CN107372373A - 通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法 - Google Patents
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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Abstract
本发明属于裸体方格星虫养殖技术领域，公开了一种通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法，印楝素的安全浓度为0.0007mg/L；印楝素对裸体方格星虫的LC50分别为0.249mg/L、0.120mg/L、0.103mg/L、0.089mg/L、0.0078mg/L、0.007mg/L；在浓度恢复至0.007mg/L的12h、24h时，印楝素0.03mg/L以下，活力得到修复；36h和48h，印楝素0.01mg/L以下，活力得到修复；按照本发明使用印楝素，可提高裸体方格星虫养殖存活率。
Description
技术领域
本发明属于裸体方格星虫养殖技术领域，尤其涉及一种通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法。
背景技术
裸体方格星虫(Sipunculus nudus)属星虫动物门、方格星虫纲、方格星虫目、方格星虫属，裸体方格星虫又有一个通俗的名字——沙虫，在我国沿海分布广阔，但其资源量由南到北呈现出一个递减的趋势。其中分布最广泛的且资源量最多的在我国广西沿海。沙虫的特征比较大，呈圆筒状。吻部短，无钩，其上着生三角形乳突，尖端向后，呈鳞状排列。其味道肥美，营养含量可观，因富含蛋白质、脂肪和钙、磷、铁等多种营养成分而素有“海滩香肠”的美誉，是一种无法替代的海产品，能够为广西海洋养殖业带来惊人的创收。方格星虫不仅具有营养价值，同时还存在潜力惊人的药用价值，因此在中国的消费市场是非常可喜的。最近，由于方格星虫的人工繁育成功，促进了养殖行业的增长，极大的补充了野生资源供不应求的缺口。现代医学临床试验表明，方格星虫含有多种活性物质，能够调整人体各种功能，具有显著的延缓衰老、抗氧化、抗疲劳、耐缺氧和耐高温等功效，是一种可以作为新世纪医药保健品开发的良好原材料。由于疏于对野生裸体方格星虫的资源保护，盲目追逐经济效益，导致恶意生境的不断衰退及沿海资源的不断挖掘，裸体方格星虫野生资源急剧下降，多年的无监督状态导致了沙虫只能有可数的几个地方出产。作为广西代名词的海洋资源，其脆嫩的肉质，丰富的营养价值及独树一帜的医药价值，使得裸体方格星虫具有十分迫切的养殖需求和药用开发。过去合成农药被用于控制土壤虫害，目的是为了农产品的增收，由于合成农药的各种负面影响导致了人们对新型农药的迫切需求。印楝(Azadirachta indicaA.Juss)被认为是世界出众的杀虫植物，印楝素(azadirachtin)是从印楝种子中提取出来的并且用来制作杀虫剂，从印楝的提取物中发现其中含有超过100种化合物，作为一种新型植物源杀虫剂，印楝素至少有10种杀虫活性成分，有利于延迟害虫抗药性的产生；杀虫广谱，可有效地防治农林、仓储、卫生多种主要害虫；主要作用于昆虫的内分泌系统，使害虫不能合成完成其生长发育所必需的激素，从而抑制生长发育，使昆虫的神经系统、消化系统、血淋巴、呼吸系统、免疫系统和遗传物质受到损害以至于不能完成正常的生理功能而死亡，具有拒食、忌避、触杀、破坏代谢平衡、抑制生长发育及不育等多种杀虫机理。在大量使用的过程中，印楝素会随着雨水冲刷、人工喷洒等过程进入到天然水环境，进而通过食物链的富集进入生物体内，并对低等水生生物产生一定的影响。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有的裸体方格星虫养殖存在合成药物印楝素会随着雨水冲刷、人工喷洒等过程进入到天然水环境，进而通过食物链的富集进入生物体内，并对低等水生生物产生一定的影响，影响裸体方格星虫的产量和质量。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法。
本发明是这样实现的，一种通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法，所述通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法包括：
印楝素的安全浓度为0.0007mg/L；
印楝素对裸体方格星虫的LC50分别为0.249mg/L、0.120mg/L、0.103mg/L、0.089mg/L、0.0078mg/L、0.007mg/L；
在浓度恢复安全浓度0.007mg/L的12h、24h时，裸体方格星虫的活力得到修复；
36h和48h，印楝素0.01mg/L以下，裸体方格星虫的活力得到修复。
进一步，所述通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法采用印楝素毒性试验和SPSS 17.0统计软件进行方差分析；用Probit法求出LC50浓度。
进一步，所述通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法计算存活率：
S：存活率；a：各个容器中存活的裸体方格星虫个数；b：各个容器裸体方格星虫总数；
不同时间段存活时间计算公式：
其中，h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7分别表示24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h时裸体方格星虫存活时间，a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8分别表示裸体方格星虫存活12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的个数。
进一步，所述通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法印楝素溶液对方格星虫的毒力回归方程位：
36h y＝2.623-10.531x；
48h y＝4.955-41.236x；
60h y＝3.716-36.149x；
72h y＝4.409-49.545x；
84h y＝3.200-40.861x；
96h y＝2.966-42.099x。
本发明的优点及积极效果为：进行96h的印楝素对裸体方格星虫(约10g)的急性毒性试验，结果发现：96h时，0.01mg/L以下印楝素浓度组裸体方格星虫存活率与对照组差异不显著(P>0.05)，但0.03mg/L以上印楝素浓度组存活率与对照组(0mg/L)差异显著。36h、48h、60h、72h、84h、96h，印楝素对裸体方格星虫的LC50分别为0.249、0.120、0.103、0.089、0.0078、0.007mg/L，安全浓度为0.0007mg/L。96h以内，0.03mg/L以下印楝素浓度对裸体方格星虫的存活时间没有显著影响。在浓度恢复48h时，0.01mg/L以下的印楝素浓度恢复到0mg/L对裸体方格星虫的存活时间影响不显著。在浓度恢复12h、24h时，印楝素0.03mg/L以下，裸体方格星虫的活力可以得到修复，不影响其存活率。在浓度恢复36h和48h，印楝素0.01mg/L以下，裸体方格星虫的活力可以得到修复，不影响其存活率。
附图说明
图1是本发明实施例提供的通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的方格星虫在不同浓度的印楝素溶液下的存活率示意图。
图3是本发明实施例提供的印楝素对方格星虫的LC50示意图。
图4是本发明实施例提供的不同浓度的印楝素对裸体方格星虫存活时间的影响示意图。
图5是本发明实施例提供的印楝素恢复后对裸体方格星虫存活率的影响示意图。
图6是本发明实施例提供的印楝素恢复后对裸体方格星虫存活时间的影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法包括以下步骤：
S101：设置0mg/L(对照)、0.01mg/L、0.03mg/L、0.05mg/L、0.007mg/L、0.09mg/L、0.11mg/L共7个印楝素浓度梯度，由印楝素溶液和25度海水配制而成。每浓度梯度设置3个平行，每个平行10只裸体方格星虫，共计210只裸体方格星虫；
S102：采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析(One-way ANOVA)检验其差异显著性；用LSR法的新复极差检验(SSR检验)法(Duncan法)进行组间多重比较，p<0.05为差异显著；用Probit法求出12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的LC50浓度；另外用Excel2010软件进行绘图；
S103：计算存活率、不同时间段存活时间。
下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1方格星虫
裸体方格星虫购买钦州东风市场，平均每个体重大约10g，放在盐度20的海水中充气备用。试验时挑选体表无损光滑、生命体征完好、体格均匀的裸体方格星虫来做试验。
1.1.2海水及养殖桶
海水为经沙滤的天然海水，再经400目筛绢网过滤备用，盐度为20，pH为7.9。
养殖容器为13.6cm×13.6cm×19cm，容量大约为4L的透明塑料罐，试验前用高锰酸钾浸泡1h后用自来水洗净，并用上述海水润洗，试验时准确装入2L上述海水，并充气。
1.1.3药品
印楝素溶液，主要有效成份为印楝素,有效含量为0.3％。
1.1.4仪器工具
pH计、盐度计、烧杯、量筒、网捞、移液管
1.2方法
1.2.1印楝素毒性试验
经预试验后，本试验设置0mg/L(对照)、0.01mg/L、0.03mg/L、0.05mg/L、0.007mg/L、0.09mg/L、0.11mg/L共7个印楝素浓度梯度，由印楝素溶液和25度海水配制而成。每浓度梯度设置3个平行，每个平行10只裸体方格星虫，共计210只裸体方格星虫。
计算好要配的母液体积后，用移液管将母液量入养殖容器中，然后装入2L海水，搅匀，再把挑选好的裸体方格星虫按每个桶10只投放进去，最后接上打氧管持续充氧；一天换一次水和药。
试验持续96h，每12h观察一次，记录其生命特征、存活率、存活时间以及水体温度、气温、pH值。
1.2.2统计分析
采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析(One-way ANOVA)检验其差异显著性；用LSR法的新复极差检验(SSR检验)法(Duncan法)进行组间多重比较，p<0.05为差异显著；用Probit法求出12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的LC50浓度；另外用Excel2010软件进行绘图。
1.2.3计算方法
存活率计算公式如下：
S：存活率；a：各个容器中存活的裸体方格星虫个数；b：各个容器裸体方格星虫总数。
不同时间段存活时间计算公式如下：
其中，h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7分别表示24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h时裸体方格星虫存活时间，a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8分别表示裸体方格星虫存活12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的个数。
2结果与分析
2.1不同浓度的印楝素溶液对方格星虫的影响
不同浓度的印楝素溶液对方格星虫的影响，包括印楝素对方格星虫存活率和存活时间的影响。
2.1.1不同浓度的印楝素溶液对方格星虫存活率的影响
不同浓度的印楝素溶液对裸体方格星虫存活率的影响明显，结果见表1
表1方格星虫在不同时间段不同浓度的印楝素溶液下的存活率
对表1的数据进行One-way ANOVA统计分析见图2。
从图2可见，12h、24h时，各印楝素浓度组裸体方格星虫存活率(100％)差异不显著(P>0.05)。36h时，0.007mg/L以下印楝素浓度组裸体方格星虫存活率(100％)与对照组差异不显著(P>0.05)，但0.09mg/L以上印楝素浓度组裸体方格星虫存活率(93.33％)与对照组差异显著(F(6，14)＝8.667，P<0.05)。48h时，0.007mg/L以下印楝素浓度组裸体方格星虫存活率与对照组差异不显著(P>0.05)，但0.09mg/L以上印楝素浓度组裸体方格星虫存活率(83.33％)与对照组差异显著(F(6，14)＝22.750，P<0.05)。60h，0.03mg/L以下印楝素浓度组裸体方格星虫存活率与对照组差异不显著(P>0.05)，但0.05mg/L以上印楝素浓度组裸体方格星虫存活率(93.33％)与对照组差异显著(F(6.14)＝86.250，P<0.05)。72h时，0.05mg/L以下印楝素浓度组裸体方格星虫存活率与对照组差异不显著(P>0.05)，但0.05mg/L以上印楝素浓度组存活率(93.33％)与对照组差异显著(F(6，14)＝79.815，P<0.05)。84h时，0.01mg/L以下印楝素浓度组裸体方格星虫存活率与对照组差异不显著(P>0.05)，但0.03mg/L以上印楝素浓度组存活率(93.33％)与对照组差异显著(F(6，14)＝144.056，P<0.05)。96h时，0.01mg/L以下印楝素浓度组裸体方格星虫存活率与对照组差异不显著(P>0.05)，但0.03mg/L以上印楝素浓度组存活率(93.33％)与对照组差异显著(F(6，14)＝240.250，P<0.05)。0.11mg/L浓度组84h裸体方格星虫全部死亡，存活率为0。这说明，4d以内的短时间印楝素暴露时，0.01mg/L以下的印楝素浓度，对裸体方格星虫存活影响不明显。
2.1.2 Probit分析
用Probit回归分析，对表1的数据进行处理，得出不同浓度的印楝素溶液在不同时间段下的毒力回归方程，结果见表2。
表2.2不同时间段下不同浓度的印楝素溶液对方格星虫的毒力回归方程
不同时间段下印楝素的LC50结果见图3。
将表1的数据进行Probit分析后，得到的印楝素对裸体方格星虫的LC50如图3。
从图3可见，随着时间的推移，印楝素对裸体方格星虫LC50值逐渐降低。进入84h后，降至0.0078mg/L以下时，逐渐趋于稳定。至96h，LC50为0.007mg/L。所以，印楝素对裸体方格星虫的安全浓度为0.007mg/L。
2.1.3印楝素溶液对裸体方格星虫存活时间的影响
观察不同浓度的印楝素溶液对裸体方格星虫的存活时间的影响，结果见表3。
表3印楝素不同时间段裸体方格星虫的存活时间
对表3的数据进行One-way ANOVA统计分析结果见图4。
从图4可知，从试验开始至24h，0.11mg/L以下各印楝素浓度组对裸体方格星虫的存活时间组间差异不显著(p＞0.05)，这说明，从试验开始至24h，0.11mg/L以下各印楝素浓度组对裸体方格星虫的存活时间影响不显著。36h，印楝素对裸体方格星虫的存活时间具有显著影响(F(6,14)＝8.667,p＜0.05)：0.007mg/L以下印楝素浓度组组间差异不显著(p＞0.05)，但与0.007mg/L以上印楝素浓度组组间差异显著(F(6,14)＝8.667,p＜0.05)，这说明，36h以内，0.007mg/L以下印楝素浓度组对裸体方格星虫的存活时间影响不显著，0.007mg/L以上印楝素浓度不适合裸体方格星虫存活。48h，印楝素对裸体方格星虫的存活时间具有显著影响(F(6,14)＝23.517,p＜0.05)：0.007mg/L以下印楝素浓度组组间差异不显著(p＞0.05)，但与0.007mg/L以上印楝素浓度组组间差异显著(F(6,14)＝23.571,p＜0.05)，这说明，48h以内，0.007mg/L以下印楝素浓度组对裸体方格星虫的存活时间影响不显著，0.007mg/L以上印楝素浓度不适合裸体方格星虫存活。60h，0.007mg/L以下印楝素浓度组组间差异不显著(p＞0.05)，0.007mg/L以上印楝素浓度组与对照组组间差异显著(F(6,14)＝54.241,p＜0.05)，说明60h以内，0.007mg/L以下印楝素浓度对裸体方格星虫的存活时间没有显著影响，浓度超过0.007mg/L则不适合裸体方格星虫存活。72h，0.007mg/L以下印楝素浓度组组间差异不显著(p＞0.05)，0.007mg/L以上印楝素浓度组与对照组组间差异显著(F(6,14)＝72.078,p＜0.05)，说明72h以内，0.007mg/L以下印楝素浓度对裸体方格星虫的存活时间没有显著影响，浓度超过0.007mg/L则不适合裸体方格星虫存活。84h，0.05mg/L以下印楝素浓度组组间差异不显著(p＞0.05)，0.05mg/L以上印楝素浓度组与对照组组间差异显著(F(6,14)＝109.831,p＜0.05)，说明84h以内，0.05mg/L以下印楝素浓度对裸体方格星虫的存活时间没有显著影响，浓度超过0.05mg/L则不适合裸体方格星虫存活。96h，0.03mg/L以下印楝素浓度组组间差异不显著(p＞0.05)，0.03mg/L以上印楝素浓度组与对照组组间差异显著(F(6,14)＝155.761,p＜0.05)，说明96h以内，0.03mg/L以下印楝素浓度对裸体方格星虫的存活时间没有显著影响，浓度超过0.03mg/L则不适合裸体方格星虫存活。
2.2印楝素恢复后对裸体方格星虫的影响
2.2.1印楝素恢复后对裸体方格星虫存活率的影响
印楝素恢复后，裸体方格星虫不同时间段的存活率见表4。
表4印楝素恢复后不同时间段裸体方格星虫的存活率
对表4数据进行统计分析见图5。
从图5发现，浓度恢复12h时，0.03mg/L以下的印楝素浓度恢复与对照组组间差异不显著(p＞0.05)，但0.05mg/L以上浓度恢复与对照组差异显著(F(6,14)＝273.250,p＜0.05)，则说明，浓度恢复12h时，印楝素浓度0.03mg/L以下，裸体方格星虫的活力可以得到修复，不影响其存活率，但浓度在0.05mg/L以上，则不利于裸体方格星虫的活力修复。在浓度恢复24h时，0.01mg/L浓度恢复与对照组组间差异不显著(p＞0.05)，但0.03mg/L以上的浓度恢复与对照组组间差异显著(F(6,14)＝850.333,p＜0.05)，这说明，在浓度恢复24h时，印楝素浓度0.01mg/L以下，裸体方格星虫的活力可以得到修复，不影响其存活率，但浓度在0.03mg/L以上，则不利于裸体方格星虫的活力修复。在浓度恢复36h和48h时，0.01mg/L浓度恢复与对照组组间差异不显著(p＞0.05)，但0.03mg/L以上的浓度恢复与对照组组间差异显著(F(6,14)＝1404.000、F(6,14)＝685.333,p＜0.05)，这说明，在浓度恢复36h和48h时，印楝素浓度0.01mg/L以下，裸体方格星虫的活力可以得到修复，不影响其存活率，但浓度在0.03mg/L以上，则不利于裸体方格星虫的活力修复。
2.2.2印楝素恢复后对裸体方格星虫存活时间的影响
印楝素恢复后，裸体方格星虫不同时间段的存活时间见表5。
表5印楝素恢复后不同时间段裸体方格星虫的存活时间
对表5的数据进行统计分析见图6。
从图6发现，在恢复12h时，0.03mg/L以下的印楝素浓度恢复组组间差异不显著(p＞0.05)，但与0.05mg/L以上的印楝素浓度恢复组组间差异显著(F(6,14)＝103.051，p＜0.05)，这说明，在恢复12h时，0.03mg/L以下的印楝素浓度恢复到0mg/L对裸体方格星虫的存活时间影响不显著。在恢复24h时，0.03mg/L以下的印楝素浓度恢复组组间差异不显著(p＞0.05)，但与0.05mg/L以上的印楝素浓度恢复组组间差异显著(F(6,14)＝230.503，p＜0.05)，这说明，在恢复24h时，0.03mg/L以下的印楝素浓度恢复到0mg/L对裸体方格星虫的存活时间影响不显著。在浓度恢复36h和48h时，0.01mg/L浓度恢复与对照组组间差异不显著(p＞0.05)，但0.03mg/L以上的浓度恢复与对照组组间差异显著(F(6,14)＝222.789、F(6,14)＝188.457,p＜0.05)，这说明，在浓度恢复36h和48h时，印楝素浓度0.01mg/L以下，裸体方格星虫的活力可以得到修复，不影响其存活率，但浓度在0.03mg/L以上，则不利于裸体方格星虫的活力修复。
3讨论
3.1印楝素对裸体方格星虫的毒性
毒性试验96h后，0.01mg/L以下的印楝素浓度组存活率100％；0.03mg/L以上浓度组与对照组(0mg/L)差异显著(p＜0.05)。36h、48h、60h、72h、84h、96h，印楝素对裸体方格星虫的LC50分别为0.249、0.12、0.103、0.089、0.0078、0.007mg/L，随着时间的增加，印楝素的毒性逐渐减弱；从整体而言印楝素的毒性对裸体方格星虫的影响敏感。
3.2裸体方格星虫的印楝素适应性
在本试验中，高浓度的印楝素对裸体方格星虫的存活率及存活时间产生显著的影响(p＜0.05)，印楝素浓度升高，裸体方格星虫的存活率降低，存活时间短。试验证明，印楝素浓度在0.09mg/L时，裸体方格星虫的存活率仅26.7％，平均存活时间69.2h；印楝素浓度在0.09mg/L以上时，存活率为0，存活时间最高不超过50.4h。印楝素浓度在0～0.01mg/L时，裸体方格星虫的存活率最高，达100％，存活时间96h以上，Probit分析得出，毒性试验进行到96h时，印楝素的安全浓度为0.007mg/L，则说明印楝素浓度在0.007mg/L以下为裸体方格星虫在含印楝素环境中的可生存的浓度。本试验印楝素对裸体方格星虫的36h和48h的LC50值分别为0.249和0.12mg/L。这说明，在印楝素较低浓度的情况下，裸体方格星虫有存活的可能性，裸体方格星虫对印楝素比较敏感。
3.3印楝素恢复后对裸体方格星虫的影响
印楝素恢复后12h，0.03mg/L以下的印楝素浓度恢复到0mg/L对裸体方格星虫的存活时间影响不显著；恢复后48h时，对裸体方格星虫的存活率及存活时间有著影响(p＞0.05)，说明印楝素中毒恢复后的48小时内毒性仍有残留。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法，其特征在于，所述通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法包括：
印楝素的安全浓度为0.0007mg/L；
印楝素对裸体方格星虫的LC50分别为0.249mg/L、0.120mg/L、0.103mg/L、0.089mg/L、0.0078mg/L、0.007mg/L；
在浓度恢复至0.007mg/L的12h、24h时，裸体方格星虫的活力得到修复；
36h和48h，印楝素0.01mg/L以下，裸体方格星虫的活力得到修复。
2.如权利要求1所说的通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法，其特征在于，所述通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法采用印楝素毒性试验和SPSS 17.0统计软件进行方差分析；用Probit法求出LC50浓度。
3.如权利要求1所说的通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法，其特征在于，所述通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法计算存活率：
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S：存活率；a：各个容器中存活的裸体方格星虫个数；b：各个容器裸体方格星虫总数；
不同时间段存活时间计算公式：
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其中，h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7分别表示24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h时裸体方格星虫存活时间，a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8分别表示裸体方格星虫存活12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的个数。
4.如权利要求1所说的通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法，其特征在于，所述通过控制印楝素浓度提高裸体方格星虫养殖存活率的方法印楝素溶液对方格星虫的毒力回归方程位：
36h y＝2.623-10.531x；
48h y＝4.955-41.236x；
60h y＝3.716-36.149x；
72h y＝4.409-49.545x；
84h y＝3.200-40.861x；
96h y＝2.966-42.099x。
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