CN107278873B - 一种鉴别玉米单倍体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别玉米单倍体的方法。本发明提供的鉴别玉米单倍体的方法，包括如下步骤：(1)以训练集各个玉米籽粒为真实单倍体还是真实二倍体为因变量，以训练集各个玉米籽粒的近红外透射光谱吸收值作为自变量，应用机器学习算法构建单倍体鉴别模型；所述训练集由若干玉米籽粒组成，其中一部分为真实单倍体，另一部分为真实二倍体；(2)取待测玉米籽粒，采集近红外透射光谱吸收值，然后输入步骤(1)建立的单倍体鉴别模型，由模型输出该待测玉米籽粒为预测单倍体或者预测二倍体的结果。本发明提供的方法可以用于自动化鉴别，对于推动玉米单倍体育种技术工程化具有重要作用。
Description
技术领域
本发明属于植物育种领域，具体涉及一种鉴别玉米单倍体的方法。
背景技术
玉米是我国种植面积最大的作物，同时也是重要的粮食作物，在国民生产和粮食安全领域具有不可替代的作用。2006年玉米种植面积2666万公顷，2009年超过水稻成为我国种植面积最大的作物。来自国家统计局网站数据显示，2016年全国玉米种植面积3676万公顷，总产2.19亿吨，玉米单产水平达到5972.7公斤/公顷。玉米单产水平的不断提升离不开种质遗传改良和优良杂交种的选育。生产上广泛应用的单交种使玉米成为杂种优势利用的典范。而优良自交系的选育是成功组配高产优质多抗广适杂交种的前提。在玉米自交系选育方面，育种家一直以来都是采用系谱法和轮回选择等传统的育种手段，经历6～7个世代才能获得稳定纯合的玉米自交系。玉米单倍体育种技术作为一项快速获得纯系的技术手段，使育种效率有了极大提高。育种家只需要经过诱导和加倍两个世代就能获得纯合的玉米自交系。该技术已经被国内外许多种业公司规模化应用，成为可与转基因技术、分子标记辅助育种技术相媲美的现代玉米育种三大核心技术之一。
玉米单倍体技术是一套易于实现工程化的育种技术，该技术包含基础材料的准确、单倍体的生产、单倍体加倍以及双单倍体(Doubled Haploid,DH)系的管理与应用等四个环节。其中单倍体的生产包括单倍体诱导和鉴别两个关键步骤。利用诱导系作为父本与基础材料杂交，后代会产生一定频率的单倍体。单倍体产生的多少受诱导率的影响。随着新型诱导系的选育，诱导率不断提高使诱导不再成为单倍体生产的限制因素。而如何从大量诱导的籽粒中快速准确鉴别单倍体则变得尤为重要。
R1-nj颜色标记系统是目前应用最广泛的成熟籽粒阶段鉴别玉米单倍体的方法。该方法由Nanda and Chase于1966年提出，根据单倍体的形成特征，由于单倍体胚中只含有母本的染色体，使得其在胚部颜色的表达跟二倍体存在差异，这样在种子阶段就可以仅通过颜色的识别来达到单倍体鉴别的目的。然而由于颜色基因的表达受C1-I等显性抑制基因的影响，R1-nj在籽粒中的表达清晰度上存在很大差异，一些欧洲硬粒种质和热带种质的材料难以通过该法进行鉴别。
在DH系生产过程中，需要产生大量的单倍体才能满足要求。传统的人工挑选受到巨大的挑战，自动化鉴别单倍体的方法在不断探索。根据单倍体与二倍体籽粒颜色差异，相继有基于机器视觉和图片信息提取的自动化方法应用于玉米单倍体鉴别中。然而，由于需要籽粒有清晰的颜色表达，这些基于视觉识别颜色来分选单倍体的系统都在适用性方面有其局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别玉米单倍体的方法。
本发明提供的鉴别玉米单倍体的方法，包括如下步骤：
(1)以训练集各个玉米籽粒为真实单倍体还是真实二倍体为因变量，以训练集各个玉米籽粒的近红外透射光谱吸收值作为自变量，应用机器学习算法构建单倍体鉴别模型；所述训练集由若干玉米籽粒组成，其中一部分为真实单倍体，另一部分为真实二倍体；
(2)取待测玉米籽粒，采集近红外透射光谱吸收值，然后输入步骤(1)建立的单倍体鉴别模型，由模型输出该待测玉米籽粒为预测单倍体或者预测二倍体的结果。
所述训练集中的玉米籽粒和所述待测玉米籽粒属于同一杂交群体。
所述训练集中的玉米籽粒是从所述待测玉米籽粒所在的杂交群体中抽样获得的。
所述杂交群体具体可为杂交群体A，即采用同一诱导系与m1种DH系进行杂交得到的杂交子代(籽粒)。所述杂交中，所述诱导系具体作为父本。所述诱导系具体可为诱导系CHOI3。m1为1以上的自然数，具体可为大于等于70小于等于107的自然数。所述DH系的制备方法具体如下：①玉米自交系甲(母本)和玉米自交系乙(父本)杂交，得到杂交子代(籽粒)；②步骤①得到的杂交子代(植株)作为母本，和作为父本的诱导系CAU5杂交，得到杂交子代(籽粒)；③从步骤②得到的杂交子代(籽粒)中选择拟单倍体，进行单倍体加倍，得到DH系。所述DH系的制备方法具体如下：①玉米自交系齐319(母本)和玉米自交系昌7-2(父本)杂交，得到杂交子代(籽粒)；②步骤①得到的杂交子代(植株)作为母本，和作为父本的诱导系CAU5杂交，得到杂交子代(籽粒)；③从步骤②得到的杂交子代(籽粒)中选择拟单倍体，进行单倍体加倍，得到DH系。
所述杂交群体具体可为杂交群体B，即采用同一诱导系与m2种杂交种玉米进行杂交得到的杂交子代(籽粒)。所述杂交中，所述诱导系具体作为父本。所述诱导系具体可为诱导系CHOI3。m2为1以上的自然数，具体可为大于等于1小于等于5的自然数。所述m2种杂交种玉米具体可为玉米京科968、玉米屯玉88、玉米屯玉188、玉米屯玉168和玉米屯玉4911。
所述杂交群体具体可为杂交群体C，即由杂交群体A和杂交群体B组成的杂交群体。
所述训练集具体可由将候选训练集中的所有玉米籽粒剔除异常样本后的籽粒组成。所述候选训练集中的玉米籽粒是从所述待测玉米籽粒所在的杂交群体中抽样获得的。
剔除异常样本的标准如下：计算该样本点到所有样本点中心的曼哈顿距离di,i＝1,2,3,……,N；和s为d1,d2,d3,……,dN的均值和标准差；如果则该样本为需要剔除的异常样本。
所述训练集具体可由187-2393个真实单倍体籽粒和185-708个真实二倍体籽粒组成。
所述近红外透射光谱的光谱范围为900-1600nm。
所述近红外透射光谱吸收值为未经处理的近红外透射光谱吸收值原始值。
所述玉米籽粒为成熟籽粒。
所述真实单倍体是通过田间试验鉴定获得的。
所述真实二倍体是通过田间试验鉴定获得的。
本发明还保护近红外光谱仪和记载有机器算法的载体在鉴别玉米单倍体中的应用。
本发明还保护近红外光谱仪和记载有以上任一所述方法的载体在鉴别玉米单倍体中的应用。
本发明还保护近红外光谱仪、记载有机器算法的载体和记载有以上任一所述方法的载体在鉴别玉米单倍体中的应用。
本发明还保护一种用于鉴别玉米单倍体的试剂盒，包括近红外光谱仪和记载有机器算法的载体。
本发明还保护一种用于鉴别玉米单倍体的试剂盒，包括近红外光谱仪和记载有以上任一所述方法的载体。
本发明还保护一种用于鉴别玉米单倍体的试剂盒，包括近红外光谱仪、记载有机器算法的载体和记载有以上任一所述方法的载体。
以上任一所述近红外光谱仪具体可为JDSU公司生产的微型光谱仪MicroNIR1700，光谱范围950-1600nm，单次测量时间为1s。
以上任一所述机器学习算法为神经网络算法、随机森林算法、偏最小二乘法算法或支持向量机算法。
神经网络算法的参数为：神经网络隐藏层节点数size＝5,模型权重值的衰减精度decay＝0.03727594。
随机森林算法的参数为：随机抽样变量个数mtry＝300。
偏最小二乘法算法的参数为：主成分个数ncomp＝24。
支持向量机算法的参数为：支持向量参数sigma＝0.04966604，惩罚系数C＝1024。
本发明提供了基于近红外透射光谱并利用机器学习构建模型鉴别玉米单倍体的方法，简化了鉴别步骤，可以快速高效的鉴别出玉米单倍体，利用本方法单倍体鉴别准确率可达92％-96％，并且单倍体漏选率在0.13％-7.65％。本发明提供的方法可以用于自动化鉴别，对于推动玉米单倍体育种技术工程化具有重要作用。
附图说明
图1为单倍体的平均光谱和二倍体的平均光谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。玉米京科968、玉米屯玉88、玉米屯玉188、玉米屯玉168和玉米屯玉4911均为杂交种玉米。杂交子代(籽粒)长成的植株即为杂交子代(植株)。
玉米自交系齐319：在文献“叶金才.育成我国首例对玉米南方锈病免疫系齐319[J].中国农业科学,2000,(04):110.”中公开过。
玉米自交系昌7-2：在文献“张文英,华福平,申为民,王金平,张桂堂,王东彬.优良玉米自交系昌7-2的选育及其利用[J].河南职技师院学报,2001,(04):17-19.”中公开过。
诱导系CAU5(农大高诱5号)：在文献“徐小炜，2013，玉米母本单倍体诱导性状的遗传与生物学机理研究，博士论文”中公开过。
诱导系CHOI3(农大高油高诱诱导系H3)：在文献“Dong X,Xu X,Li L,etal.Marker-assisted selection and evaluation of high oil in vivo haploidinducers in maize[J].Molecular Breeding,2014,34(3):1147-58.”中公开过。
玉米京科968：北京屯玉种业有限公司产品。玉米屯玉88：北京屯玉种业有限公司产品。玉米屯玉188：北京屯玉种业有限公司产品。玉米屯玉168：北京屯玉种业有限公司产品。玉米屯玉4911：北京屯玉种业有限公司产品。
以诱导系CHOI3为父本的授粉方法(种植地点：海南三亚南滨农场)：2015年冬，分别种植母本与父本；母本花丝吐出前，用羊皮纸袋套住雌穗进行隔离；授粉前一天下午用剪刀将母本花丝剪平，授粉当天将父本的花粉大量授予母本，并用羊皮纸袋继续套住雌穗，以防止外来花粉污染杂交后的雌穗。
鉴定拟单倍体和拟二倍体的方法：玉米果穗完成成熟后，将杂交所得的果穗进行收获，放置于干燥环境下晾干；然后根据R1-nj颜色进行拟单倍体籽粒和拟二倍体(“拟二倍体”又称“拟杂合二倍体”)籽粒的挑选，籽粒顶部紫色且胚盾片无色的为拟单倍体籽粒，籽粒顶部紫色且胚盾片紫色的为拟二倍体籽粒。
实施例1、杂交群体的制备
一、DH系的制备
1、玉米自交系齐319(母本)和玉米自交系昌7-2(父本)杂交，得到杂交子代(籽粒)。
2、步骤1得到的杂交子代(植株)作为母本，和作为父本的诱导系CAU5杂交，得到杂交子代(籽粒)。
3、从步骤2得到的杂交子代(籽粒)中选择拟单倍体，进行单倍体加倍，得到107个DH系。依次命名为DH系1至DH系107。
二、杂交群体A的制备
分别以步骤一得到的各个DH系为母本，以诱导系CHOI3为父本，进行杂交，获得杂交子代(籽粒)。从以每个DH系为母本得到的杂交子代(籽粒)中随机取30-40个拟单倍体和n1个(n1＝10或0)拟二倍体。具体来说：从以DH系1为母本得到的杂交子代(籽粒)中随机取30-40个拟单倍体和n1个拟二倍体，组成杂交群体A1；……(依次类推)；从以DH系107为母本得到的杂交子代(籽粒)中随机取30-40个拟单倍体和10个拟二倍体，组成杂交群体A110；DH系1至DH系70时n1＝10，DH系71至DH系107时n1＝0。
将杂交群体A1至杂交群体A110混合，得到杂交群体A(由3997粒籽粒组成，其中拟单倍体3297粒，拟二倍体700粒)。
三、杂交群体B的制备
以玉米京科968为母本，以诱导系CHOI3为父本，进行杂交，获得杂交子代(籽粒)；从杂交子代(籽粒)中随机取50个拟单倍体和50个拟二倍体，组成杂交群体B1。
以玉米屯玉88为母本，以诱导系CHOI3为父本，进行杂交，获得杂交子代(籽粒)；从杂交子代(籽粒)中随机取50个拟单倍体和50个拟二倍体，组成杂交群体B2。
以玉米屯玉188为母本，以诱导系CHOI3为父本，进行杂交，获得杂交子代(籽粒)；从杂交子代(籽粒)中随机取50个拟单倍体和50个拟二倍体，组成杂交群体B3。
以玉米屯玉168为母本，以诱导系CHOI3为父本，进行杂交，获得杂交子代(籽粒)；从杂交子代(籽粒)中随机取50个拟单倍体和50个拟二倍体，组成杂交群体B4。
以玉米屯玉4911为母本，以诱导系CHOI3为父本，进行杂交，获得杂交子代(籽粒)；从杂交子代(籽粒)中随机取50个拟单倍体和50个拟二倍体，组成杂交群体B5。
将杂交群体B1、杂交群体B1、杂交群体B3、杂交群体B4和杂交群体B5混合，得到杂交群体B(由500粒籽粒组成，其中拟单倍体250粒，拟二倍体250粒)。
四、杂交群体C的制备
1、分别以步骤一得到的DH系1至DH系70为母本，以诱导系CHOI3为父本，进行杂交，获得杂交子代(籽粒)。从以每个DH系为母本得到的杂交子代(籽粒)中随机取8-10个拟单倍体和10个拟二倍体。共获得698个拟单倍体和700个拟二倍体。
2、将步骤1得到的所有拟单倍体和拟二倍体与步骤二得到的杂交群体B混合，得到杂交群体C(由1898粒籽粒组成，其中拟单倍体948粒，拟二倍体950粒)。
实施例2、通过采集红外光谱建立模型鉴别单倍体
一、籽粒近红外透射光谱获取
将实施例1制备的杂交群体A以及实施例1制备的杂交群体B以及实施例1制备的杂交群体C中的每个籽粒分别进行近红外透射光谱扫描(籽粒胚面朝向光源，光源距离光谱仪3cm)。光谱仪为JDSU公司生产的微型光谱仪MicroNIR1700，光谱范围950-1600nm，单次测量时间为1s。微型光谱仪MicroNIR1700在光谱范围950-1600nm之间采集125个特定波长下的近红外透射光谱吸收值。
二、拟单倍体和拟二倍体真实性鉴定
完成步骤一后，将实施例1制备的杂交群体A以及实施例1制备的杂交群体B以及实施例1制备的杂交群体C中的每个籽粒播种到田间。拟单倍体播种采用3m行长，每行30粒，株距10cm。拟二倍体播种采用5m行长，每行21粒，株距25cm。
根据籽粒萌发得到的植株拔节期的表型进行鉴定：具有“植株矮小，叶片上冲，株型紧凑”表型的为真实单倍体；具有“植株粗壮，叶片披散”表型的为真实二倍体。
杂交群体A中，真实单倍体数量为3203粒，真实二倍体为794粒。
杂交群体B中，真实单倍体数量为249粒，真实二倍体为251粒。
杂交群体C中，真实单倍体数量为940粒，真实二倍体为958粒。
三、制备杂交群体A’、杂交群体B’和杂交群体C’
基于步骤二得到的真实单倍体和真实二倍体的结果，对步骤一获得的近红外透射光谱吸收值进行检查，剔除异常样本。
剔除异常样本的标准如下：计算该样本点到所有样本点中心的曼哈顿距离di,i＝1,2,3,……,N；和s为d1,d2,d3,……,dN的均值和标准差；如果则该样本为需要剔除的异常样本。
杂交群体A剔除异常样本后，为杂交群体A’。杂交群体A’中，真实单倍体数量为3190粒，真实二倍体为783粒。
杂交群体B剔除异常样本后，为杂交群体B’。杂交群体B’中，真实单倍体数量为249粒，真实二倍体为246粒。
杂交群体C剔除异常样本后，为杂交群体C’。杂交群体C’中，真实单倍体数量为916粒，真实二倍体为943粒。杂交群体C’中，所有真实单倍体的平均光谱与所有真实二倍体的平均光谱见图1。
四、应用机器学习算法进行单倍体鉴别
待测群体为：杂交群体A’、杂交群体B’或杂交群体C’。
从每个待测群体中随机抽取四分之三真实单倍体和四分之三真实二倍体组成训练集，剩余的四分之一真实单倍体和剩余的四分之一真实二倍体组成测试集。
待测群体A’相应的训练集由2981个籽粒组成(真实单倍体2393，真实二倍体588)，相应的测试集由992个籽粒组成(真实单倍体797，真实二倍体195)。待测群体B’相应的训练集由372个籽粒组成(真实单倍体187，真实二倍体185)，相应的测试集由123个籽粒组成(真实单倍体62，真实二倍体61)。待测群体C’相应的训练集由1395个籽粒组成(真实单倍体687，真实二倍体708)，相应的测试集由464个籽粒组成(真实单倍体229，真实二倍体235)。
1、用训练集的相关数据建立模型。
以训练集各个籽粒的真实状态(即步骤二中鉴定为真实单倍体还是真实二倍体)为因变量，以训练集各个籽粒125个波长下的近红外透射光谱吸收值(未经处理的近红外透射光谱吸收值原始值)作为自变量，应用机器学习算法构建单倍体鉴别模型。采用的机器学习算法分别为：朴素贝叶斯算法(参数为：预测变量符合独立分布特征)、K近邻算法(参数为：K＝5)、梯度推进机算法(参数为：决策树深度为9，决策树数目为300)、支持向量机算法(参数为：支持向量参数sigma＝0.04966604，惩罚系数C＝1024)、随机森林算法(参数为：随机抽样变量个数mtry＝300)、神经网络算法(参数为：神经网络隐藏层节点数size＝5,模型权重值的衰减精度decay＝0.03727594)或偏最小二乘法算法(参数为：主成分个数ncomp＝24)。上述机器学习算法中，除偏最小二乘法算法是线性判别方法外，其他算法均为非线性判别方法。
2、用测试集的相关数据评价模型。
利用步骤1建立的单倍体鉴别模型，输入测试集各个籽粒125个波长下的近红外透射光谱吸收值，得到测试集各个籽粒的预测值(预测单倍体或预测二倍体)。
将各个籽粒的预测值与步骤二获得的各个籽粒的真实值(真实单倍体或真实二倍体)进行比对，获得模型的评估参数。
模型的评估参数包括：模型准确率、单倍体鉴别准确率和单倍体漏选率。评估参数根据单倍体鉴别混淆矩阵中真实值与预测值来计算。设定单倍体为正样本，二倍体为负样本。将单倍体和二倍体预测正确分别称之为True Positive(TP)和True Negative(TN)，相应的将单倍体和二倍体预测错误分别称之为False Negative(FN)和False Positive(FP)。模型准确率反映的是模型对单倍体和二倍体都预测准确的比例。单倍体鉴别准确率则是预测的单倍体中有多少是真单倍体。单倍体漏选率是指漏选单倍体所占比例。
模型准确率＝(TP+TN)/(TP+FP+FN+TN)。
单倍体鉴别准确率＝TP/(TP+FP)。
单倍体漏选率＝FN/(TP+FN)。
待测群体分别为杂交群体A’、杂交群体B’和杂交群体C’时，利用偏最小二乘法算法建立的模型的评估参数结果见表1。对于杂交群体B’(以杂交种为母本得到的杂交群体)来说，模型准确率仅为87.98％。对于杂交群体A’(以DH系为母本得到的杂交群体)来说，模型准确率高达96.77％。对于杂交群体C’来说，模型准确率介于前述两者之间。对于杂交群体B’(以杂交种为母本得到的杂交群体)来说，单倍体鉴别准确率为92.00％。对于杂交群体A’(以DH系为母本得到的杂交群体)来说，单倍体鉴别准确率为96.72％。对于杂交群体C’来说，单倍体鉴别准确率介于前述两者之间。对于杂交群体B’(以杂交种为母本得到的杂交群体)来说，单倍体漏选率为7.26％。对于杂交群体A’(以DH系为母本得到的杂交群体)来说，单倍体漏选率为0.13％。对于杂交群体C’来说，单倍体漏选率介于前述两者之间。
表1
| 单倍体数 | 二倍体数 | 模型准确率 | 单倍体鉴别准确率 | 单倍体漏选率 | |
| 杂交群体A’ | 3190 | 783 | 96.77％ | 96.72％ | 0.13％ |
| 杂交群体B’ | 249 | 246 | 87.98％ | 92.00％ | 7.26％ |
| 杂交群体C’ | 916 | 943 | 92.71％ | 92.81％ | 0.44％ |
待测群体为杂交群体C’时，采用各个机器学习算法建立的模型的评估参数结果见表2。模型准确率比较发现，神经网络算法最高(95.42％)，偏最小二乘法算法次之(93.26％)，朴素贝叶斯算法和K近邻法算法最低。单倍体鉴别准确率与模型准确率结果类似。单倍体漏选率比较发现，随机森林算法建立的模型的单倍体漏选率最低(1.64％)，然后是神经网络算法(4.92％)，朴素贝叶斯算法和K近邻算法建立的模型的单倍体漏选率均较高。
表2
| 模型准确率 | 单倍体鉴别准确率 | 单倍体漏选率 | |
| 偏最小二乘法算法 | 93.26％ | 93.89％ | 7.65％ |
| 神经网络算法 | 95.42％ | 95.60％ | 4.92％ |
| K近邻算法 | 54.99％ | 54.65％ | 48.63％ |
| 朴素贝叶斯算法 | 60.11％ | 61.44％ | 48.63％ |
| 随机森林算法 | 92.45％ | 87.80％ | 1.64％ |
| 梯度推进机算法 | 65.77％ | 66.09％ | 37.16％ |
| 支持向量机算法 | 81.13％ | 80.87％ | 19.13％ |
Claims (6)
1.一种鉴别玉米单倍体的方法，包括如下步骤：
(1)以训练集各个玉米籽粒为真实单倍体还是真实二倍体为因变量，以训练集各个玉米籽粒的近红外透射光谱吸收值作为自变量，应用神经网络算法构建单倍体鉴别模型；所述训练集由若干玉米籽粒组成，其中一部分为真实单倍体，另一部分为真实二倍体；所述近红外透射光谱吸收值为未经处理的近红外透射光谱吸收值原始值；
(2)取待测玉米籽粒，采集近红外透射光谱吸收值，然后输入步骤(1)建立的单倍体鉴别模型，由模型输出该待测玉米籽粒为预测单倍体或者预测二倍体的结果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述近红外透射光谱的光谱范围为900-1600nm。
3.近红外光谱仪和记载有权利要求1或2所述方法的载体在鉴别玉米单倍体中的应用。
4.近红外光谱仪、记载有机器算法的载体和记载有权利要求1或2所述方法的载体在鉴别玉米单倍体中的应用。
5.一种用于鉴别玉米单倍体的试剂盒，包括近红外光谱仪和记载有权利要求1或2所述方法的载体。
6.一种用于鉴别玉米单倍体的试剂盒，包括近红外光谱仪、记载有机器算法的载体和记载有权利要求1或2所述方法的载体。
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