CN107412768B

CN107412768B - Ggpps的抑制在制备治疗梗阻性黄疸肝损伤药物中的用途

Info

Publication number: CN107412768B
Application number: CN201710440907.3A
Authority: CN
Inventors: 毛谅; 李朝军; 贾文俊; 仇毓东; 汤俏丽
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2037-06-13
Also published as: CN107412768A

Abstract

本发明提供了GGPPS基因作为靶点治疗梗阻性黄疸肝脏损伤的应用，具体为，肝脏特异性敲除GGPPS基因模型、靶向抑制肝脏GGPPS蛋白活性的试剂及靶向抑制肝脏GGPPS基因表达的试剂在治疗梗阻性黄疸肝脏损伤中和在制备治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物中的用途。其中，本发明中的肝脏特异性敲除GGPPS基因模型可以减轻梗阻性黄疸肝脏损伤，降低肝脏和血液中疏水性胆汁酸含量，降低血液中天冬氨酸转氨酶(AST)以及总胆红素(TB)水平，保护肝脏功能；靶向抑制肝脏GGPPS蛋白活性的试剂能够减少梗阻性黄疸引起的死亡，并且显著减少梗阻性黄疸后肝脏损伤及肝脏液化性坏死区域面积。

Description

GGPPS的抑制在制备治疗梗阻性黄疸肝损伤药物中的用途

技术领域

本发明属于生物工程及医药领域，其涉及GGPPS基因在制备治疗梗阻性黄疸肝损伤药物中的用途，具体为GGPPS基因的肝脏特异性敲除在治疗梗阻性黄疸肝脏损伤模型中应用，靶向抑制肝脏GGPPS蛋白活性的试剂和靶向抑制肝脏GGPPS基因表达的试剂在治疗梗阻性黄疸肝脏损伤中和在制备治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物中的用途。

背景技术

梗阻性黄疸肝脏损伤是一种因胆道梗阻，胆汁排出障碍引起的肝脏损伤。梗阻性黄疸肝脏损伤以肝脏液化坏死，肝脏汇管区中性粒细胞浸润，毛细胆管增殖以及胶原纤维沉积为主要病理改变，其可导致肝细胞受损加重，最终可导致肝硬化、肝功能衰竭，进而引发患者死亡。

梗阻性黄疸肝脏损伤常常出现于诸如：胆管结石，远端胆管癌，肝门部胆管癌，胆囊癌以及胰头癌等患者中(这些患者都伴有较为严重的梗阻性黄疸状态)。梗阻性黄疸肝脏损伤患者表现为皮肤巩膜黄染，食欲不振，消瘦及营养不良。血清学检查中通常出现总胆红素(TB)，谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，碱性磷酸酶(AKP)及谷氨酰转肽酶(GGT)的升高。影像学检查中，腹部B超，CT及MRI的检查可发现肝脏胆管扩张表现。

临床目前针对梗阻性黄疸肝脏损伤常用的治疗方案包括经皮肝穿刺胆汁引流，内镜下胆道支架以及内镜下鼻胆管引流，而上述三种治疗方式会造成严重的并发症，甚至在癌症患者(例如肝门部胆管癌患者)中导致肿瘤种植转移。因此临床对于梗阻性黄疸肝脏损伤急需新的无创的治疗方式。

目前梗阻性黄疸导致肝脏损伤的具体机制未有完全明确，但已有研究初步表明，梗阻性黄疸发生后肝细胞内胆汁酸转运障碍以及胆汁酸合成共同参与，引起肝细胞内疏水性胆汁酸包括牛磺胆酸(TCA)，牛磺脱氧胆酸(TCDCA)及牛磺β鼠胆酸(TβMCA)累积，这些疏水性胆汁酸具有细胞毒作用，它们在肝细胞内的累积造成肝细胞坏死，进而引起严重的肝脏损伤。

GGPPS即香叶基香叶基二磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase)，其在甲羟戊酸代谢途径中是一个重要的分支酶。GGPPS在甲羟戊酸代谢途径中将香叶基香叶基二磷酸(GGPP)转化合成为法尼基二磷酸(farnesyl diphosphate,FPP)。

发明内容

发明人通过胆总管结扎及胆囊切除术构建梗阻性黄疸肝脏损伤小鼠模型，并通过质谱分析检测肝脏中FPP和GGPP含量以及通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测GGPPS表达量，我们发现梗阻性黄疸后，肝脏中FPP和GGPP出现了不一致的变化：FPP含量增高，GGPP含量降低。同时，GGPPS的表达量是显著降低的。这表明GGPPS是与梗阻性黄疸肝脏损伤是存在相关性的，但是GGPPS表达量降低是促进肝损伤的加重因素还是机体作为抵抗肝损伤的自我保护机制未能明确(正相关或者负相关未知)，而为了证实以及明确GGPPS降低对于梗阻性黄疸肝损伤的相关性，我们构建了肝脏特异性GGPPS敲除小鼠明确GGPPS降低在梗阻性黄疸过程中发挥这样的作用。

有鉴于此，本发明提供了GGPPS基因的肝脏特异性敲除在治疗梗阻性黄疸肝脏损伤模型中应用，靶向抑制肝脏GGPPS蛋白活性的试剂和靶向抑制肝脏GGPPS基因表达的试剂在治疗梗阻性黄疸肝脏损伤中和在制备治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物中的用途。

本发明其中一个实施例提供了GGPPS基因的肝脏特异性敲除在治疗梗阻性黄疸肝脏损伤模型中应用。该实施例利用肝脏特异性敲除GGPPS基因小鼠(以下简称为敲除小鼠)模型，并对对照小鼠及敲除小鼠进行胆总管结扎造模，观察胆总管结扎后5天两组小鼠的生存以及肝脏损伤情况。观察发现，敲除小鼠在胆总管结扎5天后死亡率显著下降，解剖显示敲除小鼠在胆总管结扎后未出现明显的胆汁淤积现象；H&E染色发现，肝脏形态大体正常，并未出现较为严重的液化性坏死情况；血清学数据表明，敲除小鼠在胆总管结扎后AST与TB水平下降；同时，TUNEL染色发现，敲除小鼠在胆总管结扎后肝细胞的凋亡指数明显下降。更重要的是，液相色谱质谱分析结果显示，敲除小鼠在胆总管结扎后肝细胞内疏水性胆汁酸TCA，TCDA以及TβMCA的累积含量减少。此外FXR荧光素酶实验以及实时定量PCR的结果显示敲除小鼠通过增加肝细胞内FPP下游代谢产物法尼醇(Farnesol，FOH)的含量激活法尼酯X受体进而促进介导胆汁酸向肝外分泌相关基因表达。上述实验结果显示肝脏特异性敲除GGPPS基因模型可有效缓解胆汁酸淤积，从而有效治疗梗阻性黄疸肝脏损伤。其中，所述梗阻性黄疸肝脏损伤可由胰头癌，胆管结石，远端胆管癌，肝门部胆管癌或胆囊癌引起。

本发明其中一个实施例提供了靶向抑制肝脏GGPPS蛋白活性的试剂在制备治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物中的用途。其中，所述梗阻性黄疸肝脏损伤可由胰头癌，胆管结石，远端胆管癌，肝门部胆管癌或胆囊癌引起。

进一步地，所述靶向抑制肝脏GGPPS蛋白活性的试剂可为二香叶基二磷酸(digeranyl bisphosphonate，DGBP)。

进一步地，所述治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物可包含所述靶向抑制肝脏GGPPS蛋白活性的试剂和药学上可接受的载体。

进一步地，所述治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物的施用方式可包括皮下注射、肝脏特异性施用及全身施用(例如，透过皮肤或者使用栓剂)。

进一步地，所述治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物的剂型可包括针剂、片剂及胶囊，且在无菌条件下制备。

进一步地，所述治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物还可包含具有功能活性的多肽或蛋白质。

本发明其中一个实施例提供了靶向抑制肝脏GGPPS基因表达的试剂在制备治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物中的用途。其中，所述梗阻性黄疸肝脏损伤可由胰头癌，胆管结石，远端胆管癌，肝门部胆管癌或胆囊癌引起。

进一步地，所述治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物可包含靶向抑制肝脏GGPPS基因表达的试剂和药学上可接受的载体。

本发明的有益效果在于：本发明首次公开了肝脏特异性敲除GGPPS基因模型可用于治疗梗阻性黄疸肝脏损伤，靶向抑制GGPPS基因表达和靶向抑制GGPPS蛋白活性的试剂可以用于制备治疗梗阻性黄疸肝脏损伤的药物的技术方案，有助于肝脏特异性抑制GGPPS表达或抑制GGPPS活性，可以有效减轻梗阻性黄疸肝脏损伤，在梗阻性黄疸肝脏损伤治疗领域具有潜在、良好的应用前景。

附图说明

图1是梗阻性黄疸后小鼠肝脏FPP和GGPP含量变化以及GGPPS表达量变化。其中，A图显示随着梗阻时间延长，病理学检查发现梗阻性黄疸肝损伤程度的加重；B图显示随着梗阻性黄疸肝损伤程度加重，质谱分析发现肝脏内FPP含量增加，GGPP含量降低的；C图显示随着梗阻性黄疸肝损伤程度加重，蛋白免疫印迹显示GGPPS表达量也是降低的。其中，标记“#”为肝损伤液化性坏死区域。

图2是敲除小鼠和对照组小鼠在胆总管结扎后生存情况及肝脏表现。其中，A图显示敲除小鼠和对照组小鼠在胆总管结扎后两组小鼠生存率变化曲线，显示肝脏特异性GGPPS敲除能够减少梗阻性黄疸后死亡率；B图显示敲除小鼠和对照组小鼠体式镜下及显微镜下肝脏形态，显示敲除小鼠肝脏大体形态正常无胆汁淤积，并且H&E染色也未出现大片液化性坏死情况。其中，标记“#”为肝损伤液化性坏死区域。

图3是敲除小鼠和对照组小鼠在胆总管结扎后血清学变化。其中，A图显示肝脏特异性GGPPS敲除能够降低梗阻性黄疸后血清AST水平，显示敲除小鼠梗阻性黄疸后血清AST水平下降；B图显示肝脏特异性GGPPS敲除能够降低梗阻性黄疸后血清TB水平，显示敲除小鼠梗阻性黄疸后血清TB水平下降保护了肝脏的功能

图4是敲除小鼠和对照组小鼠在胆总管结扎后肝细胞凋亡变化。其中，A图显示通过TUNEL染色观察对照组与敲除组梗阻性黄疸后肝细胞凋亡变化，其中绿色荧光为凋亡肝细胞，蓝色荧光为细胞核；B图为对照组与敲除组梗阻性黄疸后肝细胞凋亡变化计数图，显示敲除小鼠梗阻性黄疸后肝细胞凋亡减少。

图5是敲除小鼠和对照组小鼠在胆总管结扎后肝细胞内疏水性胆汁酸含量变化，显示肝脏GGPPS敲除能够显著降低梗阻性黄疸后肝脏内疏水性胆汁酸TCA，TCDCA及TβMCA的累积。

图6是敲除小鼠和对照组小鼠在胆总管结扎后肝细胞调控胆汁酸向肝外分泌的相关基因的表达情况。其中，A图显示通过实时定量PCR的方法检测Mrp1，Mrp3，Ostβ及Bsep的表达量增加，B图显示并通过免疫组织化学明确了Mrp3的表达增加情况。

图7是体内体外实验明确GGPPS敲除对FXR的激活作用。其中，A图是体外试验观察FOH对于FXR荧光素酶活性的作用，显示FOH能够显著增加FXR的荧光素酶活性，B图是观察对照组以及敲除组小鼠原代肝细胞中FXR荧光素酶活性的激活情况，显示敲除小鼠原代肝细胞中FXR的荧光素酶活性是增加的。

图8是在小鼠体内使用DGBP的方式以及DGBP处理后肝脏FPP等的含量变化。其中，A图显示实验方案，B图显示DGBP皮下注射可类似肝脏特异性敲除GGPPS起到增加肝细胞内FPP和GGPP含量的作用。

图9是对照组与DGBP处理组小鼠在胆总管结扎后生存情况及肝脏表现。其中，A图显示DGBP处理能够减少梗阻性黄疸后死亡率，B图大体形态显示DGBP处理组肝脏形态正常，C图通过H&E染色也表明其液化性坏死区域面积减少，并通过Image J软件量化处理。其中，虚线圈出的为肝损伤液化性坏死区域。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的说明。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆实验指南》(molecular cloning:alaboratory manual)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料及生物检测

材料：8周龄C57BL/6J小鼠及肝脏特异性GGPPS敲除小鼠购自南京大学模式动物研究所，GGPPS，α微管蛋白，β肌动蛋白抗体购自santacruz公司，MRP3抗体购自abcam公司，ECL发光液购自CST公司，总RNA抽提试剂(Trizol)及反转录试剂盒购自Takara公司，TUNEL试剂盒购自Promega公司，DGBP合成自南京大学化学系李建新教授实验室。

H&E染色检测：

步骤1石蜡切片制备

取肝组织右叶适量，用4％的多聚甲醛固定24-48h，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片，厚度为5μm。

步骤2石蜡切片H&E染色

将切片分别浸于二甲苯中10min和5min脱蜡，之后于梯度乙醇中复水。苏木精染色4min后单蒸水稍洗。用0.25％NH₃·H₂O泛蓝30s后单蒸水洗。用梯度浓度乙醇脱水至95％乙醇脱水后，0.5％伊红液染色2-3s，之后100％乙醇中脱水，并在二甲苯中浸泡2min。最后用中性树胶封片。

AST和TB水平检测：

鼠麻醉后，通过眼窝静脉取血，并置于室温30min，待血清析出，离心。取10ul血清用于AST和TB试剂盒检测。

肝细胞内FPP，FOH，GGPP，香叶基香叶醇(geranylgeraniol,GGOH)含量测定(质谱分析法)：

小鼠肝组织(50毫克)用Tris缓冲液(pH 7.4)匀浆，调节终浓度至100毫克/毫升。匀浆物氮气吹干，100微升的甲醇水溶液(1:1，v:v)重悬，12000g离心1分钟，取上清待分析。高效液相色谱由2个高压梯度泵(LC-30AD)，1个真空脱气机(DGU-20A5)，和1个自动进样器(SIL-30AC)组成，柱温箱温度维持在20℃。上清被进样至反相分离柱(Inert Sustain C18柱，3×100mm，3μm)进行分离。FPP和GGPP按以下线性梯度进行分离(流动相A为0.1％氨水的水溶液，流动相B为100％的乙氰溶液)：5％B—5％B(0—1分钟)；5％B—80％B(1—3分钟)；80％B—80％B(3—5分钟)；80％B—5％B(5—5.1分钟)；5％B平衡(5.1—6.5分钟)。每次分析都进2微升的样品，整个分析时间为6.5分钟，流速为0.4毫升/分钟。液相色谱分离后，耦联到三重四级杆质谱仪(LCMS-8050，日本岛津)上，样品在电喷雾负离子模式下进行分析。氮气为雾化气，氩气为碰撞气。FPP和GGPP利用质谱的多反应监测模式(MRM，参数如下表1)进行定性和定量。

表1 FPP和GGPP的MRM参数

采用气相色谱耦联单四级杆质谱仪(GCMS-QP2010Ultra，日本岛津)分析FOH和GGOH。每次2微升的样品被进样至DB-5柱(30m×0.25mm)，柱温维持在50℃，载气为超纯氦，流速为39cm/min。质谱离子化模式为电子碰撞，检测电压被调至70eV。FOH和GGOH利用质谱的选择离子监测模式(SIM，参数如下表2)进行定性和定量。

表2 FOH和GGOH的SIM参数

化合物名称	定量离子	参考离子	检测电压(eV)
				FOH	222	41,69,83	70.0
GGOH	290	41,69,83	70.0

组织总RNA提取及反转录：

总RNA提取

取新鲜或者速冻的肝脏组织5mg于1ml总RNA抽提试剂中，用组织匀浆器充分匀浆，室温下加入200μl氯仿溶液，充分震荡后12000rpm离心15min，取500μl上清液加入无RNA酶的EP管，并加入等体积的异丙醇溶液，-20℃下充分沉淀。20min后，12000rpm离心10min，弃去上清液，用75％乙醇溶液清洗杂质，并溶于30μl DEPC溶液(焦炭酸二乙酯)中，55℃水浴中充分溶解。浓度测定。

反转录成cDNA

按照20μl体系反转录1μg RNA，采用PrimeScriptTM RT试剂(Takara Bio,Japan)试剂盒进行。反转录条件为：37℃，15min；85℃，5s。反转录完成后cDNA稀释20倍备用。

实时定量PCR：

引物序列为

扩增条件

1.95℃，2min；2.95℃，15s；3.58℃，15s；4.72℃，30s；5.重复2-4步骤40次。数据分析。

TUNEL染色：

依次将载玻片置入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中脱蜡，各10min；各浓度究竟中梯度复水；将载玻片浸入4％多聚甲醛溶液中固定15min；PK工作液(20μg/ml)处理10min；将载玻片浸入4％多聚甲醛溶液中固定5min，PBS漂洗5min；用Eq缓冲液预处理5min，去除载玻片上多余Eq缓冲液，滴加适量rTdT mix(按照Eq缓冲液98μl，Bio Nu 1μl，rTdT 1μl体系配置rTdTmix)处理1h；将载玻片浸润至2XSSC溶液中终止反应；荧光显微镜下观察。

免疫组织化学检测：

依次将载玻片置入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中脱蜡，各10min；再将载玻片置入梯度酒精中复水；将载玻片置入3％双氧水中；采用热修复法，将载玻片浸泡在柠檬酸/柠檬酸钠溶液中，微波炉中加热(高火1min，中火2min，低火7min)。之后将其冷却至室温；将载玻片放置于湿盒中，每张载玻片肝脏组织上滴加适量10％正常山羊血清封闭，室温封闭1h；去除载玻片上多余山羊血清，在每张载玻片肝脏组织上滴加适量一抗，并将载玻片放置入湿盒中，放入4℃冰箱中过夜；将载玻片取出，去除载玻片上多余的PBST，滴加适量辣根过氧化物酶标记(HRP)的第二抗体(PBST稀释，1：200)，并将载玻片置入湿盒中，室温孵育3hr；PBST溶液清洗二抗(5min×3次)；DAB显色：将载玻片取出，滴加适量DAB显色液，反应1min，其后用自来水冲洗终止反应；苏木精染色，自来水冲洗，0.5％氨水溶液反蓝，自来水冲洗；脱水透明：载玻片经梯度酒精(50％，75％，85％，95％，100％)脱水干燥，各1min，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ透明，各2min。封片后显微镜下观察

肝脏组织疏水性胆汁酸含量测定：

小鼠肝组织(50毫克)用Tris缓冲液(pH 7.4)匀浆，调节终浓度至100毫克/毫升。匀浆产物用氮气吹干，100微升的甲醇水溶液(1:1，v:v)重悬，12000g离心1min，取上清待分析。上清用氮气吹干，150μl的甲醇水溶液(1:1，v:v)重悬。高效液相色谱为LC-20A(日本岛津)，并装有一根AcquityUPLCBEHC18柱(1.7μm，2.1×100mm；沃特世)。柱温维持在65℃，自动进样器的温度维持在4℃。进样量为4μl，流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的乙氰溶液，流速为0.5ml/min。洗脱梯度为：5％B—5％B(0—0.5min)；5％B—25％B(0.5—5min)；25％B—40％B(5—15.5min)；40％B—95％B(15.5—17.5min)；95％B—95％B(17.5—19min)；95％B—5％B(19—19.1min)；5％B平衡(19.1—21min)。液相色谱分离后，耦联到三重四级杆质谱仪(LCMS-8050，日本岛津)上，样品在电喷雾负离子模式下进行分析，检测模式为多反应监测模式(MRM，参数如下表)。离子源温度为370℃，脱溶剂温度为200℃，脱溶剂和雾化气流速为10l/min和3l/min，碰撞气为氩气。疏水性胆汁酸利用质谱的多反应监测模式(MRM，参数如下表3)进行定性和定量。

表3 疏水性胆汁酸的MRM参数

FXR荧光素酶活性检测：

转染

(1)将培养稳定的原代肝细胞细胞进行胰酶消化，并制成细胞悬液；

(2)将细胞悬液接种于24孔培养板中，在37℃、5％CO₂条件的培养箱中继续培养，至细胞融合度达到约80％；

(3)转染：

1)将培养液液换成约为400μl的opti-MEM培养基；

2)按照每孔转染1μg质粒，需要2μl Lipofectamine 2000的比例，将质粒和Lipofectamine 2000分别溶解于opti-MEM中，混匀，室温静置5min；

3)将2)中稀释好的质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温静置20min；

4)将质粒与Lipofectamine 2000的混合液加入培养原代肝脏细胞的培养板中，培养箱中培养5小时后换成新鲜的含10％血清的培养基；

5)转染24小时后观察质粒上荧光标记基因的表达情况判断转染效率。

(4)荧光素酶活性检测

1)24孔板中每孔去除一半体积培养基，加入剩余体积同等量(即250μl)的

荧光素酶试剂，室温充分反应以待细胞充分裂解，吹打混匀后转移至1.5mL EP管中；

2)根据需要的量配制

Stop&

试剂待用；

3)吸取100μl步骤1)中的细胞裂解液100μl于Lockwellmaxisorp检测板中，酶标仪检测萤火虫荧光酶荧光值；

4)检测萤火虫荧光酶荧光值后，再在每孔中加入50μl

Stop&

试剂，室温反应，在10min-2h之内完成海肾荧光酶荧光值的检测，该检测时间点距

Stop&

试剂加入时间点应与萤火虫荧光酶荧光值检测时间点距

荧光素酶试剂加入时间点一致。

总蛋白提取与蛋白免疫印迹：

总蛋白提取

(1)取20mg肝脏组织，加200μl RIPA裂解液，用匀浆机在冰上充分匀碎，12000rpm4℃离心15min后用移液器吸取上清液；

(2)将样品按4:1比例加入5×的上样缓冲液，充分混匀后在99℃下变性10min；

蛋白免疫印迹

(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳：待聚丙烯酰胺凝胶完全聚合，将玻璃板放置在电泳槽里，加入1×电泳缓冲液，用移液器按照既定顺序吸取蛋白样品加入相应梳孔中，并在另一梳孔中加入蛋白标记；电泳开始时，初始电压为80V，当蛋白样品进入分离胶之后，可将电压增加至120V，将预定蛋白分离至相应位置，可关闭电泳槽电源；

(2)转膜：电泳结束后，以蛋白转移装置使蛋白转移至硝酸纤维素膜上，常规方法进行转移蛋白；

(3)免疫印迹：将硝酸纤维素膜放入封闭液中，封闭结束之后，并将硝酸纤维素膜倒置于一抗溶液上，4℃冰箱中孵育过夜；然后加入二抗；ECL显色，曝光仪曝光。

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1GGPPS基因的肝脏特异性敲除在治疗梗阻性黄疸肝脏损伤模型中应用本实施例首先进行GGPPS梗阻性黄疸肝脏损伤之间的相关性研究，我们取20只小鼠，分为Non-BDL，BDL-1d，BDL-3d，BDL-5d组，Non-BDL组为对照组，后面三组分别在胆总管结扎后1天，3天及5天处死取得肝脏组织制备成切片组织并匀浆后取上清组织进行FPP，FOH，GGPP及GGOH含量测定，并且分析GGPPS表达量的变化。附图1中的A图中我们发现随着梗阻时间的延长，肝脏损伤加重，H&E染色表现为液化性坏死区域面积的增加(如图中“#”标记所示)，并且肝脏中FPP含量显著增加，GGPP含量明显减少(附图1中的B图)，更进一步的，GGPPS的表达量是减少的(附图1中的C图)。因此我们认为GGPPS是与梗阻性黄疸肝脏损伤存在相关性的(正相关或负相关未知)。

进一步的，为了明确GGPPS对于梗阻性黄疸肝脏损伤的相关性，我们构建了肝脏特异性敲除GGPPS小鼠(以下简称敲除小鼠)，对敲除小鼠及对照组小鼠进行胆总管结扎构建梗阻性黄疸模型，并在5天后麻醉处死小鼠解剖出肝脏进行分析。如附图2的B图所示，对照组小鼠肝脏出现肝叶萎缩，肝脏出现胆汁淤积状况，而敲除小鼠肝脏形态正常。同时，附图2的B图中的H&E染色结果显示，对照组小鼠肝脏出现了大片的液化性坏死灶(如图中“#”标记所示)，而敲除小鼠肝脏形态正常。说明肝脏特异性敲除GGPPS能够有效改善梗阻性黄疸引起的肝脏损伤。

进一步地，本实施例对上述麻醉处死小鼠血液中谷草转氨酶(AST)及总胆红素(TB)的水平进行分析，结果如表4及附图3所示。

表4 对照组小鼠与敲除小鼠胆总管结扎后5天(BDL-5d)血清AST与TB水平

	AST(U/L)	TB(μmol/L)
			对照组	1754±435.6	254.3±22.5
敲除组	965.3±113.4	197.6±18.6
			平均值降幅	45.0％	22.4％

由表4可知，相比与对照组小鼠，敲除小鼠血清中AST与TB水平显著下降，AST的降幅为45％，TB的降幅为22.4％。附图3中的A图为两组小鼠在梗阻性黄疸后血清谷草转氨酶水平变化图，附图3中的B图为两组小鼠在梗阻性黄疸后血清总胆红素水平变化图。*表示两者相比具有显著差异，**表示两者相比具有极显著差异。结果表明肝脏特异性敲除GGPPS能够显著降低小鼠血清AST及TB水平，说明肝脏特异性敲除GGPPS能够有效拮抗梗阻性黄疸引起的肝脏损伤，对梗阻性黄疸患者肝脏达到保护的作用。

进一步地，本实施例对上述麻醉处死小鼠的肝脏进行肝细胞凋亡检测。取出所述麻醉处死的小鼠肝脏，按前述生物检测方法制备成石蜡切片并对这些石蜡切片进行TUNEL染色，观察肝脏特异性GGPPS基因敲除对于肝细胞凋亡的影响。结果如表5及附图4所示。

表5 对照组小鼠与敲除小鼠胆总管结扎后5天(BDL-5d)肝细胞凋亡水平的变化

	肝细胞凋亡比例(‰)
		对照组	42.3±7.6
敲除组	16.7±4.8
		平均值降幅	60.5％

由表5可知，相比与对照组小鼠，敲除小鼠肝细胞凋亡比例显著下降，凋亡比例的降幅为60.5％。附图4中的A图为两组小鼠在梗阻性黄疸后肝细胞凋亡状况，绿色为凋亡细胞，蓝色为正常细胞细胞核，附图4中的B图为两组小鼠在梗阻性黄疸后肝细胞凋亡统计数据。**表示两者相比具有极显著差异。结果表明肝脏特异性敲除GGPPS基因能够显著降低梗阻性黄疸后肝细胞凋亡比例，说明肝脏特异性敲除GGPPS基因能够对梗阻性黄疸肝脏达到保护的作用。

进一步地，本实施例对上述麻醉处死小鼠的肝脏进行肝细胞疏水性胆汁酸含量的测定。按前述生物检测方法,取出所述麻醉处死的小鼠肝脏，匀浆取上清液进行疏水性胆汁酸含量的测定，观察肝脏特异性GGPPS基因敲除对于梗阻性黄疸后肝细胞内疏水性胆汁酸含量的影响。结果如表6及附图5所示。

表6 肝脏特异性敲除GGPPS基因对于梗阻性黄疸后肝细胞疏水性胆汁酸累积的影响

由表6可知，相比与对照组小鼠，敲除小鼠肝细胞内疏水性胆汁酸含量显著下降，TCA的降幅为64.5％，TβMCA的降幅为72.7％，TCDCA的降幅为57.9％。附图5为两组小鼠在梗阻性黄疸后肝细胞内疏水性胆汁酸含量的统计数据。**表示两者相比具有极显著差异。结果表明肝脏特异性敲除GGPPS能够显著降低梗阻性黄疸后肝细胞内疏水性胆汁酸含量，说明肝脏特异性敲除GGPPS基因能够通过减少梗阻性黄疸后肝细胞内的疏水性胆汁酸累积对梗阻性黄疸肝脏达到保护的作用。

更进一步地，本实施例通过实时定量PCR的方法分析了参与肝细胞胆汁酸代谢的相关基因的表达情况。取出上述麻醉处死小鼠的肝脏，按前述生物检测方法提取总RNA后反转录成cDNA后进行实时定量PCR；并将肝脏制备成石蜡切片，进行免疫组化实验，观察肝脏特异性GGPPS基因敲除对于梗阻性黄疸后肝细胞内胆汁酸代谢相关基因的表达情况。结果如表7及附图6所示。

表7 肝脏特异性敲除GGPPS对于梗阻性黄疸后肝细胞内胆汁酸代谢的影响

	Mrp3	Mrp1	Ostβ	Bsep	Mrp4
						对照组	1±0.21	1±0.31	1±0.35	1±0.73	1±0.76
敲除组	2.1±0.12	3.3±1.2	5.1±0.55	14.3±4.67	0.92±0.98
						平均值倍数	2.1倍	3.3倍	5.1倍	14.3倍	无显著差异

由表7可知，相比与对照组小鼠，敲除小鼠肝细胞内介导胆汁酸向肝外分泌的Mrp1，Mrp3，Ostβ及Bsep的表达量显著上升，Mrp1的增幅为3.3倍，Mrp3的增幅为2.1倍，Ostβ的增幅为5.1倍，Bsep的增幅为14.3倍，Mrp4与对照组相比没有显著差异。附图6中的A图为两组小鼠在梗阻性黄疸后肝细胞内疏水性胆汁酸含量的统计数据，**表示两者相比具有极显著差异。附图6中的B图为敲除小鼠在梗阻性黄疸后肝脏Mrp3表达量显著增加，棕色为Mrp3表达位置，蓝色为细胞核。结果表明肝脏特异性敲除GGPPS基因能够显著增加介导胆汁酸向肝外排泄的转运酶的表达量，说明肝脏特异性敲除GGPPS基因能够通过增加介导胆汁酸向肝外排泄的转运酶的表达量，减少肝细胞内的疏水性胆汁酸累积对梗阻性黄疸肝脏达到保护的作用。

更进一步地，本实施例通过检测FXR荧光素酶活性的方法的方法分析肝脏特异性敲除GGPPS是否通过调控核受体FXR促进相关转运蛋白的表达。我们首先使用FOH刺激野生型小鼠原代肝细胞，观察FOH对FXR的激活情况，并且其后处死对照组与敲除组小鼠，并分离小鼠原代肝脏细胞，按前述生物检测方法检测对照组与敲除组FXR的荧光素酶活性；结果如表8，表9及附图7所示。

表8 FOH对野生型小鼠原代肝细胞FXR的激动情况(GW4064为阳性对照)

表9 对照组小鼠与敲除小鼠原代肝细胞中FXR的激动情况

由表8可知，相比于对照组，FOH能够显著增强野生型小鼠原代肝细胞中的FXR荧光素酶活性，更为重要的是，由表9可知敲除小鼠中原代肝细胞中FXR的荧光素酶活性也是显著增加的，达到对照组小鼠的2.98倍。附图7中的A图为不同浓度的FOH对于FXR荧光素酶活性激活情况的统计数据，**表示两者相比具有极显著差异。附图7中的B图为对照组小鼠与敲除小鼠原代肝细胞中FXR荧光素酶活性的统计数据，**表示两者相比具有极显著差异。结果FOH能够显著增加FXR的荧光素酶活性，并且在敲除小鼠原代肝细胞中其也是被显著增强的，表明肝脏特异性敲除GGPPS通过增加肝细胞中FOH含量激活FXR促进介导胆汁酸向肝外排泄的转运酶的表达量，继而减少肝细胞内的疏水性胆汁酸累积对梗阻性黄疸肝脏达到保护的作用。

实施例2 DGBP在制备治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物中的用途

本实施例中，将DGBP通过颈部皮下注射(0.15mg/kg,每天两次，溶于生理盐水中)到实验组小鼠体内，对对照组小鼠皮下注射相同量的生理盐水(附图9所示实验方法)，我们运用了质谱分析的方法检测FPP及FOH的方法验证其在肝脏中抑制GGPPS的效率，结果如表10及附图8所示。并在其后对两组小鼠进行胆总管结扎构建梗阻性黄疸模型(BDL)，并在5天后麻醉处死小鼠，解剖出肝脏，并按前述生物检测方法将肝脏制备成石蜡切片，进行H&E染色，观察DGBP对梗阻性黄疸后肝脏损伤的影响。结果如表11及附图9。

表10 DGBP在体内抑制肝脏GGPPS活性的效率(质谱分析验证)

由表10可知，通过使用DGBP皮下注射的方法，能够增加肝脏中FPP及FOH含量(增幅分别为46.7％，57.1％)，降低肝脏中GGPP及GGOH的含量(降幅分别为35.2％，43.2％)。附图8中的B图为两组野生型小鼠在注射生理盐水或DGBP后肝脏FPP，FOH，GGPP及GGOH含量变化的统计数据，*表示两者相比具有显著差异。以上数据结果表明DGBP能够在体内显著抑制肝脏中GGPPS活性。

表11 DGBP对梗阻性黄疸肝脏坏死区域面积的影响

	坏死区域面积
		对照组	1±0.41
实验组	0.14±0.06
		平均值降幅	86％

由表11可知，相比与对照组小鼠，DGBP处理能够显著减少肝细胞液化性坏死区域面积，平局值降幅为86％。附图9中的A图为两组小鼠在梗阻性黄疸后统计生存数据，p＝0.03。附图9中的B图为两组小鼠在梗阻性黄疸后肝脏大体形态，其中DGBP处理组在梗阻性黄疸后肝脏大体形态正常。附图9中的C图为两组小鼠在梗阻性黄疸后肝脏病理学检查(H&E染色)，虚线圈出的为液化性坏死区域，发明人通过Image J对液化性坏死区域统计并均一化的统计数据，**表示两者相比具有极显著差异。结果表明DGBP能够改善梗阻性黄疸肝脏损伤并改善生存情况。

Claims

1.靶向抑制肝脏GGPPS蛋白活性的试剂在制备治疗梗阻性黄疸肝脏损伤药物中的用途，其特征在于，所述靶向抑制肝脏GGPPS蛋白活性的试剂为二香叶基二磷酸。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的梗阻性黄疸肝脏损伤由胰头癌、远端胆管癌、肝门部胆管癌或胆囊癌引起。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的施用方式选自皮下注射、肝脏特异性施用及全身施用。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型选自针剂、片剂及胶囊。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物进一步包含具有功能活性的多肽或蛋白质。