CN107383136B - 吉西他滨ProTide乏氧活化前药及其应用 - Google Patents

吉西他滨ProTide乏氧活化前药及其应用 Download PDF

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Abstract

吉西他滨ProTide乏氧活化前药及其应用，其化学结构通式为
Figure DDA0001359400170000011
其中：R1、R2中的一个为‑C(R3R4)ArNO2的乏氧活化基团，另一个为1‑6个碳原子的烷基、苯基、‑CH2Ar，R3、R4为‑H、甲基，‑Ar为芳香环类化合物。本发明所述的吉西他滨ProTide乏氧活化前药在乏氧条件下具有更强的细胞毒性，具有优异的抗肿瘤作用和良好的安全性，与其他抗肿瘤药物联合使用能够发挥出更好的抗肿瘤效果，可用于治疗肿瘤药物的制备。

Description

吉西他滨ProTide乏氧活化前药及其应用
技术领域
本发明属于制药领域，提供一类吉西他滨ProTide乏氧活化前药及其应用。
背景技术
吉西他滨是一种核苷类抗肿瘤药物，该类药物的作用机理为拮抗核苷酸代谢，在体内经细胞内三磷酸化后，通过抑制脱氧核苷三磷酸(dNTPs)的合成、掺入DNA或RNA分子中干扰细胞复制、竞争性抑制DNA聚合酶等作用，特异性干扰核酸的代谢，阻止细胞的分裂和繁殖，最终导致肿瘤细胞死亡。核苷类抗肿瘤药物容易发生耐药，其ProTide前药能够减少耐药发生，具有良好的抗肿瘤作用，其中吉西他滨ProTide前药NUC-1031已经进入临床研究(Journal of Medicinal Chemistry 2014，57，1531-1542)。但是ProTide前药不能减少药物对非肿瘤组织的毒副作用。
Figure BDA0001359400150000011
随着肿瘤的快速生长，部分肿瘤组织离最近的血管越来越远，氧供应不足，导致肿瘤乏氧(Nature review cancer 2002,2:38-47)。传统的抗肿瘤药物对血管附近的肿瘤有良好的杀伤力，但对乏氧区域的肿瘤作用有限。肿瘤乏氧活化前药能够特异性地在肿瘤乏氧区域释放抗肿瘤活性成分，从而杀伤乏氧区域肿瘤(Chinese Journal of Cancer 2014,33:80-86)。乏氧活化前药具有肿瘤靶向性，从而具有更好的安全性，与传统的抗肿瘤药联合使用时抗肿瘤效果更加出色。其中TH302已经进入临床研究，对胰腺癌等具有良好的治疗作用(Journal of Clinical Oncology 2015，33，1475-1482)。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一类吉西他滨ProTide乏氧活化前药及其应用。该类前药在乏氧条件下具有更强的细胞毒性，对肿瘤具有优异的抗癌作用和良好的安全性，与传统抗肿瘤药物合用，可以在较小的剂量下获得良好的抗肿瘤效果，可用于制备治疗肿瘤的药物。
技术方案：吉西他滨ProTide乏氧活化前药，其化学结构为：
Figure BDA0001359400150000021
其中：R1、R2中的一个为-C(R3R4)ArNO2的乏氧活化基团，另一个为1-6个碳原子的烷基、苯基或-CH2Ar，R3、R4为-H或甲基，-Ar为芳香环类化合物。
作为优选方案，上述吉西他滨ProTide乏氧活化前药，所述的R1的结构为：
Figure BDA0001359400150000023
R2为1-6个碳原子的烷基或苄基，R3为-H或甲基，R4为甲基。
作为优选方案，上述吉西他滨ProTide乏氧活化前药，所述R1为苯基，R2的结构为：
Figure BDA0001359400150000024
R3为-H或甲基，R4为甲基。
作为优选方案，上述吉西他滨ProTide乏氧活化前药，所述的R1的结构为：
Figure BDA0001359400150000025
Figure BDA0001359400150000031
R2为1-6个碳原子的烷基或苄基，R3、R4为-H。
作为优选方案，上述吉西他滨ProTide乏氧活化前药，所述的R1为-CH2Ar，-Ar为带有供电子取代基的苯环，R2的结构为：
Figure BDA0001359400150000032
R3为-H或甲基，R4为甲基。
作为优选方案，上述吉西他滨ProTide乏氧活化前药，结构如下所示：
Figure BDA0001359400150000033
Figure BDA0001359400150000041
作为优选方案，上述吉西他滨ProTide乏氧活化前药，结构如下所示：
Figure BDA0001359400150000051
上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。
上述化合物或其药学上可接受的盐和盐酸吉西他滨的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
治疗肿瘤药物，有效成分为上述吉西他滨ProTide乏氧活化前药或其药学上可接受的盐。
治疗肿瘤药物，有效成分为上述吉西他滨ProTide乏氧活化前药或其药学上可接受的盐和盐酸吉西他滨的组合物。
需要指出的是，我们的研究发现：化合物001-021在乏氧条件下的细胞毒性明显高于正常氧条件下的细胞毒性。在吉西他滨ProTide前药NUC-1031的胺基位置引入乏氧活化基团，获得的目标化合物(如：化合物022)在乏氧条件下的细胞毒性与正常氧条件下的细胞毒性没有显著差异(见表1)。提示乏氧活化基团引入的位置对保持药物的乏氧活化功能具有特异性。
还需要指出的是，我们的研究发现，R2为乏氧活化基团时，如果R3、R4同时为H时(如化合物023)，目标化合物在乏氧条件下的细胞毒性与正常氧条件下的细胞毒性没有显著差异(见表1)，而当R1为乏氧活化基团时，如果R3、R4同时为H时(如化合物013-017)，目标化合物在乏氧条件下的细胞毒性明显高于与正常氧条件下的细胞毒性(见表1)。
Figure BDA0001359400150000061
当R1为乏氧活化基团，R2为-CH2Ar时，Ar为具有供电子取代基的苯基时，目标化合物在乏氧条件下表现出更强的细胞毒性(如化合物018-021)；当Ar为没有取代基或者具有吸电子取代基的苯基时(如化合物024)，目标化合物在乏氧条件下的细胞毒性与正常氧状态下差异较小。
以化合物001为例，考察了目标化合物的抗肿瘤效果和安全性，目标化合物显示了显著的抗肿瘤生长作用(见图1，图2)，在4倍治疗剂量下，与对照组相比，动物体重没有明显差异，说明目标化合物具有良好的安全性(见图3)。与吉西他滨等传统抗肿瘤药物联合使用，可以获得更好的抗肿瘤效果(见图2)。
有益效果：本发明获得的吉西他滨ProTide乏氧活化前药，在正常氧环境下具有较小的细胞毒性，在乏氧条件下，具有较大的细胞毒性，因此，能够特异性的对肿瘤乏氧区域的肿瘤发挥抗肿瘤作用，减少对其他组织的毒副作用，对肿瘤具有优异的抗癌作用和良好的安全性，与传统抗肿瘤药物如吉西他滨合用，可以在较小的剂量下获得良好的抗肿瘤效果，可用于制备治疗肿瘤的药物。进一步的研究发现，本发明提供的吉西他滨ProTide乏氧活化前药在4倍有效剂量时，与低剂量比，未见明显的毒性作用增加。
附图说明
图1为目标化合物001对人BxPC-3裸小鼠原位移植瘤的生长抑制作用示意图。给药后，实验组(化合物001)裸鼠胰腺癌肿瘤组织质量明显低于吉西他滨组、NUC-1031组，提示其具有更好的抑制肿瘤生长作用。
图2为目标化合物001对人BxPC-3裸小鼠皮下原位移植瘤的生长抑制作用示意图。给药后，高剂量组、低剂量+吉西他滨组组裸鼠胰腺癌肿瘤组织体积明显低于吉西他滨组，提示其具有更好的抑制肿瘤生长作用。
图3为目标化合物001对人BxPC-3裸小鼠皮下原位移植瘤药物治疗下，动物体重变化情况示意图。与低剂量组(1倍有效剂量)相比，高剂量组(4倍有效剂量)动物体重与低剂量组、阳性对照药吉西他滨组没有明显差异，说明目标化合物具有良好的安全性。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员可全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：目标化合物001-021的合成：
化合物001的合成
Figure BDA0001359400150000071
3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨的合成
合成路线(参考文献方法获得，The Journal of Organic Chemistry，1999，64:8319-8322)：
Figure BDA0001359400150000072
实验操作：吉西他滨(gemcitabine,0.60g,2mmol)，Na2CO3(1.06g)，40mL二氧六环，40mL水，二碳酸二叔丁酯(DBDC,0.44g,2mmol)于室温搅拌48小时。加入20mL水，用2×300mL乙酸乙酯萃取，Na2SO4干燥，减压浓缩。快速柱层析(CH2Cl2-乙酸乙酯-EtOH 1:1:0.02)得到3′-O-(N-叔丁氧羰基)吉西他滨(0.60g)。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):7.64(d,1H)7.40(d,2H),6.21(t,1H),5.81(d,1H),5.25-5.12(m,2H),4.13(t,1H)3.71-3.60(m,2H),1,45(s,9H).
合成路线(参考文献方法获得，The Journal of Medicinal Chemistry，2014，57:1531-1542)：
Figure BDA0001359400150000073
在100mL茄形瓶中加入10mL重蒸二氯甲烷，加入三氯氧磷(0.2g，1.3mmol)于二氯甲烷内，将反应体系放置于-78℃的环境下，向其中加入三乙胺(0.13g，1.3mmol)，搅拌15min后，滴加苯酚(0.153g，1mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液，15min滴毕，-78℃反应1h，室温反应1h。将整个反应体系继续放置于-78℃环境下，向其中加入0.23g(2.3mmol)的三乙胺，搅拌15min后，加入溶有0.275g(1mmol)L-丙氨酸-1-(4-硝基苯基)乙醇酯盐酸盐的重蒸二氯甲烷液10mL，搅拌3h。另取一50mL茄形瓶，加入30mL重蒸二氯甲烷，加入0.29g(0.8mmol)3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨，加入0.2g(2mmol)三乙胺，再加入N-甲基咪唑2mL，室温下，将此二氯甲烷液加入上瓶100mL反应体系中，室温反应过夜。浓缩溶剂，滤去不溶物，滤液用3×30mL水洗涤，以二氯甲烷萃取，浓缩溶剂，用三氟乙酸和二氯甲烷(体积比1:1)6mL于0℃搅拌4小时，浓缩溶剂，快速柱层析(二氯甲烷：甲醇体积比20:1)。得化合物001：1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.22-8.21(m,2H),7.60-7.55(m,1H),7.52-7.51(m,2H),7.41-7.36(m，2H)，7.29-7.22(m,3H)，6.30-6.25(m,1H),6.04-5.89(m,2H),4.56-4.38(m,2H),4.28-4.21(m,1H),4.15-4.10(m,1H),3.97-3.91(m,1H)，1.56-1.55(m,3H),1.38-1.32(m,3H).
按照同样的方法，合成了化合物002-化合物021。
化合物002：
Figure BDA0001359400150000081
参考化合物001方法，采用苯酚，L-丙氨酸-1-(4-硝基苯基)-1-甲基乙醇酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.21-8.20(m,2H),7.65-7.64(m,2H),7.54-7.50(m,1H),7.35-7.30(m，2H)，7.23-7.18(m,3H)，6.25-6.19(m,1H),5.99-5.85(m,1H),4.48-4.37(m,2H),4.23-4.14(m,1H),4.09-4.04(m,1H),3.91-3.84(m,4H)，1.74-1.73(m,6H),1.32-1.26(m,3H).
化合物003：
Figure BDA0001359400150000082
参考化合物001方法，采用苯酚，L-丙氨酸-1-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基)乙醇酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):7.58-7.53(m,1H),7.40-7.33(m,2H),7.30-7.22(m,3H),7.22-7.20(m,1H)，6.26-6.23(m,1H),6.02-5.90(m,1H),5.85-5.75(m,1H),4.59-4.41(m,2H),4.20-4.30(m,1H),3.97-3.90(m,4H)，1.60-1.59(m,3H),1.34-1.27(m,3H).
化合物004：
Figure BDA0001359400150000091
参考化合物001方法，采用苯酚，L-丙氨酸-1-(5-硝基-呋喃-2-基)乙醇酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):7.69(d,1H),7.57-7.52(m,1H),7.38-7.33(m,2H),7.26-7.19(m,3H),6.93(d,1H),6.27-6.21(m,1H),5.97-5.90(m,1H),4.53-4.31(m,2H),4.25-4.18(m,1H),4.12-4.07(m,1H),3.94-3.87(m,1H),1.57-1.56(m,3H),1.35-1.29(m,3H).
化合物005：
Figure BDA0001359400150000092
参考化合物001方法，采用苯酚，L-丙氨酸-1-(5-硝基-噻吩-2-基)乙醇酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.75(s,1H),7.72(s,1H),7.55-7.50(m,1H),7.36-7.31(m,2H),7.24-7.18(m,3H),6.26-6.21(m,1H),6.07-6.01(m,1H),5.90-5.81(m,1H),4.51-4.30(m,2H),4.24-4.16(m,1H),4.10-4.04(m,1H),3.92-3.86(m,1H),1.60-1.59(m,3H),1.32-1.27(m,3H).
化合物006：
参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸苄酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.20-8.18(m,2H),7.64-7.62(m,2H),7.58-7.53(m,1H),7.39-7.34(m,5H),6.28-6.23(m,1H),5.92-5.76(m,2H),5.16-5.10(m,2H),4.54-4.32(m,2H),4.26-4.20(m,1H),4.12-4.06(m,1H),3.95-3.90(m,1H),1.56-1.53(m,3H),1.35-1.30(m,3H).
化合物007：
Figure BDA0001359400150000102
参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸甲酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.22-8.20(m,2H),7.67-7.65(m,2H),7.60-7.55(m,1H),6.31-6.26(m,1H),5.96-5.80(m,2H),4.57-4.35(m,2H),4.29-4.23(m,1H),4.15-4.09(m,1H),3.97-3.92(m,1H),3.58(s,3H),1.61-1.55(m,3H),1.38-1.33(m,3H).
化合物008：
Figure BDA0001359400150000103
参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸乙酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.19-8.17(m,2H),7.63-7.61(m,2H),7.58-7.52(m,1H),6.26-6.21(m,1H),5.90-5.75(m,2H),4.52-4.30(m,2H),4.24-4.18(m,1H),4.14-4.05(m,1H),3.91-3.75(m,3H),1.55-1.50(m,3H),1.34-1.29(m,3H),1.16-1.12(m,3H).
化合物009：
Figure BDA0001359400150000111
参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸异丙酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.21-8.19(m,2H),7.65-7.63(m,2H),7.60-7.56(m,1H),6.29-6.25(m,1H),5.94-5.88(m,2H),5.03-4.97(m,1H),4.55-4.34(m,2H),4.28-4.22(m,1H),4.15-4.10(m,1H),3.98-3.93(m,1H),1.58-1.54(m,3H),1.38-1.31(m,3H),1.26-1.23(m,6H).
化合物010：
Figure BDA0001359400150000112
参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸丁酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.23-8.21(m,2H),7.65-7.63(m,2H),7.62-7.57(m,1H),6.31-6.25(m,1H),5.97-5.79(m,2H),4.58-4.35(m,2H),4.30-4.24(m,1H),4.17-4.12(m,1H),4.00-3.95(m,1H),3.88-3.78(m,2H),1.60-1.20(m,10H),0.85-0.81(m,3H).
化合物011：
Figure BDA0001359400150000113
参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸2，2-二甲基丙酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.24-8.22(m,2H),7.66-7.64(m,2H),7.62-7.58(m,1H),6.32-6.27(m,1H),5.99-5.80(m,1H),4.60-4.38(m,2H),4.32-4.26(m,1H),4.18-4.14(m,1H),4.02-3.96(m,1H),3.90-3.80(m,2H),1.62-1.58(m,3H),1.39-1.33(m,3H),1.24-1.21(m,9H).
化合物012：
Figure BDA0001359400150000121
参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸环己酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.19-8.17(m,2H),7.63-7.61(m,2H),7.57-7.52(m,1H),6.28-6.23(m,1H),5.94-5.78(m,2H),4.55-4.35(m,2H),4.28-4.20(m,2H),4.15-4.10(m,1H),4.02-3.94(m,1H),1.70-1.52(m,5H),1.39-1.15(m,11H)。
化合物013：
参考化合物001方法，采用1-(5-硝基噻吩-2-基)甲醇，L-丙氨酸环己酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.08-8.07(m,1H),7.65-7.55(m,1H),7.32-7.31(m,1H),6.30-6.25(m,1H),5.98-5.88(m,1H),5.25-5.07(m,3H),4.55-4.35(m,1H),4.28-4.21(m,1H),4.15-4.10(m,1H),4.04-3.97(m,1H),1.72-1.55(m,5H),1.42-1.18(m,11H)。
化合物014：
Figure BDA0001359400150000131
参考化合物001方法，采用4-硝基苄醇，L-丙氨酸甲酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.20-8.19(m,2H),7.65-7.63(m,2H),7.59-7.53(m,1H),6.28-6.24(m,1H),5.95-5.90(m,1H),5.14-5.02(m,2H),4.55-4.35(m,2H),4.28-4.21(m,1H),4.15-4.10(m,1H),3.98-3.90(m,1H),3.56(s,3H),1.57-1.53(m,3H),1.36-1.30(m,3H).
化合物015：
参考化合物001方法，采用1-(5-硝基呋喃-2-基)甲醇，L-丙氨酸苄酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):7.69-7.68(m,1H),7.65-7.64(m,1H),7.59-7.54(m,1H),7.36-7.29(m,5H),6.29-6.24(m,1H),5.94-5.88(m,1H),5.08-5.03(m,2H),4.57-4.36(m,2H),4.30-4.20(m,1H),4.14-4.09(m,1H),3.97-3.88(m,1H),3.89-3.60(m,2H),1.56-1.51(m,3H),1.35-1.31(m,3H).
化合物016：
Figure BDA0001359400150000133
参考化合物001方法，采用1-(5-硝基噻吩-2-基)甲醇，L-丙氨酸异丙酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.07-8.06(m,2H),7.67-7.55(m,1H),7.31-7.30(m,1H),6.30-6.25(m,1H),5.96-5.88(m,1H),5.22-5.18(m,2H),5.09-4.98(m,1H),4.56-4.35(m,1H),4.32-4.21(m,1H),4.15-4.10(m,1H),3.99-3.90(m,1H),1.38-1.33(m,3H)1.26-1.24(m,6H)。
化合物017：
Figure BDA0001359400150000141
参考化合物001方法，采用(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基)甲醇，L-丙氨酸乙酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):7.66-7.55(m,1H),7.22-7.21(m,1H)，6.29-6.23(m,1H),5.94-5.86(m,1H),4.54-4.31(m,2H),4.26-4.18(m,1H),4.17-4.10(m,3H)，3.96-3.70(m,3H),1.36-1.32(m,3H),1.16-1.13(m,3H).
化合物018：
参考化合物001方法，采用4-甲氧基苄醇，L-丙氨酸-1-甲基-1-(5-硝基呋喃-2-基)乙醇酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):7.68-7.66(m,1H),7.61-7.56(m,1H),7.05-7.04(m,2H),6.96-6.94(m,2H),6.32-6.25(m,1H),5.96-5.87(m,2H),5.10-5.03(m,2H),4.57-4.34(m,2H),4.29-4.21(m,1H),4.15-4.09(m,1H),3.98-3.91(m,4H),1.56-1.55(m,3H),1.37-1.32(m,3H).
化合物019：
Figure BDA0001359400150000151
参考化合物001方法，采用2-甲基苄醇，L-丙氨酸-1-甲基-1-(5-硝基噻吩-2-基)乙醇酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.73-8.72(m,1H),7.64-7.63(m,1H),7.59-7.54(m,1H),7.37-7.32(m,1H),7.24-7.15(m,3H),6.31-6.23(m,1H),5.95-5.89(m,1H),5.13-5.00(m,2H),4.56-4.32(m,2H),4.28-4.10(m,3H),4.14-4.06(m,1H),3.97-3.90(m,1H),2.37-2.35(m,3H),1.82-1.81(m,6H),1.37-1.30(m,6H).
化合物020：
Figure BDA0001359400150000152
参考化合物001方法，采用4-N,N-二甲基苄醇，L-丙氨酸-1-甲基-1-(5-硝基噻吩-2-基)乙醇酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):8.20-8.18(m,2H),7.61-7.56(m,1H),7.50-7.49(m,2H),7.06-6.83(m,4H),6.30-6.21(m,1H),6.02-5.89(m,2H),5.11-4.98(m,2H),4.56-4.32(m,2H),4.29-419(m,1H),4.12-4.06(m,1H),3.96-3.88(m,1H),2.81-2.80(m,6H),1.82-1.81(m,6H),1.35-1.29(m,3H).
化合物021：
参考化合物001方法，采用2-甲氧基苄醇，L-丙氨酸-1-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基)乙醇酯盐酸盐，吉西他滨等原料合成。1H NMR(MeOD,300MHz)δ(ppm):7.55-7.61(m,1H),7.35-7.25(m,2H),7.00-6.92(m,2H),7.20-7.19(m,1H)，6.26-6.23(m,1H),5.96-5.84(m,1H),5.04-4.90(m,2H),4.58-4.40(m,2H),4.28-4.17(m,1H),3.95-3.88(m,4H)，1.59-1.58(m,3H),1.30-1.20(m,3H).
实施例2：目标化合物正常氧状态、乏氧状态下对肿瘤细胞增殖体外抑制作用研究
取对数生长期肿瘤细胞，加入0.25％胰酶消化3min，用含10％小牛血清RPMI-1640悬浮细胞，计数，调细胞浓度为1×105个/mL，以100μL/孔接种于Top-count专用96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2孵育24h。然后将细胞分为实验组和对照组，实验组加入目标化合物溶液(0.001μg/mL，0.01μg/mL，0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL)，每一浓度均为四复孔，且每孔体积均补足200μL。各组加样后分别继续培养72h(乏氧组于5％CO2，95％N2下分别继续培养72h)，于培养结束前，每孔分别加入3H-TdR 3×105Bq，用Top-count测定各孔CPM(count perminute)值。计算各实验组药物对细胞增殖的半数抑制浓度(median inhibitionconcentration，IC50)。
表1目标化合物正常氧、乏氧状态下对肿瘤细胞增殖(72小时)的半数抑制浓度(IC50，μg/mL)
Figure BDA0001359400150000161
Figure BDA0001359400150000171
以上实验结果显示：吉西他滨、NUC-1031、化合物022-024在正常氧、乏氧状态下的对肿瘤细胞增殖体外抑制作用没有显著差异，本发明的实施例化合物(1-021)在正常氧、乏氧状态下的对肿瘤细胞增殖体外抑制作用具有显著差异(10-50倍)。提示本发明的实施例化合物对乏氧区域的肿瘤有更强的细胞毒性。
实施例3：目标化合物对人BxPC-3裸小鼠原位移植瘤的生长抑制作用
取对数生长期的BxPC-3人类胰腺癌细胞，以5×106个细胞·0.2mL-1·只-1的浓度，接种于裸鼠背部皮下，建立人原发性胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，待生长成1cm皮下移植瘤后取出，无菌条件下去除中央坏死组织，选取周围健康肿瘤组织剪成1mm3的组织块。
外科原位移植模型制备:戊巴比妥钠(50mg/Kg)腹腔麻醉裸鼠，左上腹直肌旁切口，暴露脾脏和胰尾，剪开胰腺被膜，将瘤块植入胰尾近脾动脉处，缝合胰腺被膜。
给药方案:术后3周后模型动物随机被分为实验组(化合物001)、对照组、吉西他滨组、NUC-1031组，于术后第3周起分别经腹腔注射给药(0.2mmol/kg,2次/每周)，持续4周，停药一周后处死裸鼠，取胰腺肿瘤组织，称重。抑制效果见图1：目标化合物对人BxPC-3裸小鼠原位移植瘤的生长抑制作用。给药后，实验组(化合物001)裸鼠胰腺肿瘤组织质量明显低于吉西他滨组、NUC-1031组，提示其具有更好的抑制肿瘤生长作用。
实施例4：目标化合物对人BxPC-3裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用
取对数生长期的BxPC-3人类胰腺癌细胞，以5×106个细胞·0.2mL-1·只-1的浓度，接种于裸鼠背部皮下，3周后，待裸鼠移植瘤长径均≥5mm后，以移植瘤长短径计算瘤体相似体积。按肿瘤体积的大小来顺排，用随机区组设计分配方法将裸鼠分为5组。
给药方案:模型动物50只，随机被分为阴性对照组、低剂量组(化合物001，0.1mmol/kg)、高剂量组(化合物001，0.4mmol/kg)、盐酸吉西他滨组(0.2mmol/kg)，联合给药组(化合物001，0.1mmol/kg+盐酸吉西他滨，0.1mmol/kg)、分别经腹腔注射给药(2次/每周)，持续3周，停药一周后处死裸鼠。同时测定动物体重，观察动物眼部情况。
抑制效果见图2，体重变化见图3：给药后，各组均显示出显著的抑制肿瘤生长作用，高剂量组和联合给药组显示出更好的治疗作用。所有试验组裸小鼠体重没有明显差异，但是均小于对照组。
以上实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.吉西他滨ProTide乏氧活化前药，其特征在于其化学结构为：
其中：R1的结构为：
Figure FDA0002312563010000012
Figure FDA0002312563010000013
R2为1-6个碳原子的烷基或苄基，R3为-H或甲基，R4为甲基。
2.吉西他滨ProTide乏氧活化前药，其特征在于结构如下所示：
Figure FDA0002312563010000014
3.权利要求2所述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。
4.治疗肿瘤药物，其特征在于有效成分为权利要求2所述吉西他滨ProTide乏氧活化前药。
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