CN107217014A - 一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株二氯喹啉酸降解菌及其应用。本发明所提供的一株二氯喹啉酸降解菌J7属于泛菌属(Pantoea sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2017年3月16日，保藏编号为CCTCC M 2017131，利用16S rDNA鉴定为泛菌属。该菌为革兰氏阴性菌，菌落呈淡黄色，表面光滑，圆形，边缘整齐。该菌具有降解二氯喹啉酸的功能，且可以防治烟草受到二氯喹啉酸的药害。

Description

一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株

技术领域

本发明属于环境污染微生物处理技术领域，具体涉及一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacum）属茄科一年生或有限多年生草本植物，起源于南美洲，目前种植遍布世界各地。烟草是一种特殊的经济作物，我国自1982年实行烟草专卖制度以来，烟草行业得到长足发展并成为国民经济的一个重要支柱产业。烟草在我国南北各省区均有种植，其主要用途为加工烟叶生产卷烟。因此，优质的烟叶是烟草生产的重要目标，如何保证优质的烟叶也是烟农关心的重要问题。在福建，烟草种植主要以稻烟轮作方式为主，然而上茬作物水稻常用的农药如除草剂的使用，严重影响了后茬烟草的生长。烟草对除草剂较为敏感，随着除草剂在水稻田的广泛使用，烟草生产受到除草剂药害的现象时有发生，给烟草生产带来极大的危害。

已有研究表明二氯喹啉酸施用后，在美国阿肯色州有研究者检测到水稻田附近水域二氯喹啉酸的残留量可达µg/l级; 利用测渗计模拟水稻田施用二氯喹啉酸的环境行为，结果表明95% 残留在水稻田的30 cm表层土壤中。土壤中残留的二氯喹啉酸会影响烟草植株的畸形生长，导致新叶向叶背卷缩，随后逐渐发展成线状鼠尾状叶形。由于二氯喹啉酸的药害，烤烟的产量和产值均明显降低，严重危害时可降低80%以上，甚至绝收。

微生物法降解残留农药具有环境友好，无污染，高效等特点，因此利用生物进行环境修复是近年来的研究热点。本发明通过田间长期使用二氯喹啉酸的土壤中分离筛选获得降解菌株，本发明所采用的菌株为泛菌属菌株，目前尚未见泛菌属用于土壤残留二氯喹啉酸降解的报道；本发明菌株来源于土壤，具有环境友好的特点。采用生物法解除烟田残留除草剂二氯喹啉酸不仅能降低药害带给烟草的经济损失，而且也对保护环境，净化土壤有不可小觑的意义。

发明内容

为解决上述二氯喹啉酸在土壤中残留导致烟草产量和产值降低的问题，本发明提供一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株。该菌株可有效降解土壤中残留的二氯喹啉酸，从而提高烟草产量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株，经鉴定，该菌株为泛菌J7 (Pantoea sp.J7)；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮政编码：430072；保藏日期为2017年3月16日，保藏编号为CCTCC M 2017131。

本发明菌株J7通过如下方法富集得到：

本实验从福建烟田采集土壤，利用富集法筛选获得，其筛选过程如下：

（1）二氯喹啉酸降解菌的富集：取0.1g土壤与100 ml MM培养基混合，并加入二氯喹啉酸使其终浓度为100 µg/ml，于30℃，150 r/min培养1周；取培养液1 ml加入100 ml含同样浓度除草剂的新鲜培养基中，同时于固体培养基划线以确认有细菌生长，同样条件培养1周；连续转代培养10次后，经平板划线分离，获得单菌落菌株。该菌为革兰氏阴性菌，菌落呈淡黄色，表面光滑，圆形，边缘整齐。

（2）液相色谱测定该菌降解率：将所得菌株分别置于含有5 µg/ml二氯喹啉酸和不含二氯喹啉酸的MM培养基中培养，以不加菌液只含相同浓度二氯喹啉酸的MM培养基为参照，利用高效液相色谱法进行测定；取样时间分别为第6 d和第23 d，样品体积为1 ml；将样品在8000 r/min 条件下离心10 min, 上清液经0.22 µm滤膜过滤后用于HPLC分析，每个处理三次重复。HPLC检测条件为：固定相为C18柱（4.6×250 nm，5 µm，安捷伦）；流动相为甲醇+0.5%乙酸水（体积比为65:35）；流速为1.0 ml/min；柱温为30℃；检测波长为240 nm；进样体积为10 µl。

利用（2）中所述检测条件对该菌株的二氯喹啉酸降解能力进行检测，并通过下列公式求得其二氯喹啉酸降解率：

本发明所述的菌株J7可用于降解二氯喹啉酸。

本发明的优点在于：

本发明通过田间长期使用二氯喹啉酸的土壤中分离筛选获得降解菌株，采用生物法降解烟田残留除草剂二氯喹啉酸不仅能降低药害带给烟草的经济损失，而且也对保护环境，净化土壤有不可小觑的意义。

附图说明

图1 富集法筛选可降解二氯喹啉酸的微生物菌株流程图；

图2 J7菌落形态图：菌落呈淡黄色，表面光滑，圆形，边缘整齐；

图3 标准品二氯喹啉酸（5 mg/L）在MM培养基及甲醇中的色谱图。A 为MM培养基，B为添加菌液的MM培养基，C为添加二氯喹啉酸的MM培养基，D为溶解在甲醇中的二氯喹啉酸；

图4 高效液相色谱法检测二氯喹啉酸的标准曲线；

图5 MM培养基中添加菌株J7培养6d和23d后对二氯喹啉酸的降解率；

图6 土壤中不同浓度二氯喹啉酸对烟苗生长的影响：从左至右依次分别表示未加药的清水对照（ck），添加0.001µg/g、0.01µg/g及0.1µg/g二氯喹啉酸的处理；

图7 土壤中含不同浓度二氯喹啉酸对烟苗生长各指标的影响：叶面积（A）、叶片数（B）、株高（C）的影响；

图8 菌株J7在含二氯喹啉酸的土壤中对烟苗生长的影响：A图从左至右依次分别表示清水对照（ck）、添加菌株J7、添加0.01µg/g二氯喹啉酸、同时添加菌株J7和 0.01µg/g二氯喹啉酸的处理；B图从左至右依次分别表示清水对照（ck）、添加菌株J7、添加0.1µg/g二氯喹啉酸、同时添加菌株J7和 0.1µg/g二氯喹啉酸的处理；

图9 菌株J7在含二氯喹啉酸的土壤中对烟苗各生长指标的影响：横坐标从左至右依次分别表示清水对照（ck）、添加菌株J7、0.01µg/g及0.1µg/g二氯喹啉酸、同时添加菌株J7和0.01及0.1µg/g二氯喹啉酸的处理；A图为以上条件对叶面积的影响，B图为对叶片数的影响，C图为对株高的影响。

具体实施方式

实施例1 菌株J7的筛选

本试验从烟田采集土壤，利用富集法筛选可降解二氯喹啉酸的微生物菌株，过程如图1所示。本试验筛选得到一株可以降解土壤二氯喹啉酸的菌株，将其命名为J7；其筛选过程如下：

（1）二氯喹啉酸降解菌的富集：取0.1g土壤与100 ml MM培养基混合，并加入二氯喹啉酸使其终浓度为100 µg/ml，于30℃，150 r/min培养1周；取培养液1 ml加入100 ml含同样浓度除草剂的新鲜培养基中，同时于固体培养基划线以确认有细菌生长，同样条件培养1周；连续转代培养10次后，经平板划线分离，获得单菌落菌株。该菌为革兰氏阴性菌，菌落呈淡黄色，表面光滑，圆形，边缘整齐；其菌落形态图见图2。

（2）液相色谱测定该菌降解率：将所得菌株分别置于含有5 µg/ml二氯喹啉酸和不含二氯喹啉酸的MM培养基中培养，以不加菌液只含相同浓度二氯喹啉酸的MM培养基为参照，利用高效液相色谱法进行测定；取样时间分别为第6 d和第23 d，样品体积为1 ml；将样品在8000 r/min 条件下离心10 min, 上清液经0.22 µm滤膜过滤后用于HPLC分析，每个处理三次重复。HPLC检测条件为：固定相为C18柱（4.6×250 nm，5 µm，安捷伦）；流动相为甲醇+0.5%乙酸水（体积比为65:35）；流速为1.0 ml/min；柱温为30℃；检测波长为240 nm；进样体积为10 µl。其色谱图见图3，结果表明在该条件下，可以很好的地将二氯喹啉酸的目标峰与杂质分离开。

（3）制作标准曲线：用色谱甲醇配制得到500 µg/ml 二氯喹啉酸标准储备溶液，再用色谱甲醇稀释得到0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0和10.0 µg/ml二氯喹啉酸系列标准工作溶液。将标准溶液分别进样，获得的峰面积与药液浓度作相关图，求相关系数。标准曲线如图4所示，结果表明不同浓度二氯喹啉酸与峰面积间的线性相关系数r为0.9980；表明二氯喹啉酸含量与响应值呈良好的线性关系。

利用（2）中所述检测条件对该菌株的二氯喹啉酸降解能力进行测定，并通过下列公式求得其二氯喹啉酸降解率：

测定结果如图5所示，表明培养6d后，菌株J7对二氯喹啉酸的降解率为4%；培养23d后，菌株J7对二氯喹啉酸的降解率为39%。由此可见菌株J7对土壤中的二氯喹啉酸具有较佳的降解能力。

实施例2 分子鉴定

利用细菌16S rDNA通用引物fD2/ rP1，通过菌落PCR 扩增菌株的16s rDNA测序后进行对比分析鉴定菌株：

fD2：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，

rP1：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’；

PCR反应体系：PCR反应体系为：1×PCR MIX反应液（全式金生物科技有限公司，北京），0.4 μM引物，并利用牙签挑取少量菌落作为模板；

PCR反应程序：95℃预变性4 min后进行32次循环，每次循环包括95℃变性30 s，58℃退火30 s及72℃延伸1 min；最后在72℃再延伸10 min。

PCR产物J7-16S rDNA经琼脂糖凝胶电泳验证后进行DNA回收、测序，测序结果与Genbank数据库进行比对。结果显示，本发明筛选所得菌株J7的序列与Genbank中的泛菌属Pantoea agglomerans（登录号AM184264.1和KC764985.1）同源性达99%。经鉴定，菌株J7为泛菌属(Pantoea sp.)，编号J7，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮政编码：430072；保藏日期为2017年3月16日，保藏编号为CCTCC M 2017131。

实施例3 烟苗实验：菌株J7的防治效果

（1）测定土壤中药液对烟苗产生药害的的浓度：分别配置含有0、0.001、0.01和0.1 µg/g二氯喹啉酸药液的营养土，均匀搅拌后等量装入花盆，移栽入生长情况相似的烟苗，40天后观察烟草生长情况，并测定烟苗株高、叶面积和叶片数等参数。每处理5次重复。结果表明当二氯喹啉酸为0.001µg/g 土壤时，药害不明显；当二氯喹啉酸为0.01µg/g 和0.1µg/g 土壤时，药害明显（图6）。药害主要表现为叶片面积缩小，同时对株高有一定的影响，但是对叶片数无明显抑制作用（图7）。

（2）测定菌株J7在有二氯喹啉酸药害的土壤中对烟苗生长的影响：分别配置含有0.01和0.1 µg/g药液的营养土，均匀搅拌后等量装入花盆。然后添加100 ml新鲜菌液 (OD= 0.2)于土壤中。试验中设置处理包括：清水对照（ck）、添加菌株J7、添加二氯喹啉酸、同时添加菌株J7和二氯喹啉酸的营养土处理，每个处理包括5次重复。7 d后将生长情况相近的烟苗移栽入花盆中，于温室中自然光照下培养40 d，调查不同处理中烟苗的生长情况，并测定烟苗株高、叶面积和叶片数等参数。

烟苗生长情况如图8所示，各生长指标情况如图9所示。图8表明在产生药害的土壤中添加菌液后，发现菌株J7能明显降低药害作用。图9表明，与不加菌液只含药剂的处理相比，J7菌株能显著增大最大叶面积，且对增加叶片数及提高株高度也有一定作用。烟苗试验结果与MM培养基中检测到的降解效果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

中国烟草总公司福建省公司

<120> 一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> fD2

<400> 1

agagtttgat catggctcag 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

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<400> 2

acggttacct tgttacgact t 21

<210> 3

<211> 1408

<212> DNA

<213> J7-16S rDNA

<400> 3

tgcagtcgaa cggtagcaca gagagcttgc tctcgggtga cgagtggcgg acgggtgagt 60

aatgtctggg aaactgcctg atggaggggg ataactactg gaaacggtag ctaataccgc 120

ataacgtcgc aagaccaaag agggggacct tcgggcctct tgccatcaga tgtgcccaga 180

tgggattagc tagtaggtgg ggtaacggct cacctaggcg acgatcccta gctggtctga 240

gaggatgacc agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt 300

ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat gccgcgtgta tgaagaaggc 360

cttcgggttg taaagtactt tcagcgggga ggaaggtgtt gtggttaata accacagcaa 420

ttgacgttac ccgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg 480

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ttgtagaggg gggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tggaggaata 660

ccggtggcga aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc aggtgcgaaa gcgtggggag 720

caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcgactt ggaggttgtg 780

cccttgaggc gtggcttccg gagctaacgc gttaagtcga ccgcctgggg agtacggccg 840

caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 900

attcgatgca acgcgaagaa ccttacctac tcttgacatc cagagaactt agcagagatg 960

cattggtgcc ttcgggaact ctgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt 1020

gaaatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat cctttgttgc cagcggtccg 1080

gccgggaact caaaggagac tgccagtgat aaactggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1140

tcatcatggc ccttacgagt agggctacac acgtgctaca atggcgcata caaagagaag 1200

cgacctcgcg agagcaagcg gacctcataa agtgcgtcgt agtccggatt ggagtctgca 1260

actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtagat cagaatgcta cggtgaatac 1320

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca aaagaagtag 1380

gtagcttaac cttcgggagg gcgctacc 1408

Claims (2)

1.一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株，其特征在于：该菌株为泛菌J7 (Pantoea sp. J7)；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2017年3月16日，保藏编号为CCTCC M 2017131。

2.利用权利要求1所述的一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株在降解二氯喹啉酸中的应用。