CN107412856A - 纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架、蛋白涂层复合支架及制备方法和应用 - Google Patents

纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架、蛋白涂层复合支架及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架、蛋白涂层复合支架及制备方法和应用。京尼平交联蛋白涂层载药‑纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的制备方法包括下述步骤：将聚丁二酸丁二醇酯和有机溶剂混合，之后与纳米孔硅酸镁微球和致孔剂混合，压制成型，除去有机溶剂，除去致孔剂，干燥即得复合支架；将复合支架浸泡在白藜芦醇的缓冲溶液中，干燥得载白藜芦醇复合支架；将麦醇溶蛋白溶液加入载白藜芦醇复合支架上，干燥得麦醇溶蛋白涂层载药复合支架，之后与京尼平溶液混合，进行交联反应即可。本发明的复合支架体外降解性和生物活性较高，细胞相容性较好，药物的吸附量高，物缓释效果好，可延长药物有效作用时间。

Description

纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架、蛋白涂层复 合支架及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架、蛋白涂层复合支架及制备方法和应用。
背景技术
骨骼是人体重要组成部分，由于外界创伤、骨疾病(骨肿瘤、骨髓炎等)以及感染多种原因造成的骨缺损，使骨组织的结构完整性遭到破坏，在临床上很常见且难以完全修复。因此，对于骨修复与替代材料的研发，修复或替代体内发生病变或损伤的骨组织，以恢复其原有形态或功能，具有重大的意义。
骨植入材料，不仅应具有优良的安全性和生物相容性，而且还需要具有优良的成骨性和降解性，一定的力学性能，快速修复骨缺损，缩短患者康复所需要的时间。有机/有机复合材料(如壳聚糖/PBSu)的体外生物活性和降解性相对较差。用于骨修复领域的无机活性材料，包括β-磷酸三钙、羟基磷灰石等，其比表面积和孔容较小，体外生物活性较差。
硅基材料具有较好的生物活性，可促进细胞增殖和分化，并有效激活骨的相关基因表达，在骨修复领域中一直备受瞩目。镁离子可以调节细胞与材料表面的亲和力，并促进成骨细胞的增殖。研究发现具有高表面积和孔容的生物活性材料在模拟体液中更有利于羟基磷灰石的形成。但介孔硅镁基生物活性材料存在脆性大，力学性能低，成型困难等缺点。近年来，生物降解高分子材料已广泛用于具有三维结构的骨组织工程支架材料。聚丁二酸丁二醇酯(Poly(butylene succinate)，PBSu)是一种可完全生物降解的脂肪族聚酯类材料。相比于可用于制备支架的有机材料，包括聚乳酸、聚己内酯等可生物降解材料等，聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)价格较低，生物相容性良好、力学和机械性能优异、热稳定性好、易加工以及降解的产物无毒性等优点。然而，PBSu也有一些缺点，限制了其在生物医学领域的应用。例如，PBSu是疏水性材料，会影响PBSu表面的细胞粘附行为；PBSu是生物惰性材料，从而阻碍了其与宿主骨的结合，影响其成骨性能，缺乏对骨组织再生的明显促进作用。
尽管介孔硅基材料生物活性好，但其存在脆性大，力学性能低，成型困难等缺点；而可降解高分子材料具有优良的力学性能、延展性、可加工性，以及易成型等优点。无机/有机复合材料不仅可将二者的优良性能充分地结合起来，克服单一材料存在的缺点，而且还可获得单一材料没有的新性能。
经研究，白藜芦醇是具有成骨和骨诱导特性的多酚植物雌激素，它可以改变骨细胞的代谢，并具有调节骨转换的能力，可增强骨形成，增加骨矿物质密度，并具有较强的抑菌效果。但是，从力学性能方面考虑，白藜芦醇不能单独作为制备骨修复材料的原料。载白藜芦醇复合支架，不仅可以提升材料的成骨效果，而且还赋予其抗菌性能，具有双重功能。然而，通过物理吸附作用，载白藜芦醇复合支架极易产生暴释现象，缩短了白藜芦醇的作用时间。
麦醇溶蛋白是具有独特特征的小麦储存蛋白，作为可再生可降解的天然高分子，其具有来源广泛、生物相容性和降解特性优异、无免疫原性、含有与细胞外基质相同或类似的结构，可以促进细胞的粘附、增殖和分化。但麦醇溶蛋白作为细胞相容性材料应用于组织工程领域时，其机械性能、水稳定性以及强度较差。
目前尚未有关于纳米孔硅酸镁微球与聚丁二酸丁二醇酯的复合骨修复支架材料、及其蛋白涂层负载白藜芦醇复合支架的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中常用的骨修复材料细胞响应慢、骨向分化能力差、营养不足等呈现活性低、骨再生和骨整合速度慢等缺陷，提供了一种纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架、蛋白涂层复合支架及制备方法和应用。
本发明的研究发现，载白藜芦醇复合支架，在提升材料成骨效果的同时，还具有了抗菌性能，可以有效地预防术后感染。麦醇溶蛋白涂层并京尼平交联，是缓释白藜芦醇，延长其作用时间的有效方法。蛋白涂层载白藜芦醇复合支架，是一种可降解、兼具成骨和抗菌双重特性的骨修复支架材料。
本发明的纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架孔隙率、吸水率、体外降解性和生物活性较高，与MC3T3-E1细胞相容性较好，细胞的黏附、增殖能力及ALP活性较好，药物的吸附量提高，并具有缓释能力，可延长药物有效作用时间，京尼平交联蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的药物缓释效果好，可以明显促进MC3T3-E1细胞的增殖、生长和分化，还可以持续稳定的释放白藜芦醇，保持长期的抗大肠杆菌的效果。
本发明通过下述技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的制备方法，其包括下述步骤：
将聚丁二酸丁二醇酯和有机溶剂混合得混合物Ⅰ，然后将纳米孔硅酸镁微球和致孔剂与混合物Ⅰ混合得混合物Ⅱ，将混合物Ⅱ压制成型，之后除去有机溶剂，然后除去致孔剂，干燥即得纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
本发明中，所述聚丁二酸丁二醇酯为本领域常规使用的所述聚丁二酸丁二醇酯，较佳地，所述聚丁二酸丁二醇酯的数均分子量为4×104～7×104，分子量分布(Mw/Mn)为1.2～2.4。
本发明中，所述有机溶剂为本领域常规使用的用于溶解聚丁二酸丁二醇酯的有机溶剂，例如二甲基甲酰胺、三氯甲烷、二氯甲烷、1,4-二氧己环或间甲基苯酚中的一种或多种，较佳地为二甲基甲酰胺。
本发明中，所述纳米孔硅酸镁微球为本领域常规使用的纳米孔硅酸镁微球，宏观以粉末态存在。较佳地，所述纳米孔硅酸镁微球符合下述条件：所述纳米孔硅酸镁微球的粒径为180～220nm，所述纳米孔硅酸镁微球的孔径为3～5nm，所述纳米孔硅酸镁微球的比表面积为534～542m2/g，所述纳米孔硅酸镁微球的孔容为0.65～0.69cm3/g。
在本发明一实施例中，所用的纳米孔硅酸镁微球符合下述条件：所述纳米孔硅酸镁微球的粒径为200nm，且粒径分布均一，孔径为4nm，且孔径分布均一，比表面积为538m2/g，孔容为0.67cm3/g。
本发明中，所述纳米孔硅酸镁微球可采用本领域常规用于制备纳米孔硅酸镁微球的方法制备而得，一般采用模板及自组装法。在本发明某一实施方式中，所述纳米孔硅酸镁微球采用包括如下步骤的方法制备：
将模板剂和水混合，之后在33～37℃下将氨水、正硅酸乙酯(TEOS)和六水合硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)加入上述溶液中，反应3～5小时形成乳白色悬浊液，离心得白色沉淀物，洗涤所得白色沉淀物后干燥，然后在500～700℃下烧结除去模板剂即得纳米孔硅酸镁微球。
其中，所述模板剂为本领域常规使用的模板剂，通常采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，所述水可为去离子水，所述模板剂和水的用量可参照本领域常规，较佳地，所述模板剂和水的用量比为1g：(44～50)mL。
其中，所述氨水的浓度较佳地为0.5～1.5mol/L，更佳地为1.0mol/L。
其中，向上述溶液中加氨水、正硅酸乙酯和六水合硝酸镁可采用分步加入，依次加入氨水、正硅酸乙酯和六水合硝酸镁。
其中，所述氨水、所述正硅酸乙酯和所述六水合硝酸镁的用量可参照本领域常规，较佳地，所述氨水、所述正硅酸乙酯和所述六水合硝酸镁的用量比为(2.5～3.34)mL：(1.42～1.54)mL：(1～1.1)g。
其中，所述洗涤的操作和条件为本领域常规的洗涤的操作和条件，较佳地，先用酒精洗涤两次，再用去离子水洗涤一次。
其中，所述干燥的操作和条件为本领域常规的干燥的操作和条件，较佳地为在50～70℃电热鼓风干燥箱中烘干22～26小时，更佳地为在60℃电热鼓风干燥箱中烘干24小时。
其中，所述烧结的操作和条件为本领域常规的烧结的操作和条件，较佳地在马弗炉中进行。所述烧结的时间不作特殊限定，以使十六烷基三甲基溴化铵能被完全除去为宜，较佳地为2～4小时，更佳地为3小时。
在本发明一较佳实施例中，所述纳米孔硅酸镁微球的制备按照如下操作进行：准确称量0.7g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于33mL去离子水中，置于35℃恒温水槽中。CTAB完全溶解后，依次加入7mL1mol/L氨水，3.6mLTEOS和2.47g六水合硝酸镁。经过4小时充分反应后，溶液变为乳白色悬浊液，离心后收集到白色沉淀物。经过两次酒精洗涤和一次去离子水洗涤后，置于60℃电热鼓风干燥箱中24小时，烘干。最后，将所得产物置于马弗炉中，600℃条件下进行烧结，保温三小时，除去CTAB，得到白色粉末即为纳米孔硅酸镁微球。
本发明中，所述致孔剂为本领域常规使用的致孔剂，一般采用氯化钠(NaCl)，所述氯化钠的颗粒粒径不做特殊限定，较佳地为300～500μm。所述氯化钠的用量例如可为相对于纳米孔硅酸镁微球和聚丁二酸丁二醇酯总质量的7～9倍，如8倍。
本发明中，将纳米孔硅酸镁微球和致孔剂与混合物Ⅰ混合可采用分步进行，先将所述纳米孔硅酸镁微球与所述混合物Ⅰ混合，再将致孔剂加入进行混合。
本发明中，所述纳米孔硅酸镁微球与所述聚丁二酸丁二醇酯的质量比较佳地为(20～40):(80～60)，更佳地为30:70。
本发明中，所述有机溶剂的用量不做特殊限制，该用量的选用只要使得到的所述混合物Ⅱ的物理状态能够进行压制成型的操作即可，例如所述聚丁二酸丁二醇酯和所述有机溶剂的用量比为1g：(2～4)mL，较佳地为1g：3mL。
本发明中，所述混合可采用搅拌混合，所述混合一般为混合至各组分均匀。
本发明中，所述压制成型本领域公知需要使用模具，一般为不锈钢模具，通常可根据所要制备的样品选择不同规格的模具。
本发明中，所述压制成型的操作和条件为本领域常规的压制成型的操作和条件，所述压制成型的压力较佳地为1～3MPa，如2MPa。所述压制成型的时间较佳地为1～3分钟，如2分钟。
本发明中，所述除去有机溶剂的操作和条件为本领域常规的除去溶剂的操作和条件，较佳地采用在通风橱中自然晾干10～14小时使溶剂挥发干净，更佳地为自然晾干12小时。
本发明中，所述去除致孔剂的操作和条件为本领域常规的除去致孔剂的操作和条件，较佳地在能够溶解致孔剂但不会使介孔硅酸镁和聚丁二酸丁二醇酯溶解的溶剂中浸泡后去除，所述溶剂一般采用水，例如去离子水；其中，所述浸泡的时间不作特殊限定，例如可为44～50h，较佳地为48h。浸泡期间，为使致孔剂更好地去除，一般可每隔一段时间更换一次溶剂，例如每6～10h更换一次溶剂，较佳地为每8h更换一次溶剂。
本发明中，所述干燥的操作和条件为本领域常规的干燥的操作和条件，较佳地为在35～39℃烘箱中干燥10～14小时，更佳地为在37℃烘箱中干燥12小时。
本发明提供了一种由上述方法制备的纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
本发明提供了一种载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的制备方法，其包括下述步骤：
将所述纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架浸泡在白藜芦醇的缓冲溶液中，之后干燥，即得载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
本发明中，所述缓冲溶液为本领域常规使用的缓冲溶液，例如磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液，较佳地为磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)。所述白藜芦醇为本领域常规使用的白藜芦醇，较佳地为购自Sigma Aldrich公司货号为V900386-5G(CAS号：501-36-0)的白藜芦醇。在本发明的一实施例中，所述白藜芦醇的PBS缓冲溶液中白藜芦醇的浓度为0.4～0.6mg/mL，较佳地为0.5mg/mL。
本发明中，可通过本领域常规的操作使白藜芦醇均匀分布在所述纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架上，所述浸泡较佳地在恒温震荡箱中进行，所述浸泡的时间较佳地为22～26小时，更佳地为24小时，所述浸泡的温度较佳地为36～38℃，更佳地为37℃。
本发明提供了一种由上述方法制备的载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
本发明提供了一种麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的制备方法，其包括下述步骤：
将麦醇溶蛋白溶液加入所述载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架上，干燥即得麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
本发明中，所述麦醇溶蛋白本领域公知为谷类(如小麦、黑麦等)种子的一种蛋白质混合物，市售可得，较佳地为购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司产品编码为G0031(CAS编码：9007-90-3)的麦醇溶蛋白。所述麦醇溶蛋白溶液为本领域常规使用的麦醇溶蛋白溶液，所述麦醇溶蛋白溶液的浓度不作特殊限定，例如可为0.4～0.6mg/mL，较佳地为0.5mg/mL。所述麦醇溶蛋白溶液较佳地为麦醇溶蛋白乙醇溶液，所用乙醇溶液的浓度不作特殊限定，例如可为55～75％，较佳地为65％。所述麦醇溶蛋白溶液的用量不作特殊限定，只要能够使麦醇溶蛋白在所述载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架上均匀分布即可，可通过多次加入麦醇溶蛋白溶液来实现，例如使用移液枪滴加40μL所述麦醇溶蛋白溶液在载白藜芦醇复合支架上，烘干，反复重复三次。
本发明提供了一种由上述方法制备的麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
本发明提供了一种京尼平交联蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的制备方法，其包括下述步骤：
将所述麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架与京尼平溶液混合，进行交联反应，即得京尼平交联蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
本发明中，所述京尼平溶液的用量较佳地为0.4～0.6mL，更佳地为0.5mL。所述京尼平溶液中的京尼平浓度较佳地为6～14mmol/L，更佳地为10～14mmol/L，最佳地为10mmol/L。当京尼平浓度小于10mmol/L时，支架的交联度和抗压强度随着京尼平浓度增加而增加；当京尼平的浓度大于10mmol/L，支架的交联度和抗压强度保持不变，所以选用10mmol/L的用量是最优化的选择。
本发明中，所述交联反应较佳地在摇床中进行，所述交联反应的温度较佳地为30～45℃，例如37℃；所述交联反应的时间较佳地为12～24小时。
本发明提供了一种由上述方法制备的京尼平交联蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
本发明还提供了一种所述纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架、所述载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架、所述麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架和所述京尼平交联蛋白涂层-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架在制备骨修复材料中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明的纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架孔隙率、吸水率、体外降解性和生物活性较高，与MC3T3-E1细胞相容性较好，细胞的黏附、增殖能力及ALP活性较好，药物的吸附量提高，并具有缓释能力，可延长药物有效作用时间。
(2)蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的药物缓释效果好，可以明显促进MC3T3-E1细胞的增殖、生长和分化，还可以持续稳定的释放白藜芦醇，保持长期的抗大肠杆菌的效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中的纳米孔硅酸镁微球(NMS)的透射电镜图片(标尺分别为200nm和40nm)。
图2为本发明实施例1中的NMS的XRD分析结果(a为广角分析结果，b为小角分析结果)。
图3为本发明实施例1中的NMS的BET分析结果。(a图为吸附脱附等温线，b图为孔径分布)。
图4为本发明实施例1中纳米孔硅酸镁微球(NMS)(a，c)和对比例1中的非介孔硅酸镁(MS)(b，d)的SEM图。
图5为本发明实施例1中NMS和对比例1中的MS的粒径分布图。
图6为本发明实施例1中的纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(NMPC)(a，c)和对比例1中的非介孔硅酸镁/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(MPC)(b，d)的SEM图。
图7为本发明实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)的EDS分析结果。
图8为本发明实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)的孔隙率(A)和吸水率(B)。
图9为本发明实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)的失重率(A)和pH(B)。
图10为本发明实施例1中的NMPC(a，c)和对比例1中的MPC(b，d)浸泡于SBF溶液中3(a，b)和5天后(c，d)材料表面形貌的SEM图。
图11为本发明实施例1中的NMPC(A)和对比例1中的MPC(B)浸泡5天后材料表面的EDS谱图。
图12为本发明实施例1中的NMPC(A)和对比例1中的MPC(B)浸泡于SBF溶液中离子浓度变化曲线。
图13为MC3T3-E1细胞在本发明实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)上培养3，6和12小时的粘附率。
图14为MC3T3-E1细胞粘附在本发明实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)的形态图。
图15为本发明实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)的细胞增殖率(A)及ALP活性(B)。
图16为本发明实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)对盐酸万古霉素的吸附(A)及缓释(B)行为分析结果。
图17为本发明实施例1中的Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)的XRD谱图。
图18为本发明实施例1中的Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)的FTIR谱图。
图19为本发明实施例1中的Res@NMP(a，d),GRes@NMP(b，e)和GGRes@NMP(c，f)的SEM图。
图20为本发明实施例1中的Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP的药物释放曲线。
图21为本发明效果实施例5中的MC3T3-E1细胞在Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)表面培养1，3和5天后的O.D.值。
图22为本发明效果实施例5中的MC3T3-E1细胞在Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)上分别培养7,10和14天时的ALP活性分析。
图23为本发明实施例1中的Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)在24小时后的抗菌率。
图24为本发明实施例1中的Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)在48小时后的抗菌率。
图25为本发明实施例1中的Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)在120小时后的抗菌率。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例1～3和对比例1中的聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)购自安庆和兴化工有限责任公司，数均分子量为4×104～7×104，分子量分布(Mw/Mn)为1.2～2.4。下述实施例1～3中京尼平(Genipin)购自国药集团化学试剂有限公司。下述实施例1～3中麦醇溶蛋白购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(CAS编码：9007-90-3)，产品编码为G0031。
实施例1
(1)制备纳米孔硅酸镁微球(NMS)
准确称量0.7g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于33mL去离子水中，置于35℃恒温水槽中。CTAB完全溶解后，依次加入1mol/L氨水7mL，3.6mL正硅酸乙酯(TEOS)和2.47g六水合硝酸镁。经过4小时充分反应后，溶液变为乳白色悬浊液，离心后收集到白色沉淀物。经过两次酒精洗涤和一次去离子水洗涤后，置于60℃电热鼓风干燥箱中24小时，烘干。最后，将所得产物置于马弗炉中，600℃条件下进行烧结，保温3小时，除去CTAB，得到白色粉末即为NMS。
(2)制备纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
用称量瓶准确称取0.6g的PBSu，溶解在2mL二甲基甲酰胺溶液中。加入0.4g的纳米孔硅酸镁微球(NMS)粉末并不断搅拌使其均匀分散，充分混合后加入8g的氯化钠颗粒(粒径为300-500μm)，混合搅拌10分钟。然后将上述混合物加入到不锈钢模具中，0.2MP的压力下，2分钟压制成型。所得样品在通风橱中自然晾干12小时使溶剂挥发干净。然后将材料浸泡在去离子水中48小时，以去除致孔剂(氯化钠颗粒)，每8小时更换一次去离子水。最后将样品置于37℃烘箱中12小时，获得纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(NMPC)。
(3)制备载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
将纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架浸泡在0.5mg/mL白藜芦醇的PBS溶液中，置于37℃恒温震荡箱内24小时，取出支架烘干，得到载白藜芦醇复合支架(Res@NMP)。
(4)制备麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
称取麦醇溶蛋白溶于65％的乙醇溶液中，配置成0.5mg/mL的麦醇溶蛋白溶液。使用移液枪，滴加40μL上述麦醇溶蛋白溶液在Res@NMP，烘干，反复重复三次，得到麦醇溶蛋白涂层载药复合支架(GRes@NMP)。
(5)制备京尼平交联蛋白涂层-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
然后将每个成型的样品放入24孔板中，在每个孔中加入0.5mL京尼平溶液(10mmol/L)，置于37℃摇床中，交联一定时间(12和24小时)后，得到京尼平交联蛋白涂层-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(GGRes@NMP)。
实施例2
(1)制备纳米孔硅酸镁微球(NMS)
准确称量0.6g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于31mL去离子水中，置于33℃恒温水槽中。CTAB完全溶解后，依次加入0.5mol/L氨水8mL，3.4mL正硅酸乙酯(TEOS)和2.40g六水合硝酸镁。经过3小时充分反应后，溶液变为乳白色悬浊液，离心后收集到白色沉淀物。经过两次酒精洗涤和一次去离子水洗涤后，置于50℃电热鼓风干燥箱中26小时，烘干。最后，将所得产物置于马弗炉中，500℃条件下进行烧结，保温4小时，除去CTAB，得到白色粉末即为NMS。
(2)制备纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
用称量瓶准确称取0.8g的PBSu，溶解在3.2mL二甲基甲酰胺溶液中。加入0.2g的纳米孔硅酸镁微球(NMS)粉末并不断搅拌使其均匀分散，充分混合后加入8g的氯化钠颗粒(粒径为300-500μm)，混合搅拌10分钟。然后将上述混合物加入到不锈钢模具中，1MP的压力下3分钟压制成型。所得样品在通风橱中自然晾干10小时使溶剂挥发干净。然后将材料浸泡在去离子水中44小时，以去除致孔剂(氯化钠颗粒)，每6小时更换一次去离子水。最后将样品置于35℃烘箱中14小时，获得纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(NMPC)。
(3)制备载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
将纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架浸泡在0.4mg/mL白藜芦醇的PBS溶液中，置于36℃恒温震荡箱内26小时，取出支架烘干，得到载白藜芦醇复合支架(Res@NMP)。
(4)制备麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
称取麦醇溶蛋白溶于55％的乙醇溶液中，配置成0.4mg/mL的麦醇溶蛋白溶液。使用移液枪，滴加40μL上述麦醇溶蛋白溶液在Res@NMP，烘干，反复重复三次，得到麦醇溶蛋白涂层载药复合支架(GRes@NMP)。
(5)制备京尼平交联蛋白涂层-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
然后将每个成型的样品放入24孔板中，在每个孔中加入0.4mL京尼平溶液(10mmol/L)，置于30℃摇床中，交联24小时后，得到京尼平交联蛋白涂层-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(GGRes@NMP)。
实施例3
(1)制备纳米孔硅酸镁微球(NMS)
准确称量0.8g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于33mL去离子水中，置于35℃恒温水槽中。CTAB完全溶解后，依次加入1.5mol/L氨水8mL，3.8mL正硅酸乙酯(TEOS)和2.54g六水合硝酸镁。经过5小时充分反应后，溶液变为乳白色悬浊液，离心后收集到白色沉淀物。经过两次酒精洗涤和一次去离子水洗涤后，置于70℃电热鼓风干燥箱中22小时，烘干。最后，将所得产物置于马弗炉中，700℃条件下进行烧结，保温2小时，除去CTAB，得到白色粉末即为NMS。
(2)制备纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
用称量瓶准确称取0.7g的PBSu，溶解在1.4mL二甲基甲酰胺溶液中。加入0.3g的纳米孔硅酸镁微球(NMS)粉末并不断搅拌使其均匀分散，充分混合后加入8g的氯化钠颗粒(粒径为300-500μm)，混合搅拌10分钟。然后将上述混合物加入到不锈钢模具中，3MP的压力下1分钟压制成型。所得样品在通风橱中自然晾干14小时使溶剂挥发干净。然后将材料浸泡在去离子水中50小时，以去除致孔剂(氯化钠颗粒)，每10小时更换一次去离子水。最后将样品置于39℃烘箱中10小时，获得纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(NMPC)。
(3)制备载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
将纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架浸泡在0.6mg/mL白藜芦醇的PBS溶液中，置于38℃恒温震荡箱内22小时，取出支架烘干，得到载白藜芦醇复合支架(Res@NMP)。
(4)制备麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
称取麦醇溶蛋白溶于75％的乙醇溶液中，配置成0.6mg/mL的麦醇溶蛋白溶液。使用移液枪，滴加40μL上述麦醇溶蛋白溶液在Res@NMP，烘干，反复重复三次，得到麦醇溶蛋白涂层载药复合支架(GRes@NMP)。
(5)制备京尼平交联蛋白涂层-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架
然后将每个成型的样品放入24孔板中，在每个孔中加入0.6mL京尼平溶液(10mmol/L)，置于45℃摇床中，交联12小时后，得到京尼平交联蛋白涂层-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(GGRes@NMP)。
对比例1
(1)制备非介孔硅酸镁(MS)
于35℃恒温水槽中，将33mL去离子水中、7mL 1M氨水、3.6mL TEOS和2.47g六水合硝酸镁混合。经过4小时充分反应后，溶液变为乳白色悬浊液，离心后收集到白色沉淀物。经过两次酒精洗涤和一次去离子水洗涤后，置于60℃电热鼓风干燥箱中24小时，烘干，得到白色粉末即为MS。
(2)制备非介孔硅酸镁/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(MPC)
用称量瓶准确称取0.6g的PBSu，溶解在适量的二甲基甲酰胺溶液中。加入0.4g的非介孔硅酸镁(MS)粉末并不断搅拌使其均匀分散，充分混合后加入8g的氯化钠颗粒(粒径为300-500μm)，混合搅拌10分钟。然后将上述混合物加入到不锈钢模具中，0.2MP的压力下，2分钟压制成型。所得样品在通风橱中自然晾干12小时使溶剂挥发干净。然后将材料浸泡在去离子水中48小时，以去除致孔剂(氯化钠颗粒)，每8小时更换一次去离子水。最后将样品置于37℃烘箱中12小时，获得非介孔硅酸镁/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(MPC)。
效果实施例1
实施例1中的纳米孔硅酸镁微球(NMS)和对比例1中的非介孔硅酸镁(MS)的性能表征：
(1)透射电镜(TEM)
将经研磨的NMS和MS粉末样品加入无水乙醇中超声分散15min，吸取一滴溶液滴在铜网上，干燥后采用透射电镜(TEM；JEM2010，日本)观察材料的微观结构。
图1为实施例1中的NMS的透射电镜的图片(标尺分别为200nm和40nm)，图中可见，颗粒粒径分布较为均匀，大部分颗粒粒径为200nm左右，并具有蠕虫状的孔结构，且孔径分布也较为均一。规则的球形颗粒有利于在复合材料中分散分布，均一的孔结构有助于负载更多量的药物。
(2)X射线衍射分析(XRD)
采用X射线衍射仪(XRD，Rigaku D/max 2550，日本)在0.5～8°和10～80°分析了材料的微观结构及结晶状态。
图2为实施例1中的NMS的XRD分析结果(a为广角分析结果，b为小角分析结果)。a图可见，介孔材料具有一个从15°到30°左右的馒头峰，表明该材料为无定形态物质；b图为小角XRD，其在100，110，200具备三个明显的衍射峰，表明该物质为有序的介孔材料。该颗粒为无定形结构，有利于颗粒的降解，而小角XRD的三个衍射峰说明该材料具有有序的孔结构，验证了TEM得到的结果。
(3)氮气吸附脱附(BET)
采用孔隙率仪(Tristar 3000,Micro-metrics Instrument Corp.,Norcross,GA,USA)测定不同相对压力P/P0下N2等温吸附-脱附曲线，通过Brunauer Emmett Teller(BET)计算材料的比表面积和孔容，并根据Barrett-Joyner-Helen(BJH)公式计算平均孔径。
图3为实施例1中的NMS的BET分析结果。a图为吸附脱附等温线，可见所制备介孔材料具有一个明显的Ⅳ型回滞环，说明该材料是有序介孔材料。b图为该材料的孔径分布，图中可知，该材料的孔径约为4nm，且孔径分布范围较小，也说明该材料为有序的介孔材料。通过吸附脱附等温线计算可得，NMS的比表面积和孔容分别为538m2/g和0.67cm3/g。结果表明，该材料具有4nm的均一孔径。这是用作药物载体的较为合适的孔径，能够稳定的吸附和负载万古霉素。
(4)扫描电镜(SEM)
将粉末样品研磨后黏附在导电胶上采用电子扫描电镜(S-3400N,Hitachi,Japan)观察样品表面形貌。
图4为实施例1中的NMS(a，c)和对比例1中的MS(b，d)的SEM图。由图中可知，纳米孔硅酸镁具有较为均匀的粒径分布，微球的粒径为200nm左右，分布较为均一，且微球分散较好，无团聚现象。图4b和d为硅酸镁颗粒，由图中可知，该颗粒粒径约为1微米，球状微粒较少，且团聚严重。可以预见的是，在进行复合材料的制备过程中，纳米孔硅酸镁微球能够更为均一的分散在基体中，而硅酸镁颗粒可能会团聚成更大的颗粒而分散在PBSu基体中。因此纳米孔硅酸镁微球能够形成较为均一的生物活性表面，而硅酸镁因为团聚现象可能导致形成复合材料的表面具有生物活性区域以及非生物活性区域，由此可能对后期的类骨磷灰石的形成以及细胞的粘附产生较大的影响。
(5)粒度分析
采用粒度分析仪(PSS-Nicomp particle sizing systems,USA)来表征其粒径分布。
图5为实施例1中的NMS和对比例1中的MS的粒度分析结果，由图可知，纳米孔硅酸镁的粒径分布在较小的范围，大部分纳米孔硅酸镁的粒径为200nm左右的颗粒。而硅酸镁颗粒的粒径相对而言分布较宽，其平均粒径为1微米左右。一般而言，颗粒粒径越小，其相对表面积就越大，越容易均一的分散于基体材料中，且能够吸附更多的药物。
实施例2和3中的NMS的形貌、结构、比表面积、孔容、粒径与实施例1中的NMS基本相当。
效果实施例2
对实施例1中纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(NMPC)和对比例1中的非介孔硅酸镁/聚丁二酸丁二醇酯复合支架(MPC)的表征：
(1)扫描电镜(SEM)
将粉末样品研磨后黏附在导电胶上采用电子扫描电镜(S-3400N,Hitachi,Japan)观察样品表面形貌。
图6为实施例1中的NMPC(a，c)和对比例1中的MPC(b，d)的SEM图。由图可知，在小倍数观察下，支架并无明显区别，均具有约为400微米的大孔结构，且孔与孔之间相互贯通。采用300～400μm的食盐作为制孔剂，故而溶出食盐颗粒形成的孔为300～400μm，而1:8的质量比则保证了孔与孔之间的连通性。在大倍数SEM图中，观察大孔孔壁发现NMPC孔壁没有发现明显的颗粒物。这验证了之前对于NMS颗粒的表征，纳米孔硅酸镁微球颗粒大小形状规则，能够均匀的分布在PBSu基体中。
(2)元素分析(EDS)
通过元素分析仪(EDS,Falcon,USA)上测得样品表面的元素组成。
图7为实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)的EDS分析结果。由图可知，两种支架表面元素无明显区别，都是具有C，O，Mg，Si四种元素分布，且含量类似。结果表明，NMS和MS成功复合到PBSu基体中，证明图6(b)中的颗粒状物质为MS。
(3)吸水率及孔隙率
材料的吸水性能是通过将材料浸泡在去离子水中一定时间后所吸收水的重量来测定。具体步骤如下：首先准确称量NMPC和MPC圆片样品的重量，记为W0。之后将样品浸泡在去离子水中，分别在0.5，6，12，24和48小时后，擦去样品表面水份并对样品称重，记为Wt。吸水率表示吸收水的重量占原重的百分比，按照公式计算：
吸水率(％)＝(Wt-W0)/W0×100。
通过阿基米德原理测定多孔骨修复支架的孔隙率。以NMPC为例，首先将NMPC(Φ12×2mm)在烘箱中烘干并准确称量其重量记为m1；将NMPC浸入水中以便水完全充满支架内部的孔隙，支架在水中的重量记为m3；从水中将多孔支架材料取出，擦干其表面的水分并准确称量其重量记为m2。孔隙率按下列公式计算：
孔隙率(％)＝(m2-m1)/(m2-m3)×100
其中m1为NMPC在空气的重量，m2为NMPC与其内部所吸水的重量，m3为NMPC悬浮在水中的重量。
图8为实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)的孔隙率(A)和吸水率(B)。由图可知，NMPC具有更高的孔隙率，为75％左右；而MPC仅具有60％的孔隙率。NMPC的吸水率远远高于MPC。在24小时，NMPC的吸水率达到240％，而MPC仅为160％。介孔材料有更为均匀的分布，在表面能够分布更多的无机颗粒，且介孔硅酸镁微球具有均一的介孔结构，增加了该材料的孔隙率，从而提高了其吸水率。
(4)体外降解性能及pH变化
通过将材料浸泡在Tris-HCl缓冲液中，测量计算其重量损失率来表征体外降解性能。Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)的配制方法如下：42mL稀盐酸溶液(0.1mol/L)与50mL三羟甲基氨基甲烷(Tris，0.1mol/L)溶液混合均匀后，用去离子水定容至100mL。以NMPC为例，首先将NMPC样品超声清洗2次，100℃真空干燥至恒重，分析天平称其初始质量，记为W0。按照固体/液体为0.25g/50ml的比例，将样品浸泡在Tris-HCl(pH＝7.4)溶液中，置于恒温振荡箱(37℃，80r/min)中。分别在3，7，14，21，28，42，56，70和84天时取出样品，100℃真空干燥至恒重，称重并记为Wi。则失重率(％)按照公式计算：
失重率(％)＝(W0-Wi)/(W0)×100。
在选取的时间点，通过pH计(PHS-2C，上海仪电科学仪器股份公司)测量Tris-HCl溶液的pH值，记录其pH值变化。
图9为实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)的失重率(A)和pH(B)。结果可知，在相同时间，NMPC具有比MPC更高的失重率。到12周时，NMPC的失重率高达66％，而MPC的失重率仅为46％。在降解过程中，两种支架的降解过程都引起了缓冲溶液的pH变化，都呈现出先升高后降低的趋势。最初3天，浸泡NMPC和MPC的缓冲溶液中的pH值分别升高到7.7和7.5。其后两者的pH值均开始逐步下降，到第四周时两者均达到7.4左右。这是因为NMS具有更高的比表面积，加入到PBSu后形成的复合支架具有更高的孔隙率，从而导致其具有更快的降解性能。更高的失重率，导致了pH变化快于MPC，然而pH值在7.7到7.4之间的变化对细胞并无太大影响，也不会引起严重的炎症反应。
(5)体外生物活性及离子释放
将NMPC和MPC(Φ12×2mm)浸泡在SBF溶液中，5天后从溶液中把样品取出，用去离子水仔细润洗，并在37℃的电热鼓风干燥箱中烘干。材料的表面形貌和组成分别采用SEM和EDS进行表征。具体方法见2.2.3。用等离子体发射光谱仪(ICP-AES；IRIS 1000,ThermoElemental,USA)测定SBF溶液中Ca，P，Mg和Si离子的浓度。
图10为实施例1中的NMPC(a，c)和对比例1中的MPC(b，d)浸泡于SBF溶液中3(a，b)和5天后(c，d)材料表面形貌的SEM图。由图可知，两种支架表面均生成球状磷灰石。比较而言，NMPC表面磷灰石明显多于MPC。5天时，NMPC表面基本完全被球状磷灰石所覆盖，而MPC表面仍存在未生成磷灰石的区域。图11为实施例1中的NMPC(A)和对比例1中的MPC(B)浸泡5天后材料表面的EDS谱图。EDS分析可知，表面球状物的元素Ca/P元素比值接近于磷灰石钙磷比(1.67)，故表面球状物质为类骨磷灰石。相对于MS，NMS具有更大的比表面积，因此形成的复合支架同样具有更高的比表面积，从而增大了支架与模拟体液的接触面积。因此NMPC能够溶出更多的Si和Mg离子，并提供更多的钙离子附着位点。而硅酸镁颗粒在支架表面团聚，其表面的离子附着位点的区域较小，因此其离子沉积矿化的速度及程度明显低于NMPC。从SEM图中，恰好能够观察这样的情形，MPC表面形成的磷灰石多是局部形成，而在第五天时，类骨磷灰石已经完全覆盖NMPC表面，因此NMPC具有更高的体外生物活性。
通过研究SBF溶液的离子变化来分析磷灰石生成机理，图12为实施例1中的NMPC(A)和对比例1中的MPC(B)浸泡于SBF溶液中离子浓度变化曲线。由图可见，两种样品的SBF溶液中钙和磷离子浓度均有明显的下降趋势，镁离子浓度先上升后下降，硅离子浓度均有明显的上升的趋势，其中NMPC明显高于MPC。钙元素作为人体骨骼的重要组成元素，在新骨形成过程中有着重要的促进作用。由结果可知，NMPC的溶液中钙和磷元素的离子浓度在1-2天明显下降，而钙和磷元素是类骨磷灰石的主要组成元素，因此在NMPC表面形成类骨磷灰石的主要时间是前两天。而对于MPC，明显下降区间出现在第4-5天，说明该材料表面的磷灰石主要形成过程是在第4-5天。两者不同的磷灰石形成过程可见其生物活性的差别，这也是NMS和MS的分布情况导致的结果。两者的镁离子浓度在浸泡初期两天都是明显升高，说明镁离子的溶出速度大于沉积速度；而2天后，镁离子的沉积速度大于溶出速度，从而导致镁离子浓度逐渐下降。在整个浸泡过程中，硅离子都是一个缓慢的上升过程，表明硅离子不断从NMPC和MPC中溶出。而NMPC的孔隙率远大于MPC，从而导致硅离子溶出速度大于MPC。
(6)细胞活性及粘附
本实验选用MC3T-E1细胞，MC3T3-E1细胞(中国科学院，上海，中国)培养在DMEM培基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)中。培基中含有10％(v/v)的胎牛血清(FBS；GibcoBRL,Grand Island,NY,USA)，1％(v/v)的抗生素(100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素)(Gibco BRL,USA)。细胞生长环境为37.5℃，100％饱和湿度，5％CO2。在使用细胞进行实验之前，使用0.25％胰酶对细胞进行消化，使其脱落下来呈悬浮状体，为后期实验计算细胞密度做准备。
将细胞接种到复合支架材料上3，6和12小时后，移除培养基。使用PBS溶液清洗3次，去除未粘附的细胞。使用胰酶消化复合支架材料上的细胞，通过流式细胞仪(BDBiosciences,Franklin Lakes,USA)分析测定粘附在复合支架上细胞数目，将其与细胞接种数目的比值记为粘附率(％)。
采用SEM观察细胞在复合支架材料表面的粘附情况。将细胞接种到复合支架材料上12小时后，弃去培基，样品经PBS溶液洗涤和戊二醛溶液固定后，使用梯度酒精(30,50,70,90和100％)进行脱水。将样品置于通风橱中晾干，最后采用SEM观察粘附在材料表面细胞的形貌。
本实验使用小鼠前成骨细胞评价材料的细胞相容性。图13为MC3T3-E1细胞在实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)上培养3，6和12小时的粘附率。由图可知，在3，6和12小时，NMPC表面细胞的细胞粘附率是均高于MPC。12小时后，NMPC表面细胞的粘附率接近95％，而MPC表面细胞的粘附率只有80％。
图14为MC3T3-E1细胞粘附在实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)的形态图。由图可知，NMPC表面的细胞具有更为铺展的细胞形态，细胞伸出更多的伪足，与材料结合更为紧密，铺展效果更好。这是因为NMS均一的分布在基体表面，从而提供了更多的蛋白附着位点，为细胞的粘附提供了更为优良的条件。与之相比，MS发生团聚现象，提供的蛋白附着位点相对较少，故而细胞的粘附量及粘附效果均要低于NMPC。
(7)细胞增殖及ALP活性
细胞增殖实验所用MC3T-E1细胞的接种密度为5×103个细胞/孔。采用CCK-8法测试多孔骨修复支架表面细胞细胞的增殖情况。将细胞在多孔支架材料上培养1，3和5天后，采用CCK-8法在酶标仪上测定OD值。本实验中，将各组多孔支架材料在1天的OD值定义为1，从而得出3和5天的修订OD值，最后细胞增殖情况以相对增值率表示。
ALP活性实验所用MC3T-E1细胞的接种密度为4×104个细胞/孔。细胞与多孔支架材料共培养24小时，待细胞完全贴壁后，将培基更换为成骨诱导培养基：DMEM培基中含有10％(v/v)的胎牛血清(FBS；GibcoBRL,Grand Island,NY,USA)，0.1μmol/L地塞米松(Sigma)，50μmol/L抗坏血酸(Sigma)和10μmol/Lβ-甘油磷酸钠(Sigma)。培养7，10和14天后，进行ALP活性测定。
图15为实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)的细胞增殖率(A)及ALP活性(B)。A图可知，在1和3天，两种复合支架材料的细胞增殖率并无显著性差异；5天时，NMPC的细胞增殖率明显高于MPC。B图可知，在培养7天时，两种材料上细胞的ALP活性并没有显著性差异；在10和14天时，NMPC上细胞的ALP活性明显高于MPC。由前面结果可知，NMPC能够缓释出更多的镁离子和硅离子，而大量的研究证明镁离子和硅离子能够促进成骨细胞的增殖和分化。因此，NMPC可明显促进MC3T3-E1细胞的增殖和ALP活性。
(8)药物吸附及缓释行为
本实验选择万古霉素作为模型药物，进行复合支架材料吸附缓释能力测试。首先绘制万古霉素的标准曲线。将万古霉素溶于PBS溶液中，配置不同浓度：0.4mg/mL，0.2mg/mL，0.1mg/mL，0.08mg/mL，0.06mg/mL，0.04mg/mL，0.02mg/mL，0.01mg/mL。采用紫外吸收光谱仪测量溶液在280nm的吸光度。以万古霉素浓度为横坐标，所测溶液的吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。
将每个复合支架材料加入到10mL 0.4mg/mL万古霉素溶液中，将其置于恒温振荡箱中。在选定时间点(0.25,0.5,1,2,4,8,12,24和48小时)，吸取200μL上清液转移到96孔板中，使用紫外吸收光谱仪测定吸光度，根据标准曲线计算出溶液中万古霉素的浓度。支架的载药量记为载药量/支架质量(mg/g)。
将载药复合支架材料浸泡于10mL 0.01M PBS溶液中测试其药物缓释行为。该实验中，每个支架中的载药量固定为0.5mg/g(载药量/支架质量)。在选定时间点，吸取200μL上清液转移到96孔板中，使用紫外吸收光谱仪测定吸光度，根据标准曲线计算出溶液中万古霉素的浓度，测定出药物累积释放率(％)。
图16为实施例1中的NMPC(a)和对比例1中的MPC(b)对盐酸万古霉素的吸附(A)及缓释(B)行为分析结果。图16A可知，NMPC吸附万古霉素的量明显高于MPC。48小时，NMPC吸附万古霉素的量高达10mg/g，而MPC吸附的量仅有6mg/g。而图16B表明，MPC在最初6小时就释放了接近58.2％，属于明显的暴释。相同时间内，NMPC仅释放了18.4％。随后，NMPC中的药物逐渐释放，直到240小时，释放量达到87.4％。
万古霉素仅仅能够吸附在MPC表面；而万古霉素能够吸附在NMPC表面，而且还能够在介孔材料的孔道中吸附大量的万古霉素，故而其吸附量要大于MPC。但是表面吸附的万古霉素不稳定，很容易脱离。因此两种复合支架样品在最初的1小时都存在有突释现象，而MPC的突释过程持续到6小时。另一方面，介孔材料中万古霉素的释放是一个缓释的过程，从而导致NMPC的药物释放过程要明显慢于MPC。
实施例2和3中的NMPC的形貌、元素组成、吸水率及孔隙率、体外降解性能、体外生物活性及离子释放性能、细胞实验的效果、药物吸附及缓释行为与实施例1中NMPC基本相当。
效果实施例3
实施例1中的Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP的性能表征：
(1)观察实施例1中的Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)的样品可知，涂层之后并没有对其产生影响。之后通过京尼平交联蛋白涂层，发现白色支架材料变为淡蓝色，这是京尼平交联成功的显色反应。
(2)X射线衍射分析(XRD)
采用X射线衍射仪(XRD，Rigaku D/max 2550，日本)在10～80°分析了材料的微观结构及结晶状态。通过从X-射线衍射图谱的峰面积比来计算各组样品的结晶度。
图17是Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)的XRD谱图，结果表明，三者之间并没有明显区别。这可能是因为白藜芦醇和麦醇溶蛋白及京尼平量较少，未能造成明显影响。
(3)傅里叶红外分析(FTIR)
将约1mg多孔支架样品烘干后与100mg干燥的溴化钾粉末(KBr)混合研磨均匀，压成薄片，使用傅立叶变换红外光谱仪(Nicolet 380,Thermo,USA)进行分析。
图18是Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)的FTIR谱图。Res@NMP的谱线a中，可观察到1082cm-1处出现的强吸收谱带，分别是Si-O-Si反对称伸缩振动；在1640cm-1处出现的强吸收谱带，是PBSu中C＝O键的对称伸缩振动吸收谱带；在1730cm-1处出现的强吸收谱带是H-OH弯曲振动所致，3450cm-1附近出现的较宽吸收峰是材料表面吸附水分子中游离的羟基吸收谱带。谱线b和c中，可观察到1640cm-1处吸收峰增强，这是因为麦醇溶蛋白酰胺键中C＝O的伸缩振动峰；同时1540cm-1出现的峰为N-H的面内弯曲振动峰。结果表明，复合支架表面形成了麦醇溶蛋白涂层。
(3)扫描电镜(SEM)
将多孔支架材料样品烘干后，黏附在导电胶上喷金后，采用电子扫描电镜(S-3400N,Hitachi,Japan)观察样品表面形貌。
图19是Res@NMP(a，d),GRes@NMP(b，e)和GGRes@NMP(c，f)的SEM图，从图中看出三种支架均具有约400μm的大孔结构，涂层麦醇溶蛋白及京尼平交联之后并没有对大孔结构产生明显影响。但是麦醇溶蛋白涂层后，GRes@NMP(b，e)表面可观察到大量的颗粒覆盖在支架表面，颗粒直径约为3μm。这可能酒精挥发之后剩余的麦醇溶蛋白。经过京尼平交联之后，GGRes@NMP(c，f)表面明显观察到表面有一层光滑物质，部分表面存在凹凸不平的微孔结构。这可能是京尼平交联产生的两种不同的表观形貌。
实施例2和3中的Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP的形貌、结构与实施例1中Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP基本相当。
效果实施例4
对实施例1中的Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP的释药行为的表征：
白藜芦醇标准曲线的测定：将白藜芦醇溶于PBS溶液中，配制成0.5mg/mL的白藜芦醇溶液。把该溶液稀释成不同梯度浓度(20、60、80、120、160、250、300、500μg/mL)，取不同浓度的溶液200μL，用酶标仪(Spectra max plus，美国科仪公司)在306nm处，测定相应的吸光度值(O.D.)，用Origin Pro 8.1绘制白藜芦醇标准曲线。
将实施例1中制备的载有白藜芦醇支架材料(Res@NMP，GRes@NMP和GGRes@NMP)放入37℃鼓风干燥箱中烘干后，置于10mL PBS溶液的离心管中探究支架对药物缓释的情况，整个药物缓释实验在37℃恒温震荡箱中进行。在第0.5、1、3、5、7、10、13、16和21天取上清液200μL，用酶标仪(Spectra max plus，美国科仪公司)在306nm处，测定相应的吸光度值(O.D.)，同时向离心管中补充200μL PBS溶液。然后通过白藜芦醇标准曲线计算每个时间段白藜芦醇的累积释放量。
通过标准曲线计算可得，该复合支架可吸附白藜芦醇的量为5mg/g。图20为Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP的药物释放曲线，并探讨了不同交联时间对其影响。Res@NMP载药复合支架(a)在初期表现出明显的突释行为，在前1个小时就释放出52.49％，24小时释放量超过80％，最终在10天时停留在91.9％。表面涂层蛋白后(b)，药物释放速度相对较慢，24小时释放量为58％，之后继续释放到10天时共释放89.9％。通过京尼平交联之后(c,d)，GGRes@NMP表现出明显的药物持续释放现象，且在10天时持续释放量基本不变达到最高值。由图可知，交联24小时样品的缓释效果更佳明显。但是，交联12小时和24小时的样品在10天时的释放量分别为83.4％和63％。这说明，交联24小时样品，释放的药物减少。这可能是因为交联度太高，导致药物无法释放；另外，交联过程中，药物释放到京尼平溶液中，产生药物损耗。药物量的减少可能会影响到后期促进细胞分化及抗菌的效果，因此本实验选用交联12小时的GGRes@NMP作为后期实验样品。
实施例2和3中的Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP的释药行为与实施例1中Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP基本相当。
效果实施例5
实施例1中的Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP的细胞实验：
本实验选用MC3T-E1细胞，MC3T3-E1细胞(中国科学院，上海，中国)培养在DMEM培基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)中。培基中含有10％(v/v)的胎牛血清(FBS；GibcoBRL,Grand Island,NY,USA)，1％(v/v)的抗生素(100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素)(Gibco BRL,USA)。细胞生长环境为37.5℃，100％饱和湿度，5％CO2。在使用细胞进行实验之前，使用0.25％胰酶对细胞进行消化，使其脱落下来呈悬浮状体，为后期实验计算细胞密度做准备。将三种载药支架样品灭菌处理后放入24孔板中，将消化重悬后的细胞接种在样品表面，接种密度为2×104个/孔。
(1)细胞活性
本实验采用CCK-8法(Cell Counting Kit-8)测试多孔支架材料的细胞活性。细胞接种密度为3×104个细胞/孔，不加支架材料的空白孔作为对照。具体方法如下，将MC3T-E1细胞接种到多孔支架材料1、3和5天后，使用pH＝7.4无菌磷酸盐缓冲液(PBS)仔细冲洗支架三次，然后转移到一个全新的24孔板，以避免原24孔板内细胞的影响。以每500μL DMEM培养基中加入50μL CCK-8检测液(Dojindo Molecular Technologies Inc.,Japan)的比例，向24孔板中加入检测液。在37.5℃，5％CO2的环境下孵育3小时。孵育完成后，取上清液，转移到96孔板中，在酶标仪(Synergy HT,Bio-tek,Winooski,Vermont,USA)上450nm处读取吸光度(OD)值。
图21为MC3T3-E1细胞在Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)表面培养1，3和5天后的O.D.值。由图可知，1天时，三组之间没有显著性差异，但是Res@NMP表面细胞的O.D.值较其他两组较高。这是因为Res@NMP内药物在24小时内基本释放量达到80％以上，利于细胞生长。3天时，GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)表面细胞的O.D.值明显高于Res@NMP。5天时，GGRes@NMP(c)表面细胞的O.D.值明显高于Res@NMP。这是因为Res@NMP内药物在24小时内基本释放完全，细胞培养基更换后药物浓度大幅度降低；GGRes@NMP内药物可以持续释放，从而长期稳定地维持在有效浓度，刺激细胞增殖。
(2)碱性磷酸酶(ALP)活性
ALP活性实验所用MC3T-E1细胞的接种密度为4×104个细胞/孔。细胞与多孔支架材料共培养24小时，待细胞完全贴壁后，将培基更换为成骨诱导培养基：DMEM培基中含有10％(v/v)的胎牛血清(FBS；GibcoBRL,Grand Island,NY,USA)，0.1μmol/L地塞米松(Sigma)，50μmol/L抗坏血酸(Sigma)和10μmol/Lβ-甘油磷酸钠(Sigma)。培养7，10和14天后，进行ALP活性测定。
对培养在材料表面的MC3T3-E1细胞进行了碱性磷酸酶(ALP)活性测定。细胞接种到m-MS和MS圆片样品上，组织培养板(TCP)作为对照。培养4和7天后，弃去培养基，样品用PBS冲洗三次。每孔加入500μL的1％Nonidet P-40(NP-40)溶液，在室温下裂解细胞1小时，获得细胞裂解液。每孔加入50μL1mg/mL的硝基苯磷酸二钠盐(p-nitrophenylphosphate；Songon，中国)溶液(含0.1mol/L甘氨酸和1mmol/L六水氯化镁，pH＝9)，置于37℃培养箱内孵育1小时。结束后，每孔加入100μL的0.1mol/LNaOH溶液终止显色反应。最后使用酶标仪(384SPECTRAmax，Molecular Devices，美国)在405nm处，测定O.D.值。裂解液中总蛋白的含量采用牛血清白蛋白为标准蛋白，使用BCA试剂盒(碧云天生物科技，中国)进行测定。ALP活性表示为405nm处O.D.值/总蛋白含量。
图22为MC3T3-E1细胞在Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)上分别培养7,10和14天时的ALP活性分析。ALP活性可反映成骨细胞在材料表面的分化程度。整个培养周期里，成骨细胞的ALP活性不断上升且细胞GGRes@NMP和GRes@NMP上的ALP活性都要高于Res@NMP。结果说明：白藜芦醇的加入能刺激细胞的成骨分化。
通过上述效果实施例1～5表明，将NMS/PBSu复合支架浸没在白藜芦醇溶液中制备出载白藜芦醇复合支架，每单位质量的复合支架(g)可以吸附约为5mg的白藜芦醇。为了达到药物缓释的效果，在复合支架表面形成了麦醇溶蛋白涂层，并经过京尼平交联。涂层之后，外观上支架没有明显变化，通过SEM观察发现表面有蛋白结晶颗粒存在；京尼平交联后，复合支架由白色变为淡蓝色，通过SEM观察发现支架表面涂覆了一层较均匀的蛋白涂层，对药物缓释起重要作用。
通过将载药复合支架浸泡在PBS溶液中，观察药物缓释行为。结果发现，蛋白涂层之后药物释放行为变慢；而京尼平交联之后，增强了这一效果，达到缓释的目的。在10mmol/L京尼平溶液中，交联12小时可以制得GGRes@NMP。该载药复合支架在10天的缓释过程中缓释效果较好，最终累积释药量为83.4％。
实施例2和3中的Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP的细胞实验的效果与实施例1中Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP基本相当。
效果实施例6
实施例1中的Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP的抗菌实验：
大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)属于革兰氏阴性短杆菌，常被用来作为抗菌实验的检测。
将Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP用70％的酒精润洗消毒，干燥后，每组材料取4个支架(约0.75g)放入透析袋中备用。选用大肠杆菌(E.coli)为细菌模型，采用振荡计数法考察载药支架样品在24，48和120小时后的抑菌率。
抗菌实验具体操作步骤如下：首先配置105CFU/mL浓度的大肠杆菌菌液，取20mL菌液与上述透析袋中载药复合支架一起置于试管中，放入恒温振荡箱中固定，设定温度为37℃，振荡速度为250r/min，让各样品和菌液充分接触。24小时后，取0.1mL瓶中的大肠杆菌菌液，滴在预先经过高温消毒处理，并已冷却的琼脂培养基上，采用经消毒冷却的玻璃棒进行涂覆，使菌液均匀铺展在琼脂培养基上。再将各培养基倒置放入恒温箱中，静置18小时，待大肠杆菌在培养基上生长。18小时后，取出平板培养基，对大肠杆菌菌落计数，其中不加载药复合支架的培养皿记为空白对照组，抗菌率的计算公式如下：
抗菌率＝(M-N)/M×100％，其中，M是加入支架材料的菌落数，N是空白组的菌落数。
将上述24小时样品取出，重新按照上述步骤操作，即得到48小时和120小时的抑菌率。
图23为Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)在24小时后的抗菌率。通过计算可得，Res@NMP，GRes@NMP和GGRes@NMP在24小时的抑菌率分别为85％，78％和59％。这是由于，Res@NMP和GRes@NMP在初期表现出突释现象，能够释放出较多的白藜芦醇，而GGRes@NMP没有初期突释效应，药物浓度较低，但仍表现出一定的抑菌效果。
图24为Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)在48小时后的抗菌率。通过计算可得，与24小时相比，GGRes@NMP的抑菌率提高到69％，而Res@NMP的抑菌率有所降低。这是由于GGRes@NMP中的白藜芦醇逐步释放，溶液中的浓度提高；而Res@NMP在24到48小时区间，白藜芦醇的释放量较少，从而影响了其抑菌率。
图25为Res@NMP(a)、GRes@NMP(b)和GGRes@NMP(c)在120小时后的抗菌率。通过计算可得，Res@NMP，GRes@NMP和GGRes@NMP在120小时的抑菌率分别为15％，58％和89％。这是由于，在前期Res@NMP中的白藜芦醇已经基本释放完全，后期基本没有抑菌效果。GRes@NMP内仍存有少量的白藜芦醇，所以还有一定的抑菌效果。而GGRes@NMP在此时间区间内可以释放出大量的白藜芦醇，保持稳定的抑菌效果。结果表明，白藜芦醇对大肠杆菌有明显的抑制效果，GGRes@NMP可以持续稳定的释放白藜芦醇，保持长期的抑菌效果。
实施例2和3中的Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP的抗菌实验的效果与实施例1中Res@NMP、GRes@NMP和GGRes@NMP基本相当。
效果实施例7
上述效果实施例1～5的数据统计分析
所用数据均用平均值±标准差表示。数据组间差异统计采用Origin 8.0的Oneway ANOVA功能。p<0.05为具有显著性差异。
上述抗菌实验结果表明，白藜芦醇对大肠杆菌有一定的抗菌性能，GGRes@NMP可以持续稳定的释放白藜芦醇，保持长期的抑菌效果，在120小时的抑菌率可达到91％。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：
将聚丁二酸丁二醇酯和有机溶剂混合得混合物Ⅰ，然后将纳米孔硅酸镁微球和致孔剂与混合物Ⅰ混合得混合物Ⅱ，将混合物Ⅱ压制成型，之后除去有机溶剂，然后除去致孔剂，干燥即得纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚丁二酸丁二醇酯的数均分子量为4×104～7×104，分子量分布Mw/Mn为1.2～2.4；
和/或，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、三氯甲烷、二氯甲烷、1,4-二氧己环或间甲基苯酚中的一种或多种，较佳地为二甲基甲酰胺；
和/或，所述纳米孔硅酸镁微球为粉末态，所述纳米孔硅酸镁微球的粒径为180～220nm，较佳地为200nm，所述纳米孔硅酸镁微球的孔径为3～5nm，较佳地为4nm，所述纳米孔硅酸镁微球的比表面积为534～542m2/g，较佳地为538m2/g，所述纳米孔硅酸镁微球的孔容为0.65～0.69cm3/g，较佳地为0.67cm3/g；
和/或，所述致孔剂为氯化钠，所述氯化钠的颗粒粒径为300～500μm，所述氯化钠的用量为相对于纳米孔硅酸镁微球和聚丁二酸丁二醇酯总质量的7～9倍，较佳地为8倍；
和/或，将纳米孔硅酸镁微球和致孔剂与混合物Ⅰ混合分步进行，先将所述纳米孔硅酸镁微球与所述混合物Ⅰ混合，再将致孔剂加入进行混合；
和/或，所述纳米孔硅酸镁微球与所述聚丁二酸丁二醇酯的质量比为(20～40):(80～60)，较佳地为30：70；
和/或，所述聚丁二酸丁二醇酯和所述有机溶剂的用量比为1g：(2～4)mL，较佳地为1g：3mL；
和/或，所述混合为搅拌混合；
和/或，所述压制成型所用的模具为不锈钢模具，所述压制成型的压力为1～3MPa，较佳地为2MPa，所述压制成型的时间为1～3分钟，较佳地为2分钟；
和/或，所述除去有机溶剂的过程为在通风橱中自然晾干10～14小时，较佳地为在通风橱中自然晾干12小时；
和/或，所述除去致孔剂的过程为浸泡在溶剂中去除，所述浸泡的时间为44～50h，较佳地为48h，所述浸泡所用的溶剂为水，较佳地为去离子水，所述浸泡的过程中，每隔6～10h更换一次浸泡所用的溶剂，较佳地为每隔8h更换一次浸泡所用的溶剂；
和/或，所述干燥的温度为35～39℃，较佳地为37℃，所述干燥的时间为10～14小时，较佳地为过程为12小时，所述干燥在烘箱中进行。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述纳米孔硅酸镁微球采用模板及自组装法制得，较佳地包括如下步骤：
将模板剂和水混合，之后在33～37℃下将氨水、正硅酸乙酯和六水合硝酸镁加入上述溶液中，反应3～5小时形成乳白色悬浊液，离心得白色沉淀物，洗涤所得白色沉淀物后干燥，然后在500～700℃下烧结除去模板剂即得纳米孔硅酸镁微球；
其中，所述模板剂较佳地为十六烷基三甲基溴化铵；
和/或，所述模板剂和水的用量比较佳地为1g：(44～50)mL；
和/或，所述氨水的浓度较佳地为0.5～1.5mol/L，更佳地为1.0mol/L；
和/或，向上述溶液中加氨水、正硅酸乙酯和六水合硝酸镁较佳地采用分步加入，依次加入氨水、正硅酸乙酯和六水合硝酸镁；
和/或，所述氨水、所述正硅酸乙酯和所述六水合硝酸镁的用量比较佳地为(2.5～3.34)mL：(1.42～1.54)mL：(1～1.1)g；
和/或，所述洗涤的操作较佳地为先用酒精洗涤两次，再用去离子水洗涤一次；
和/或，所述干燥的温度较佳地为50～70℃，更佳地为60℃，所述干燥的时间较佳地为22～26小时，更佳地为24小时，所述干燥较佳地在电热鼓风干燥箱中进行；
和/或，所述烧结较佳地在马弗炉中进行，所述烧结的时间较佳地为2～4小时，更佳地为3小时，所述烧结的温度较佳地为600℃。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的制备方法制备的纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
5.一种载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：
将所述纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架浸泡在白藜芦醇的缓冲溶液中，之后干燥，即得载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架；
其中，所述缓冲溶液较佳地为磷酸盐、硼酸盐或柠檬酸盐缓冲溶液，更佳地为磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)；
和/或，所述白藜芦醇的PBS缓冲溶液中白藜芦醇的浓度较佳地为0.4～0.6mg/mL，更佳地为0.5mg/mL；
和/或，所述浸泡的时间较佳地为22～26小时，更佳地为24小时；
和/或，所述浸泡的温度较佳地为36～38℃，更佳地为37℃；
和/或，所述浸泡较佳地在恒温震荡箱中进行。
6.一种如权利要求5所述的制备方法制备的载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
7.一种麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：
将麦醇溶蛋白溶液加入所述载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架上，干燥即得麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架；
其中，所述麦醇溶蛋白溶液的浓度较佳地为0.4～0.6mg/mL，更佳地为0.5mg/mL；
和/或，所述麦醇溶蛋白溶液较佳地为麦醇溶蛋白乙醇溶液，所用乙醇溶液的浓度较佳地为55～75％，更佳地为65％；
和/或，将所述麦醇溶蛋白溶液加入所述载白藜芦醇复合支架上的操作较佳地为使用移液枪滴加40μL所述麦醇溶蛋白溶液在载白藜芦醇复合支架上，烘干，反复重复三次。
8.一种如权利要求7所述的制备方法制备的麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
9.一种京尼平交联蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：
将所述麦醇溶蛋白涂层载药复合支架与京尼平溶液混合，进行交联反应，即得京尼平交联蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架；
其中，所述京尼平溶液的用量较佳地为0.4～0.6mL，更佳地为0.5mL；
和/或，所述京尼平溶液中的京尼平浓度较佳地为6～14mmol/L，更佳地为10～14mmol/L，最佳地为10mmol/L；
和/或，所述交联反应较佳地在摇床中进行；
和/或，所述交联反应的温度较佳地为30～45℃，更佳地为37℃；
和/或，所述交联反应的时间较佳地为12～24小时。
10.一种如权利要求9所述的制备方法制备的京尼平交联蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架。
11.一种如权利要求4所述的纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架或者如权利要求6所述的载白藜芦醇-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架或者如权利要求8所述的麦醇溶蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架或者如权利要求10所述的京尼平交联蛋白涂层载药-纳米孔硅酸镁微球/聚丁二酸丁二醇酯复合支架在制备骨修复材料中的应用。
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