CN107413845A - 一种利用微生物制剂降解土壤中拟除虫菊酯类农药残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，公开了一种利用微生物制剂修复拟除虫菊酯类农药污染的土壤的方法，其包括如下步骤：首先将拟除虫菊酯类农药污染的土壤进行粉碎，然后喷洒水，保持土壤含水量为20‑30wt％，再按照每吨土壤使用50‑100g微生物制剂的添加量播撒微生物制剂，48小时后，翻耕土壤，然后按照每吨土壤使用50‑100g微生物制剂的添加量播撒微生物制剂，48小时后，检测土壤中除虫菊酯类农药的含量。本发明方法修复效率高，时间短，环保无污染。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用微生物制剂降解土壤中拟除虫菊酯类农药残留的方法。
背景技术
拟除虫菊酯农药是国内代替有机氯农药和其它剧毒长残留杀虫剂的主要农药类型之一。其品种和使用量仅次于有机磷农药，占杀虫剂市场的第二位。由于第二代以后的拟除虫菊酯农药的特点是光、热的分解，自然环境中的拟除虫菊酯残留主要由微生物的活动来去除，所以国外工作者已筛得些能降解拟除虫菊酯的菌株并进一步研究了农药的降解机理。而在国内， 主要侧重于研究拟除菊酯的环境行为和残留消解动态的工作。拟除虫菊酯类农药都含有多个苯环结构，具有中等的生毒性。
降低农药残留的途径有多种，包括禁用(限用)某种农药、化学处理和微生物降解等方式。拟除虫菊酯类农药作为目前最有发展前景的杀虫剂，在尚未找到新型替代化合物之前，未来几十年内仍将被广泛使用，因而迫切需要研究残留农药的降解。微生物降解是各种农药降解方法中较为绿色和高效的一种。
大量研究表明，微生物对土壤和水环境中的农药降解起着关键作用，如假单胞菌属、肠杆菌属、产碱杆菌属和芽孢杆菌属等对拟除虫菊酯类农药具有很好的降解作用。在土壤、水体等自然环境中，对残留农药的降解往往是多种微生物共同作用的结果，但以往的研究大多针对单一菌对单一农药的降解，而针对混合菌同时降解多种拟除虫菊酯类农药的报道较少。丁海涛，土壤学报2003年，公开了一株地衣芽孢杆菌，其对菊酯的降解率仅为50%左右，降解时间为5天。在降解污染物时，不同微生物之间可存在协同作用，降解效果往往比单一菌要好，降解时间更短，但是不同的微生物之间也可存在拮抗作用，筛选配伍合理的微生物制剂来有效处理土壤中拟除虫菊酯类农药残留尤为困难。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供用于一种利用微生物制剂降解土壤中拟除虫菊酯类农药残留的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种利用微生物制剂修复拟除虫菊酯类农药污染的土壤的方法，其包括如下步骤：
首先将拟除虫菊酯类农药污染的土壤进行粉碎，然后喷洒水，保持土壤含水量为20-30wt％，再按照每吨土壤使用50-100g微生物制剂的添加量播撒微生物制剂，48小时后，翻耕土壤，然后按照每吨土壤使用50-100g微生物制剂的添加量播撒微生物制剂，48小时后，检测土壤中除虫菊酯类农药的含量。
进一步地，所述微生物制剂按照如下步骤制备而得：
1）将鞘氨醇假单胞菌种子液（1×108个/ml）按照6%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6h；然后将地衣芽孢杆菌种子液（1×108个/ml）、沼泽红假单胞菌种子液（1×108个/ml）以及藤黄微球菌种子液（1×108个/ml）按照2-3:1-2:1-2的体积比混合，再按照6%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6h，然后添加0.02wt%的氰戊菊酯；最后将阴沟肠杆菌种子液（1×108个/ml）按照10%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养12h，得到复合菌液；
2）将复合菌液添加到相同重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为20℃，干燥后含水量为6wt％，包装，即得。
优选地，所述驯化培养基按照如下方法制备而得：取氰戊菊酯100-150mg，葡萄糖50-70g，农作物秸秆粉40-60g，豆粕20-30g，K2HPO4 2-3g，KH2PO4 2-3g，MgSO4 0.5-0.6g，MnSO4 0.2-0.3g，FeSO4 0.1-0.2g，添加到水中，调pH为6.8，定容至1L，制得驯化培养基。
优选地，所述载体按照如下方法制备而得：将农作物秸秆粉和豆粕按照1:1的质量比混合搅拌均匀得到载体。
优选地，所述鞘氨醇假单胞菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液、藤黄微球菌种子液以及阴沟肠杆菌种子液的浓度均为1×108个/ml。
优选地，所述农作物秸秆粉为玉米秸秆粉、小麦秸秆粉或二者的混合物。
优选地，所述鞘氨醇假单胞菌为CGMCC No.4589，所述地衣芽孢杆菌为ATCC14580，所述沼泽红假单胞菌为ATCC 17001，所述藤黄微球菌为ATCC 49442，所述阴沟肠杆菌为ATCC 700323。
进一步地，
上述只是本发明的优选方案。作为次优选的技术方案，本发明对加入的种子液中菌株的数量也没有特别的限制，这可以根据所述环境需要来决定。
本发明所述的菌种属于已知菌株，均可以从CGMCC、ATCC等商业途径购买得到。本发明的各菌种的种子培养和发酵罐培养为本领域的常规培养方式，不是本发明创新点，此处不详述。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
与现有技术相比较，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
利用微生物制剂降解拟除虫菊酯类农药残留的寄主专化性既是它的一个优点，同时也是其主要缺陷，含有单一菌株的微生物制剂的专化性特性，使其很难对所有农田进行有效防除，从而就限制微生物制剂推广应用；而且一般采用单一菌株降解速度较慢，需要一周以上的处理时间才能发挥一定的降解效果，利用多个菌株混合开发出微生物制剂是解决过于单一缺陷的有效途径。
本发明微生物制剂中各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，活性高，能够有效地处理土壤中拟除虫菊酯类农药残留；
本发明的修复拟除虫菊酯类农药残留土壤的方法操作简单易行，修复成本低，环保无污染，应用前景广阔；利用微生物制剂的修复方法操作简单易行，显著降低了用药量、施药次数以及用药成本，成本低，环保无污染，应用前景广阔；
本发明菌株首先经过驯化培养，使其能够更快速适应环境，提高了降解菊酯类农药的效率；按照菌株适应拟除虫菊酯类农药的不同能力进行培养，其中，阴沟肠杆菌降解能力最强，可直接采用高浓度的拟除虫菊酯类农药进行驯化；在制备驯化培养基时采用农作物秸秆作为原料，以及在制备载体时使用了大量农业废弃物，不仅增强菌株的存活时间及在土壤中的定植能力，对拟除虫菊酯类农药也有一定的吸附性，节省了成本，并且还可作为有机质来来改良土壤。
本发明微生物制剂可降解高浓度的菊酯类农药残留，降解速度快，96h之内基本实现了完全降解，应用前景广阔。
附图说明
图1：本发明微生物制剂对土壤中联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯降解效果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种利用微生物制剂修复拟除虫菊酯类农药污染的土壤的方法，其包括如下步骤：
首先将拟除虫菊酯类农药污染的土壤进行粉碎，控制粒径小于2mm，然后喷洒水，保持土壤含水量为20wt％，再按照每吨土壤使用50g微生物制剂的添加量播撒微生物制剂，48小时后，翻耕土壤，然后按照每吨土壤使用100g微生物制剂的添加量播撒微生物制剂，48小时后，检测土壤中除虫菊酯类农药的含量；修复时间共为96小时。
所述微生物制剂按照如下步骤制备而得：
取氰戊菊酯100mg，葡萄糖50g，农作物秸秆粉40g，豆粕20g，K2HPO4 2g，KH2PO4 2g，MgSO40.5g，MnSO4 0.2g，FeSO4 0.1g，添加到水中，调pH为6.8，定容至1L，制得驯化培养基；
将鞘氨醇假单胞菌种子液（1×108个/ml）按照6%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6h；然后将地衣芽孢杆菌种子液（1×108个/ml）、沼泽红假单胞菌种子液（1×108个/ml）以及藤黄微球菌种子液（1×108个/ml）按照2:1:1的体积比混合，再按照6%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6h，然后添加0.02wt%的氰戊菊酯；最后将阴沟肠杆菌种子液（1×108个/ml）按照10%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养12h，得到复合菌液；
将农作物秸秆粉和豆粕按照1:1的质量比混合搅拌均匀得到载体；
将复合菌液添加到相同重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为20℃，干燥后含水量为6wt％，包装，即得。
所述鞘氨醇假单胞菌为CGMCC No.4589，所述地衣芽孢杆菌为ATCC 14580，所述沼泽红假单胞菌为ATCC 17001，所述藤黄微球菌为ATCC 49442，所述阴沟肠杆菌为ATCC700323。
实施例2
一种利用微生物制剂修复拟除虫菊酯类农药污染的土壤的方法，其包括如下步骤：
首先将拟除虫菊酯类农药污染的土壤进行粉碎，控制粒径小于2mm，然后喷洒水，保持土壤含水量为30wt％，再按照每吨土壤使用100g微生物制剂的添加量播撒微生物制剂，48小时后，翻耕土壤，然后按照每吨土壤使用50g微生物制剂的添加量播撒微生物制剂，48小时后，检测土壤中除虫菊酯类农药的含量；修复时间共为96小时。
所述微生物制剂按照如下步骤制备而得：
取氰戊菊酯150mg，葡萄糖70g，农作物秸秆粉60g，豆粕30g，K2HPO4 3g，KH2PO4 3g，MgSO40.6g，MnSO4 0.3g，FeSO4 0.2g，添加到水中，调pH为6.8，定容至1L，制得驯化培养基；
将鞘氨醇假单胞菌种子液（1×108个/ml）按照6%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6h；然后将地衣芽孢杆菌种子液（1×108个/ml）、沼泽红假单胞菌种子液（1×108个/ml）以及藤黄微球菌种子液（1×108个/ml）按照3:2:2的体积比混合，再按照6%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6h，然后添加0.02wt%的氰戊菊酯；最后将阴沟肠杆菌种子液（1×108个/ml）按照10%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养12h，得到复合菌液；
将农作物秸秆粉和豆粕按照1:1的质量比混合搅拌均匀得到载体；
将复合菌液添加到相同重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为20℃，干燥后含水量为6wt％，包装，即得。
所述鞘氨醇假单胞菌为CGMCC No.4589，所述地衣芽孢杆菌为ATCC 14580，所述沼泽红假单胞菌为ATCC 17001，所述藤黄微球菌为ATCC 49442，所述阴沟肠杆菌为ATCC700323。
实施例3
土壤中拟除虫菊酯类农药残留的降解试验：
样品选择：样品1：联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量均为100mg/kg；样品2：联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量均为200mg/kg；样品3：联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量均为400mg/kg；样品4：联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量均为800mg/kg。
操作流程：以实施例1为例；分别检测样品的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量。由图1可见，微生物制剂对相同浓度的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的降解效果差异不大，最高处理浓度可达到800mg/kg土壤；在低浓度的样品1组，联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯基本实现了完全降解
申请人意外发现，本发明微生物制剂对其他农药也有降解作用，例如菌酯类农药和有机磷类农药，采用实施例1的方法，设定土壤中嘧菌酯含量为100mg/kg、乙酰甲胺磷含量为50mg/kg，降解率分别为92.7%和83.4%。
实施例4
本发明微生物制剂中各菌株的配伍协同效果测试：
选择土壤样本联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量均为400mg/kg；微生物制剂组分别为实施例2组，对照组1（不添加鞘氨醇假单胞菌，其他同实施例2），对照组2（不添加地衣芽孢杆菌，其他同实施例2），对照组3（不添加沼泽红假单胞菌，其他同实施例2），对照组4（不添加藤黄微球菌，其他同实施例2）；对照组5（不添加阴沟肠杆菌，其他同实施例2）；具体结果见表1：
表1
| 组别 | 实施例2组 | 对照组1 | 对照组2 | 对照组3 | 对照组4 | 对照组5 |
| 联苯菊酯 | 8.6 | 29.6 | 42.7 | 54.1 | 61.3 | 78.0 |
| 甲氰菊酯 | 16.4 | 37.8 | 51.4 | 39.4 | 44.8 | 57.1 |
| 氯氰菊酯 | 12.8 | 40.3 | 28.9 | 42.4 | 37.3 | 60.2 |
结论：本发明微生物制剂中各菌株相互协同，配伍合理，对菊酯类农药残留具备较好的降解效果，应用前景广阔。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种利用微生物制剂修复拟除虫菊酯类农药污染的土壤的方法，其包括如下步骤：
首先将拟除虫菊酯类农药污染的土壤进行粉碎，然后喷洒水，保持土壤含水量为20-30wt％，再按照每吨土壤使用50-100g微生物制剂的添加量播撒微生物制剂，48小时后，翻耕土壤，然后按照每吨土壤使用50-100g微生物制剂的添加量播撒微生物制剂，48小时后，检测土壤中除虫菊酯类农药的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物制剂按照如下步骤制备而得：
1）将鞘氨醇假单胞菌种子液（1×108个/ml）按照6%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6h；然后将地衣芽孢杆菌种子液（1×108个/ml）、沼泽红假单胞菌种子液（1×108个/ml）以及藤黄微球菌种子液（1×108个/ml）按照2-3:1-2:1-2的体积比混合，再按照6%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6h，然后添加0.02wt%的氰戊菊酯；最后将阴沟肠杆菌种子液（1×108个/ml）按照10%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养12h，得到复合菌液；
2）将复合菌液添加到相同重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为20℃，干燥后含水量为6wt％，包装，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述驯化培养基按照如下方法制备而得：取氰戊菊酯100-150mg，葡萄糖50-70g，农作物秸秆粉40-60g，豆粕20-30g，K2HPO4 2-3g，KH2PO4 2-3g，MgSO4 0.5-0.6g，MnSO4 0.2-0.3g，FeSO4 0.1-0.2g，添加到水中，调pH为6.8，定容至1L，制得驯化培养基。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体按照如下方法制备而得：将农作物秸秆粉和豆粕按照1:1的质量比混合搅拌均匀得到载体。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述鞘氨醇假单胞菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液、藤黄微球菌种子液以及阴沟肠杆菌种子液的浓度均为1×108个/ml。
6.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于，所述农作物秸秆粉为玉米秸秆粉、小麦秸秆粉或二者的混合物。
7.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于，所述鞘氨醇假单胞菌为CGMCCNo.4589，所述地衣芽孢杆菌为ATCC 14580，所述沼泽红假单胞菌为ATCC 17001，所述藤黄微球菌为ATCC 49442，所述阴沟肠杆菌为ATCC 700323。
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