CN107337724A - 一种天然活性多肽spkp‑35的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备新型生物活性多肽的方法，得到的这种新型生物活性多肽，名称为蜘蛛抑钾肽‑35（SPKP‑35），是通过阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC共三步分离获得，是从敬钊缨毛蛛毒液中分离鉴定到的一种新型神经毒素，其一级结构由36个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键，C‑端未酰胺化。分子量为4120.8 Da，该多肽纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。

Description

一种天然活性多肽SPKP-35的制备方法
技术领域
本发明涉及一种新型生物活性多肽及其制备方法，具体涉及一种通过阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC分离获得新型生物活性多肽的方法。
背景技术
生物毒素是一种重要的生命现象，是生物界在亿万年进化过程中为了生存而形成的，是一个巨大的潜在发现新的生物活性分子的重要资源。目前国际上已经成功筛选到一些生物毒素分子用于治疗某些相关疾病或作为新型药物的设计参考。蜘蛛产生各种作用于神经系统的神经毒素，其神经毒素根据它们的化学结构分为蛋白多肽类神经毒素和多胺类神经毒素。其中蜘蛛多肽神经毒素最重要，蜘蛛多肽类神经毒素根据它们的功能和分子特征可分为两种类型:第一种是低分子量多肽类，它们能与兴奋性细胞膜上的阳离子通道相互作用；第二种是高分子量多肽类，它们与突触前膜的受体组分及增强神经介质的分泌作用密切相关。蜘蛛毒液已成为神经毒素的一个重要新来源，而且蜘蛛毒液中特异性药物和毒素分子也是我们寻找农业杀虫剂的较好模式分子。
发明内容
本发明的目的旨在于提供一种从广西缨毛蛛粗毒中制备新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽为蜘蛛抑钾肽-35（SPKP-35），其氨基酸序列为：
NH2-Asp Cys Arg Ala Leu Tyr Gly Gly Cys Thr Lys Asp Glu Asp Cys Cys LysHis Leu Ala Cys Arg Arg Thr Leu Pro Thr Tyr Cys Ala Trp Asp Leu Thr Phe Pro-OH,
所述的蜘蛛抑钾肽-35的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之间分别形成二硫键。
所述方法包括：（1）粗毒干粉用双蒸水溶解配成5mg/ml的毒素溶液，12 000rpm离心5 min, 上清用Millipore公司一次性过滤器(0.22 µm)过滤后，置于4°C保存。粗毒上样阳离子交换HPLC(ion-exchange HPLC)进行第一步分离。采用Waters 650型HPLC、美国Pharmacia 公司的HiprepTM16/10 CM FF预装柱进行分离。486检测器检测，检测波长为215nm。流动相为四相洗脱系统，流速为1.5mL/min。洗脱液分别为A相0.1M NaH2PO4, B相0.1M Na2HPO4, C相 1M NaCl, D相ddH2O。上述经ion-exchange HPLC分离后收集的各洗脱峰分别上样反相HPLC进行进一步纯化。采用分析型Vydac C18 RP-HPLC反相柱 (218TP54,4.6×250 mm) 于分析型Waters 2690 高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，996检测器检测，检测波长为215nm，流动相为含0.1%TFA的水（A）和乙腈（B），洗脱速度为1mL/min，柱温为40℃。
（2）通过上述阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC共三步分离获得的SPKP-35，运用质谱鉴定纯度达到98%以上，其分子量约为4120.8Da，经序列测定，该多肽的一级结构由36个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键，C-端未酰胺化。多肽SPKP-35纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。
附图说明
图1是广西缨毛蛛粗毒阳离子交换HPLC图谱。“*”表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在280 nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间。
图2是广西缨毛蛛粗毒目的阳离子交换峰反相HPLC图谱。箭头表示目的峰，纵坐标表示各个洗脱峰在280 nm下的吸收值，横坐标表示洗脱时间。
图3是目的多肽SPKP-35的反相HPLC图谱。
具体实施方式
1、实验材料和方法
1.1 粗毒的获取
广西缨毛蛛采集于海南省琼中县境内的山区，粗毒毒液采于雌性蛛种。简述如下：使蜘蛛张开螯爪伸入塑料杯中，然后用5～10 V的脉冲电流刺激两螯肢基部外侧3～5 s。蜘蛛感受电刺激后，即用触肢紧紧抱住杯壁，同时将螯爪有力刺向杯内壁并射出毒液。毒液收集后，放入-40℃冷冻干燥机中经真空冷冻干燥成浅黄色或白色粉末即为粗毒。
1.2 SPKP-35 的分离纯化及质谱分析
粗毒干粉用双蒸水溶解配成5mg/ml的毒素溶液，12 000rpm离心5 min, 上清用Millipore公司一次性过滤器(0.22 µm)过滤后，置于4°C保存。粗毒上样阳离子交换HPLC(ion-exchange HPLC)进行第一步分离。采用Waters 650型HPLC、美国Pharmacia 公司的HiprepTM16/10 CM FF预装柱进行分离。486检测器检测，检测波长为 215nm。流动相为四相洗脱系统，流速为1.5mL/min。洗脱液分别为A相0.1M NaH2PO4, B相0.1M Na2HPO4, C相 1MNaCl, D相ddH2O。上述经ion-exchange HPLC分离后收集的各洗脱峰分别上样反相HPLC进行进一步纯化。采用分析型Vydac C18 RP-HPLC反相柱 (218TP54, 4.6×250 mm) 于分析型Waters 2690 高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，996检测器检测，检测波长为215nm，流动相为含0.1%TFA的水（A）和乙腈（B），洗脱速度为1mL/min，柱温为40℃。
利用MALDI-TOF质谱（Voyager-DEÔSTR BiospectromitryÔ workstation）测定分子量。线性阳离子模式；N2光源337 nm；离子加速电压为20000 V。基质为α-氰基-4-羟基-肉桂酸（CCA），通过以下方式制备样品：取1 mL（约0.5 mg）样品液加入到9 mL CCA 0.1%TFA/50%乙腈饱和溶液，混匀后取1 mL点样，室温干燥后测定，并采用内标法校正。
1.3 SPKP-35的氨基酸序列测定
SPKP-35氨基酸序列测定采用N-端Edman降解法在Applied Biosystems公司491A型气相测序仪上完成。测30个循环，采用仪器配备的标准程序测序，在线HPLC检测，准确读出SPKP-35的氨基酸序列。
2、实验结果与分析
2.1 SPKP-35的分离纯化
由于广西缨毛蛛成分非常复杂，通常采用二维色谱的方法分离纯化毒素多肽：即首先经过阳离子交换分离粗毒后，洗脱成分进一步采用反相HPLC分离纯化。二维色谱是一种非常有效的分离纯化的方法，通过阳离子交换HPLC以及反相HPLC两步分离，我们从广西缨毛蛛粗毒中成功分离到SPKP-35。图1是广西缨毛蛛粗毒的阳离子交换HPLC图谱，在280 nm波长下检测，可观察到8个非常明显的洗脱峰，其中第3个峰是目的峰。收集此峰后，在AKTA纯化系统上进行脱盐处理所得图谱见图2。收集目的峰并冷冻干燥后，在Alliance系统上进行再次反相HPLC（见图3）。图中显示含SPKP-35的洗脱峰为单一峰，通过质谱鉴定它们的纯度达到98%以上。
2.2 质谱分析
洗脱峰用MALDI-TOF质谱分析表明所含组分单一。经鉴定SPKP-35的分子量为4120.8Da，样品纯度达到98%以上，说明目的肽的分离纯化是很成功的。
2.3 氨基酸序列分析
SPKP-35的序列测定在491-A测序仪上进行。测序之前对SPKP-35进行碘乙酰胺烷基化修饰，结果表明，SPKP-35是单链多肽分子，由36个氨基酸残基组成，其中包括6个Cys。SPKP-35含有6 个半胱氨酸，形成三对二硫键。蜘蛛抑钾肽-35的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之间分别形成二硫键。SPKP-35是新发现的一个序列独特的蜘蛛毒素分子，SPKP-35与其它ICK 模体毒素半胱氨酸残基位置非常保守，因此SPKP-35也是一种ICK 模体多肽毒素。
SEQUENCE LISTING
<110> 长沙沁才生物科技有限公司
<120> 一种天然活性多肽SPKP-35的制备方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 广西缨毛蛛(Chilobrachysguangxiensis)
<400> 1
Asp Cys Arg Ala Leu Tyr Gly Gly Cys Thr Lys Asp Glu Asp Cys
1 5 10 15
Cys Lys His Leu Ala Cys Arg Arg Thr Leu Pro Thr Tyr Cys Ala
16 20 25 30
Trp Asp Leu Thr Phe Pro
31 35

Claims (2)

1.一种从广西缨毛蛛粗毒中制备新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽为蜘蛛抑钾肽-35（SPKP-35I），其氨基酸序列为：
NH2-Asp Cys Arg Ala Leu Tyr Gly Gly Cys Thr Lys Asp Glu Asp Cys Cys LysHis Leu Ala Cys Arg Arg Thr Leu Pro Thr Tyr Cys Ala Trp Asp Leu Thr Phe Pro-OH。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括：（1）粗毒干粉用双蒸水溶解配成5mg/ml的毒素溶液，12 000rpm离心5 min, 上清用Millipore公司一次性过滤器(0.22 µm)过滤后，置于4°C保存；粗毒上样阳离子交换HPLC(ion-exchange HPLC)进行第一步分离；采用Waters 650型HPLC、美国Pharmacia 公司的HiprepTM16/10 CM FF预装柱进行分离；486检测器检测，检测波长为 215nm；流动相为四相洗脱系统，流速为1.5mL/min；洗脱液分别为A相0.1M NaH2PO4, B相0.1M Na2HPO4, C相 1M NaCl, D相ddH2O；上述经ion-exchange HPLC分离后收集的各洗脱峰分别上样反相HPLC进行进一步纯化；采用分析型Vydac C18 RP-HPLC反相柱 (218TP54, 4.6×250 mm) 于分析型Waters 2690 高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，996检测器检测，检测波长为215nm，流动相为含0.1%TFA的水（A）和乙腈（B），洗脱速度为1mL/min，柱温为40℃；
（2）通过上述阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC共三步分离获得的SPKP-35，运用质谱鉴定纯度达到98%以上，其分子量约为4122.5 Da，经序列测定，该多肽的一级结构由35个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键，C-端酰胺化；多肽SPKP-35纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEI P,ET AL.: "Jingzhaotoxin-35, a novel gating-modifier toxin targeting both Nav1.5 and Kv2.1 channels.", 《TOXICON》 *

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