相比，在HCC中其磷酸衍生物S1P以及二氢鞘氨醇磷酸衍生物二氢鞘氨醇-1-磷酸(SA1P)都显示出显著的累积(分别为图3B、3C，P<0.001)。
实施例2：鞘脂参数与HCC的生化标志物和替代标志物的相关性
由于SL参数显示在HCC患者的血清中显著的累积，因此使用斯皮尔曼秩相关来确定这些患者中与人口统计学特征和生化参数的潜在关系。确定了各种DHC和Cer与肝细胞损伤标志物的显著相关性，而所评估的参数中没有一个与所纳入的患者的年龄显著相关(表2)。对于肝脏疾病的严重程度，仅C16DHC和C16Cer与MELD评分呈正相关(表2，分别为P<0.05和P<0.001)，而C20Cer、C24Cer、S1P和SA1P水平与MELD评分成反比(表2，分别为P<0.01，P<0.001，P<0.001和P<0.05)。令人感兴趣的是，尽管事实是所评估的所有SL参数均显示在HCC患者血清中累积(图1、2和3)，但只有其中一部分与甲胎蛋白(AFP)(在临床环境中迄今唯一广泛可用的HCC生物标志物)相关。特别是C16DHC、C18DHC、C24:1DHC、C16Cer、C18Cer和鞘氨醇与AFP水平显著相关(表2，分别为P<0.01，P<0.001，P<0.01，P<0.001，P<0.05，P<0.01)。
表2：HCC患者中血清SL与年龄、MELD评分和生化参数的相关性
由斯皮尔曼相关系数Rho(r)评估相关性。缩写：AST：天冬氨酸氨基转移酶；ALT：丙氨酸氨基转移酶；γGT：γ谷氨酰转移酶；AFP：甲胎蛋白；CRP：C反应蛋白；Hb：血红蛋白；MELD：末期肝病模型；DHC：二氢神经酰胺；Cer：神经酰胺；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；SA1P：二氢鞘氨醇-1-磷酸。显著相关性以粗体显示，并在相应的图中指出：“*”＝p<0.05，“**”＝p<0.01，“***”＝p<0.001。
实施例3：血清C16Cer和S1P在由肝硬化患者分化的HCC患者中显示出较高的诊断准确性
由HCC患者血清中SL参数的显著上调驱动，接下来评估了上述观察到的关联的诊断潜力。由于在单变量分析中所分析的几乎所有SL均与HCC的发生显著相关，意图进行多变量分析以评估SL参数是否构成HCC的独立的诊断预测因子。然而，多变量回归分析在统计学上是不可行的，因为SL参数中的一些，特别是C16Cer和S1P，提供了肝硬化患者与HCC患者的几乎完全的诊断分离。因此，通过ROC分析以及对应AUC的估算，对血清SL的诊断性能进行了评估。表3列出了AUC值、截止参数浓度和错误分类率(WCR)的估算。
表3：在肝硬化患者的HCC预测中的肝脏酶、MELD评分以及进一步的生化参数和SL参数的AUC值
通过接受者操作特征(ROC)曲线分析以及对应的曲线下面积(AUC)估算来评估血清SL的诊断性能。缩写：CI：置信区间；SD：标准差；WCR：错误分类率；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；γGT：γ-谷氨酰转移酶；AFP：甲胎蛋白；CRP：C反应蛋白；Hb：血红蛋白；MELD：终末期肝病模型；DHC：二氢神经酰胺；Cer：神经酰胺；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；SA1P：二氢鞘氨醇-1-磷酸。
C16Cer和S1P显示出最高的AUC值(分别为0.999和0.985，P<0.001)，相应地也显示出最低的WCR值(分别为1.2％和4.2％)，因此在由肝硬化患者分化的HCC中比AFP显著更准确(WCR为24.1％)。此外，C16DHC和C18DHC也呈现高诊断准确性，因为它们的AUC值(对于两个参数0.932，P<0.001)均显著高于AFP的AUC值(0.823，P<0.001)。血清SL、AFP和进一步的生化参数的相应ROC图如图5所示。
实施例4：诊断算法
最后，根据C16Cer和S1P的上述截止浓度，评估了在HCC(特别是早期BCLC A HCC)的初步诊断中的诊断算法(图6)。在122位HCC患者中的106位，以及26位BCLC A HCC患者中的22位中，AFP、C16Cer和S1P的水平是接近的。只有33位HCC患者(30.5％)可以通过AFP水平进行诊断确定，而C16Cer和S1P能够分别鉴定其他72位(67.5％)和70位(64.8％)HCC患者(图6A、6C)。在早期BCLC A HCC患者中，C16Cer和S1P的诊断益处甚至更加显著，因为通过C16Cer和S1P可以确定AFP水平<200ng/ml的其他20位患者(图6B、6D)。基于诊断标志物物AFP、C16DHC和C18DHC开发了第二种算法。
总之，本研究首次确定了HCC患者血清中SL参数的显著变化，并强调了鞘脂组学的潜力，以便查询HCC血清学标志中的新型生物标志物。

Claims (14)

1.预测、监测和/或诊断对象中肝细胞癌(HCC)的非侵入性方法，其包括测定来自所述对象的生物样品中选自鞘脂类的一种或多种生物标志物的水平。
2.如权利要求1所述的非侵入性方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自所述对象的生物样品；
(b)测定所述生物样品中选自鞘脂类的一种或多种生物标志物的水平；
(c)将所述生物样品中一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的对照水平进行比较；
其中与所述对照水平相比，所述生物样品中一种或多种生物标志物的不同水平指示所述对象中是否存在HCC。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自长链神经酰胺或长链二氢神经酰胺。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自C16至C24神经酰胺或C16至C24二氢神经酰胺。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自C16DHC、C18DHC、C16Cer和S1P，并且优选C16Cer。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物样品为血液样品或血液来源的样品。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中诊断HCC包括在患有肝硬化的对象中诊断是否存在HCC。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述对照水平为截止水平，并且与所述截止水平相比，所述生物样品中一种或多种生物标志物的增加的水平或相同的水平指示存在HCC。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象为哺乳动物，优选人。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中测定所述一种或多种生物标志物的水平使用色谱法、质谱法或免疫学方法如基于抗体的方法来进行。
11.监测对象中肝病治疗的非侵入性方法，所述方法包括：
(a)提供在治疗的第一时间点获取的所述对象的第一生物样品，
(b)提供在治疗的第二时间点获取的所述对象的第二生物样品，
其中所述第二时间点晚于所述第一时间点，
(c)测定所述第一生物样品和所述第二生物样品中选自鞘脂类的一种或多种生物标志物的水平，
(d)将所述第一生物样品中一种或多种生物标志物的水平与所述第二生物样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较，
其中与所述第一生物样品相比，所述第二生物样品中一种或多种生物标志物水平的增加指示治疗成功。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自C16Cer、C16DHC、C18DHC、S1P、C24DHC、C24:1DHC、C18Cer、C20Cer、C24Cer、C24:1Cer、鞘氨醇和SA1P。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述肝病为HCC。
14.用于进行权利要求1至13中任一项所述方法的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包含用于测定所述生物样品中一种或多种生物标志物的水平的装置。
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