CN107177621A - 远红光基因环路表达控制系统进行转基因调控表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种远红光基因环路表达控制系统，包括感受远红光光源的光感受器；处理所述光感受器所传递信号的处理器；及应答所述处理器所传递信号的效应器。本发明还公开了一种基因环路远程调控系统，包括所述远红光基因环路表达控制系统；用于发出远程控制指令的控制装置；以及远红光光源装置。本发明还公开所述远红光基因环路表达控制系统以及所述基因环路远程调控系统在治疗糖尿病中的应用。本发明还公开了含所述远红光基因环路表达控制系统的真核表达载体、工程化细胞或工程化细胞移植载体。本发明可以快速调控基因表达，具有超远程控制、智能调控基因表达量、调控表达倍数高、高度时空特异性、强组织穿透力、绝缘性好以及无毒副作用等特点。

Description

远红光基因环路表达控制系统进行转基因调控表达的方法

技术领域

本发明涉及合成生物学、光遗传学、电子工程等多学科交叉领域，具体涉及一种包括远红光基因环路表达控制系统、包括所述远红光基因环路表达控制系统的基因环路远程调控系统，及其调控方法和应用。

背景技术

合成生物学是以工程学理论为指导,设计和合成各种复杂生物功能模块、系统甚至人工生命体，并应用于特定化学物生产、生物材料制造、基因治疗、组织工程等的一门综合学科。合成生物学经过近十年的飞速发展，已经在多个应用领域取得重大进展。尤其是在哺乳动物细胞合成生物学领域，人们设计、构建了多种可控的基因遗传电路用于诊断和治疗代谢疾病、癌症、免疫系统疾病等。

在合成生物学与疾病治疗领域，人工精确调控基因表达的分子开关在疾病治疗中已经成为一种不可或缺的手段。目前世界上已经有很多通过人工调控诱导基因表达的系统，主要可以分为两大类：(1)通过化学物质来诱导调控基因表达系统；(2)通过物理方法来诱导调控基因表达系统。

化学诱导物主要是一些小分子物质，例如四环素诱导调控基因表达系统[Gossen,M.等.,Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:5547-5551]、乙醛诱导调控基因表达系统[Weber,W.等.,Nat Biotechnol.,2004Nov；22(11):1440-1444]、苯甲酸和香草酸诱导调控基因表达系统[Xie,M.等.,Nucleic Acids Res.2014Aug；42(14):]等。这些系统通常以化学物质为诱导物，有的系统经过多年来的优化获得了非常优异的诱导性能。因而在过去的数年间，化学物质来诱导调控基因表达系统广泛应用于时间上对基因的有效表达调控。但是化学物质来诱导调控基因表达系中涉及的小分子诱导剂存在一些潜在的问题，例如毒性、多效性、非特异性以及组织渗透性差等。而且化学物质来诱导调控基因表达系很难做到在时空上精确调控。

物理方法来诱导的调控系统包括：紫外线诱导调控的“囚笼(cage)”技术[Keyes,WM.等.,Trends Biotechnol.2003Feb；21(2):53-5.]、远红外光控制热激效应诱导调控基因表达系统[Kamei,Y.等.,Nat Methods.2009Jan；6(1):79-81.]、无线电控制温度感应诱导调控基因表达系统[Stanley,SA.等.,Science.2012May4；336(6081):604-8.]等。这些通过物理方法诱导基因表达的系统通常对细胞的毒性很大，可能会对细胞造成不可逆的伤害甚至使细胞死亡，而且这些系统涉及的一些设备装置较昂贵且操作复杂。

光是一种理想的基因表达诱导物，因为它在自然界中普遍存在，容易获得，高度可控，没有毒性，最重要的是，它能够在时间和空间上实现精确调控。因此利用光作为诱导剂来调控基因表达进而调控生命体的各种新陈代谢活动是生物学家们一直在追求的目标。在我们的前期研究工作中，尝试利用合成生物学的方法设计、合成了蓝光调控转基因表达的基因环路，利用蓝光作为开关去激活、调控表达基因[Ye,H.等,Science,2011.332(6037):p.1565-8.]。华东理工大学杨弋教授课题组报道了LightOn蓝光调控基因表达开关[Wang,X.等,Nat Methods,2012.9(3):p.266-9.]。然而蓝光用于调控体内基因表达有很大的局限性——蓝光透皮效率低，不易透过皮肤或腹腔去激活靶基因，极大地限制了光调控系统的深层次开发与临床应用。德国弗莱堡大学的Wilfired Weber教授课题组开发了红光调控的转基因表达控制开关[Müller K.等,Nucleic Acids Res,2013,41(7):e77.Nat Protoc,2014,9(3):622-32]，但是这个红光控制系统并未体现出较好的基因表达强度，也没有任何实验数据表明该红光控制开关在动物模型鼠体内调控基因表达的效果。更重要的是，该红光控制开关需要额外添加一种光敏色素藻蓝素(Phycocyanobilin)才能激活基因表达。而且这种色素来源极不方便，无法通过商业购买获得，需在实验室人工合成，合成步骤复杂，合成产物不稳定且产量极低。这些不利因素都极大地限制了该红光控制系统的进一步应用。

糖尿病是当前威胁全球人类健康的最重要的慢性流行性疾病之一。糖尿病是一种影响人类健康的慢性终身性疾病，患者发病后主要以血糖升高等为主，并且随着病情的加重，将会累及身体各个重要脏器及全身组织，引发多种并发症，不能彻底治愈，只能控制。近几十年，全球糖尿病患者数以惊人的速度增长。一项多国联合研究显示，1980-2008年，全球糖尿病人数由1.53亿人增至3.47亿人。中华医学会糖尿病学分会组织覆盖全国14个省市的糖尿病流行病学调查数据显示，我国成人糖尿病患病人数已达9240万，发病率9.7％。随着人们生活水平的提高，生活方式的改变，肥胖和超重的比例逐年增加，使糖尿病“后备役部队”源源不断。1型糖尿病是一种慢性自身免疫疾病，是由于胰腺中分泌胰岛素的胰岛β细胞遭到自身反应性T细胞的靶向性破坏，导致胰岛素分泌减少，从而使机体丧失调节血糖的能力，进而影响机体新陈代谢，患者通常需要终身接受胰岛素治疗。2型糖尿病特有的标志是异常的糖平衡，这种异常的平衡也是由胰岛素缺乏引起的，而胰岛素缺乏源于胰岛β细胞功能失活或者胰岛素抗性，也就是胰岛素作用的靶器官、组织对其生物学效应的反应性降低或丧失，机体需要分泌更多的胰岛素来代偿这种缺陷。这样经常导致其他严重的有生命危险的第二并发症，如心血管疾病，肾衰竭和视网膜病变。但是迄今为止，糖尿病尚无法根治且需终身给药。糖尿病患者需每天口服降血糖药物或注射胰岛素来维持血糖稳定，尤其是注射胰岛素无法达到可控地释放胰岛素，极易造成低血糖风险。

发明内容

为克服现有技术存在的问题，本发明首次提出了一种新的远红光基因环路表达控制系统、以及一种包括所述远红光基因环路表达控制系统、控制装置和远红光光源装置的基因环路远程调控系统。本发明中，远红光透皮效率远远优于蓝光，可透过皮肤、肌肉组织7-8厘米，可以实现远程、无痕迹地调控移植在腹腔内的靶细胞表达目的基因，甚至可调控体内特定组织器官表达靶基因。远红光的光子能量要比蓝光光子能量低很多，对细胞产生的毒副作用要远远小于蓝光。且，本发明远红光控制系统不需要额外添加任何光敏色素就可被远红光直接激活。本发明系统及远红光控制开关具有极大潜在应用价值，可广泛推广于临床应用。

本发明提出了一种人工设计、合成的基于智能手机平台超远程调控转基因表达的基因环路控制系统。该系统由智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统和远红光调控转基因表达的基因环路控制系统两部分组成。本发明提供智能手机控制远红光光源的智能控制系统、包含智能手机调控转基因表达系统的真核表达载体、在宿主细胞内智能手机调控转基因表达方法以及将其移植到小鼠体内智能手机调控转基因表达的方法。本发明提供了上述智能手机调控转基因表达系统各组分的试剂盒。本发明还提供了一种基于智能手机平台超远程调控的新型糖尿病疗法。本发明可以快速调控基因表达，具有超远程控制、智能调控基因表达量、调控表达倍数高、高度时空特异性、强组织穿透力、绝缘性好以及无毒副作用等特点。

本发明提出的远红光基因环路表达控制系统，其包括：感受远红光光源的光感受器；处理所述光感受器所传递信号的处理器；应答所述处理器所传递信号的效应器。

其中，所述光感受器包括光敏二鸟苷酸环化酶Bphs，其在远红光条件下将GTP转变为c-di-GMP。其中，所述光敏二鸟苷酸环化酶Bphs为最关键蛋白之一，作为核心部件。

其中，所述光感受器光敏二鸟苷酸环化酶Bphs是由BphG蛋白的第1-511位氨基酸和Slr1143蛋白的第175-343位氨基酸融合，并且将融合蛋白的587位精氨酸突变为丙氨酸(R587A)制备得到；其中，所述编码BphG蛋白基因可通过人工化学合成，也可以来自于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)中；所述Slr1143蛋白可以来自于集胞藻(Synechocystis sp.)，也可以人工化学合成，本发明所采用的编码Slr1143蛋白的基因由人工化学合成。

其中，所述光感受器的构建形式包括：

a)人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶Bphs编码基因(Bphs)；

b)人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶Bphs编码基因通过2A序列与c-di-GMP降解酶YhjH编码基因相连(Bphs-2A-YhjH)；

c)人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶Bphs编码基因通过2A序列与光敏色素合成酶Bpho编码基因相连(Bphs-2A-Bpho)；

d)人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶Bphs编码基因通过2A序列与光敏色素合成酶Bpho编码基因相连，再通过2A序列与c-di-GMP降解酶YhjH编码基因相连(Bphs-2A-Bpho-2A-YhjH)；

其中，所述2A序列可以被内部核糖体进入位点序列IRES替代；所述光敏色素合成酶Bpho具有合成光敏色素胆绿素(biliverdin)的功能；所述c-di-GMP的降解酶YhjH具有将c-di-GMP降解为pGpG的功能。

其中，所述Bphs、Bpho、YhjH的氨基酸序列选自序列45、46、48。

其中，所述表达光感受器的启动子包括：a)SV40；b)CMV；c)hEF1α；d)mPGK；e)CAG。

其中，所述处理器包括：作为DNA结合域和c-di-GMP结合域的多肽、作为核定位信号NLS的多肽、作为连接域的多肽、以及作为转录调控域的多肽。

其中，所述作为DNA结合域和c-di-GMP结合域的多肽，其为与c-di-GMP结合后，能与特定的DNA序列结合的蛋白，例如BldD蛋白，该BldD蛋白可以是来自委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)中的BldD蛋白，也可以人工合成，其氨基酸序列选自序列49，本发明的BldD蛋白由人工合成。

其中，所述作为核定位信号NLS的多肽，其可以为1-3拷贝多种形式，其氨基酸序列为选自序列54。

其中，所述作为连接功能域(Linker)的多肽，其长度可以从0-30个氨基酸多种形式，其氨基酸序列选自序列55。

其中，所述作为转录调控域的多肽，其为一切具有转录激活功能的结构域蛋白，包括NF-ΚB p65亚基转录激活结构域、热休克转录因子HSF1转录激活域、单纯疱疹病毒颗粒蛋白VP16转录激活结构域以及其4拷贝的转录激活结构域VP64；其氨基酸序列选自序列50、51、52、53。

其中，所述作为转录调控域的多肽置于所述DNA结合域和c-di-GMP结合域的多肽BldD的N端或C端。

其中，所述处理器中不同功能域的多肽之间可直接连接或通过连接肽连接。

其中，所述效应器包括P_FRL-reporter；所述效应器包括启动子序列和待转录蛋白的核酸序列。

其中，所述启动子序列包含处理器BldD蛋白结合的DNA序列和启动基因表达的弱启动子。

其中，所述处理器BldD蛋白结合的DNA序列，其为DNA结合域和c-di-GMP结合域的多肽特异性识别并结合的DNA序列，可以为来自委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae)bldM和whiG启动子区域的部分序列，也可以人工化学合成，本发明的BldD特异性识别并结合的DNA序列bldM和whiG启动子部分序列由人工化学合成。

其中，所述bldM的核苷酸序列选自序列18；所述whiG的核苷酸序列选自序列19。

其中，所述bldM和whiG启动子区域的部分序列，其为1-10拷贝。

其中，所述启动基因表达的弱启动子包括所有的弱启动子，其包括TATA box、巨细胞病毒CMV最小启动子及其突变体CMVmin 3G。

其中，所述启动子序列的核酸序列选自序列20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39。

其中，所述待转录核酸序列编码表达的蛋白可以为一切有意义的蛋白，包括作为报告基因的蛋白和/或作为治疗疾病的药物蛋白或小肽的核酸序列；其中，所述作为报告基因的蛋白包括分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP、EYFP)、荧光素酶(Luciferase)的核酸序列；作为治疗疾病的药物蛋白或小肽包括胰岛素(Insulin)、胰高血糖素样肽(GLP-1)的核酸序列。

其中，所述一切有意义的蛋白可通过2A序列在一个表达载体上同时表达多个蛋白，包括SEAP-2A-Insulin、EGFP-2A-Insulin、EGFP-SEAP-2A-Insulin；其中，所述2A序列可以被内部核糖体进入位点序列IRES替代。

在一具体实施方案中，本发明远红光基因环路表达控制系统包括：感受远红光的光感受器Bphs；处理光感受器所传递信号的处理器P65-VP64-BldD；应答处理器所传递信号的效应器P_FRL-reporter。

本发明远红光基因环路表达控制系统，其三部分可由三种质粒装载。

其一，载有感受远红光的光感受器表达载体质粒，所述光感受器包含Bphs、Bpho、YhjH和2A。

其中Bphs是由BphG的第1-511位氨基酸和Slr1143的第175-343位氨基酸融合，并且将该融合蛋白的第587位氨基酸精氨酸突变为丙氨酸(R587A)得来；所述编码BphG的基因可以来自于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，也可以通过人工化学合成，本发明所采用的编码BphG蛋白基因由人工化学合成；所述编码Slr1143蛋白基因可以来自于集胞藻(Synechocystis sp.)，也可以通过人工化学合成，本发明所采用的Slr1143蛋白基因片段由人工化学合成。Bphs的第1-511位氨基酸为PAS-GAF-PHY结构域，能够感受远红光；第512-680位氨基酸为DGC结构域，活化后能将GTP转变成c-di-GMP。该光受体可以为来自其他菌属的具有相同功能域的蛋白，如BphG等[Ryu M H.等,ACS synthetic biology,2014,3(11):802-810.]，也可以通过人工化学合成BphG等。

Bpho是存在于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)中的血红氧化酶，其编码基因也可以通过人工化学合成，其能够合成光敏色素胆绿素(biliverdin)，为Bphs合成c-di-GMP提供光敏色素[Ryu M H.等,ACS synthetic biology,2014,3(11):802-810.]。

YhjH来自于大肠杆菌(E.coli.)，其基因可以通过人工化学合成，其具有将c-di-GMP降解为pGpG的功能[Ryu M H.等,ACS synthetic biology,2014,3(11):802-810.]，其降解酶还可以为其他一切具有将c-di-GMP降解为pGpG的功能的蛋白。

2A为同一启动子表达两个不同的蛋白的氨基酸序列，可以有T2A，F2A，

P2A等[Doronina VA等，Molecular and cellular biology,2008,28(13):4227‐4239]。其中所用2A序列可以被内部核糖体进入位点序列IRES替代。

当哺乳类动物细胞内表达Bphs、Bpho和YhjH时，在远红光照射及光敏色素胆绿素的作用下，Bphs能感知远红光将GTP合成c-di-GMP。当光照强度或光照时间不同时，其能合成不同的量的c-di-GMP，并且光照强度或光照时间在一定范围内与产生c-di-GMP的量呈正相关。当不需要c-di-GMP时，其能被YhjH降解。

其二，载有处理光感受器所传递信号的处理器质粒。该处理器由作为DNA结合域和c-di-GMP结合域的多肽BldD，作为入核信号域的多肽NLS，作为连接域的多肽Linker以及作为转录激活域的多肽P65、VP64、VP16和HSF1等组成。其中BldD蛋白可以来自于委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)[Tschowri N.等,Cell,2014,158(5):1136-1147.]，也可以通过人工化学合成，本发明的编码BldD蛋白基因为人工化学合成，VP16为单纯疱疹病毒颗粒蛋白转录激活结构域、p65为NF-ΚB p65亚基转录激活结构域、HSF1为热休克转录因子转录激活域[Konermann S.等,Nature.2015Jan 29；517(7536):583-8.]。

NLS可以为1-3拷贝等，其直接连于BldD的N端，P65、VP64、HSF1等作为转录激活域则可以分别或两两组合或三者串联连于BldD的N端或C端，其各组分之间则以作为连接功能的多肽Linker(0-30个氨基酸不等)相连。具体构建有可以有以下几种形式：NLS-BldD-VP16、VP64-Linker-NLS-BldD、VP64-Linker-NLS-BldD-Linker-VP64、NLS-BldD-Linker-VP64、P65-Linker-VP64-Linker-NLS-BldD、P65-HSF1-Linker-NLS-BldD、NLS-BldD-Linker-P65-HSF1和VP64-NLS-BldD-Linker-P65-HSF1等。

该处理器在c-di-GMP不存在时，其不能与效应器中的特异性序列识别、结合；当c-di-GMP存在并形成四聚体时，该两分子处理器能与c-di-GMP的四聚体结合，形成一个六聚体复合物[Tschowri N.等,Cell,2014,158(5):1136-1147.]，并能与效应器中的DNA序列识别并结合。

其三，载有效应器的质粒。该效应器由绝缘信号、启动子序列和待转录核酸序列组成。

其中，绝缘信号可以为猿猴空泡病毒PolyA(SV40 PolyA)、牛生长素基因PolyA(BGH polyA)等，具有阻断上游启动子影响的功能。启动子序列由BldD结合的DNA序列和启动基因表达的弱启动子序列组成。BldD结合的DNA序列为来自委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae)bldM和whiG启动子区域的部分序列，，1重复到10重复等多种野生型或突变形式，其特点是能被上游处理器BldD所特异性识别并结合的序列，所述bldM和whiG启动子区域的部分序列也可以人工化学合成。

启动基因表达的弱启动子，其包含TATA box、巨细胞病毒CMV最小启动子及突变体(CMV_min3G)，在上游处理器不存在时，其不表达或几乎不表达下游待转录的核酸序列。

待转录核酸序列可以为任何一种有意义的蛋白，其可以为报告基因分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP、EYFP)、荧光素酶(Luciferase)等；也可以为治疗疾病的功能型蛋白，如胰岛素(Insulin)、胰高血糖素样肽(GLP-1)等。不同的所需要的蛋白还可以用2A相连，实现一个启动子同时表达多个蛋白。如SEAP-2A-Insulin、EGFP-2A-Insulin、EGFP-2A-SEAP-2A-Insulin等。

当c-di-GMP存在时，其形成的四聚体与两分子处理器形成六聚体，识别效应器中的特异性序列并结合，招募转录因子开始转录表达下游基因。当c-di-GMP不存在时，处理器无法结合到效应器上，则无法开启基因的转录表达。

本发明另一目的是提供一种新型的基因环路远程调控系统。随着移动互联网技术的快速发展，手机远程控制在各种设备应用中引发一场变革，市场前景巨大。手机超远程控制系统整合了硬件资源和互联网云端平台，可以将硬件设备通过局域网WiFi接入物联网云端，通过手机APP软件便捷地超远程控制设备，甚至是跨洲际的控制。本发明将手机的超远程智能控制系统与所述远红光基因环路表达控制系统相结合，提出基于智能手机平台超远程调控基因表达的基因环路远程控制系统。

本发明基因环路远程调控系统包括：所述远红光基因环路表达控制系统、用于发出远程控制指令的控制装置、以及远红光光源装置；其中，所述控制装置通过发出控制指令远程调控所述远红光光源装置，通过所述远红光光源装置发出的远红光调控所述远红光基因环路表达控制系统，实现调控转基因表达。

其中，所述控制装置通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络发送远程控制指令来调控所述远红光光源装置的不同工作状态。

其中，所述不同工作状态包括所述远红光光源的开启或关闭、可按需要调节的光照强度、光照时间或照射方法。

其中，所述光照强度为0-5mW/cm²；所述照射时间为0-72h；所述照射方法包括脉冲式照射、连续照射、直接照射或用镂空刻画的投影卡片在空间上控制不同位置的细胞的基因表达水平的照射。

其中，所述控制装置包括智能手机App和/或智能远程控制器。所述智能远程控制器包括所有具有远程控制功能的控制器，其包括单路输出和/或多路输出的智能远程控制器。

在具体实施方案中，本发明基于智能手机平台超远程基因环路远程调控系统，包括：智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制装置、远红光光源装置、以及远红光调控转基因表达的基因环路远程调控系统。其中，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制装置，包括智能手机App和/或智能远程控制器。

其一，智能手机App客户端。智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统是通过智能手机上的APP客户端输入指令完成对远红光光源的控制，其可通过局域网WiFi或者手机移动数据，经云端服务器将指令传送至智能远程控制器。具有输入超远程选择何种远红光光源及其开或关的工作状态、超远程调控远红光光源工作强度、工作时间等指令的功能，从而实现对目的基因调控式诱导表达。该App可以安装与任何一台智能手机，适用于安卓、iOS等操作系统。

其二，具有多路输出功能的远程智能控制器。智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统是经过智能远程控制器接收由手机发送至云端服务器的信号并执行对远红光光源的控制。其控制的条件可以为：a)超远程控制，智能远程控制器接收手机发送至云端服务器的信号可以实现超远程控制，通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络，无论控制对象和被控制对象在不同的城市、国家甚至不同的洲际都可以实现超远程控制；b)该设备支持多路控制，每路可独立控制，多路输出开关电源实现。控制效果实时推送至手机APP客户端，实现控制远红光光源产生不同的光照强度，从而实现智能手机远程调控基因的不同表达量；c)该设备支持定时开关，实现定时开关和一键开关功能，实现控制远红光光源产生不同的光照时间，从而实现智能手机远程调控基因的不同表达量。

其中，所述远红光光源装置为能产生波长为600-900nm远红光的光源装置。

其中，所述远红光光源装置能产生600-900nm波长远红光的光源，可以为600-900nm LED、红外线治疗器、激光灯等。在一具体实施方案中，本发明中体外实验采用720nm的远红光LED，实现智能手机超远程控制、不同光照时间调控基因表达以及不同光照强度调控基因表达等。体内实验则是通过控制红光理疗仪或720nmLED体内移植，经无线电供电实现智能手机超远程控制、不同光照时间调控基因表达以及不同光照强度调控基因表达等。智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统控制远红光光源有三种方式可以实现，其为：手机和远红光光源接入同一局域网WiFi，手机通过其接入的局域网WiFi超远程控制远红光光源；或手机通过2G/3G/4G网络超远程控制远红光光源以及紧急情况下手动按键控制远红光光源。

在具体实施方案中，本发明基于智能手机平台、遥控器等控制通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控基因表达的基因环路远程调控系统，其中，远红光光源装置由指令接收装置及光源构成，由手机、遥控器等控制远红光光源，产生不同强度、光照时间、照射方式的远红光诱导表达所述远红光基因环路表达控制系统，如图2(a)所示。当在哺乳类动物细胞载体内表达远红光光感受器、处理器、效应器，在没有远红光诱导时，光感受器中的Bphs不被激活，无c-di-GMP合成，从而无法使处理器结合到远红光诱导启动的启动子(P_FRL)，则无法驱动下游目的基因表达。当远红光诱导时，光感受器中的Bphs被激活，合成c-di-GMP，使处理器结合到远红光诱导启动的启动子(P_FRL)，招募转录因子开始转录翻译，驱动下游目的基因表达，如图2(b)所示。

本发明还提出了含有所述远红光基因环路表达控制系统的的真核表达载体、工程化细胞或工程化细胞移植载体。

本发明还提出了制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的的真核表达载体、工程化细胞或工程化细胞移植载体的方法。

所述真核表达载体包括含有所述远红光基因环路表达控制系统的哺乳类动物细胞表达载体。所述表达载体可以是单独含有远红光光感受器编码基因的载体或单独含有处理器编码基因的载体或单独含有效应器编码基因的载体，所述的效应器含有远红光响应的启动子，但不含有待转录核酸序列。或者，也可以是含有其中两种或三种都含有的表达载体。前述所有的哺乳类动物细胞表达载体的构建方式详见表1。

本发明还提出了含有所述远红光基因环路表达控制系统的的真核表达载体在制备治疗糖尿病药物中的应用。

本发明另一目的在于，提出了利用所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统在宿主细胞中调控基因表达的方法。所述方法包括以下步骤：a)将所述远红光基因环路表达控制系统构建在真核质粒表达载体中；b)经转染导入所述宿主细胞中；c)通过调控或远程调控远红光照射条件来诱导调控所述宿主细胞，实现所述效应器编码基因表达。其中，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞。

在具体实施方案中，本发明利用所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统在哺乳类动物细胞中调控基因的表达方法，包括如下步骤：

a)将所述智能手机平台通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控基因表达的远红光基因环路表达控制系统构建在哺乳类动物细胞表达载体中；

b)将质粒导入哺乳动物细胞中；

c)由智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超调控一定远红光照射条件诱导调控所述哺乳动物细胞，使所述哺乳动物细胞中的效应器P_FRL-reporter编码基因(如SEAP、EGFP、Luciferase、Insulin、GLP-1等)表达。

d)分别在24h、48h、72h三个时间点检测目的基因的表达情况

本发明中质粒构建方法参照材料方法以及表1。将质粒导入哺乳动物细胞中的方法包括：磷酸钙转染、PEI转染、脂质体转染电穿孔转染，病毒感染等。

其中，由智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控一定远红光照射条件，包括光源的选择和照射强度、时间和照射方法的选择。其中光源包括LED灯、远红光理疗仪等；照射强度，其为0-5mW/cm²等；照射时间，其为0-72h等，可以为连续照射或不连续照射等；照射方法，包括直接照射和用镂空刻画的投影卡片在空间上控制不同位置的细胞的基因表达水平。

本发明还提出了利用所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统在移植载体中进行转基因调控表达的方法。

所述方法包括步骤：a)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的真核质粒表达载体；b)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的工程化细胞；c)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的工程化细胞移植载体；d)通过远程调控远红光光源对工程化细胞移植载体进行诱导表达，使所述移植载体中的效应器P_FRL-reporter编码基因(如SEAP、EGFP、Luciferase、Insulin、GLP-1等)表达。e)分别在24h、48h、72h三个时间点检测目的基因的表达情况。

在具体实施方案中，本发明利用所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统在工程化细胞移植载体中调控基因的表达方法，包括如下步骤：

a)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的真核质粒表达载体；

b)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的工程化细胞；

c)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的工程化细胞移植载体；

d)通过远程调控远红光光源对含有工程化细胞的移植载体进行诱导表达，使所述移植载体中的效应器P_FRL-reporter编码基因(如SEAP、EGFP、Luciferase、Insulin、GLP-1等)表达；

e)分别在24h、48h、72h三个时间点检测目的基因的表达情况。

所述的构建真核表达载体的方法详见表1；所述工程化细胞的方法包括磷酸钙转染、PEI转染、脂质体转染电穿孔转染、或病毒感染；所述工程化细胞移植载体的制备方法包括：制备微胶囊、制备海藻酸钠胶块皮、制备中空纤维膜移植管。

其中，由智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控一定远红光照射条件，包括光源的选择和照射强度、时间和照射方法的选择。其中光源包括LED灯、远红光理疗仪等；照射强度，其为0-5mW/cm²等；照射时间，其为0-72h等，且照射时间大于0h，可以为连续照射或不连续照射等。

本发明还提供将所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统移植载体植入小鼠体内的方法，以及所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统在小鼠体内进行转基因调控表达的方法，包括：

a)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的真核质粒表达载体；b)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的工程化细胞；c)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统的移植载体；d)将含有所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统的移植载体植入小鼠体内；e)通过远程调控远红光光源对含有工程化细胞的移植载体进行诱导表达，使所述移植载体中的效应器P_FRL-reporter编码基因(如SEAP、EGFP、Luciferase、Insulin、GLP-1等)表达；f)分别在24h、48h、72h三个时间点检测目的基因的表达情况。

在具体实施方案中，将含有上述远红光基因环路表达控制系统的工程化细胞移植载体移植到小鼠体内进行远红光诱导表达，步骤如下：

a)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的真核质粒表达载体；

b)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的工程化细胞；

c)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统的移植载体；

d)将含有所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统的移植载体植入小鼠体内；

e)通过远程调控远红光光源对含有工程化细胞的移植载体进行诱导表达，使所述移植载体中的效应器P_FRL-reporter编码基因(如SEAP、EGFP、Luciferase、Insulin、GLP-1等)表达；

f)分别在24h、48h、72h三个时间点检测目的基因的表达情况。

其中制备移植载体的方法有制备微胶囊、制备海藻酸钠胶块皮、制备中空纤维膜移植管；移植方法可以为腹腔移植或皮下移植等；

在小鼠体内调控基因表达的方法包括光源的选择和光源的控制。光源包括LED灯、理疗仪、激光灯。光照方法包括光照时间、光照强度、光照频率的选定。

本发明还提出了含有所述远红光基因环路表达控制系统的的真核表达载体在制备治疗糖尿病药物中的应用。

本发明还提出利用所述远红光基因环路表达控制系统或所述基因环路远程调控系统在制备糖尿病治疗药物中的应用。所述糖尿病包括I型糖尿病和/或II型糖尿病。本发明系统提供一种安全、可靠、在时空上可精确调控释放胰岛素和胰高血糖素样肽治疗糖尿病的新策略。本发明提供了治疗糖尿病的新方法、新策略。所述系统可调控胰岛素和/或胰高血糖素样肽GLP-1的表达。所述胰岛素的表达构建包括SEAP-2A-Insulin、EGFP-2A-Insulin、EGFP-2A-SEAP-2A-Insulin。所述胰高血糖素样肽GLP-1的表达包括GLP-1-Fc等。

本发明还提出了一种试剂盒，其含有所述远红光基因环路表达控制系统或含有所述基因环路远程调控系统。本发明还提出了一种试剂盒，其装有含有所述远红光基因环路表达控制系统的真核表达载体或/和转染了含有所述真核表达载体的宿主细胞及相应的说明书。

所述试剂盒，包括智能手机平台超远程调控所述远红光基因环路表达控制系统各组分质粒试剂盒、含有智能手机平台超远程调控所述远红光基因环路表达控制系统的哺乳类动物细胞试剂盒。包括装有所述智能手机平台通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控所述远红光基因环路表达控制系统各组分质粒试剂盒和含有智能手机平台通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控所述远红光基因环路表达控制系统的哺乳类动物细胞试剂盒以及相应的说明书。

附图说明

图1为本发明远程控制远红光基因环路表达控制系统在哺乳类动物细胞中的原理图示意图。

图2中：图2A为本发明控制装置通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制远红光光源装置示意图；图2B为本发明远红光调控转基因表达的远红光基因环路表达控制系统在哺乳类动物细胞中的原理图。

图3为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的基因环路表达控制系统的APP示意图。

图4为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统的智能控制器的示意图及实物图。

图5为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统的多路输出开关电源的示意图及实物图。

图6为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统的具有多路输出功能的超远程智能控制器的系统接线图。

图7为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统的具有多路输出功能的超远程智能控制器的实物图。

图8为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统的24个远红外LED电路设计图。

图9为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统的24个远红外LED电路布局图。

图10为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统的24个远红外LED电路实物图。

图11为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络控制远红光光源的智能控制系统的整体系统示意图。

图12为本发明红光诱导光感受器pWS189在哺乳动物细胞内产生c-di-GMP的实验结果图。

图13为证明本发明远红光基因环路表达控制系统组成部件的实验结果图。

图14为本发明远红光基因环路表达控制系统不同构建的光感受器的实验结果图。

图15为本发明远红光基因环路表达控制系统不同启动子表达的光感受器的实验结果图。

图16为本发明远红光基因环路表达控制系统不同构建的处理器的实验结果图。

图17、图18为本发明远红光基因环路表达控制系统不同构建的效应器中的不同的处理器识别位点及识别位点的不同重复数的实验结果图。

图19为本发明远红光基因环路表达控制系统不同构建的效应器中的在含有不同重复数的处理器识别位点前添加绝缘信号的实验结果图。

图20为本发明远红光基因环路表达控制系统不同构建的效应器中的不同种类的弱启动子的实验结果图。

图21为本发明远红光基因环路表达控制系统在不同的哺乳类动物细胞中表达的实验结果图。

图22为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程设定不同的光照时间调控远远红光基因环路表达控制系统不同的表达量的实验结果图。

图23为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程设定不同的光照强度调控远红光基因环路表达控制系统不同的表达量的实验结果图。

图24、25、26和27为本发明以表达SEAP、Luciferase、EGFP、GLP1为例证明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统可以表达一切有意义的蛋白的实验结果。

图28和附图29为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统可以同时表达两个或多个一切有意义的蛋白的实验结果图。

图30为本发明制备含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超调控远红光基因环路表达控制系统工程化细胞的微胶囊移植载体的实验结果图。

图31为本发明含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统工程化细胞在微胶囊中受远红光调控表达的实验结果图。

图32为本发明制备含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统工程化细胞的中空纤维膜移植管移植载体的实验结果图。

图33为本发明含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统工程化细胞在中空纤维膜移植管中受远红光调控表达的实验结果图。

图34、图35为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统在小鼠体受远红光调控表达的情况的实验结果图。

图36为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统在一型糖尿模型鼠内精确调控胰岛素表达治疗Ⅰ型糖尿病的空腹血糖值。

图37为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统在一型糖尿模型鼠内精确调控胰岛素表达治疗Ⅰ型糖尿病的糖耐受实验结果。

图38为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统在一型糖尿模型鼠内精确调控GLP-1表达治疗Ⅱ型糖尿病的空腹血糖值。

图39为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统在一型糖尿模型鼠内精确调控GLP-1表达治疗Ⅱ型糖尿病的糖耐受实验结果。

图40为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统在一型糖尿模型鼠内精确调控GLP-1表达治疗Ⅱ型糖尿病的胰岛素耐受实验结果。

图41为本发明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控远红光基因环路表达控制系统在一型糖尿模型鼠内精确调控GLP-1表达治疗Ⅱ型糖尿病所表达胰高血糖素的量。

具体实施方式

以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅用于举例说明发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本发明的实施过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公认常识，本发明没有特别限制内容。以下实施例中所用的试剂、仪器等，以及未注明具体条件的实验方法，按照常规或商品供货商所建议的条件进行。

材料与方法

智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制远红光光源的智能控制系统的制作

智能控制器

制作所用的智能控制器购自智能家居工作室，其参数及功能如下所示：

1.支持手机远程控制，支持WiFi，2G/3G/4G控制模式；

2.最大允许10A大电流，支持多路控制，每路可独立控制，控制效果实时推送至手机App客户端；

3.支持定时开关、场景模式，实现定时开关和一键开关功能；

4.支持安卓、苹果手机及平板；软件支持自定义属性；

5.同一款软件支持多个设备、多个开关；

6.支持数据备份和数据恢复；支持扫描二维码导入设备，也可与其他人员分享设备，操作方便捷。

多路输出开关电源

所用的多路输出开关电源购自云粒方电子工作室，其参数及功能如下所示：

1.输入电压:5～23V，最高23V，建议20V内使用,输入防接反(输入的电压须比输出电压高1V以上)

2.可调输出电压范围0V～16.5V连续可调，自动保存上次设定电压。

3.峰值电流3A，建议在2A内使用。精度1％，最小显示0.01，单位是A，超过2A发热较大，请自行想办法解决散热问题。

4.转换效率高，可达95％(效率与输入、输出电压、电流、压差有关)

5.负载调整率S(I)≤0.8％，电压调整率S(u)≤0.8％

6.尺寸62mm×44mm×18mm

7.重量45g

远红外LED灯

所使用的远红外LED灯珠购自百光光电，远红外LED灯电路板设计由微电子工程师白郁完成，加工由深圳捷多帮科技有限公司完成。其他材料均为普通国产材料。

1.输入电压：1.5V～4.8V，最高6V使用；

2.6路不同的电压可以随意切换；

3.带有独立的开关，设置有整体调节亮度的电位器(正常情况下不建议用)；

4.二极管可以独立拆卸；

分子克隆

本发明所有表达质粒的构建试剂、具体构建体系及步骤如下所示。

所有用于PCR的引物均由金唯智生物科技有限公司合成。本发明实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由金唯智生物科技有限公司完成。本发明实施例中所用的Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司。核酸内切酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司。同源重组酶购自和元生物技术(上海)股份有限公司。Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶购买时附带有相应的聚合酶缓冲液和dNTP。核酸内切酶、T4DNA连接酶、同源重组酶购买时附带有相应的缓冲液。酵母提取物(YeastExtract)、胰蛋白胨(Trypton)、琼脂粉、氨苄青酶素(Amp)购自上海生工生物工程技术有限公司。DNA Marker DL5000、DNAMarker DL2000(宝生物工程有限公司)；核酸染料EB(广东国奥生物技术公司)；质粒小抽提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自康为世纪生物科技有限公司；实施例中提及的无水乙醇、NaCl等其余试剂均为国产分析纯产品。

(一)聚合酶链式反应(PCR)

扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)。

(二)核酸内切酶酶切反应

1.对质粒载体进行双酶切的体系(x是代表质粒质量为1μg时的体积；n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μL量)

2.对PCR产物片段进行双酶切的体系(x是代表质粒质量为1μg时的体积；n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μL量)

3.将双酶切后PCR产物片段连接入双酶切后的质粒载体成环装质粒的体系：

注:PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2:1-6:1之间。

(三)同源重组连接反应

按照和元生物技术(上海)股份有限公司无缝克隆(组装)试剂盒说明书：PCR产物片段扩增时在两侧加入了15bp与线性化载体两侧的15bp核酸序列同源的核苷酸序列，扩增得到的PCR产物两侧15bp核酸序列与线性化载体序列两侧核苷酸序列同源，在同源重组酶的作用下，PCR产物片段与线性化载体同源重组连接成环状。

注:n值视PCR产物片段的大小、浓度而定。

(四)大肠杆菌感受态细胞的制备

所有用于感受态细胞制备的溶液和耗材均经过高温高压灭菌处理。

1.将大肠杆菌DH5α菌株菌种划线于不含抗生素的平板上，37℃下倒置培养12～16h；

挑取一个单菌落于2mL不含任何抗生素的LB摇菌管中，37℃180rpm振荡培养过夜；

2.吸取1mL菌液转入250mL三角瓶LB培养基中进行扩大培养(按1:100比例扩大培养)，37℃下180rpm摇床振荡培养2～3h至OD600在0.4～0.5之间；

3.将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000rpm离心10min(离心机需要提前预冷)，小心的弃去上清；

4.加入预冷的0.1M CaCl₂ 4mL(0.1M CaCl₂应提前预冷)，充分预冷后用旋涡混合器快速悬浮菌体，然后再冰浴10min，将两管合并1管；

5.4℃，4000rpm离心6min；

6.弃上清，加入4mL冰冷的0.1M CaCl₂和0.1mL预冷灭菌纯甘油，悬浮沉淀；

7.将上述悬浮液以100μL/管分装于PCR管中(PCR管最好提前置于冰上预冷)，液氮中保存备用；

(五)连接产物转化至大肠杆菌中

1.将制备好的感受态细胞解冻(冰上解冻)，加入适当体积的连接产物混匀后，冰浴30min。通常加入连接产物的体积小于感受态细胞体积的1/10；

2.42℃水浴中热激90s，然后迅速冰上放置5min；

3.将菌液加入到800μL LB液体培养基(无抗生素)中，混匀后于37℃振荡培养40-60min；

4.将菌液转至1.5mL的离心管中，4000rpm离心5min，弃部分上清，留100μL左右上清，再将细胞吹散成细胞悬液；

5.将上述悬液涂布在含有Amp的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱中过夜培养；

其余实验操作，例如DNA片段的胶回收、纯化回收，其步骤根据DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)的操作说明书；质粒提取步骤根据质粒小抽(天根生化科技(北京)有限公司)提取试剂盒说明书。

光源的选择与制作

本发明实施例中用以720nm波长的LED(L720-__AU,epitex,Japan)和红外线治疗器(CQ-61,中国重庆航天火箭电子技术有限公司)为例说明本发明基因环路远程调控系统的调控方法，但不限制本发明发明保护范围。

实验所用的LED均购日本epitex公司；红外线治疗器购自中国重庆航天火箭电子技术有限公司。其余配件均为国产常规耗材。

720nm波长的LED，为提供小功率的远红光发射器。4×6LED板，其连接方式为：根据细胞培养板(24孔)的排列，使每个LED对应每孔的中心位置，每个LED之间以并联方式相连。根据实验需要调整光照时间，光照强度进行实验。

红外线治疗器，为提供大功率的远红光发射器。根据实验需要调整光照时间，光照强度进行实验。

细胞培养与转染

本发明实施例中用以下细胞系和PEI转染为例说明远红光调控转基因表达的基因环路远程调控系统在细胞及动物体内的工作情况，但不限制本发明发明保护范围。

用于细胞培养的10cm细胞培养皿、细胞培养板(24孔)、15mL和50mL的离心管均购自美国Thermo Fisher Scientific公司(Labserv)；使用的改良过的Eagle培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素溶液购自美国Gibico公司；转染所用的PEI购自Polysciences公司；细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司。其余耗材为普通国产耗材。

细胞培养。人胚胎肾细胞(HEK-293T,ATCC:CRL-11268)、持续表达RTP1,RTP2,REEP1和G_αoλφ的HEK-293(Hana3A)、端粒酶永生化的人类间充质干细胞(hMSC-TERT,ATCC:CRL-3220)，人胚肾上皮细胞(HEK-293A)、人子宫颈癌细胞(HeLa,ATCC:CCL-2)、鼠神经瘤母细胞(Neuro-2A，ATCC:CCL-131)培养于改良过的Eagle培养基中，培养基中加入10％(v/v)的胎牛血清和1％(v/v)的青霉素和链霉素溶液。所有类型的细胞都培养于37℃、含有5％二氧化碳浓度的培养箱中。

转染。所有细胞系转染使用优化后的PEI的操作步骤(Wieland M,Methods56(3):351)。简单的说，即为在培养体系为500μL 24孔板中每孔种植6x10⁴个细胞，在培养16h后，将最优比例的DNA按照3:1(PEI:DNA)的质量比与PEI混合溶解于50μL的培养基中静止6h。

报告基因分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的检测

用于配置检测报告基因反应缓冲液的高精氨酸、氯化镁、二乙醇胺、HCl均购至生工生物工程(上海)股份有限公司；生色底物(pNPP:p-Nitrophenylphosphate)购至上海晶纯生化科技股份有限公司(阿拉丁)。

(1)试剂配置：

2x buffer:

·20mM高精氨酸注：其作用是抑制内源性的碱性磷酸酶活性

·1mM氯化镁

·2％二乙醇胺

·用HCl调节pH至9.8

底物溶液：

·120mM生色底物(pNPP:p-Nitrophenylphosphate)

·In 2x assay buffer

(2)实验步骤：

1.吸取细胞培养液上清液，200uL到离心管中(注：一般要超过150uL，因为后续加热会损耗体积一部分)

2.65℃水浴30min(注：加热主要是让内源性的碱性磷酸酶失活，而SEAP耐高温，在此温度下不会失活)。

3.吸取80uL(根据实验的情况自行稀释)到96孔板，快速加入事先预热好的2xbuffer 100μl和底物溶液20μl。

4.酶标仪405nm测10次，每次间隔1min(根据实验的情况可另设条件)。

(3)酶活的计算

碱性磷酸酶的酶活力定义是:37℃，pH 9.8时,在1min内与底物对硝基苯磷酸二钠(PNPP-Na₂)反应生成1mol/L对硝基苯酚的碱性磷酸酶,定义为1个活力单位(1U)。对硝基苯酚本身有亮黄色，在波长405nm时，不同浓度的对硝基苯酚对应不同的吸光值。计算方法为：样品和底物反应过程中不同时间点所测OD值做成曲线的斜率*256.8即为酶活，单位U/L。

报告基因荧光素酶(Luciferase)的检测

使用的双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国biotool公司。具体操作步骤详见产品双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Cat:B17001,Lot71005,Bitool,Houston,TX,USA)说明书。

海藻酸钠-PLL-海藻酸钠微胶囊的制备方法

制备微胶囊所用的海藻酸钠、微胶囊造粒仪均购自瑞士Buchi公司，多聚赖氨酸购自美国Sigma公司，柠檬酸三钠(Na₃-Cirate)、氯化钠、氯化钙、MOPS(Morpholinopropanesulfonic acid)均购自上海生工生物工程技术有限公司。实验所用的试剂配制以及操作步骤详见微胶囊造粒仪(Inotech Encapsulator Research Unit IE-50R)操作手册。

制备过程中的主要参数为：装配的喷头直径为200μm、超声震动断流的频率为1300Hz、分散使用的静电为1100V、注射速度为20mL/min、每秒所形成的微胶囊为500个、每微胶囊大小为300-350μm；每个微胶囊包裹的细胞数为200-250个。

中空纤维膜移植管的制备方法

实验所用的中空纤维膜移植管(Implant Membrane)购置美国SpectrumLaboratories公司。中空纤维膜移植管的制备的方法详见Implant Membrane产品说明书。

胰岛素(Insulin)的检测方法

实验所用的胰岛素检测试剂盒(Mouse Insulin ELISA kit)购自瑞典Mercodia公司,具体测定方法详见产品说明书。

胰高血糖素(GLP-1)的检测方法

实验所用的胰高血糖素检测试剂盒(Millipore Corporation,Billerica,MA01821USA,Cat.no.EGLP-35K,Lot.no.2639195)购自美国Millipore公司,具体测定方法详见产品说明书。

实施例1，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制远红光光源的智能控制系统的制作

本发明中以智能家居工作室制作的智能控制器及其相配套的APP、6个多路输出开关电源以及24个远红外LED灯作为远红光光源为例，说明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制远红光光源的智能控制系统的制作方法，但不限制本发明发明保护范围。

第一步，APP客户端的实现。由购买的智能控制器生产厂家(具体见实验材料与方法)提供的相配套的APP，其具体的设置及其使用方法详见厂家使用说明书。APP示意图详见说明书附图3。

第二步，远程智能控制器的实现。本发明中的智能控制器(具体功能及参数详见实验方法与材料)购自智能家居工作室，通过其可以使用智能手机利用局域网WiFi或2G/3G/4G网络资源实现超远程控制远红光光源。智能控制器示意图及实物图详见说明书附图4。

第三步，多路输出开关电源实现。本发明中的多路输出开关电源(具体功能及参数详见实验方法与材料)购自云粒方，分别将云粒方电子工作室的6路独立开关电源接入智能控制器，通过手机APP控制6路电源的开断来对同一远红光光源不同亮度的设置，从而实现多路输出开关电源的设计。多路输出开关电源示意图及实物图详见说明书附图5。

第四步，具有多路输出功能的超远程智能控制器的实现。本发明中，具有多路输出功能的超远程智能控制器的制作方法为：将6个独立的开关电源的输出端口分别与智能控制器的其中6路输入端口相连接，再将智能控制器的相对应的6路输出端口与远红外LED的输入端口相连接，作为远红外LED的直流电供电端口。其中整个系统的供电由AC/DC电源适配器完成，并且在AC/DC电源适配器的负极连接线串联接上参数为3A的保险丝，保护多路输出功能的超远程智能控制器在安全电流范围内正常工作，系统接线图详见明书附图6。当智能手机上安装与智能控制器配套的APP软件时，智能手机和智能控制器配置共同接入局域网WiFi或者2G/3G/4G网络资源时，可通过操作智能手机APP软件控制切换6路独立的开关电源的打开与关闭，并且可以设定6路独立的开关电源的打开和关闭的时间，从而超远程控制远红光光源的不同工作状态，如不同的光照强度，不同的光照时间等。具有多路输出功能的超远程智能控制器的实物图详见附图7。

第五步，远红外LED灯的实现。将24个远红外LED分别和电阻串联，之后再并联供电。该远红光光源的印刷电路板设计了6路供电端，其中6路供电端每处加入一个电压钳位二极管，对LED电路进行有效保护，并且在整个供电加入一个总控自锁开关，从而实现手动控制灯板电路的开断。24个远红外LED电路设计图详见附图8。在PCB电路布局中，为保证光照的分布均匀性，将24个LED灯等间距均匀放置，按照4行6列布局，行间距列间距均为2cm。24个远红外LED电路布局图详见附图9；24个远红外LED电路实物图详见附图10。

综上所述，将APP客户端、远程智能控制器、多路输出开关电源、远红外LED灯整合连接后，形成上述智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制远红光光源的智能控制系统的制作。整体系统示意图详见附图11。

实施例2，远红光调控转基因表达的基因环路远程调控系统元件的构建

本实施例中包含了远红光调控转基因表达的基因环路远程调控系统中具有代表性元件的构建方法，但不对本发明保护范围有限制。详细设计方案及步骤见表1。

实施例3，验证远红光诱导光感受器pWS189在哺乳动物细胞内产生c-di-GMP

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后种于7块24孔板中，每孔种6×10⁴个细胞，并加入500μL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μg光感受器pWS189、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL,质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照。换液14-18小时后，将其分成7组(分别编号1、2、3、4、5、6、7)，除1号外全部置于波长为720nm，光照强度为1mW/cm²的LED下(具体连接方式参照实验材料与方法)照射1h。

第五步，收集细胞。光照一小时后分别在0、5、10、15、30、60min(分别与编号2、3、4、5、6、7对应；编号1的24孔板始终处于黑暗条件下)收获细胞。将24孔板中的培养基去除，加入200μL的PBS，用移液器依次逐孔反复吹打使细胞脱落。将其转移到一个新的2mL离心管中，1000×g离心5min收集细胞。

第六步，裂解细胞。向上述收集的细胞中加入200μL的裂解缓冲液，于-80℃放置15min，迅速取出37℃放置5min，反复3次，中间均震荡混匀。5000×g离心5min，取上清即可检测。

第七步，c-di-GMP量的测定。用c-di-GMPELISA试剂盒测定各组c-di-GMP的表达量。实验数据详见说明书附图12。

实施例4，远红光调控转基因表达的基因环路远程调控系统的组成

本实例以SEAP为报告基因，举例证明远红光调控转基因表达的基因环路远程调控系统的组成部件，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后种于2块24孔板中，每孔种6×10⁴个细胞，并加入500μL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，转染。将2块24孔板分为黑暗组和光照组，每组均分为1-8个小组。在接种细胞16到24h内，其中黑暗组和光照组的第1小组中将0.3μg pcDNA3.1(+)，第2小组中将0.1μg pWS189和0.2μg pcDNA3.1(+)，第3小组中将0.1μg pGY32和0.2μg pcDNA3.1(+)，第4小组中将0.1μg pXY34和0.2μg pcDNA3.1(+)，第5小组中将0.1μg pWS189、0.1μg pGY32和0.1μg pcDNA3.1(+)，第6小组中将0.1μg pWS189、0.1μg pXY34和0.1μg pcDNA3.1(+)，第7小组中将0.1μg pGY32、0.1μg pXY34和0.1μg pcDNA3.1(+)以及第8小组中将0.1μg pWS189、0.1μg pGY32和0.1μg pXY34分别和PEI转染试剂和无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照。换液14-18h后，将光照组置于波长为720nm，光照强度为1mW/cm²的LED下(具体连接方式参照材料与方法)光照4h，而黑暗组则一直置于黑暗处培养。

第五步，检测报告基因。分别在培养48h后取黑暗组和光照组的细胞培养液上清测定SEAP的表达量(具体方法参照材料与方法)。

结果显示，只有当远红光基因环路表达控制系统的光感受器，处理器以及效应器同时在宿主细胞中存在并且在远红光诱导时，该系统才能正常工作。如果缺少其中任意一个部件或在黑暗条件下该系统无法工作。实验数据详见说明书附图13。

实施例5，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统不同构建的光感受器

本实施例中，为举例证明远红光调控转基因表达的远红光基因环路表达控制系统不同构建的光感受器在哺乳类动物细胞中受远红光调控表达的情况，但不对本发明保护范围有所限制。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞(具体步骤同实施例3)。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将2块24孔板分为黑暗组和光照组，每组均分为1-4个小组。在接种细胞16到24h内，其中黑暗组和光照组的第1小组中将0.1μg pWS46，第2小组中将0.1μg pWS48，第3小组中将0.1μg pWS1，第4小组中将0.1μg pWS50分别和0.1μg pGY32、0.1μg pXY34、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照(具体步骤同实施例3)。

第五步，检测报告基因(具体步骤同实施例3)。

结果显示，远红光调控转基因表达的远红光基因环路表达控制系统不同构建的光感受器，在远红光诱导下都可以在哺乳类动物细胞中正常工作。但是在相同远红光诱导下不同的构建的光感受器使效应器的反应强度有所不同。实验数据详见说明书附图14。

实施例6，远红光调控转基因表达的远红光基因环路表达控制系统不同启动子表达的光感受器

本实施例中，为举例证明远红光调控转基因表达的远红光基因环路表达控制系统的光感受器用不同的启动子表达，其在哺乳类动物细胞中受远红光调控表达的情况，但不对本发明保护范围有所限制。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞(具体步骤同实施例3)。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将2块24孔板分为黑暗组和光照组，每组均分为1-5个小组。在接种细胞16到24h内，其中黑暗组和光照组的第1小组中将0.1μgpWS189，第2小组中将0.1μg pWS50，第3小组中将0.1μg pWS51，第4小组中将0.1μg pWS55、第5小组中将0.1μg pWS59分别和0.1μg的处理器pGY32、0.1μg效应器pXY34、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照(具体步骤同实施例3)。

第五步，检测报告基因(具体步骤同实施例3)。

结果显示，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统中，用不同启动子表达的光感受器，在远红光诱导下都可以在哺乳类动物细胞中正常工作。但是在相同远红光诱导下不同启动子表达的光感受器使效应器的反应强度有所不同。实验数据详见说明书附图15。

实施例7，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统不同构建的处理器

本实施例中，为举例证明远红光调控转基因表达的基因环路控制系统的不同构建的处理器在哺乳类动物细胞中受远红光调控表达的情况，但不限制本发明保护范围。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞(具体步骤同实施例3)。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将2块24孔板分为黑暗组和光照组，每组均分为1-8个小组。在接种细胞16到24h内，其中黑暗组和光照组的第1小组中将0.1μgpWS200，第2小组中将0.1μg pXY34，第3小组中将0.1μg pXY35，第4小组中将0.1μg pXY36、第5小组中将0.1μg pGY28、第6小组中将0.1μg pGY32、第7小组中将0.1μg pGY33、第8小组中将0.1μg pGY34分别和0.01μg的远红光感受器pWS189、0.1μg效应器pXY24、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照(具体步骤同实施例3)。

第五步，检测报告基因(具体步骤同实施例3)。

结果显示，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统中，不同的处理器在远红光诱导下都可以在哺乳类动物细胞中正常工作。但是在相同远红光诱导下不同的构建的处理器使效应器的反应强度有所不同，可根据实验需要选择不同的处理器。实验数据详见说明书附图16。

实施例8，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统不同构建的效应器

本实施例中，为证明远红光调控转基因表达的基因环路控制系统的不同构建的效应器在哺乳类动物细胞中受远红光调控表达的情况。以不同的处理器识别位点、识别位点的不同重复数、是否含有绝缘信号以及不同种类的弱启动子为例，说明不同效应器在哺乳类动物细胞中受远红光调控的情况，但不对本发明保护范围有所限制。

不同的处理器识别位点及识别位点的不同重复数。具体具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞(具体步骤同实施例3)。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将2块24孔板分为黑暗组和光照组，每组均分为1-10个小组。在接种细胞16到24h内，其中黑暗组和光照组的第1小组中将0.1μgpXY19，第2小组中将0.1μg pXY20，第3小组中将0.1μg pXY21，第4小组中将0.1μg pXY22、第5小组中将0.1μg pXY23、第6小组中将0.1μg pXY16、第7小组中将0.1μg pXY17、第8小组中将0.1μg pXY18、第9小组中将0.1μg pXY31、第10小组中将0.1μg pXY32分别和0.1μg的远红光感受器pWS189、0.1μg处理器pGY32、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照(具体步骤同实施例3)。

第五步，检测报告基因(具体步骤同实施例3)。

结果显示，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统中，不同的处理器识别位点及不同重复数识别位点的效应器在远红光诱导下都可以在哺乳类动物细胞中正常工作。但是在相同远红光诱导下不同的处理器识别位点及不同重复数识别位点的效应器的反应强度有所不同，可根据实验需要选择不同的处理器。实验数据详见说明书附图17、18。

在含有不同重复数的处理器识别位点前添加绝缘信号。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞(具体步骤同实施例3)。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将2块24孔板分为黑暗组和光照组，每组均分为1-5个小组。在接种细胞16到24h内，其中黑暗组和光照组的第1小组中将0.1μg pXY33，第2小组中将0.1μg pXY28，第3小组中将0.1μg pXY34，第4小组中将0.1μg pXY39、第5小组中将0.1μg pXY40分别和0.1μg的远红光感受器pWS189、0.1μg处理器pGY32、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照(具体步骤同实施例3)。

第五步，检测报告基因(具体步骤同实施例3)。

结果显示，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统中，在含有不同重复数的处理器识别位点前添加绝缘信号的效应器在远红光诱导下都可以在哺乳类动物细胞中正常工作。但是在相同远红光诱导下含有不同重复数的处理器识别位点前添加绝缘信号的效应器的反应强度有所不同，可根据实验需要选择不同的处理器。实验数据详见说明书附图19。

不同种类的弱启动子。以启动子h_CMV_min3G为例说明可以使用不同的弱启动子。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞(具体步骤同实施例3)。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将2块24孔板分为黑暗组和光照组，每组均分为1-5个小组。在接种细胞16到24h内，其中黑暗组和光照组的第1小组中将0.1μg pGY36，第2小组中将0.1g pGY37，第3小组中将0.1μg pGY38，第4小组中将0.1μg pGY39、第5小组中将0.1μg pGY40分别和0.1μg的远红光感受器pWS189、0.1μg处理器pGY32、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照(具体步骤同实施例3)。

第五步，检测报告基因(具体步骤同实施例3)。

结果显示，远红光调控转基因表达的基因环路控制系统中，在效应器中含有的不同的弱启动子在远红光诱导下都可以在哺乳类动物细胞中正常工作。但该弱启动子与其他弱启动子响应的强度不同。实验数据详见说明书附图17、20。

实施例9，远红光调控转基因的基因环路控制系统在不同的哺乳类动物细胞中表达

本实施例中，为举例证明远红光调控转基因表达的基因环路控制系统在不同的哺乳类细胞中受远红光调控表达的情况，但不限制本发明保护范围。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态良好的Neuro-2A细胞、HeLa细胞、hMSC-TERT细胞、Hana3A细胞、HEK-293A细胞以及HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后分别种于2块(每种细胞在每块板上种4个孔)不同的24孔板中，每孔种6×10⁴个细胞，并加入500μL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μg pWS189、0.1μg pGY32、0.1μgpXY34、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照(具体步骤同实施例3)。

第五步，检测报告基因(具体步骤同实施例3)。

结果显示，本发明中的远红光调控转基因表达的基因环路控制系统可以在不同的哺乳类动物细胞中受远红光诱导表达。因此本发明中的远红光调控转基因的基因环路控制系统适用于多种哺乳类动物细胞。实验数据详见说明书附图21。实施例10，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制不同的光照时间调控远红光调控转基因表达的基因环路控制系统不同的表达量

本实施例中，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制不同的光照时间可以是脉冲式光照也可以是连续光照、不连续光，光照时间可长可短。本实例为举例证明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制不同的光照时间(连续)与效应器调控表达量的关系，但不对本发明的保护范围有所界定。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后种于12块24孔板中，每孔种6×10⁴个细胞，并加入500μL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μg光感受器pWS189、0.1μg pGY32、0.1μg pXY34、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制不同的光照时间进行光照。换液14-18h后，将其分成12组，置于波长为720nm，光照强度为1mW/cm²的LED下(具体连接方式参照材料与方法)。其智能手机控制不同的光照时间分别为0、0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、48、72h(其中光照组0h的一直置于黑暗处培养)。

第五步，检测报告基因。分别在培养72h后取各组的细胞培养液上清测定SEAP的表达量。

实验结果表明，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制的不同光照时间可以诱导远红光调控转基因的基因环路控制系统调控目的基因的不同表达量，且光照诱导时间越长，其表达量越高，呈现光照时间依赖性表达。实验数据详见说明书附图22。

实施例11，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制不同的光照强度调控远红光调控转基因表达的基因环路控制系统不同的表达量

本实施例中，为举例证明证明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制不同的光照强度与效应器调控表达量的关系，但不对本发明的保护范围有所界定。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后种于7块24孔板中，每孔种6×10⁴个细胞，并加入500μL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，转染(具体步骤同实施例8)。

第四步，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制不同的光照强度进行光照。换液14-18h后，将其分成7组，分别置于波长为720nm，光照强度为分别为0、50、75、100、250、500、750、1000、1500、2000μW/cm²的LED下(具体连接方式参照材料与方法)。其光照时间为4h(其中光照强度为0的一直置于黑暗处培养)。

第五步，检测报告基因。分别在培养72h后取各组的细胞培养液上清测定SEAP的表达量。

实验结果表明，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制的不同光照强度可以诱导远红光调控转基因表达的基因环路控制系统调控目的基因的不同表达量，且光照强度越强，其表达量越高，呈现光照强度依赖性表达。实验数据详见说明书附图23。

实施例12，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因的基因环路控制系统可以表达一切有意义的蛋白

智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统可以表达一切有意义的蛋白，本实施例中，以表达报告基因分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)以及胰高血糖素样肽(GLP-1)为例说明远红光调控转基因表达的基因环路控制系统可以调控表达一切有意义的蛋白。但不对本发明的保护范围有所界定。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后分别种于不同的24孔板中，每孔种6×10⁴个细胞，并加入500μL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μg pWS189、0.1μg pGY32、0.1μgpXY34；0.1μg pWS189、0.1μg pGY32、0.1μg pGY44；0.1μg pWS189、0.1μg pGY32、0.1μgpWS212分别和PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程设定光照强度进行光照。换液14-18h后，将光照组置于波长为720nm，设定的光照强度为1mW/cm²的LED下(具体连接方式参照材料与方法)光照4h，而黑暗组则一直置于黑暗处培养。

第五步，检测报告基因。分别在24h、48h、72h和测定SEAP的量；分别在0h、6h、12h、24h、48h拍摄荧光照片；在24、48、72h用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶的量；在48h用ELISA试剂盒测定GLP-1在不同光照时间下的表达量(具体方法参照实验材料与方法)。

结果显示，本发明中的智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统可以很好的诱导表达不同的蛋白。因此本发明中的智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因的基因环路控制系统适用于表达一切有意义的蛋白。实验数据详见说明书附图24、25、26、27。

实施例13，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因的基因环路控制系统可以同时表达两个或多个一切有意义的蛋白

智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统可以同时表达两个不同的蛋白(用2A连接)，本实施例中，以表达增强型绿色荧光蛋白-2A-胰岛素(EGFP-2A-Insulin)为例说明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统可以同时表达两个不同的蛋白(用2A连接)。但不对本发明的保护范围有所界定。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后分别种于不同的24孔板中，每孔种6×10⁴个细胞，并加入500μL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μg pWS189、0.1μg pGY32、0.1μgpWS213、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照(具体步骤同实施例11)。

第五步，检测报告基因。在48h时拍摄不同光照时间的荧光蛋白图；用ELISA试剂盒测定Insulin在不同光照时间下的表达量(具体方法参照实验材料与方法)。

结果显示，本发明中的智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统可以很好的同时表达两个不同的蛋白(用2A连接)。因此本发明中的智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因的基因环路控制系统可以用于同时表达多个蛋白。实验数据详见说明书附图28、29。

实施例14：制备含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的微胶囊移植载体

本实施例中，以制备含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的微胶囊移植载体为例说明移植载体的制备方法，但不对本发明的保护范围有所界定。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后种于10厘米细胞培养皿中，每皿种4×10⁶个细胞，并加10mL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，在接种细胞16到24h内，将4μg pWS189、4μg pGY32、4μg pXY34、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到10厘米细胞培养皿中。其中每皿的配制总体积为2mL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入10mL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，微胶囊制备。换液14-18h后，胰酶消化，离心收集细胞。利用微胶囊制备仪制备微胶囊(具体设备及参数详见实验方法与材料)。

制备好的微胶囊具有海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(Alginate-Polylysine-Alginate-membrane)三层膜系统，细胞生长所需的营养物质以及工程化的细胞所分泌的小分子目的蛋白可以自由通过该膜系统。但是细胞及其他大分子蛋白则无法通过该膜系统。因此由微胶囊包裹的细胞可以移植到小鼠体内正常生长。实验数据详见说明书附图30。

实施例15，含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞在微胶囊中受远红光调控表达

本实施例根据实施例14操作方法，制得的微胶囊在6孔板中进行培养，同时用红外线治疗器，光照强度为5mW/cm²，光照时间为2h诱导表达含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的在微胶囊，分别在24h、48h、72h检测报告基因。含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞在微胶囊中可以很好的受远红光调控表达。实验数据详见说明书附图31。

实施例16：制备含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的中空纤维膜移植管移植载体

本实施例中，以制备含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的中空纤维膜移植管移植载体为例说明移植载体的制备方法，但不对本发明的保护范围有所界定。具体步骤如下：

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后种于24孔细胞培养板中，每孔种6×10⁴个细胞，并加500μL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，在接种细胞16到24h内，将0.1μg pWS189、0.1μg pGY32、0.1μg pXY34、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔细胞培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入10mL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，中空纤维膜移植管制备。换液14-18h后，胰酶消化，离心收集细胞。按照制作方法制作中空纤维膜移植管(具体操作过程详见实验方法与材料)。

制备好的中空纤维膜移植管，细胞生长所需的营养物质以及工程化的细胞所分泌的小分子目的蛋白可以自由通过该膜系统。但是细胞及其他大分子蛋白则无法通过该膜系统。因此由中空纤维膜移植管包裹的细胞可以移植到小鼠体内正常生长。实验数据详见说明书附图32。

实施例17，含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞在中空纤维膜移植管中受远红光调控表达

本实施例根据实施例16操作方法，制得的中空纤维膜移植管在6孔板中进行培养，同时用智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制红外线治疗器进行光照，光照强度为5mW/cm²，光照时间为2h诱导表达含有远红光调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的中空纤维膜移植管，分别在24h、48h、72h检测报告基因。含有远红光调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞在中空纤维膜移植管中可以很好的受远红光调控表达。实验数据详见说明书附图33。

实施例18，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统在小鼠体受远红光调控表达的情况

智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统在小鼠体受远红光调控表达的方式有多种，本实施例以移植含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的中空纤维膜移植管为例，证明远红光调控转基因表达的基因环路控制系统在小鼠体受远红光调控表达的情况。但不对本发明的保护范围有所界定。移植载体移植到小鼠体内的方式有多种，本实施例以背部皮下移植为例，说明智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统移植到小鼠体内的方法。具体步骤如下：

第一步，制备中空纤维膜移植管(具体方式参照实施例16)。

第二步，将中空纤维膜移植管植入小鼠背部(具体方法参照实验材料与方法)。

第三步，光照。用智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程控制红外线治疗器(10mW/cm²)分别在移植后2h、8h、26h、32h光照2h。

第四步，检测报告基因。分别在移植后24h和48h眼眶取血检测报告基因的量(具体方法详见实验材料与方法)。详细实验数据见附图34、35。

实施例19，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统体外精确调控胰岛素表达

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后种于6块24孔板中，每孔种6×104个细胞，并加入500μL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μg光感受器pWS189、0.1μg的处理器pGY32、0.1μg效应器pWS213、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL,质粒与PEI质量比为1:3。转染6小时后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照。换液14-18小时后，将六块板分为6组，置于波长为720nm，光照强度为1mW/cm2的LED下，智能手机分别通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程设定光照时间为0，0.1，0.25，0.5，1，2h(光照0小时的一直保存在黑暗中)。

第五步，检测胰岛素的表达。培养48小时后拍摄各组的绿色荧光蛋白的表达情况，以及用胰岛素ELISA试剂盒测定各组胰岛素的表达量。

实验表明，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统可以在体外精确调控胰岛素表达，且其表达量与光照强度成正相关。实验数据详见说明书附图28，29。

实施例20，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调转基因表达的基因环路控制系统在Ⅰ型糖尿模型鼠内精确调控胰岛素表达治疗Ⅰ型糖尿病

第一步，Ⅰ型糖尿病小鼠模型的构建。我们采用多次低剂量链脲霉素(Streptozocin，STZ，购自Sigma公司S0130，18883-6，6-4)给药法诱导模型。C57BL/6J小鼠25只(来自中国科学院)，8周龄，雄性，连续5天腹腔(注射前禁食12-16h)注射溶解有STZ(剂量为40-50mg/kg)的柠檬酸钠缓冲液。注射时将STZ溶于新鲜的柠檬酸缓冲液中(0.1mol/L，pH 4.5)，冰上配制，注意避光。溶解后尽量在30min内完成注射。

第二步智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的制备过程以及第三步含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的移植管的制备过程具体参照实施例16。

第四步含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的移植管至小鼠背部以及第五步光照，具体参照实施例18。

第六步，测定一型糖尿病小鼠空腹血糖值。移植8小时后，将小鼠禁食(供水)16小时后，经尾部取血，测定空腹血糖值。实验数据表明表达的胰岛素具有很好的降血糖效果。实验数据详见说明书附图36。

第七步，进行糖耐受实验。移植24h后，进行糖耐受实验。首先，配置新鲜的葡萄糖水溶液(125mg/ml)10mL，再根据每只小鼠的体重(1.25g/kg)计算葡萄糖水溶液的注射体积(腹腔注注射体积V＝10×小鼠的体重(g)，单位：μL)。然后测量每只小鼠(测量前饥饿16小时)的0点血糖，腹腔注射上述葡萄糖溶液。最后，测定每只小鼠30，60，90，120min的血糖值。实验表明，糖尿病鼠的糖耐量具有很好的改善。实验数据详见说明书附图37。

实施例21，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调转基因表达的基因环路控制系统体外精确调控胰高血糖素(GLP-1)的表达

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293T细胞用0.25％的胰酶消化后种于6块不同的24孔板中，每孔种6*10⁴个细胞，并加入500μL含10％FBS的DMEM培养基。

第三步，转染。在接种细胞16到24h内，将0.1μg光感受器pWS189、0.1μg的处理器pGY32、0.1μg效应器pWS212、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到24孔培养板中。其中每孔的配制总体积为50μL,质粒与PEI质量比为1:3。转染6小时后换入500μL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。

第四步，光照。换液14-18小时后，将六块板分为6组，置于波长为720nm，光照强度为1mW/cm2的LED下，智能手机分别通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程设定光照时间为0，0.1，0.25，0.5，1，2h(光照0小时的一直保存在黑暗中)。

第五步，测定智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统体外表达GLP1-Fc的量。培养48小时后用Active GLP-1ELISA试剂盒测定各组GLP1-Fc的表达量。

实验表明，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统可以在体外精确调控胰高血糖素的表达，且其表达量与光照强度成正相关。实验数据详见说明书附图27。

实施例22，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统在一型糖尿模型鼠内精确调控GLP-1表达治疗Ⅱ型糖尿病

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，Ⅱ型糖尿病模型鼠db/db小鼠20只(来自中国科学院)，8周龄，雌性，分成四组。分别为不移植不光照组、不移植光照组、移植不光照组、移植光照组。

第三步远红光工程化细胞的制备过程以及第四步含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的移植管的制备过程具体参照实施例16。

第四步含有智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统工程化细胞的移植管至小鼠背部以及第五步光照，具体参照实施例18。

第六步，测定一型糖尿病小鼠空腹血糖值。移植8小时后，将小鼠禁食(供水)16小时后，经尾部取血，测定空腹血糖值。实验数据表明表达的胰高血糖素具有很好的降血糖效果。实验数据详见说明书附图38。

第七步，进行糖耐受实验。移植24h后，进行糖耐受实验。首先，配置新鲜的葡萄糖水溶液(125mg/ml)10mL，再根据每只小鼠的体重(1.25g/kg)计算葡萄糖水溶液的注射体积(腹腔注注射体积V＝10×小鼠的体重(g)，单位：μL)。然后测量每只小鼠(测量前饥饿16小时)的0点血糖，腹腔注射上述葡萄糖溶液。最后，测定每只小鼠30，60，90，120min的血糖值。实验表明，糖尿病鼠的糖耐量具有很好的改善。实验数据详见说明书附图39。

第八步，进行胰岛素耐受实验。移植24h后，进行胰岛素耐受实验。首先，配置新鲜胰岛素溶液(0.1U/ml)，再根据每只小鼠的体重(1.1U/kg)，计算胰岛素的注射体积(腹腔注注射体积V＝1.1×小鼠的体重(g)，单位：μL)。然后测定每只小鼠的0点血糖(测量前饥饿4小时)，腹腔注射上述胰岛素溶液。最后，测定每只小鼠30，60，90，120min的血糖值。实验表明，糖尿病鼠的胰岛素耐受具有很好的改善。实验数据详见说明书附图40。

第九步，测定智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统在Ⅱ型糖尿病小鼠中GLP-1的表达。移植后48h通过眼球内眦取血，用GLP-1(7-36)activieELISA试剂盒，检测血清中GLP-1(activie)含量。实验表明，智能手机通过局域网WiFi或2G/3G/4G网络超远程调控转基因表达的基因环路控制系统可以在体内精确调控胰高血糖素的表达。实验数据详见说明书附图41。

表1.质粒构建表

引物:酶切位点以及无缝克隆片段用下划线标出。

缩写：

P_hCMV，人类巨细胞病毒启动子；P_SV40，猿猴空泡病毒启动子；P_hCMVmin3G，巨细胞病毒CMV最小启动子突变体；P_CAG，人工构建巨细胞病毒早期增强子与鸡β-肌动蛋白启动子组合启动子；EGFP，增强型绿色荧光蛋白；SEAP,人类外分泌碱性磷酸酶；GLP-1,胰高血糖素样肽1；VP64，疱疹病毒转录激活结构域四聚体；BldD，远红光处理器；2A，碳端含有一个D(V/I)EXNPGP结构域的独立寡肽；pA，多聚腺苷酸信号；Bphs，人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶；YhjH，c-di-GMP降解酶；Bpho，色素合成酶；PCR，聚合酶链式反应。

序列表中：

序列1：人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶(Bphs)核苷酸序列

序列2：光明色素合成酶(Bpho)核苷酸序列

序列3：自剪切2A肽核苷酸序列

序列4：c-di-GMP降解酶(YhjH)核苷酸序列

序列5：猿猴空泡病毒启动子(SV40)核苷酸序列

序列6：人源的EF1α(hEF1α)启动子核苷酸序列

序列7：鼠源的PGK(mPGK)启动子核苷酸序列

序列8：人工构建巨细胞病毒早期增强子与鸡β-肌动蛋白启动子组合启动子(CAG)核苷酸序列

序列9：巨细胞病毒启动子CMV核苷酸序列

序列10：远红光处理器(BldD)核苷酸序列

序列11：单纯疱疹病毒颗粒蛋白转录激活结构域(VP16)核苷酸序列

序列12：单纯疱疹病毒颗粒蛋白转录激活结构域核心序列四聚体(VP64)核酸序列

序列13：NF-ΚB p65亚基转录激活结构域核苷酸序列

序列14：热休克转录因子转录激活域(HSF1)核苷酸序列

序列15：TATA Box的核苷酸序列

序列16：巨细胞病毒最小启动子CMV_min的核苷酸序列

序列17：巨细胞病毒最小启动子CMV_min的突变体CMV_min3G的核苷酸序列

序列18：BldD结合位点(bldM)核苷酸序列

序列19：BldD结合位点(whiG)核苷酸序列

序列20：远红光效应器启动子P_FRL0(1×bldM-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列21：远红光效应器启动子P_FRL1(2×bldM-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列22：远红光效应器启动子P_FRL2(3×bldM-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列23：远红光效应器启动子P_FRL3(4×bldM-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列24：远红光效应器启动子P_FRL4(5×bldM-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列25：远红光效应器启动子P_FRL5(1×whiG-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列26：远红光效应器启动子P_FRL6(2×whiG-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列27：远红光效应器启动子P_FRL7(3×whiG-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列28：远红光效应器启动子P_FRL8(4×whiG-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列29：远红光效应器启动子P_FRL9(5×whiG-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列30：远红光效应器启动子P_FRL10(SV40PolyA-1×whiG-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列31：远红光效应器启动子P_FRL11(SV40PolyA-2×whiG-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列32：远红光效应器启动子P_FRL12(SV40PolyA-3×whiG-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列33：远红光效应器启动子P_FRL13(SV40PolyA-4×whiG-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列34：远红光效应器启动子P_FRL14(SV40PolyA-5×whiG-h_-CMV_min)核苷酸序列

序列35：远红光效应器启动子P_FRL15(1×whiG-h_-CMV_min3G)核苷酸序列

序列36：远红光效应器启动子P_FRL16(2×whiG-h_-CMV_min3G)核苷酸序列

序列37：远红光效应器启动子P_FRL17(3×whiG-h_-CMV_min3G)核苷酸序列

序列38：远红光效应器启动子P_FRL18(4×whiG-h_-CMV_min3G)核苷酸序列

序列39：远红光效应器启动子P_FRL19(4×whiG-h_-CMV_min3G)核苷酸序列

序列40：远红光效应器表达的待转录序列分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的核苷酸序列

序列41：远红光效应器表达的待转录序列绿色荧光蛋白(EGFP)的核苷酸序列

序列42：远红光效应器表达的待转录序列荧光素酶(Luciferase)的核苷酸序列

序列43：远红光效应器表达的待转录序列胰高血糖素样肽-1(GLP-1-Fc)的核苷酸序列

序列44：远红光效应器表达的待转录序列的核苷酸序列(EGFP-2A-Insulin)的核苷酸序列

序列45：人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶(Bphs)氨基酸序列

序列46：光明色素合成酶(Bpho)氨基酸序列

序列47：自剪切2A肽核苷酸序列

序列48：c-di-GMP降解酶(YhjH)氨基酸序列

序列49：远红光处理器(BldD)氨基酸序列

序列50：单纯疱疹病毒颗粒蛋白转录激活结构域(VP16)氨基酸序列

序列51：单纯疱疹病毒颗粒蛋白转录激活结构域核心序列四聚体(VP64)核酸序列

序列52：NF-KB p65亚基转录激活结构域氨基酸序列

序列53：热休克转录因子转录激活域(HSF1)氨基酸序列

序列54：核定位信号(NLS)的氨基酸序列

序列55：连接功能肽(Linker)的氨基酸序列

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Claims (12)

1.远红光基因环路表达控制系统在宿主细胞中调控基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a)将所述远红光基因环路表达控制系统构建在真核质粒表达载体中；

b)经转染导入所述宿主细胞中；

c)通过调控远红光照射条件来诱导调控所述宿主细胞，实现所述效应器编码基因表达；

其中，所述远红光基因环路表达控制系统包括：

感受远红光光源的光感受器；

处理所述光感受器所传递信号的处理器；及

应答所述处理器所传递信号的效应器。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述光感受器包括光敏二鸟苷酸环化酶Bphs，其在远红光条件下将GTP转变为c-di-GMP；其中，所述光感受器光敏二鸟苷酸环化酶Bphs是由BphG蛋白的第1-511位氨基酸和Slr1143蛋白的第175-343位氨基酸融合，并且将融合蛋白的587位精氨酸突变为丙氨酸R587A制备得到；

和/或，

所述处理器包括：作为DNA结合域和c-di-GMP结合域的多肽、作为核定位信号NLS的多肽、作为连接域的多肽、以及作为转录调控域的多肽；

和/或，

所述效应器包括P_FRL-reporter；所述效应器包括启动子序列和待转录蛋白的核酸序列。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光感受器的构建形式包括：

a)人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶Bphs编码基因Bphs；

b)人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶Bphs编码基因通过2A序列与c-di-GMP降解酶YhjH编码基因相连Bphs-2A-YhjH；

c)人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶Bphs编码基因通过2A序列与光敏色素合成酶Bpho编码基因相连Bphs-2A-Bpho；

d)人工合成的细菌光敏二鸟苷酸环化酶Bphs编码基因通过2A序列与光敏色素合成酶Bpho编码基因相连，再通过2A序列与c-di-GMP降解酶YhjH编码基因相连Bphs-2A-Bpho-2A-YhjH；

其中，所述2A序列可以被内部核糖体进入位点序列IRES替代；

所述光敏色素合成酶Bpho具有合成光敏色素胆绿素的功能；

所述c-di-GMP的降解酶YhjH具有将c-di-GMP降解为pGpG的功能。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Bphs、Bpho、YhjH的氨基酸序列选自序列45、46、48。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达光感受器的启动子包括：

a)SV40；b)CMV；c)hEF1α；d)mPGK；e)CAG。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述作为DNA结合域和c-di-GMP结合域的多肽，其为与c-di-GMP结合后，能与特定的DNA序列结合的蛋白，包括BldD蛋白，该BldD蛋白的氨基酸序列选自序列49；

和/或，

所述作为核定位信号NLS的多肽，其可以为1-3拷贝多种形式，其氨基酸序列为选自序列54；

和/或，

所述作为连接功能域的多肽，其长度可以从0-30个氨基酸多种形式，其氨基酸序列选自序列55。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述作为转录调控域的多肽，其为一切具有转录激活功能的结构域蛋白，包括NF-ΚBp65亚基转录激活结构域、热休克转录因子HSF1转录激活域、单纯疱疹病毒颗粒蛋白VP16转录激活结构域以及其4拷贝的转录激活结构域VP64；其氨基酸序列选自序列50、51、52、53；

和/或，

所述作为转录调控域的多肽置于所述DNA结合域和c-di-GMP结合域的多肽BldD的N端或C端；

和/或，

所述处理器中不同功能域的多肽之间可直接连接或通过连接肽连接。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述启动子序列包含处理器BldD蛋白结合的DNA序列和启动基因表达的弱启动子；其中，所述处理器BldD蛋白结合的DNA序列，其为DNA结合域和c‐di‐GMP结合域的多肽特异性识别并结合的DNA序列，为bldM和whiG启动子区域的部分序列；其中，所述bldM的核苷酸序列选自序列18；所述whiG的核苷酸序列选自序列19；其中，所述bldM和whiG启动子区域的部分序列，其为1-10拷贝。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，

所述启动基因表达的弱启动子包括所有的弱启动子，其包括TATA box、巨细胞病毒CMV最小启动子及其突变体CMVmin 3G；

和/或，

所述启动子序列的核酸序列选自序列20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39；

和/或，

所述待转录核酸序列编码表达的蛋白可以为一切有意义的蛋白，包括作为报告基因的蛋白和/或作为治疗疾病的药物蛋白或小肽的核酸序列；其中，所述作为报告基因的蛋白包括分泌型碱性磷酸酶、增强型绿色荧光蛋白、荧光素酶的核酸序列；作为治疗疾病的药物蛋白或小肽包括胰岛素、胰高血糖素样肽的核酸序列；其中，所述一切有意义的蛋白可通过2A序列在一个表达载体上同时表达多个蛋白，包括SEAP-2A-Insulin、EGFP-2A-Insulin、EGFP-SEAP-2A-Insulin；其中，所述2A序列可以被内部核糖体进入位点序列IRES替代。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞。

11.远红光基因环路表达控制系统在移植载体中进行转基因调控表达的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

a)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的真核质粒表达载体；

b)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的工程化细胞；

c)制备含有所述远红光基因环路表达控制系统的工程化细胞移植载体；

d)通过远程调控远红光光源对工程化细胞移植载体进行诱导表达；

其中，所述远红光基因环路表达控制系统包括：

感受远红光光源的光感受器；

处理所述光感受器所传递信号的处理器；

应答所述处理器所传递信号的效应器。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述工程化细胞的方法包括磷酸钙转染、PEI转染、脂质体转染电穿孔转染、或病毒感染；所述工程化细胞移植载体的制备方法包括：制备微胶囊、制备海藻酸钠胶块皮、制备中空纤维膜移植管。