CN107158408B - 一种具有上转换成像功能的药物与基因传输体系 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有上转换成像功能的药物与基因传输体系，具有以下组成：UCNPs@mSiO2‑SS‑H2A；其中，所述药物与基因传输体系连接的靶基因为抑癌基因如抑癌基因p53。本发明的UCNPs@mSiO2‑SS‑H2A杂合基因载体材料，选择对小牛胸腺组蛋白H2A进行修饰，使该体系能够作为基因载体，提升基因负载能力、降低载体毒性并兼顾靶向配体的作用；其次，本发明的UCNPs@mSiO2‑SS‑H2A可以在同时传递药物与基因的过程中，具有上转换成像示踪功能；最后本发明的UCNPs@mSiO2‑SS‑H2A杂合基因载体材料能够起到化学治疗与基因治疗的协同效应。本发明的基因载体材料，基因转染效率高、可视、安全无毒，为具有靶向核定位能力的诊疗载体，将为恶性肿瘤的治疗提供新的治疗方法和手段。

Description

一种具有上转换成像功能的药物与基因传输体系
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种具有上转换成像功能的药物与基因传输体系。
背景技术
癌症是威胁全球人类生命的最大杀手之一，是当前医学研究领域所面临的一个重大挑战。肿瘤的发生是极其复杂的过程，原癌基因的异常激活、抑癌基因或凋亡相关基因的失活是导致细胞恶性增殖或凋亡的重要原因。其中，抑癌基因的点突变、重组、缺失或甲基化所致的功能失活与多种人类恶性肿瘤的发生和发展密切相关。因此，通过抑癌基因的转移、表达，进而补偿和替代缺失和突变的抑癌基因，是目前癌症基因治疗的主要策略之一。肿瘤抑制基因p53在细胞中编码一个含393个氨基酸组成的磷酸化蛋白，其分子量为53kDa，即p53蛋白。
研究表明，p53在DNA损伤修复、细胞周期调控、诱导肿瘤细胞凋亡方面起着重要的作用，其中50％以上的人类肿瘤均是由于p53基因的突变或功能缺失所引起的。因此，重新导入野生型p53基因不仅可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,而且对抗肿瘤药物所引起的DNA损伤具有正向应答效应,激活凋亡程序，促使癌细胞执行“自杀”行为。因此，以野生型p53基因作为模型治疗基因，并同时负载天然抗肿瘤药物，以纳米粒子作为传输载体，探索其诱导肿瘤细胞凋亡，将是癌症治疗的有效方法，具有重要的临床应用前景。
基因治疗是治疗恶性肿瘤、遗传性疾病(如重度联合性免疫缺陷症、囊性纤维病、遗传性高胆固醇血症、帕金森病)、心血管疾病的一种潜在治疗方法，也是传统癌症化疗的有效替代方法。基因治疗通常包含以下几个独立的步骤：(1)目的基因导入受体；(2)目的基因向靶向细胞和细胞核的运输；(3)目的基因的治疗性产物的表达。应用裸露的DNA直接进行基因治疗目前还存在诸如血液循环系统中的半寿期短、被靶向细胞的吞噬效率低等障碍。因此，构建高效的基因传输体系和基因表达系统是基因治疗成功的有力保障，也是其能否进入临床和获得疗效的关键。
目前，基因传输载体包括转录病毒载体(retrovirus)、慢病毒载体(lentivirus)和腺病毒载体(adenovirus)和腺病毒相关载体(adeno-associatedvirus)，它们对大多数细胞系都有很高的转染效率,其中由深圳赛百诺基因技术有限公司开发的基因治疗药物“今又生”就是由正常人的抑癌基因p53和改构的5型腺病毒基因重组而成；但是在应用过程中有很多弊病：(1)负载量低，特异性和靶向性差；(2)其本身具有免疫原性；(3)不易大规模生产，在临床应用中受到限制的同时也带来诸多安全隐患。同时，该类载体携带DNA容量有限，靶向特异性差，且难于大规模制备，以上缺陷均限制其在临床上的广泛应用。
发明内容
本申请通过高温热分解方法，合成UCNPs@mSiO2-NH2，并对其基因转染效率和细胞毒性等进行评价；通过化学键合技术，将组蛋白H2A与UCNPs@mSiO2-NH2键合，构建UCNPs@mSiO2-SS-H2A杂合基因载体材料；以介导p3XFLAG-CMV-p53质粒转染p53基因缺失型(PC-3)、p53基因野生型(HeLa)细胞系，在细胞水平上研究其诱导肿瘤细胞凋亡的能力和分子机制；最后，通过体液免疫和细胞免疫两方面的研究，系统评价该杂合基因载体材料的免疫原性。以上研究将制备一种基因转染效率高、可视、安全无毒、具有靶向核定位能力的诊疗载体，将为恶性肿瘤的治疗提供新的治疗方法和手段。
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有上转换成像功能的药物与基因传输体系，具有以下组成：UCNPs@mSiO2-SS-H2A。
优选地，本发明所述具有上转换成像功能的药物与基因传输体系中，所述药物与基因传输体系连接的靶基因为抑癌基因。
优选地，本发明所述具有上转换成像功能的药物与基因传输体系中，所述抑癌基因为p53。
本发明的另一目的在于提供一种制备具有上转换成像功能的药物与基因传输体系的方法，包括以下步骤：
1)、高温热分解反应合成UCNPs@mSiO2-NH2；
2)、组蛋白H2A与交联剂反应形成H2A-SS；
3)、加入活化剂对UCNPs@mSiO2-NH2进行活化，将H2A-SS偶联到活化的UCNPS@mSiO2-NH2上，形成的具有上转换成像功能的药物与基因传输体系UCNPs@mSiO2-SS-H2A；
优选地，本发明所述制备具有上转换成像功能的药物与基因传输体系的方法中，所述交联剂为Traut试剂。
优选地，本发明所述制备具有上转换成像功能的药物与基因传输体系的方法中，所述活化剂为琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸脂。
优选地，本发明所述制备具有上转换成像功能的药物与基因传输体系的方法中，所述具有上转换成像功能的药物与基因传输体系UCNPs@mSiO2-SS-H2A，连接的基因为抑癌基因；更优选地，所述抑癌基因为p53基因；最优选地，所述p53基因为通过静电作用连接。
本发明还提供了上述具有上转换成像功能的药物与基因传输体系在传递药物与基因中的用途。
本发明与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
1)本发明的UCNPs@mSiO2-SS-H2A杂合基因载体材料，选择对小牛胸腺组蛋白H2A进行修饰，使该体系能够作为基因载体，提升基因负载能力、降低载体毒性并兼顾靶向配体的作用；其次，本发明的UCNPs@mSiO2-SS-H2A可以在同时传递药物与基因的过程中，具有上转换成像示踪功能；最后本发明的UCNPs@mSiO2-SS-H2A杂合基因载体材料能够起到化学治疗与基因治疗的协同效应；
2)如本发明后续实施例所示，本发明的UCNPs@mSiO2-SS-H2A杂合基因载体材料，以介导p3XFLAG-CMV-p53质粒转染p53基因缺失型(PC-3)、p53基因野生型(HeLa)细胞系，在细胞水平研究其诱导肿瘤细胞凋亡的能力和分子机制；
其次，本发明通过体液免疫和细胞免疫两方面的研究，系统评价该杂合基因载体材料的免疫原性，意外地发现本发明的基因载体材料，基因转染效率高、可视、安全无毒，为具有靶向核定位能力的诊疗载体，将为恶性肿瘤的治疗提供新的治疗方法和手段。
说明书附图
图1为本发明一个实施例中的具有上转换成像功能的药物与基因传输体系UCNPs@mSiO2-NH2合成的流程示意图；
图2为核壳结构的UCNPs@mSiO2的透射电镜图(TEM)；
图3为氨基修饰的核壳结构UCNPs@mSiO2-NH2的XPS图谱；
图4为本发明一个实施例中的具有上转换成像功能的药物与基因传输体系携带p53基因的UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53的合成示意图；
图5为UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53纳米颗粒凝胶电泳阻滞电泳图；
图6为UCNPs@mSiO2-SS-H2A/pEGFP-N3转染HeLa细胞电镜图；
图7为UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53转染HeLa、PC-3细胞活性图；
图8为对照(a)、PEI25K(b)、UCNPs@mSiO2(c)、H2A(d)、UCNPs@mSiO2-SS-H2A(e)介导p53基因转染HeLa(A)和PC-3(B)细胞凋亡图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)、通过高温热分解反应合成UCNPs@mSiO2-NH2:
如图1所示为本实施例中UCNPs@mSiO2-NH2合成的流程示意图，具体方法如下：
首先称取2mmolCF3COONa(272.5mg)，0.78mmol(CF3COO)3Y(333.8mg),0.2mmol(CF3COO)3Yb(102.4mg),0.02mmol(CF3COO)3Er(10.13mg),一起加入含有10mL油胺的50mL的三颈瓶中。通入氩气，剧烈搅拌下温度逐渐升到160℃,并使该温度持续1.5h，以便除去该体系中残留的水和和氧气。三氟稀土化合物充分溶解后会形成淡黄色均一溶液。然后，在氩气的保护下使温度持续升到330℃，在该温度下反应3h。停止加热终止反应，当反应体系自然降温到80℃时加入20mL乙醇使之沉淀，在8000rmp条件下离心分离、重复洗涤3次。最后将所得纳米粒子分散到10mL氯仿溶液中。得油胺稳定的NaYF4:Yb3+Er3+(UpconversionNanoparticles,UCNPs)。
取1mL上述含有纳米粒子的氯仿溶液，加入到10mL含有0.2gCTAB的水溶液中。剧烈搅拌后，使溶液的温度逐渐升至60℃，使氯仿蒸发掉，获得水分散的上转换纳米粒子(UCNPs)。
将上述10mL水分散的纳米粒子加入20mL蒸馏水，使总体积定容到30mL，加到50mL三角瓶中。然后，加入3mL无水乙醇，150μLNaOH(2M)，在水浴锅中搅拌加热至70℃后，加入200μLTEOS,在此温度下继续反应1h，停止反应自然降温至室温后，在8000rmp条件下离心分离、重复洗涤3次。最后将该纳米粒子分散在10mL水溶液中。得核壳结构的UCNPs@mSiO2。(见图2为核壳结构的UCNPs@mSiO2的透射电镜图(TEM))
首先将44μL的APTES加到1mL的无水乙醇中，制备成的新鲜的APTES乙醇溶液。然后，取25μL上述溶液到10mL乙醇分散的纳米粒子中，80℃回流加热12h以上，自然冷却至室温，在8000rmp条件下离心分离、重复洗涤3次。得氨基修饰的核壳结构UCNPs@mSiO2-NH2(如图3所示为氨基修饰的核壳结构UCNPs@mSiO2-NH2的XPS图谱，其中a)为氨基修饰前的XPS图谱；b)为氨基修饰后XPS图谱)。
(2)、将组蛋白H2A与Traut试剂(2-iminothiolane·HCl)反应，合成组蛋白H2A-SS：
取10mgmL-1的组蛋白H2A加入到1mL的PBS缓冲液(含5mmolEDTA,pH:8.0)中，并与14mmol的Traut试剂46μL充分混匀，室温静止1h。10,000rmp、10min离心收集，弃上清中多余的Traut试剂，制备H2A-SS；(3)、通过琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸脂(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate,SPDP)对UCNPs@mSiO2-NH2进行活化，进而将组蛋白H2A-SS偶联到UCNPS@mSiO2-NH2上，形成新的复合物UCNPs@mSiO2-SS-H2A；
取25μLSPDP(20mM)加入到1mL含2mg的NaYF4:Yb3+Er3+@mSiO2-NH2的PBS缓冲液(含5mmolEDTA,pH:8.0)中，室温孵育60min。然后，与1mLH2A-SS的PBS缓冲液(含5mmolEDTA,pH:8.0)混合，4℃条件反应20h。最后，10,000rmp、10min条件下离心分离、重复洗涤3次，即得UCNPs@mSiO2-SS-H2A。
(4)、UCNPs@mSiO2-SS-H2A与p53基因通过静电相互作用形成UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53其中，p53基因为质粒Plasmidsp3XFLAG-CMV-p53(编码野生型p53蛋白)。如图4所示，为实施例1制备UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53的合成示意图。
实施例2细胞实验
1.凝胶阻滞实验
实验步骤：取2μL(500ngμL-1)p3XFLAG-CMV-p53(实施例1制备)，分别按照0.2:1,0.3:1,0.4:1,0.5:1,0.6:1,0.7:1,0.8:1,0.9:1的体积比例加入UCNPs@mSiO2-SS-H2A溶液，加入DNA上样缓冲液(10×)1μL，双蒸水配平总体积为10μL，在室温下充分混匀并孵育30min。在90V，1％琼脂糖凝胶条件下电泳45min，之后置于245nm紫外灯下进行观察。
实验结果表明，如图5(UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53纳米颗粒凝胶电泳阻滞)所示，将实施例1制备的UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53进行凝胶阻滞实验，当UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53的比例大于0.8时，复合物不能向凝胶电泳的正极方向泳动，证明携带p53基因的载体完全与UCNPs@mSiO2-SS-H2A纳米粒子结合，具有很好的基因包裹能力。
2.UCNPs@mSiO2-SS-H2A介导的体外基因转染实验
首先，将HeLa细胞以5×104的密度铺在6孔板中，并培养24h左右使其汇合度达到70％。去除每孔的培养基，并用1mL的PBS缓冲液淋洗3次，用含有2μgpEGFP-N3的UCNPs@mSiO2-SS-H2A/pEGFP-N3无血清培养基孵育HeLa细胞6h。之后，再用含10％胎牛血清的新鲜培养基替换掉无血清培养基，继续培养24h。最后，在荧光显微镜下观察pEGFP-N3绿色荧光蛋白在细胞内的表达情况。
如图6所示，与PEI25k和H2A相比，无论在有血清和无血清培养基中，UCNPs@mSiO2-SS-H2A都展示出很好的基因转染效率。这种基因效率的提升可能归因于纳米粒子与组蛋白H2A的结合提升了蛋白本身的稳定性，增加了复合物与细胞膜的紧密接触与相互作用能力。
3.UCNPs@mSiO2-SS-H2A介导的细胞增殖抑制作用
将HeLa和PC-3细胞以5×103细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL含10％的胎牛血清的DMEM中，在37℃、5％CO2培养箱中培养24h。之后取200μL含UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53(质量比为2:1，其中p53的量为0.2μg)的DMEM替换每孔中10％的胎牛血清的DMEM，同时设立PEI25K、H2A作为对照。细胞在同样条件下培养24h，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，37℃条件下孵育2h，吸去孔内所有液体，可见甲臜晶体形成于胞内。加入DMSO150μL,震荡10min使其甲臜充分溶解后，在495nm波长处测定其光吸收值。计算细胞存活率＝(试验组吸光度/对照组吸光度)×100％。
如图7(UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53转染HeLa、PC-3细胞活性图)所示，与PEI25k相比，UCNPs@mSiO2-SS-H2A降低了细胞毒性，作用HeLa和PC-3细胞后，其细胞活性均大于90％。当UCNPs@mSiO2-SS-H2A/p53转染HeLa细胞时,细胞活性降低到40％左右。这种细胞活性的降低表明UCNPs@mSiO2-SS-H2A介导的p53基因转染能够诱导细胞增殖的抑制。而UCNPs@mSiO2-SS-H2A介导的p53基因的转染所诱导PC-3细胞抑制作用要强于HeLa细胞。这可能是由于HeLa细胞含有野生型的p53基因，其外源p53基因的表达对内源细胞信号通路的影响较小；而PC-3细胞是p53基因突变型细胞系，外源p53基因在胞内的表达可能直接启动了胞内的细胞信号通路，引起较强的细胞增殖抑制作用。
4.UCNPs@mSiO2-SS-H2A介导的细胞凋亡作用
分别用PEI25K、UCNPs@mSiO2、H2A、UCNPs@mSiO2-SS-H2A作为载体介导p53基因的转染，如图8所示(对照(a)、PEI25K(b)、UCNPs@mSiO2(c)、H2A(d)、UCNPs@mSiO2-SS-H2A(e)介导p53基因转染HeLa(A)和PC-3(B)细胞凋亡图)，流式细胞术的结果分析表明：在PC-3和HeLa细胞中都诱导其早期凋亡作用的发生，其HeLa细胞的凋亡比例分别为2.42％、15.40％、16.36％、7.76％、20.16％；PC-3细胞的凋亡比例为0.08％、19％、27％、10％、40％。UCNPs@mSiO2-SS-H2A介导的p53基因转染所诱导的凋亡效果明显强于PEI25K、UCNPs@mSiO2、H2A载体的介导作用，而且PC-3细胞比HeLa细胞更加敏感。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种具有上转换成像功能的药物与基因传输体系，其特征在于，所述药物与基因传输体系为UCNPs@mSiO2-SS-H2A。
2.根据权利要求1所述的药物与基因传输体系，其特征在于，所述药物与基因传输体系连接的靶基因为抑癌基因。
3.根据权利要求2所述的药物与基因传输体系，其特征在于，所述抑癌基因为p53。
4.一种制备具有上转换成像功能的药物与基因传输体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、高温热分解反应合成UCNPs@mSiO2-NH2；
2)、组蛋白H2A与交联剂反应形成H2A-SS；
3)、加入活化剂对UCNPs@mSiO2-NH2进行活化，将H2A-SS偶联到活化的UCNPS@mSiO2-NH2上，形成的具有上转换成像功能的药物与基因传输体系UCNPs@mSiO2-SS-H2A。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述交联剂为Traut试剂。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述活化剂为琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸酯。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述具有上转换成像功能的药物与基因传输体系UCNPs@mSiO2-SS-H2A，连接的基因为抑癌基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述抑癌基因为p53基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述p53基因为通过静电作用连接。
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CN107158408A (zh) 2017-09-15

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