CN107245333B - 基于亚胺连接的荧光纳米颗粒及其在检测Hg2+和乙酰胆碱酯酶中的应用 - Google Patents

基于亚胺连接的荧光纳米颗粒及其在检测Hg2+和乙酰胆碱酯酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于亚胺连接的荧光纳米颗粒及其在检测Hg2+和乙酰胆碱酯酶中的应用，该荧光纳米颗粒是以3,5‑二氨基苯甲酸和1,3,5‑苯三甲醛为单体，采用简单的室温合成法制备而成。本发明以此荧光纳米颗粒为荧光探针，建立了水体中痕量Hg2+分析方法，并建立了一种检测乙酰胆碱酯酶的方法。与其他荧光探针相比，本发明荧光纳米颗粒不仅具有较高的绝对荧光量子产率、均匀的球形粒径分布，而且具有较好的结晶度、均匀的孔径分布和良好的热稳定性能，检测Hg2+和乙酰胆碱酯酶的选择性高、准确度高、精密度好。

Description

基于亚胺连接的荧光纳米颗粒及其在检测Hg2+和乙酰胆碱酯 酶中的应用
技术领域
本发明属于Hg2+和乙酰胆碱酯酶的检测技术领域，具体涉及一种基于亚胺连接的荧光纳米颗粒，以及以该纳米颗粒为荧光探针检测Hg2+和乙酰胆碱酯酶。
背景技术
汞俗称水银，常以液态存在，是一种重金属。水银是一种高毒性和非必需元素，是生态系统中能完善循环的唯一的重金属，通过食物链的互补表达将最终传递给人体。汞离子可以与稀少的碱基结合并干扰细胞代谢和功能。此外，汞会破坏人体中枢神经组织，如果长期在高汞环境下活动会导致脑损伤甚至死亡。汞主要以金属汞、无机汞和有机汞化合物的形式存在于自然界中，Hg2+污染是一个全球性的环境问题。
乙酰胆碱酯酶主要存在于胆碱能神经系统和神经肌肉接头中，通过降解体内的乙酰胆碱，终止膜的兴奋作用，确保神经信号的正常传导。乙酰胆碱酯酶与一些疾病如阿尔茨海默病、重症肌无力病等的发生有密切关系。乙酰胆碱酯酶在昆虫抗药性、环境监测和临床医学等方面都有着较为深入的应用。现代技术可利用昆虫诱变剂，使得杀虫剂对它们体内的乙酰胆碱酯酶更加敏感，从而减少农药的使用量。此外，利用氨基甲酸酯类农药或者有机磷能够抑制乙酰胆碱酯酶的催化活性，实现了对氨基甲酸酯类农药或者有机磷的成熟检测。目前检测乙酰胆碱酯酶的方法(如 Ellman方法，荧光分析法，电化学方法和衍射法等)尚有不足，如易出现假阳性或假阴性结果、检测灵敏度低、缺乏特异性底物、样品的背景干扰大、样品制备程序繁琐、测量时间长等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术对Hg2+和乙酰胆碱酯酶检测的不足，提供一种基于亚胺连接的荧光纳米颗粒，以及以该纳米颗粒作为荧光探针检测Hg2+和乙酰胆碱酯酶的应用。
解决上述问题所采用的基于亚胺连接的荧光纳米颗粒由下述方法制备得到：
以无水乙醇为溶剂，将1,3,5-苯三甲醛和3,5-二氨基苯甲酸按摩尔比为1：1～2，在室温下搅拌反应20～40分钟，离心分离并用无水乙醇洗涤，固体产物加入N,N- 二甲基甲酰胺中室温回流3～5小时，离心除去N,N-二甲基甲酰胺，再加入无水乙醇中回流1～3小时，离心、洗涤、室温真空干燥，得到基于亚胺连接的荧光纳米颗粒。
本发明基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测Hg2+中的应用，检测方法如下：
1、将基于亚胺连接的荧光纳米颗粒分散于超纯水中，配制成2～5μg/mL的荧光纳米颗粒分散液，用荧光分光光度计在激发波长为313nm下检测分散液在发射波长为410nm处的荧光强度F0，然后向该分散液中加入Hg2+标准样品，常温孵育30 分钟后震荡均匀，用荧光分光光度计检测在发射波长为410nm处不同浓度Hg2+对应体系的荧光强度F，绘制F0/F随Hg2+浓度变化的标准曲线。
2、按照步骤1的方法检测待测Hg2+样品对的荧光强度F，结合步骤1中标准曲线的线性方程即可确定待测样品中Hg2+的浓度。
上述步骤1中，优选将基于亚胺连接的荧光纳米颗粒分散于超纯水中，配制成 3～4μg/mL荧光纳米颗粒分散液。
本发明基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测乙酰胆碱酯酶中的应用，检测方法如下：
1、将基于亚胺连接的荧光纳米颗粒分散于pH＝7.5的磷酸盐缓冲液中，配制成 2～5μg/mL的荧光纳米颗粒分散液，向该分散液中加入Hg2+标准样品，使混合体系中Hg2+的浓度为15～25μmol/L，然后加入碘代硫代乙酰胆碱，使混合体系中碘代硫代乙酰胆碱的浓度与Hg2+的浓度相同，用荧光分光光度计在激发波长为313nm 下检测混合体系在发射波长为410nm处的荧光强度F0，再加入乙酰胆碱酯酶标准样品，常温孵育30分钟后震荡均匀，用荧光分光光度计检测在发射波长为410nm 处不同活度乙酰胆碱酯酶对应体系的荧光强度F，绘制(F-F0)/F0随乙酰胆碱酯酶浓度变化的标准曲线。
2、按照步骤1的方法检测待测乙酰胆碱酯酶样品对应的荧光强度F，结合步骤 1中标准曲线的线性方程即可确定待测样品中乙酰胆碱酯酶的浓度。
上述步骤1中，优选将基于亚胺连接的荧光纳米颗粒分散于pH＝7.5的磷酸盐缓冲液中，配制成3～4μg/mL的荧光纳米颗粒分散液。
本发明所用的Hg2+标准样品为HgCl2。本发明以3,5-二氨基苯甲酸和1,3,5-苯三甲醛为单体采用简单的室温合成方法制备成基于亚胺连接的荧光纳米颗粒，然后以该荧光纳米颗粒作为荧光探针检测Hg2+和乙酰胆碱酯酶，建立了水体中痕量Hg2+分析方法，并建立了一种检测乙酰胆碱酯酶的方法。与其他荧光探针相比，本发明荧光纳米颗粒不仅具有较高的绝对荧光量子产率、均匀的球形粒径分布，而且具有较好的结晶度、均匀的孔径分布和良好的热稳定性能，并且检测Hg2+和乙酰胆碱酯酶的选择性高、准确度高、精密度好。
附图说明
图1是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的荧光激发和发射光谱。
图2是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的红外光谱图(a:3,5-二氨基苯甲酸,b: 1,3,5-苯三甲醛；c:荧光纳米颗粒)。
图3是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的透射电镜图。
图4是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的X-射线衍射仪谱图。
图5是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的氮气吸附-解析曲线。
图6是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的孔径分布图。
图7是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在N2气氛下的热重分析曲线图。
图8是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的荧光强度随Hg2+浓度变化的荧光光谱图。
图9是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的荧光强度比值随Hg2+浓度变化的标准曲线。
图10是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的荧光强度比水中共存金属离子的荧光响应柱状图。
图11是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的荧光强度随乙酰胆碱酯酶活度变化的荧光光谱图。
图12是基于亚胺连接的荧光纳米颗粒的荧光强度恢复率随乙酰胆碱酯酶活度变化的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
称取48.64g(0.30mmol)1,3,5-苯三甲醛和68.47g(0.45mmol)3,5-二氨基苯甲酸，分别溶于20mL无水乙醇中，然后将1,3,5-苯三甲醛的乙醇溶液迅速倒入3,5- 二氨基苯甲酸的乙醇溶液中，室温搅拌反应30min，然后在10000rpm下离心5min，并用无水乙醇洗涤3次，再于20mL N,N-二甲基甲酰胺中室温回流4h，离心除去 N,N-二甲基甲酰胺，接着再用无水乙醇回流2h，离心，洗涤，室温真空干燥12h，得到基于亚胺连接的荧光纳米颗粒。
发明人采用PE LS55型荧光分光光度计、红外光谱仪、透射电子显微镜、粉末 X-射线衍射仪、物理吸附仪、热重分析仪对所得荧光纳米颗粒进行表征，结果见图 1～7。由图1可见，所得荧光纳米颗粒有两个最大激发波长分别为225nm和313nm。图2中，曲线a上3435cm-1和3353cm-1处的两个尖峰为-NH2的吸收峰，曲线b上 1695cm-1处为芳香醛中-CHO的吸收峰，曲线c中-NH2和-CHO的吸收峰消失，而在1627cm-1处出现了-C＝N-的吸收峰、1702cm-1处存在-C＝O-的吸收峰，表明所得荧光纳米颗粒依然存在单体3,5-二氨基苯甲酸中的羧基。由图3可见，所得荧光纳米颗粒呈球形，其粒径约为3nm，且粒径较均一。图4中，2θ在小角度2.4°时有一个非常强的衍射峰，说明荧光纳米颗粒有很好的结晶度。由图5和图6可见，所得荧光纳米颗粒的BET比表面积为50.93m2·g-1、Langmuir比表面积为88.36m2·g-1，孔容量为0.03cm3·g-1，孔径尺寸分布在1.00～1.25nm，更多的集中在1.08nm处，并且孔径分别比较均一。由图7可见，在100℃以下时，所得荧光纳米颗粒有轻微的质量损失，这主要是由于材料表面吸附的水分子，当温度继续升高至约380℃时，材料开始分解损失质量，由此证明所得荧光纳米颗粒在低于380℃的温度下不会分解，可以稳定存在，其热稳定性能良好。
实施例2
实施例1中基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测Hg2+中的应用，具体方法如下：
1、将0.0034mg基于亚胺连接的荧光纳米颗粒分散于1mL超纯水中，配制成 3.4μg/mL的荧光纳米颗粒分散液；分别取50μL荧光纳米颗粒分散液于试管中，随后分别加入100μL不同浓度的Hg2+水溶液，用超纯水定容至250μL，并混合均匀，使得最终混合溶液中Hg2+的浓度分别为0、0.08、0.40、0.64、0.80、1.60、4.00、6.40、 8.00、16.00和24.00μmol/L，然后常温孵育30min后震荡均匀，用PE LS55荧光分光光度计(荧光条件：激发波长为313nm、发射光谱的范围为340～550nm，激发和发射的狭缝宽度分别为5nm、10nm)检测不同浓度Hg2+对应体系的荧光光谱和在发射波长为410nm处不同浓度Hg2+对应体系的荧光强度F(其中Hg2+浓度为0 时对应体系的荧光强度记为F0)，结果见图8，并绘制F0/F随Hg2+浓度(CHg2+)变化的标准曲线，见图9。
由图8～9可见，在相同的检测条件下，荧光纳米颗粒对Hg2+有明显的荧光响应，在Hg2+浓度为0～24.00μmol/L时，荧光强度比值F0/F与Hg2+浓度(CHg2+)呈线性关系，线性方程为：
y＝0.9894+0.09109x
式中y为F0/F，x为Hg2+浓度，相关系数R2＝0.9932，由相关系数可见，荧光强度比值与Hg2+浓度的线性关系很好。经测试，该荧光纳米颗粒对Hg2+的检出限为 0.030μmol/L。
2、按照步骤1的方法采用PE LS55荧光分光光度计检测待测Hg2+样品的荧光光谱，根据待测样品的荧光强度F，结合步骤1中标准曲线的线性方程即可确定待测样品中Hg2+的浓度。
发明人按照实施例1的方法进行了选择性试验和实际样品分析，具体试验情况如下：
1、选择性试验
按照实施例1步骤1的方法分别检测基于亚胺连接的荧光纳米颗粒对水中存在物质的荧光响应情况(其中所测试的金属离子的浓度为Hg2+浓度的50倍)，结果见图10。由图10可以看出，该荧光纳米颗粒对Hg2+的荧光响应大于水中存在的其他金属离子，说明本发明基于亚胺连接的荧光纳米颗粒抗干扰能力很强。
2、样品分析
实验采用自来水和湖水作为实际样品进行分析。自来水由陕西师范大学提供，湖水取自于陕西师范大学昆明湖。用0.22μm的水系纤维滤头将自来水和湖水分别过滤，之后加入一定量的Hg2+作为实际样品，然后分别取一定量的实际样品和一定量的荧光纳米颗粒分散液，室温孵育30min后震荡均匀，用PE LS55荧光分光光度计检测体系的荧光光谱，按照实施例1中的线性方程计算体系中Hg2+的浓度，根据加标量和测定值计算加标回收率，结果如表1所示。
表1加标回收率(n＝5)
由表1可知，本发明荧光纳米颗粒对两种样品3个浓度梯度的Hg2+加标的加标回收率在91.7％～106.3％，而且标准偏差均低于7.86％，说明该方法的准确度较高、精密度较好。由此可见，本发明基于亚胺连接的荧光纳米颗粒检测Hg2+的方法可用于检测实际样品，在环境监测领域具有潜在的应用价值。
实施例3
1、将0.0034mg基于亚胺连接的荧光纳米颗粒分散于1mLpH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，配制成3.4μg/mL的荧光纳米颗粒分散液；分别取50μL荧光纳米颗粒分散液于试管中，随后加入50μL 100.00μmol/L的Hg2+水溶液和50μL 100.00μmol/L 的碘代硫代乙酰胆碱水溶液，并分别加入50μL不同活度的乙酰胆碱酯酶水溶液，用50μL pH值为7.5的磷酸盐缓冲液定容至250μL，混合均匀，使混合溶液中乙酰胆碱酯酶的活度分别为0、1.33、6.67、13.33、33.33、40.00、46.67、53.33mU/mL，然后常温孵育30min后震荡均匀，用PE LS55荧光分光光度计检测(荧光条件：激发波长为313nm、发射光谱的范围为340～550nm，激发和发射的狭缝宽度分别为 5nm、10nm)混合溶液的荧光光谱和在发射波长为410nm处不同活度乙酰胆碱酯酶对应体系的荧光强度F(其中乙酰胆碱酯酶活度为0时对应体系的荧光强度记为 F0)，结果见图11和12。
由图11可见，未加入乙酰胆碱酯酶时，Hg2+可以猝灭荧光纳米颗粒，因而其荧光强度最小，而加入不同活度的乙酰胆碱酯酶后，荧光纳米颗粒的荧光发生了不同程度的恢复，其荧光强度恢复率((F-F0)/F0)与乙酰胆碱酯酶(AChE)的活度呈线性关系(见图12)，线性方程为
y＝42.43+1.141x
式中y为荧光强度恢复率，x为乙酰胆碱酯酶活度，相关系数R2＝0.9721，由相关系数可见，荧光强度恢复率与乙酰胆碱酯酶活性的线性关系较好。经测试，该荧光纳米颗粒对乙酰胆碱酯酶的检出限为0.45mU/mL。由此可见，本发明基于亚胺连接的荧光纳米颗粒检测乙酰胆碱酯酶的方法可利用巯基和Hg2+的结合在检测巯基化合物方面具有潜在的应用价值。

Claims (8)

1.基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测Hg2+中的应用，所述的基于亚胺连接的荧光纳米颗粒由下述方法制备得到：
以无水乙醇为溶剂，将1,3,5-苯三甲醛和3,5-二氨基苯甲酸按摩尔比为1：1～2，在室温下搅拌反应20～40分钟，离心分离并用无水乙醇洗涤，固体产物加入N,N-二甲基甲酰胺中室温回流3～5小时，离心除去N,N-二甲基甲酰胺，再加入无水乙醇中回流1～3小时，离心、洗涤、室温真空干燥，得到基于亚胺连接的荧光纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测Hg2+中的应用，其特征在于：
（1）将基于亚胺连接的荧光纳米颗粒分散于超纯水中，配制成2～5μg/mL的荧光纳米颗粒分散液，用荧光分光光度计在激发波长为313nm下检测分散液在发射波长为410nm处的荧光强度F0，然后向该分散液中加入Hg2+标准样品，常温孵育30分钟后震荡均匀，用荧光分光光度计检测在发射波长为410nm处不同浓度Hg2+对应体系的荧光强度F，绘制F0/F随Hg2+浓度变化的标准曲线；
（2）按照步骤（1）的方法检测待测Hg2+样品对的荧光强度F，结合步骤（1）中标准曲线的线性方程即可确定待测样品中Hg2+的浓度。
3.根据权利要求2所述的基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测Hg2+中的应用，其特征在于：在步骤（1）中，将基于亚胺连接的荧光纳米颗粒分散于超纯水中，配制成3～4μg/mL荧光纳米颗粒分散液。
4.根据权利要求2或3所述的基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测Hg2+中的应用，其特征在于：所述的Hg2+标准样品为HgCl2。
5.基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测乙酰胆碱酯酶中的应用，所述的基于亚胺连接的荧光纳米颗粒由下述方法制备得到：
以无水乙醇为溶剂，将1,3,5-苯三甲醛和3,5-二氨基苯甲酸按摩尔比为1：1～2，在室温下搅拌反应20～40分钟，离心分离并用无水乙醇洗涤，固体产物加入N,N-二甲基甲酰胺中室温回流3～5小时，离心除去N,N-二甲基甲酰胺，再加入无水乙醇中回流1～3小时，离心、洗涤、室温真空干燥，得到基于亚胺连接的荧光纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测乙酰胆碱酯酶中的应用，其特征在于：
（1）将基于亚胺连接的荧光纳米颗粒分散于pH=7.5的磷酸盐缓冲液中，配制成2～5μg/mL的荧光纳米颗粒分散液，向该分散液中加入Hg2+标准样品，使混合体系中Hg2+的浓度为15～25μmol/L，然后加入碘代硫代乙酰胆碱，使混合体系中碘代硫代乙酰胆碱的浓度与Hg2+的浓度相同，用荧光分光光度计在激发波长为313nm下检测混合体系在发射波长为410nm处的荧光强度F0，再加入乙酰胆碱酯酶标准样品，常温孵育30分钟后震荡均匀，用荧光分光光度计检测在发射波长为410nm处不同活度乙酰胆碱酯酶对应体系的荧光强度F，绘制（F-F0）/F0随乙酰胆碱酯酶浓度变化的标准曲线；
（2）按照步骤（1）的方法检测待测乙酰胆碱酯酶样品对应的荧光强度F，结合步骤（1）中标准曲线的线性方程即可确定待测样品中乙酰胆碱酯酶的浓度。
7.根据权利要求6所述的基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测乙酰胆碱酯酶中的应用，其特征在于：在步骤（1）中，将基于亚胺连接的荧光纳米颗粒分散于pH=7.5的磷酸盐缓冲液中，配制成3～4μg/mL的荧光纳米颗粒分散液。
8.根据权利要求6或7所述的基于亚胺连接的荧光纳米颗粒在检测乙酰胆碱酯酶中的应用，其特征在于：所述的Hg2+标准样品为HgCl2。
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