CN107436329B - 一种分离制备格隆溴铵对映体的制备型高效液相色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备型高效液相色谱法分离制备格隆溴铵手性对映体杂质的方法。通过制备型高效液相色谱法将格隆溴铵对映体分离，确认格隆溴铵四个对映体的峰位；用正己烷配制各供试品，用正己烷‑无水乙醇‑二乙胺（97∶3∶0.1）作为流动相。采用制备型高效液相色谱法分离格隆溴铵分离效果好，样品用量低，定量无需对照品，无污染，成本低，适合消旋格隆溴铵的拆分及各手性异构体（单体）的制备。

Description

一种分离制备格隆溴铵对映体的制备型高效液相色谱方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种高效液相色谱法拆分外消旋物毒蕈碱受体拮抗剂格隆溴铵四种手性对映体以及其对映体杂质检查方法的研究。

背景技术

格隆溴铵（Glycopyrronium Bromide）为季铵类抗胆碱药，其结构中含有两个手性碳原子，存在两对对映异构体（RS、SR、RR、SS），即四个手性对映体，国内外已上市产品均为各对映体的混合物，即为外消旋物，其结构如（Ⅰ）所示：

（）

手性对映体尤其是手性药物的拆分近年来已成为分析化学领域的重要课题之一，这是由于药物的药理作用是通过与体内的大分子之间严格的手性识别和匹配实现的，即手性药物与生命体中的药物靶点发生作用时具有显著的立体选择性，因此，在许多情况下，其化合物的不同对映体在生物体内呈现很大的药效学、药动学的差异，毒理作用的表现也会不同甚至完全相反。据研究得知，(3S, 2′ R)- 格隆溴铵的胆碱能拮抗作用最差，而(3R,2′S)- 格隆溴铵具有最强的胆碱能拮抗作用。

随着人们对手性药物对映体之间生物活性差异的认识，逐渐意识到发展单一对映体药物的重要性，现在世界上各大制药公司对单一对映体药物的日益重视不仅反映在新药开发上，更主要的意义是对已上市外消旋药物再开发成为单一异构体药物，因为这要比开发一个全新药物更省时省钱，且单一对映体药物可能疗效更好、安全性更高、毒副反应较少，而这种疗效最好、安全性高的新药正是国内外医药行业所努力的目标。因此，对外消旋药物通过手性拆分途径开发单一对映体药物其前景非常可观的。

本发明针对外消旋药物格隆溴铵的手性拆分展开研究，并通过4个对映体单体进行确定峰位，对各对映体进行含量测定（当以某种单体为主药时）及对映体杂质含量测定（当对映体为杂质时），其深层意义为开发单一异构体新药测定其含量、测定杂质（其他三种对映异构体）的含量。

在世界手性药物研发能力高速发展的今天，研发成果的安全性与高效性成为全球制药行业的首要关注点，而手性色谱分离与制备技术在近年内也在手性药物的研发中扮演着越来越重要的角色。手性药物质量控制越来越引起人们的关注,已成为药物研究领域的热点。高效液相色谱法是最常用的手性药物分析方法之一,其中高效液相色谱手性固定相法更是经 典、简便、快速的方法,键合型纤维素手性固定相具有性能稳定,拆分效果好,适用范围广的特点。

发明内容

本发明提供了一种高效液相色谱法拆分格隆溴铵对映体的方法，确认格隆溴铵四个对映体单体的峰位，并按自身对照法（无需对照品）计算格隆溴铵中对映体的含量，本发明是这样实现的，它主要包括样品的制备，液相色谱条件及定量计算方法；通过考察色谱条件，例如：色谱柱填料、流动相比例、检测波长、柱温等对格隆溴铵及其异构体分离的影响，综合考虑峰形、峰位，选择最佳分离条件。分别配制格隆溴铵单体的溶液，对峰位进行确证，最后，建立了自身对照法对格隆溴铵中的对映体杂质的进行定量及检测。

本发明的液相条件中使用DAICEL（大赛璐药物手性技术有限公司）提供的CHIRALCEL OZ-H手性色谱柱，该系色谱柱适合在正相流动相中使用，OZ为多糖衍生物正相涂敷型手性色谱柱，硅胶表面涂敷有纤维素-三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯），OZ为目前实际上使用范围最广的一种手性填料，亦为USP L80指定填料，在各类文献中都报道了OZ柱优秀的分离能力和耐受性；流动相中正己烷-无水乙醇-二乙胺的比例为97∶3∶0.1，所有试剂均要求为HPLC级；检测波长：220～240nm；色谱柱温度为35℃～40℃，

本发明中，用正己烷配制格隆溴铵及对映体样品，供试品浓度为0.5mg/ml～2.0mg/ml,并配制1%自身对照溶液，分别进样，格隆溴铵供试品溶液中对映异构体的峰面积不得大于自身对照溶液中主峰的峰面积（4个单体在该色谱条件下响应值相同，即校正因子满足0.95～1.05）。

高效液相色谱法用于手性药物异构体的检查有高效、快速、操作简便、样品用量少，成品低，无需对照品，格隆溴铵及对映异构体可以得到满意的分离效果。用于高效液相色谱法拆分的流动相容易得到，有较广阔的应用前景。

本发明的特征和优势将通过下列实施例和附图得以明确。

附图说明

图1是（3R,2’S）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图

图2是（3R,2’S）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图

图3是（3R,2’R）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图

图4是（3R,2’R）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图

图5是（3S,2’S）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图

图6是（3S,2’S）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图

图7是（3S,2’R）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图

图8是（3S,2’R）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图

图9是格隆溴铵四个单体混合高效液相色谱图

具体实施方式：

实施例1

试验仪器：岛津高效液相色谱仪（10ADvp）,岛津紫外检测器（9A）

色谱条件：CHIRALCEL OZ-H手性色谱柱（4.6mm*250mm，5μm）；流动相：正己烷—无水乙醇—二乙胺（97∶3∶0.1）；检测波长：230nm；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl。

样品配制过程如下：

分别配制格隆溴铵四个单体溶液浓度为0.15mg/ml，分别进样，每个样品连续进2针，确定峰位并计算比较响应值（四个单体响应值近乎一致，校正因子为0.95～1.05，无需校正），结果见图1 、2为（3R,2’S）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图，图3、4为（3R,2’R）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图，图5、6为（3S,2’S）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图，图7、8为（3S,2’R）-型格隆溴铵单体高效液相色谱图。

实施例2

色谱条件同实施例1。配制四个单体的混合溶液（单体浓度均为0.15 mg/ml），考察四个单体的分离度，均大于2.0，满足检测要求，结果见图9为单体混合高效液相色谱图。

结论

本专利建立了一种高效液相色谱法拆分格隆溴铵对映体以及对映体杂质检查的方法。本法简单，分离效率高，分离速度快，进样量少，无需对照品，分析成本低。一般只需要一些常用的试剂，所有试剂用量不大，其有益效果主要表现在：

分离效能高，实现了四个单体的手性分离，分离时间短，10分钟之内实现分离，并且满足杂质检查的要求。

样品用量少，每次进样所需样品只有几微升

对杂质定量采用自身对照法，无需使用对照品（外标），节约成本。

该方法检测灵敏度高，耐用性好，色谱条件使用的色谱柱及试剂应用广泛，对异构体分离有较好的指导意义。

Claims (7)

1.一种分离制备格隆溴铵对映体的制备型高效液相色谱方法，其特征是，主要包括样品的制备，高效液相色谱法条件的考察及分析方法；通过高效液相色谱法将格隆溴铵及其对映异构体分离，并确认格隆溴铵四个对映体单体的峰位；用正己烷配制各供试品，用正己烷-无水乙醇-二乙胺作为流动相，所述的流动相：正己烷—无水乙醇—二乙胺97∶3∶0.1；所有试剂均要求为HPLC级；所述的色谱条件：CHIRALCEL OZ-H手性色谱柱4.6mm*250mm，5μm。

2.根据权利要求1所述的一种分离制备格隆溴铵对映体的制备型高效液相色谱方法，其特征是：高效液相色谱仪系统经过正相冲洗，任何模块部件中均不得含有水分，检测波长：220～240nm，色谱柱温度为35℃～40℃，流速:0.9～1.1ml/min。

3.根据权利要求1所述的一种分离制备格隆溴铵对映体的制备型高效液相色谱方法，其特征是:用正己烷配制消旋格隆溴铵分析样品，以及四个对映异构体单体样品，其中正己烷要求为HPLC级。

4.根据权利要求1所述的一种分离制备格隆溴铵对映体的制备型高效液相色谱方法，其特征是：四个对映异构体单体样品，分别进样，得到四个对映体的峰位为：RS、RR、SS、SR。

5.根据权利要求1所述的一种分离制备格隆溴铵对映体的制备型高效液相色谱方法，其特征是：格隆溴铵对映体的计算方法是分别配制格隆溴铵供试品溶液以及1%自身对照溶液，分别进样，格隆溴铵供试品溶液中对映体杂质的峰面积不得大于自身对照溶液中主峰的峰面积。

6.根据权利要求1所述的一种分离制备格隆溴铵对映体的制备型高效液相色谱方法，其特征是：可以采用该方法对格隆溴铵及异构体进行分离的同时，采用自身对照法计算对映异构体的含量。

7.根据权利要求1所述的一种分离制备格隆溴铵对映体的制备型高效液相色谱方法，其特征是：当格隆溴铵及异构体与其他药物配伍使用时，可以采用该方法检查混合液中格隆溴铵及异构体的含量。