CN107432372A - 一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法 - Google Patents

一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法，包括将漆酶水溶液及氧化辅助物(可选)喷洒到棉籽蛋白表面，漆酶水溶液和棉籽蛋白的质量比为1:5～5:1；漆酶水溶液和棉籽蛋白在20～40℃下保持10～30个小时，取出棉籽蛋白即可。本发明使用漆酶可以对棉籽蛋白中的结合棉酚和游离棉酚进行降解，降解生成的物质为环化棉酚，原有醛基消失。环化棉酚具有抗菌和抗氧化作用，从而减少棉粕饲料中抗生素和抗氧化剂的添加量，不仅可以解毒，还可以降低抗生素和抗氧化剂的量，既简单又经济。

Description

一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法
技术领域
本发明涉及的是一种棉籽蛋白中棉酚的降解方法，尤其涉及的是一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法。
背景技术
棉籽蛋白是由棉籽经过剥绒、剥壳，在低温下一次性浸油、沥干后再经过脱除有毒物质——棉酚后制成的一种高蛋白产品，是国内新上市的一种蛋白原料。经过一些奶牛场的试验和应用证明，使用棉籽蛋白能显著提高奶牛产奶量，改善乳品品质，节约饲养成本，是一种很有应用前景的奶牛蛋白饲料。棉籽经脱壳提油后所得的棉籽粕中，蛋白质含量可达40％～50％，而且在质量上近似豆类蛋白，营养价值远比谷类蛋白高。近年来，我国畜牧业蓬勃发展，蛋白质饲料短缺的情况越来越严重目前，但棉籽中的棉酚难以清除，严重制约了我国畜牧业的发展。
棉酚是一种姜黄色结晶，熔点为181～185℃，是一种多元酚类化合物，具有多种异构体。棉酚及其衍生物对人和动物有毒害，主要是棉酚与某些酶及蛋白质结合，破坏了酶的活性及蛋白质的可消化性，阻碍了正常代谢。在一定水分和温度下棉仁生坯蒸炒时，棉酚的醛基可与赖氨酸上的ε-氨基酸形成席夫碱，使游离棉酚的毒性得以脱除，但同时也会使赖氨酸的营养价值降低。因此如果在降解棉籽中游离棉酚和结合棉酚的同时，避免赖氨酸被损失，将有利于提高我国棉籽蛋白质量，缓解蛋白资源短缺现状。我国是一个蛋白资源缺乏的国家，全国每年产棉籽700万吨左右，开发利用好这一资源，是解决我国饲料蛋白不足的快捷、经济的途径。
目前，已知的棉籽蛋白的脱酚方法有以下两种：
1.液－液－固法，也称“液－液－固三相萃取法”，它是根据溶剂萃取法“相似相溶”的原理，采用先萃取棉籽油后萃取棉酚的分步萃取方法。它既能充分发挥6溶剂的提油性能，又能使甲醇萃取棉酚的效果达到最佳状态。
该工艺是将清理去杂后的光棉籽，通过剥壳和仁壳分离装置进行仁壳分离，再经专用精选设备降低仁中含壳量和含短绒量，经过一系列低温调质处理后的胚料，送入浸出器浸出棉籽油，浸出后的湿粕直接在多级脱酚浸出设备中，通过脱酚溶剂进行脱酚处理，脱酚后经机械脱溶和低温烘干脱溶，得到脱酚棉籽蛋白成品。浸出的棉籽混合油过滤后进入分级蒸发、汽提后得到毛油，送至精炼车间精炼。萃取棉籽油和棉酚后的溶剂分别经综合回收系统再生后循环使用。
2.混合溶剂法，使用两种(或多种)溶剂在一个浸出器内混合浸出，在脱脂的同时脱去了棉酚。浸出得到混合油进行分层处理(两种溶剂的比重不同)，含脂的混合油分级蒸发、汽提得毛油，含酚的溶剂精馏，冷却后循环使用。
漆酶(Laccases)是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于蓝色多铜氧化酶家族，广泛存在于植物、真菌甚至昆虫体内。漆酶能够催化包括酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素和生物色素、金属有机化合物、非酚类底物等一系列底物的氧化反应，并还原氧气生成水，是一种绿色，环保，作用条件温和的生物催化剂，在生物造纸、食品生产、环境污染治理、有机合成、生物及免疫检测等方面具有很强的应用潜力。因此，国内外对漆酶的研究已在生物、化学、物理、医学等多领域，分子、细胞、生物组织等多水平全面展开。将漆酶应用于棉籽蛋白脱酚，是本发明的研究方向，目前未见有相关文献公开发表。
发明内容
本发明的目的在于改进现有工艺，提供一种全新的棉籽蛋白脱酚工艺路线：采用漆酶降解棉籽蛋白中的结合棉酚和游离棉酚。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
(1)将1000～40000U/L的漆酶水溶液和氧化辅助物喷洒到棉籽蛋白表面，所述漆酶水溶液和棉籽蛋白的质量比为1:5～5:1，氧化辅助物占总反应质量的0.01％；
(2)所述漆酶水溶液、氧化辅助物和棉籽蛋白在20～40℃下保持10～30个小时，取出棉籽蛋白即可。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，所述漆酶为所有类型漆酶,包括细菌，真菌，植物等物种来源的漆酶。
作为本发明的优选方式之一，所述氧化辅助物选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、双氧水中的一种或两种。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，漆酶水溶液、氧化辅助物和棉籽蛋白在30℃下保持24个小时。
一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法，包括以下步骤：
步骤(1)，将1000～40000U/L的漆酶水溶液喷洒到棉籽蛋白表面，所述漆酶水溶液和棉籽蛋白的质量比为1:5～5:1，暴露在空气中反应；
步骤(2)所述漆酶水溶液和棉籽蛋白在20～40℃下保持10～30个小时，取出所述棉籽蛋白即可。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，所述漆酶为所有类型漆酶,包括细菌，真菌，植物等物种来源的漆酶。
作为本发明的优选方式之一，所述氧化辅助物选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、双氧水中的一种或两种。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，漆酶水溶液、氧化辅助物和棉籽蛋白在30℃下保持24个小时。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明使用漆酶对棉籽蛋白中的结合棉酚和游离棉酚进行降解，降解生成的物质为环化棉酚，原有醛基消失。环化棉酚具有抗菌和抗氧化作用，从而减少棉粕饲料中抗生素和抗氧化剂的添加量，不仅可以解毒，还可以降低饲料中抗生素和抗氧化剂的量，同时不需要进行酶的失活处理，也不用调节pH值，既简单又经济。
附图说明
图1是棉酚标样的HPLC图谱；
图2是实施例1催化棉酚降解产物的HPLC图谱；
图3是实施例2催化棉酚降解产物的HPLC图谱；
图4是实施例3催化棉酚降解产物的HPLC图谱；
图5是棉酚标样质谱图；
图6a是实施例1降解后残余棉酚的质谱图。
图6b是实施例1降解后的产物环化棉酚的质谱图。
图7是棉籽蛋白中棉酚以及实施例1降解产物环化棉酚的红外图谱。
图8是棉籽蛋白中棉酚的核磁的氢谱图。
图9是实施例1降解产物环化棉酚的氢谱图。
图10是实施例1降解产物环化棉酚的碳谱图。
图11是实施例1降解产物环化棉酚的氢谱和碳谱的HMQC图谱。
图12是实施例1降解产物环化棉酚的氢谱和碳谱的HMBC图谱。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
(1)将1000U/L的漆酶水溶液和0.01％质量浓度的双氧水喷洒到棉籽蛋白表面，漆酶水溶液和棉籽蛋白的质量比为1:5，双氧水占总反应质量的0.01％；
(2)双氧水、漆酶水溶液和棉籽蛋白在20℃下保持10个小时，取出棉籽蛋白即可。检测本实施例棉籽蛋白中的棉酚降解率达到65.8％。
实施例2
(1)将20000U/L的漆酶水溶液和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD喷洒到棉籽蛋白表面，漆酶水溶液和棉籽蛋白的质量比为1:1，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD占总反应质量的0.01％；
(2)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、漆酶水溶液和棉籽蛋白在30℃下保持24个小时，取出棉籽蛋白。检测本实施例棉籽蛋白中的棉酚降解率达到87.5％。
实施例3
(1)将5000U/L的漆酶水溶液和0.01％质量浓度的双氧水喷洒到棉籽蛋白表面，漆酶水溶液和棉籽蛋白的质量比为1:5，双氧水占总反应质量的0.01％；
(2)双氧水、漆酶水溶液和棉籽蛋白在25℃下保持15个小时，取出棉籽蛋白即可。检测本实施例棉籽蛋白中的棉酚降解率达到90％。
如图1～4所示，使用HPLC技术分别检测原来棉籽蛋白中、实施例1、实施例2和实施例3降解后的棉酚含量。
HPLC检测条件为：色谱柱SunFire C18Column，5μm，4.6x 150mm，流动相A为0.015％磷酸，流动相B为乙腈，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长280nm，进样量10μL，非梯度洗脱，检测15min。
如图5和图6a所示，使用LC-MS技术分别对棉籽蛋白中棉酚以及实施例1中的降解产物进行检测。图6b可见，棉籽蛋白中的棉酚经漆酶降解后得到产物为环化棉酚。
如图7-图12所示，通过红外光谱、核磁氢谱、碳谱以及氢谱和碳谱的二位相关检测进一步证实了棉籽蛋白中的棉酚经漆酶降解后得到产物为环化棉酚。
LC-MS检测条件：色谱柱SunFire C18Column，5μm，4.6x 150mm，流动相A为0.015％甲酸，流动相B为乙腈，流速1mL/min，柱温25℃，进样量10μL，非梯度洗脱，检测15min。负离子一级质谱全扫描及二级质谱全扫描分析。

Claims (8)

1.一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将1000～40000U/L的漆酶水溶液和氧化辅助物喷洒到棉籽蛋白表面，所述漆酶水溶液和棉籽蛋白的质量比为1:5～5:1，所述氧化辅助物占总反应质量的0.01％；
(2)所述漆酶水溶液、氧化辅助物和棉籽蛋白在20～40℃下保持10～30个小时，取出所述棉籽蛋白即可。
2.根据权利要求1所述的一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述漆酶为所有类型漆酶,包括细菌、真菌、植物等物种来源的漆酶。
3.根据权利要求1所述的一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法，其特征在于，所述氧化辅助物选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD和双氧水中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述漆酶水溶液、氧化辅助物和棉籽蛋白在30℃下保持24个小时。
5.一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤(1)，将1000～40000U/L的漆酶水溶液喷洒到棉籽蛋白表面，所述漆酶水溶液和棉籽蛋白的质量比为1:5～5:1，暴露在空气中反应；
步骤(2)所述漆酶水溶液和棉籽蛋白在20～40℃下保持10～30个小时，取出所述棉籽蛋白即可。
6.根据权利要求5所述的一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述漆酶为所有类型漆酶,包括细菌、真菌、植物等物种来源的漆酶。
7.根据权利要求5所述的一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述漆酶水溶液和棉籽蛋白在30℃下保持24个小时。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法，其特征在于所述棉籽蛋白中棉酚的降解产物为环化棉酚。
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