CN107108704A - 肽组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明主题是含肽ESAT‑6的至少一个片段和肽CFP‑10的至少一个片段的组合物。优选地，片段包含至少两组肽，第一组包含长度为约7至14个氨基酸残基的至少一个肽，第二组包含16个或更多氨基酸残基的至少一个肽。本发明还涉及用所述组合物的诊断方法。

Description

肽组合物及其用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2014年10月23提交的欧洲专利申请EP14190111.6的权益，其通过引用将该申请全文纳入本文。
背景技术
本发明一般涉及基于免疫学的诊断试验领域，所述基于免疫学的诊断试验包括检测细胞介导的免疫应答力试验。
基于免疫学的诊断试验是检测各种病症的重要手段。这些试验类型的效果部分在于免疫系统内成分的特异性。尽管有这样的特异性，但对于在具有活性或潜伏感染疾病状态的对象中检测低级感染或持续低水平感染而言，基于免疫学的诊断不一定总是足够灵敏。需要开发在细胞介导的免疫应答力方面灵敏度提高的诊断试验。
基于免疫学的一种诊断方法形式涉及在分离细胞培养或全血液培养中用抗原或有丝分裂原激活T细胞，然后是检测效应分子，例如刺激T细胞(也称为效应T细胞)生成的细胞因子。效应分子一般用诸如酶免疫分析、多元珠分析、酶联免疫斑点法(ELISpot)和流式细胞仪等技术检测。然而，对于常规诊断应用而言，此类试验的灵敏度和选择性通常不足。
快速评估细胞介导免疫性的能力和具有高度的灵敏度是具有临床重要性的。尤其是在免疫系统受损的患者中。临床医师需要了解疾病状态发展及其对宿主免疫系统的影响。
WO2013/000021 A1公开了灵敏度增加的改善的细胞介导的免疫响应试验。测定对象中细胞介导的免疫应答活性的方法包括将来自对象的淋巴细胞与至少两组肽接触，第一组包括约7-14个氨基酸残基长度的至少一种肽，第二组包括16个或更多氨基酸残基的至少一种肽，所述肽包括全部或部分的蛋白质抗原。
诱导细胞免疫反应的各种蛋白质抗原已在本领域公开。例如WO95/01441 A1公开了从分枝杆菌分离的肽抗原ESAT-6。WO97/09429 A2公开了从分枝杆菌分离的肽抗原CFP-10。
Laurens等(Clin.and Diagn.Lab.Imm.,2000年3月，第7期第2版,155-160页)公开了基于ESAT-6和CFP-10诊断结核病的方法。他们发现，相比使用分开的抗原，两种抗原的组合增加了体内和体外诊断试验的灵敏度和特异度。
WO2008/141226公开了各种抗原(例如ESAT-6和CFP-10)的细菌表达系统。该文件未涉及抗原的片段。
WO2009/024822公开了用于疫苗的抗原列表，但其未公开或教导特异组合CFP-10和ESAT-10或其片段。
WO2014/085713A1涉及基于标志物蛋白检测结核病的方法和组合物。公开了诊断试验，其中通过胰蛋白酶消化在探针中获得ESAT-6和CFP-10的大片段。该文未公开肽的限定组或该肽与淋巴细胞相互作用的方法。
然而，当前需要新的灵敏且选择性的抗原组合物以及相应的免疫基诊断试验。
本发明背后的问题
本发明背后的问题是提供新的灵敏且选择性的抗原组合物以及相应的免疫基诊断试验。此外，问题是提供改善的组合物和诊断结核病的试验。
发明内容
令人惊奇的发现本发明背后的问题被权利要求所述的组合物和方法所克服。本发明进一步实施方式如本文所示。
本发明主题是含ESAT-6的至少一个片段和CFP-10的至少一个片段的组合物。
如上所用，“片段”是具有比全长ESAT-6或CFP-10更少的氨基酸的肽。
本发明组合物包含ESAT-6和CFP-10的片段。然而，并不排除存在的其他片段或抗原。在本发明一个实施方式中，不存在其他片段和/或抗原。该实施方式中，组合物中的免疫原性肽全部是ESAT-6和CFP-10的片段。
在优选实施方式中，片段包含至少两组肽，第一组包含长度为约7至14个氨基酸残基的至少一个肽，第二组包含16个或更多氨基酸残基的至少一个肽。
该实施方式中，长度为约7至14个氨基酸残基的第一组肽可称为“短肽”，包含16个氨基酸残基或更多的至少一个肽的第二组可称为“长肽”。
在优选实施方式中，肽涵盖蛋白抗原ESAT-6和CFP-10的部分。在一个实施方式中，第一和第二组肽各包含ESAT-6和CFP-10的片段。
根据本发明，不排除ESAT-6和CFP-10的其他片段为组合物的一部分。因此，还可存在长度高至6个氨基酸或15个氨基酸的ESAT-6和CFP-10的片段。
在优选实施方式中，全长ESAT-6和/或CFP-10不是组合物的一部分。在其他实施方式中，不包含长度大于75、50或25个氨基酸的ESAT-6和/或CFP-10的片段。
ESAT-6(UniProt登录号:P0A564；Entrez登录号:886209)是6kDa的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)早期分泌抗原性靶标。WO95/01441A1公开了蛋白质序列和从分歧杆菌中分离的方法。
CFP10(UniProt登录号:P0A566；Entrez登录号:886194)也称作ESAT-6样蛋白eesxB和分泌的抗原性蛋白MTSA-10。WO97/09429A2公开了序列和从分歧杆菌中分离CFP-10的方法。
Laurens等(Clin.and Diagn.Lab.Imm.,2000年3月，第7期第2版,155-160页)公开了基于ESAT-6和CFP-10诊断结核病的方法。他们发现，相比使用分开的抗原，两种抗原的组合增加了体内和体外诊断试验的灵敏度和特异度。然而，现有技术未公开本发明组合物，其合并了ESAT-6和CFP-10的片段用于诱导细胞免疫应答。
“约7-14个氨基酸”表示7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。这在本文中考虑第一组肽。
“大于15个氨基酸”表示16个至全长蛋白质抗原，包括16-50个氨基酸。本文中其涉及第二组肽。本发明不限于何组肽被称为第一或第二。各组包含至少一种肽至一系列重叠的肽。具有16个或更多氨基酸内的“长肽”的长度受ESAT-6(95个氨基酸)和CFP-10(100个氨基酸)的长度所限。在具体实施方式中，长肽的最大长度小于90、小于75、小于50或小于30个氨基酸。可通过已知方法获得肽，例如体外或体内的重组肽生产方法，或通过消化ESAT-6、CFP-10或其衍生物。
衍生自蛋白抗原的7-14个氨基酸的肽和大于15个氨基酸的肽与淋巴细胞的共孵育产生更灵敏的试验，能够比其它可能的情况更早地检测淋巴细胞刺激。增加的灵敏度包括：相较于源自抗原的7-14个氨基酸范围或>15个氨基酸范围或完整抗原本身的单个肽的共孵育，对效应器分子的检测增加至少10％。增加细胞介导的免疫应答试验灵敏度的能力还允许检测效应分子的灵敏度较低的方法。此外，在本文公开的试验中的细胞介导的免疫应答的检测的量级可能与疾病阶段、发展和/或严重性相关。因此，本公开内容指导对象内细胞介导的免疫应答力的试验。
不受理论或作用模式的限制，两组肽(7-14聚体肽和>15聚体的肽)允许通过CD4+和CD8+T细胞的检测VCD4+T细胞识别>15聚体的肽且CD8+T细胞识别7-14聚体的肽。这些肽在本文中称为“CD4+肽”(>15聚体的肽)或“CD8+肽”(7-14聚体的肽)。
优选组合物包含约7-14个氨基酸残基的多种肽和16个或更多氨基酸残基的多种不同的肽。在这一方面，“多种肽”指可包含例如2-2000、优选10-1000或20-500个不同肽的池。当包含多种肽时，免疫应答通常得到改善。
在优选实施方式中，组合物还包含至少一种糖。优选所述糖是非还原糖，最优选海藻糖。
本领域已公开(例如WO2004/042396A1)糖可增加该方法和组合物的灵敏度。
在优选式实施方式中，糖是非还原糖。“非还原糖”具体指不与针对还原糖的检测试剂(如费林溶液(Fehling's solution)、本尼迪克特试剂(Benedict's reagent)或托伦试剂(Tollens'reagent))发生反应的糖。非还原糖不包含游离还原末端且因此不包含游离醛基或游离酮基。该非还原糖可具有任何长度并可以是直链或支链的。在某些实施方式中，该非还原糖包含至少两个单糖单元。根据一个实施方式，在非还原糖的任何和全部单糖单元中，与环结构中的氧原子相邻的碳原子不包含羟基且因此不包含异头羟基。根据一个实施方式，该非还原寡糖的单糖单元的环结构不包含半缩醛或半缩酮基团。根据一个实施方式，该非还原糖是寡糖，其包含10个单糖单元或更少、更有选8个单糖单元或更少、6个单糖单元或更少、5个单糖单元或更少、4个单糖单元或更少、3个单糖单元或更少或2个单糖单元。优选地，该非还原糖是二糖。根据一个实施方式，糖苷键形成于单糖单元之间，其连接一个单糖单元的还原末端与另一个单糖单元的还原末端。非还原糖的优选的示例是蔗糖和海藻糖。海藻糖是特别优选的，因为实验显示海藻糖提高应答的量级并因此提高试验灵敏度，此外包含海藻糖和抗原的组合物显示出色的储存稳定性。然而，该非还原糖还可以是单糖，其中，例如，还原末端与另一化学实体偶联并从而被其阻碍。因此，该非还原糖可以是衍生化的。糖衍生物的示例是氨基糖，其中一个或多个羟基被氨基或乙酰氨基取代。在优选的实施方式中，该非还原糖是未取代的且特别是未衍生化的。根据一个实施方式，该非还原糖不是多糖。在某些实施方式中，该非还原糖未结合至蛋白、肽或脂质或其他大分子。根据一个实施方式，该非还原糖未包含在细胞培养基或其他培养基中。根据一个实施方式，该非还原糖未包含在液体中。该非还原糖是可由样品中包含的免疫细胞代谢的。根据一个实施方式，当该非还原糖以适当浓度存在于包含样品和抗原的孵育组合物中时，其能够增加再刺激的T细胞所释放的干扰素γ。
糖可为组合物一部分。或者，可在组合物接触淋巴细胞时加入糖。
根据一个实施方式，该非还原糖是非还原二糖，优选选自海藻糖和蔗糖。根据一个实施方式，孵育组合物中非还原糖的浓度为至少1.5mg/ml，优选至少2mg/ml。上文中还描述了孵育组合物中非还原糖的合适浓度范围且参见上述公开内容。
本发明的组合物可用作诊断或治疗组合物。下面进一步概述这些用途和应用。
本发明的组合物和方法特别适用于确定细胞介导的免疫应答，优选作为诊断组合物或诊断方法。
本发明的组合物和方法特别适用于诊断结核病。用ESAT-6，CFP-10或其组合诊断结核病的试验已经在本领域中描述。
因此，本文提供用于检测对象内细胞介导的免疫应答活性的方法，所述方法包括，使所述对象的淋巴细胞接触权利要求1所述的组合物，并检测免疫细胞的免疫效应物分子的存在或升高，其中，所述免疫效应物分子的存在或水平指示所述对象的细胞介导的应答力水平。
优选地，所述对象是人且所述样品是未经稀释的全血。或者，所述样品是占待分析样品体积约10％-100％、约50％-100％、或约80％-100％的全血。样品体积可为微升或毫升的量，例如0.5μ1至5ml。方便而言，将所述全血收集在含有肝素的管中，且所述免疫效应物分子是IFN-γ。一般而言，所述免疫效应子采用其特异性抗体例如使用ELISA或ELISpot检测。
一种或多种其他添加剂可以被添加并因此包含在组合物中。例如，可以添加一种或多种对样品制备和/或样品保存必需或有利的添加剂，例如合适的抗凝血剂(如果样品是血液样品)。优选地，该抗凝血剂是肝素。添加剂不应以会干扰细胞介导的免疫应答的浓度包含在内。根据一个实施方式，除了非还原糖外，未向孵育组合物中添加其他单糖。根据一个实施方式，除了所述非还原糖外，不向孵育组合物中添加其他还原糖，特别是还原单糖。
所述对象可受选自分枝杆菌(Mycobacterium)属例如结合分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或结核(TB)、葡萄球菌(Staphylococcus)属、链球菌(Streptococcus)属、包柔氏螺旋体菌(Borrelia)属、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、志贺菌(Shigella)属、变形杆菌(Proteus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、疱疹病毒、乙型或丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)的病原剂感染或患有其导致的疾病。
还提供一种使用户能够测定对象的细胞介导的免疫应答力状态的方法，所述方法包括：
(a)通过通讯网络接收免疫效应物分子的水平或浓度形式的数据，所述数据相较于对照提供与所述对象中细胞介导的免疫应答力状态的相关性，其中在淋巴细胞暴露于本发明组合物之后检测所述免疫效应物分子；
(b)通过单变量或多变量分析处理数据以提供免疫应答力值；
(c)根据免疫应答力值结果，与预定值相比，确定所述对象的状态；和
(d)通过通信网络将对象状态指示转移到用户。
在一个实施方式中，组合物包含至少一种其他抗原或其片段。优选地，其他抗原是结核病抗原，优选TB7.7或TB37.6。
在一个实施方式中，淋巴细胞接触CD4+和CD8+肽的组合。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用。“免疫细胞”包括淋巴细胞，例如T-细胞。
“组合”也包括多个部分如两部分组合物，其中所述试剂单独提供或单独使用或单独分散或分散前一起混合。例如，多部分试验包可以具有长度为约7至14个氨基酸残基和/或大于15个氨基酸残基的一系列重叠肽，其涵盖全部或部分蛋白质抗原，其中待检测针对其的细胞介导的免疫应答。因此，本公开内容的这方面包括试剂，所述试剂经干燥且游离或固定到试验包的分隔壁或固体支持物。
本公开涉及肽集合。术语“组”可以被诸如“池”、“队”、“系列”、“集合”等替换而不脱离本公开的方法。各组包含至少一种肽且在一个实施方式中包括一系列重叠的肽。因此，第一组可含有一系列长度为7-14个氨基酸残基的重叠的肽。这些肽被CD8+T细胞识别(CD8+肽)。第二组可含有一系列长度大于15个氨基酸残基的重叠的肽。这些肽被CD4+T细胞识别(CD4+肽)。两组肽都涵盖蛋白抗原的整个长度或一部分。此外，该肽不必是重叠的或者可通过单个氨基酸或多个氨基酸来重叠。
提及包括全部或一部分蛋白抗原的长度为约7-14个氨基酸残基的一系列重叠的肽时，指长度为约7个氨基酸残基至最多14个氨基酸残基的肽或其部分，所述肽从蛋白抗原的N末端至其C末端总共从蛋白抗原的各氨基酸残基跨越至最多6个氨基酸残基。因此，如果给定肽的长度为x个氨基酸残基，其中x为约7-14，则两种连续肽之间重叠的长度为x-1至x-6。在一个实施方式中，各连续肽的重叠为x-1。长度大于15个氨基酸残基的一系列重叠的肽也跨越全部或部分蛋白抗原，其中各肽的长度为至少16个氨基酸残基或最多完整蛋白抗原的长度。在一个实施方式中，长度大于15个氨基酸残基的肽是约16-50个氨基酸，如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸残基。如上所述，不需要肽重叠，只要存在至少一组一个或多个7至14个氨基酸的肽和另一组至少一种>15聚体的肽。
本发明包括以下情况，即系列中的各肽是相同长度的(即x)。然而，该肽系列可包含x1、x2、xj…xi肽的混合物，其中xi肽的长度为约7-14个氨基酸残基或大于15个氨基酸残基。
本发明提供了用于检测对象中的细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括用本发明组合物孵育来自对象的淋巴细胞，然后筛选由活化的淋巴细胞产生的效应器分子的水平。
淋巴细胞通过与至少两组肽共孵育来活化，第一组包含至少一种长度为约7-14个氨基酸残基的肽且第二组包含至少一种长度为16个氨基酸残基或更长的肽，所述肽包括全部或一部分蛋白抗原。
本公开内容指导暴露于本发明组合物的淋巴细胞的效应分子的生成量增高。该淋巴细胞是“活化的”或“刺激的”淋巴细胞。通过将细胞暴露于本发明的组合物来发生增大(augmentation)。应答的水平大于存在全抗原或衍生自抗原的小于7个氨基酸或大于14个氨基酸的肽的情况。这使试验更加灵敏以评估对象内细胞介导的免疫应答力。因此，本发明提供检测、评价或另外监控对象中细胞介导反应的试验，这是通过检测由本发明组合物刺激的T细胞效应分子的存在或水平来进行。所述试验还允许更早检测细胞介导的应答力。在一个实施方式中，其所指导的试验增强了细胞介导试验的灵敏度，该试验可使灵敏度较低的检测实验可行。此外，建议所述细胞介导的免疫应答的程度或量反映或提供病症状态、发展和/或严重性的信息。例如，所述应答的大小可确定对象是否患有潜在或活动性或急性的感染或病症。
方便地，该CD4+和/或CD8+肽可分为单独的肽池。
不受理论或作用模式的限制，至少两组肽使得CD4+和CD8+表位都被刺激。所述肽在本文中称为“CD4+肽”(>15聚体肽)或“CD8+肽”(7-14聚体肽)。
还可在孵育组合物中添加额外试剂以例如调控调节T细胞(T-调节细胞)的活性。后者包括抑制调节性T细胞的抑制功能。本文所涵盖的调节T调节细胞的试剂包括CD25配体；编码JAK1或TYK2遗传物质的正义或反义寡核苷酸；中和抗体；包括寡核苷酸的CpG；用作toll-样受体(TLR)调控剂的寡核苷酸；和其他TLR调控剂。
在特定实施方式中，T调节细胞是活性被抑制的免疫应答抑制细胞。
“CpG分子”指包括CpG序列或基序的寡核苷酸。
本发明提供一种测定对象内细胞介导的免疫应答力的方法，并进而指导测定病症或试剂是否诱导免疫抑制或与免疫抑制相关联。方法也能诊断传染病，病理状况，测定免疫活性水平和评价对内源或异源试剂的免疫细胞应答力，以及评价暴露于蛋白质毒剂。该试验还能筛选先前暴露于特定抗原(例如与疾病、感染或毒物相关联的抗原)的对象。
因此，本文指导的一方面考虑用于检测对象内细胞介导的免疫应答活性的方法，所述方法包括使所述对象的淋巴细胞接触本发明组合物，并检测由免疫细胞产生的免疫效应物分子的水平，其中，所述免疫效应物分子的水平指示所述对象的细胞介导的免疫应答力的水平。
本文考虑的另一方面是用于检测对象内细胞介导的免疫应答活性的方法，所述方法包括使所述对象的淋巴细胞接触本发明组合物，并检测免疫细胞的免疫效应物分子的水平的升高，其中所述免疫效应物分子的水平指示所述对象的细胞介导应答力的水平，其中，所述应答力的水平指示了选自病原剂感染、自体免疫疾病、癌症、炎性病症和暴露于毒性蛋白质剂的疾病或病症的存在或不存在或水平或阶段。
本文提供的另一方面是用于检测对象内细胞介导的免疫应答活性的方法，所述方法包括使所述对象的淋巴细胞接触本发明组合物，并检测免疫细胞的免疫效应物分子的水平的升高，其中，所述免疫效应物分子的水平指示细胞介导应答力的水平，并指示选自病原剂感染、自体免疫疾病、癌症、炎性病症和暴露于毒性蛋白质剂的疾病或病症的存在或不存在或水平或阶段。
本公开内容指导的另一个方面是检测对象内疾病或病症的存在、不存在、水平或阶段的试验，所述方法包括使所述对象的淋巴细胞接触本发明组合物，并检测免疫细胞的免疫效应物分子的水平的升高，其中，所述免疫效应物分子的水平指示所述疾病或病症。
本公开内容还涵盖一种用于测定试剂是否诱导对象内免疫抑制的方法，所述方法包括使所述对象的淋巴细胞在暴露于所述试剂后接触本发明组合物，并检测所述淋巴细胞的效应分子的存在和水平，其中，所述效应分子的水平确定由所述试剂诱导的免疫抑制的水平。
根据此方面，所述试剂可以是药物或环境毒剂。
在一个实施方式中，所述淋巴细胞包含在血样内。在一个实施方式中，血样与本发明组合物共刺激。
还提供本发明组合物在制备细胞介导的免疫应答力的诊断试验中的应用，该应用通过将淋巴细胞和限制量的激动剂孵育并检测效应分子的存在或升高的方法进行。
在另一个实施方式中，本文指导用于检测病症是否诱导对象内免疫抑制的方法，所述方法包括使具有病症的对象的淋巴细胞接触本发明组合物，检测所述淋巴细胞的免疫效应物分子的存在或水平，其中，所述免疫效应物分子的水平指示经诱导的或与该病症相关的免疫抑制的程度。
还提供本发明组合物在细胞介导的免疫应答力的诊断试验制造中的应用。通常，该方法包括用本发明组合物孵育淋巴细胞。
此应用包括检测或监控疾病或病症的存在、缺失、水平或阶段，所述疾病或病症例如病原体感染、自身免疫疾病、癌症、炎性病症和/或暴露于药剂或毒性蛋白质试剂如环境毒剂。检测“免疫效应物分子”包括检测一个或多个不同类型的分子。
本公开内容还提供用于检测对象内细胞介导的免疫应答活性的方法，所述方法包括使所述对象的调节T细胞接触选自以下的试剂：(1)抑制型调节T细胞的抑制剂；和(ii)免疫增强细胞或其亚群的活化剂；并进一步使T细胞接触本发明组合物，并检测免疫细胞的免疫效应物分子的水平的升高，其中，所述免疫效应物分子的水平指示所述对象的细胞介导应答力的水平。
T调节功能的抑制剂或调节剂的示例包括CD25配体，例如但不限于CD25的多克隆或单克隆抗体或其抗原结合片段，CD25的人源化或去免疫多克隆或单克隆抗体或者多克隆或单克隆抗体的重组或合成形式。试剂的其他示例包括正义或反义核酸(nucleic)和分子，其针对编码Janus酪氨酸激酶1(JAK1)或酪氨酸激酶2(TYK2)或者JAK1或TYK2蛋白的小分子抑制剂的mRNA或DNA(即遗传物质)。提及“小分子”包括免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，如描述于国际专利公开号WO2005/118629。然而，合适试剂的其他示例包括刺激剂，例如通过Toll样受体(TLR)和/或其他机理作用的CpG分子。因此，作为TLR调节剂的包含一个或多个寡核苷酸的CpG也形成本发明的一部分。
可使用单一类型试剂或使用两个或更多类型试剂来调控调节性T细胞。例如，该试验可用下述试剂进行：CD25配体和JAK1/TYK2正义或反义寡核苷酸；CD25配体和TLR调节试剂；JAK1/TYK2正义或反义寡核苷酸和TLR调节试剂；或CD25配体，JAK1/TY 2正义或反义寡核苷酸和TLR调节试剂。或者，只使用一种类型的试剂。或者，可使用包含寡核苷酸和TLR调节剂的CpG。
提及“对象”，包括人类或非人物种，包括灵长类，家畜动物(如绵羊，牛，猪，马，驴，山羊)，实验室试验动物(如小鼠，大鼠，兔，豚鼠，猪，仓鼠)，伴侣动物(如狗，猫)，鸟类物种(如家禽鸟，飞鸟)，爬行动物和两栖动物。本发明主题可用于人体医学，以及畜牧和兽医和野生应用，包括马、狗和骆驼比赛行业。例如，本公开内容的试验通常可用于马的强度劳作(如赛跑)之前和/或之后以筛选运动诱发肺出血(EIPH)的证据。所有马在运动中显示一定程度的一些EIPH形式。然而，EIPH的亚临床形式难以检测。
提及“人”，包括特定人群，例如儿童、老年和体弱人群以及特定种族的人的特定组和群体。
另一个实施方式中，对象是人且细胞介导的免疫应答试验用于筛选对致病微生物、病毒和寄生虫的应答力，发展可能，或监控免疫情况，乳糜泻，监控对象应答肿瘤攻击和测定任何免疫缺陷或免疫抑制的存在。后者可由例如包括各种化疗剂的某些药物引起。或者，暴露于环境蛋白质毒剂或污染物。
免疫效应物分子可以是应答细胞活化或抗原刺激所产生的某一范围分子的任何一种。尽管干扰素(IFN)例如IFN-γ是特别有用的免疫效应物分子，其它的免疫效应物分子包括一定范围的细胞因子，例如，白细胞介素(IL)，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-6(CXCL8)、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16(LCF)或IL-17、IL-1α(IL-1F1)、IL-1β(IL-1F2)、IL-1γ(IL-1F3)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、集落刺激因子(CSF)，如粒细胞(G)-CSF或粒细胞巨噬细胞(GM)-CSF、补体组分5a(C5a)、Groα(CXCL1)、sICAM-1(CD54)、IP-10(CXCL10)、I-TAC(CXCL11)、MCP-1(CCL2)、MIF(GIF)、MIP-1α(CCL3)、MIP-1β(CCL4)、RANTES(CCL5)或MIG(CXCL9)。
本发明还提供用于检测对象内细胞介导的免疫应答活性的方法，所述方法包括使所述对象的淋巴细胞接触本发明组合物，并检测来自免疫细胞的免疫效应物分子的水平，其中，所述免疫效应物分子的水平指示所述对象的细胞介导的应答力的水平。
本文指导的试验能检测对象中疾病或病症的存在或缺失或水平或阶段，所述疾病或病症例如病原体感染、自身免疫疾病、癌症、暴露于炎性病症、暴露于药物、暴露于毒性蛋白质试剂以及例如由病症诱导的免疫缺陷或免疫抑制。
在一个实施方式中，从对象收集的样品一般存于血液收集管中。血液收集试管包括抽血管或其他类似容器。便利地，当样品是全血时，肝素化血液收集管。或者，血液收集后向试管加入肝素。
尽管全血特别加以考虑且是最方便的样品，本发明也延伸到含有免疫细胞的其他样品，例如淋巴液，脑液，组织液和包括鼻腔和肺液在内的呼吸液以及经历细胞清除的样品。提及“全血”，包括没有被稀释(例如用组织培养，培养基，试剂，赋形剂等)的全血。在一个实施方式中，术语“全血”包括至少10％全血体积的试验样品(即反应混合物)。可加入额外试剂，例如培养基，酶，赋形剂、抗原等，而不离开包括“全血”的样品。
血液体积可为约0.5μ1至200mL。本发明还提供声微流在改善试验的组分的混合中的应用。声微流公开于国际专利申请PCT/AU01/00420中。
因此，本文考虑在容器中混合一种或多种淋巴细胞与本发明组合物的方法，所述方法包括提供约0.5μl～150μl的液体，所述液体包含所述容器中的成分以建立声阻抗中的不连续并施加声信号以引起所述液体内的混合。还可以应用第二声信号，第一和第二信号具有各自频率，各以交替方式选自约1Hz至约20,000Hz的频率，以在流体内产生混沌混合。
血液收集管的应用与标准自动化实验室系统相容，这些可适合大量和随机存取抽样的分析。血液收集管也使处理成本最小化并减少实验室暴露于全血和血浆，因而降低实验室人员接触病原体的风险，例如HIV，乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)。
孵育步骤和收集管的组合特别有效并提高试验的灵敏度，还提高了在单糖例如右旋糖或葡萄糖存在下孵育细胞的可选特性。
在对象抽血后的延长期后，细胞介导免疫系统的细胞丧失了增加全血中免疫应答的能力，并且无干扰的应答在抽血后约24小时常常严重降低或缺失。和对专门塑料制品的需求允许在护理地点用所述肽抗原进行细胞介导的刺激，例如医师诊所、诊所、门诊设施和兽医检验或农场上。一旦抗原刺激完成，不再需要新鲜和活性细胞。IFN-γ和其他细胞因子或免疫效应物分子在血浆中稳定，因此，样品能存储或运输而不需要特殊条件或快速时间要求。
孵育步骤可为1-50小时，例如1-40小时或8-24小时。24小时时间段特别适合。
检测细胞介导免疫的能力对评价对象的下述能力重要：对病原体例如微生物或病毒或寄生虫感染的应答，增加自体免疫应答例如自体免疫糖尿病或保护抵御癌症或其他肿瘤病症或检测炎性病症或检测对象对毒性试剂例如铍的暴露或敏感性。本文所述试验也能检测导致免疫抑制或药物诱导免疫抑制的病症。因此，提及“检测对象的细胞介导的免疫应答”，包括和涵盖传染和自体免疫疾病的免疫诊断，免疫活性标记和炎症、癌症和毒性试剂的标记。重要的是，组合的先天和/或获得性免疫应答力得到测定。另外，使用小体积血液的能力使得试验在例如儿童、老年和体弱人群中简单易行。本文所述的试验使免疫应答力的早期检测或更敏感的检测可行。
在一个实施方式中，造成免疫抑制的病症包括慢性感染和癌症。能导致免疫抑制的药物包括那些用于治疗风湿性关节炎，癌症和炎症性肠病的药物。
病原体或感染剂包括细菌、寄生虫和病毒。细菌的示例包括革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物，例如分枝杆菌属(Mycobacterium)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，链球菌属(Streptococcus)，大肠杆菌(Escherichia coli)，沙门氏菌(Salmonella)，梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，志贺菌属(Shigella)，变形杆菌属(Proteus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，嗜血杆菌属(Hemophilus)，伯疏氏螺旋体属(Borrelia)等。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)以及结核分枝杆菌感染产生的病症例如结核病(TB)是特别有用的靶标。病毒示例包括肝炎病毒(乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)，疱疹病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)和其产生的疾病。寄生虫包括疟原虫属(Plasmodium)，环癣，肝寄生虫等等。其他病原体包括真核细胞，例如酵母和真菌。
在一个实施方式中，其他结核病抗原是TB7.7或TB37.6。在一个实施方式中，所述对象被HIV感染。
本发明特别用于筛选对结核分枝杆菌的暴露。因此，本公开内容指导用于检测对象内细胞介导的免疫应答活性的方法，所述方法包括使所述对象的淋巴细胞接触本发明组合物，其中片段任选包含来自其他抗原的肽选自结核分枝杆菌的TB7.7和TB37.6，并检测由免疫细胞产生的免疫效应物分子的水平，其中，所述免疫效应物分子的水平指示所述对象针对结合分歧杆菌的细胞介导的免疫应答力的水平。
本文所述用于检测的自身免疫疾病包括脱发斑秃，强直性脊柱炎，抗磷脂综合症，自身免疫阿狄森氏病，多发性硬化症，肾上腺自体免疫疾病，自体免疫溶血性贫血，自体免疫性肝炎，自体免疫卵巢炎和睾丸炎，白塞氏病，大疱性类天疱疮，心肌病，口炎性腹泻皮炎(celiac sprue-dermatitis)，慢性疲劳综合症(CFIDS)，慢性炎症脱髓鞘，慢性炎症多神经病，变应性肉芽肿性血管炎，瘢痕性类天疱疮，CREST综合症，冷凝集素病，克隆氏病，疱疹样皮炎，盘状红斑狼疮，基本混合冷球蛋白血症，纤维组织肌痛，肾小球肾炎，格雷弗氏病，格林-巴利症，，桥本甲状腺炎，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA肾病，胰岛素依赖型糖尿病(I型)，扁平苔藓，红斑狼疮，梅尼埃病，混合性结缔组织病，多发性硬化症，重症肌无力，心肌炎，寻常性天疱疮，恶性贫血，结节性多动脉炎，多软骨炎，多腺体综合症(polyglancular syndromes)，风湿性多肌痛，多发性肌炎和皮肌炎，原发性无丙种球蛋白血症，原发性胆汁性肝硬化，牛皮癣，雷诺氏现象，赖特尔综合症，风湿热，类风湿关节炎，结节病，硬皮病，舍格伦综合症，全身肌强直综合症，系统性红斑狼疮，多发性大动脉炎，颞动脉炎/巨细胞动脉炎，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，血管炎和白癜风。
评价暴露于传染实体的对象中潜在或实际的细胞介导的应答力通常是重要的。本发明方法也能用于检测这些情况是否出现以及疾病过程的水平和阶段。
能导致免疫抑制的其他病症包括炎症病症。
本公开内容描述的炎症病症示例包括但不限于，导致某些区域变红、肿胀、疼痛和发热感觉应答的疾病和紊乱，其用于保护受损伤或疾病影响的组织。能使用本发明方法治疗的炎性疾病包括但不限于：痤疮、心绞痛、关节炎、吸入性肺炎、疾病、积脓症、肠胃炎、炎症、肠流感、NEC、坏死性肠炎、盆腔炎、咽炎、PID、胸膜炎、喉咙发炎、红肿、发红、喉咙痛、肠胃感冒和尿路感染、慢性炎症脱髓鞘多神经病、慢性炎症脱髓鞘多神经根神经病、慢性炎症脱髓鞘多神经病、慢性炎症脱髓鞘多神经根神经病。关于非人类应用，本发明也检测马的EIPH和各种动物病症，例如袋獾面部肿瘤。
癌症治疗部分取决于细胞介导免疫和肿瘤本身或用于治疗肿瘤的药物可导致免疫抑制。本文所述肿瘤包括一组疾病和紊乱，其特征为细胞生长失控(例如肿瘤形成)且这些细胞没有分化为任何专门且不同的细胞。这些疾病和紊乱包括：ABL1原癌基因、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病、腺样囊腺癌、肾上腺皮质癌、特发性髓样化生、秃头症、泡软组织肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形胶质细胞瘤、共济失调毛细血管扩张症、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳腺癌、CNS肿瘤、类癌瘤、子宫颈癌、儿童脑肿瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、结直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、促纤维组织增生性小细胞癌、导管癌、内分泌癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、肝外胆道癌、眼癌(eye cancer)、眼：黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血、纤维肉瘤、胆膀胱癌、胃癌、胃肠道癌、胃肠道类癌肿瘤、泌尿生殖系统的癌症、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞疾病肿瘤、神经胶质瘤、妇科癌症、恶性血液肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传乳腺癌、组织细胞增生症、何杰金氏病、人类乳头状瘤病毒、水囊状胎块、高钙血症、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、郎格罕细胞组织细胞增多病、喉头癌、平滑肌肉瘤、白血病、李-佛美尼综合症、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴性水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、肾恶性横纹肌肿瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、转移癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合症、骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻腔癌、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤病、奈梅亨破损综合症、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、眼癌(ocular cancers)、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌、胰腺癌、鼻窦癌、副甲状腺癌、腮腺肿瘤、阴茎癌、周边神经外胚层肿瘤、垂体肿瘤、真性红细胞增多症、前列腺癌、罕见癌症和相关疾病、肾细胞癌、成视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、先天性皮肤异色症、唾液腺肿瘤、肉瘤、神经鞘瘤、塞扎里综合症、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠肿瘤、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾-肾盂-/-输尿管)、滋养细胞癌、尿道癌、泌尿系统的癌症、膜板块蛋白、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、沃尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
在上述方面中，所述抗原可获自所述病原剂，与所述病症或癌症相关或是所述毒剂。或者，感染、疾病病症、癌症或毒剂可抑制细胞介导的免疫，此时可使用对象先前已接触的任何抗原。
免疫效应物分子的检测可以在蛋白或核酸水平检测。因此，免疫效应物分子的“出现或水平”包括直接和间接数据。例如，细胞因子mRNA的高水平是显示细胞因子水平增加的间接数据。
免疫效应物的配体对检测和/或定量这些分子特别有用。免疫效应物的抗体特别有用。本文所述试验的技术为本领域已知，并包括，例如放射性免疫试验、夹心法试验，ELISA和酶联免疫斑点法。提及“抗体”包括抗体的部分，哺乳动物化(例如人源化)抗体，去免疫抗体，重组或合成抗体以及杂交和单链抗体。对于人皮肤实验，本文特定描述人源化或去免疫抗体用于检测效应物分子。
多克隆和单克隆抗体都可用免疫效应物分子或其抗原片段免疫得到，且任一类型都可用于免疫试验。获取两种血清的方法为本领域熟知。
多克隆血清不太优选，但相对易于制备，通过向合适实验室动物注射有效剂量的免疫效应物或其抗原部分，从动物收集血清，并用任何已知免疫吸附剂技术分离特定血清。尽管此种方法生产的抗体可用于几乎任何类型的免疫分析，但是它们通常因为产品的潜在异质性而不受青睐。
免疫分析中应用单克隆抗体特别有用，因为其能大量生产且产品具有同质性。可使用本领域技术人员熟知的技术通过融合永生细胞系和对免疫原性制品敏感的淋巴细胞来获得用于单克隆抗体生产的杂交瘤细胞系制备物。
因此，另一方面本发明提供检测对象含淋巴细胞的样品中免疫效应物分子的方法，所述方法包括将样品或等分样品与对免疫效应物分子或其抗原片段具有特异性的抗体在足以形成抗体-效应物复合体情况下接触一段时间，并且然后检测复合体，其中在淋巴细胞与本发明组合物孵育后产生免疫效应物分子。
“样品”包括全血或其包括淋巴细胞的部分。方法包括平板或球形固体支持物上的微阵列，宏阵列和纳米阵列。可用微或宏阵列。“样品”还包括约0.5μl至1000μl，包括5μl、10μl、20μl、50μl和100μl的小体积样品，以及较大体积例如1ml至约200ml，例如1ml、2ml、5ml、10ml或20ml样品。
可使用多种免疫试验技术，参见美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653。
下面是一类试验的描述。没有标记的抗体固定于固体底物，待检测免疫效应物分子(如细胞因子)的样品与结合分子接触。经过一段合适时间的孵育，时间足以形成抗体-免疫效应物分子复合体，然后加入对效应物分子特异的二抗、标记有能产生检测信号的报道分子，孵育且时间足以形成另一抗体-效应物-标记抗体复合物。洗去任何没有反应的物质，通过观察报道分子产生的信号来测定效应物分子的存在。结果可以通过简单观察可见信号来定量，或通过对比含已知抗原量的对照样品来定量。此广义技术为本领域技术人员熟知，可以是多种变化中的任一种。
在这些试验中，对即时免疫效应物具有特异性的一抗可共价或被动结合到固体表面。该固体表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以是试管，珠，球，微孔板盘，或其他适合作免疫分析的合适表面。结合过程为本领域熟知，并通常由共价交联结合或物理吸附组成，洗涤聚合体-抗体复合物以制备检测样品。检测的等份样品随后加入固相复合物并在合适情况下(例如约20℃-约40℃)孵育足够时间(例如2-120分钟或更合适的时间，过夜)以使抗体中存在的任何亚基结合。孵育期后，洗涤抗体亚基固相并干燥，用对部分效应分子具有特异性的二抗孵育。二抗连接报道分子，用于指示二抗与效应分子的结合。
此试验存在很多变化。一个特别有用的变化是所有或很多成分基本同时混合时同时分析。另外，抗体与细胞因子的结合可以通过与针对首先提及抗体的经标记抗体的结合来测定。
本说明书所用的“报道分子”，指通过分子其化学性质提供可分析鉴定的信号，从而检测结合抗原的抗体。检测可以是定性或定量的。该类型的试验中最常用的报告分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。合适荧光团的示例在表1中提供。在酶免疫试验的情况下，酶偶联至二抗，通常通过还原戊二醛或高碘酸盐的方式。然而，应理解存在多种不同偶联技术，这对本领域技术人员而言是显而易见的。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。通常选择与特异性酶一起使用的底物以用于在使用相应酶进行水解后生成可检测的颜色变化。合适的酶的示例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可以使用荧光底物，产生荧光产物而不是上面提及的发色底物。所有情况中，将酶标记的抗体加入第一抗体-抗原复合物中，使之结合，然后洗去多余试剂。然后将含合适底物的溶液加入抗体-抗原-抗体复合物中。底物与连接二抗的酶反应，产生定性可见信号，通常可用分光光度分析进一步定量，指示样品中存在的抗原量。再者，本方面延伸至基本同时的分析。
或者，荧光化合物例如荧光素和若丹明，可以化学偶联于抗体上而不改变其结合能力。当用特定波长光照射激活时，荧色物标记抗体吸收光能，诱导分子激发性状态，然后发射用光学显微镜视觉可检测的特征性颜色的光。荧光标记抗体可结合第一抗体-抗原复合物。洗去未结合试剂后，剩余三元复合物随后暴露在合适波长光下，观察到的荧光指示感兴趣抗原的存在。免疫荧光和酶学免疫实验技术都是本领域中非常成熟的且对本方法特别优选。然而，也可使用其他报道分子，例如放射性同位素，化学发光或生物发光分子。
可以使用一系列其它检测系统，包括胶体金和本公开内容涵盖的所有这种检测系统。
本公开内容也包括遗传分析，例如涉及PCR分析以检测编码免疫效应物的遗传序列的RNA表达产物。
在一个实施方式中，使用引物对完成PCR，引物之一或两者一般用相同报道分子或能给出可区分信号的不同报道分子标记。使用荧光团在本发明实践中特别有用。合适荧光团的示例可选自表1中给出的列表。其他标记包括发光和磷光以及红外染料。这些染料或荧光团也可用作抗体的报道分子。
表1
合适荧光团的列表
Ex：激发峰波长(nm)Em：发射峰波长(nm)
本文包括分析荧光发射的任何合适方法。就此而言，本文指导的技术包括但不限于：2光子和3光子时间分辨荧光光谱，如Lakowicz等，Biophys.J.72:567，1997所公开，荧光寿命成像，如Eriksson等，Biophys.J.2:64，1993所公开，和荧光共振能量转移，如Youvan，Biotechnology et elia 3:1-18，1997所公开。
发光和磷光可分别由本领域已知的合适的发光或磷光标记物产生。任何可以鉴定这种标记物的光学方法能用于此方面。
红外辐射可由合适的红外线染料产生。可用于本发明的红外染料示例包括但不限于，Lewis等，Dyes Pigm.42(2):197，1999，Tawa等，Mater.Res.Soc.Symp.Proc.488[Electrical,Optical and Magnetic Properties of Organic Solid-State MaterialsIV(有机固态材料的电学，光学和磁学属性IV)]，885-890，Daneshvar等，J.Immunol.Methods 226(1-2):1-128，1999，Rapaport等，Appl.Phys.Lett.74(3):329-33，1999和Durig等，J.Raman Spectrosc.24(5):2-285，1993所公开染料。任何合适红外光谱法可以用于检测红外染料。例如，为此可使用傅里叶变换红外光谱，如Rahman等，J.Org.Chem.63:6196，1998所述。
合适地，电磁散射可由包括光和X射线在内的入射电磁辐射的衍射，反射，偏振或折射产生。这种散射可用于定量mRNA水平或蛋白质水平。
流式细胞术在分析荧光团发射中特别有用。
如本领域已知，流式细胞仪是高通量技术，涉及到快速分析粒子的物理和化学特性(例如，标记的mRNA，DNA或蛋白)，因为其悬浮于液体流时通过一个或多个激光束路径。因为每个粒子截断激光束，可检测每个细胞或粒子发射的散射光和荧光并通过任何合适追踪算法例如下述算法来记录。
现代流式细胞仪能完成这些任务达到每秒每个粒子100,000个细胞。通过使用滤镜和二向色镜的光学阵列，能分开不同波长荧光并同时检测。另外，可使用有许多不同激发波长的激光。因此，可采用各种荧光定位和检测例如，一个样品内的不同免疫效应物或多个对象的免疫效应物。
可用于本公开内容的方法的合适流式细胞仪包括使用单个激发激光测量5-9个光学参数(见表2)，通常在15mW以其488nm光谱线操作氩离子冷却式激光器。更先进的流式细胞仪能使用多个激发激光，例如氩离子激光(488或514nm)以外的HeNe激光(633nm)或HeCd激光(325nm)。
表2
可通过流式细胞仪测量的示例性光学参数
使用488nm激发激光
带通滤波器宽度
"长通滤波器
例如，Biggs等(1999)，Cytometry 36:36-45使用三个激发激光已经构建了11参数的流式细胞仪，并显示使用正向和侧向散射检测以外的九个可区分荧光团，以免疫分型(即分类)粒子。参数的选择能充分使用，主要根据所有荧光团之间的消光系数，量子产率和光谱重叠数量(Malemed等(1990)，“Flow cytometry and sorting(《流式细胞术和分选》)”，第二版，纽约的约翰威立(Wiley-Liss))。应理解本发明不限于任何特定流式细胞仪或任何特定参数组。就此而言，本公开内容还包括使用微型流式细胞仪代替传统流式细胞仪，例如Fu等(1999)，Nature Biotechnology 17:1109-1111所公开。
本文提供的试验可以自动或半自动，用于从一个对象中高通量筛选或用于筛选许多免疫效应物。通过计算机软件可方便控制自动操作。
因此本公开内容还包括基于网络和非基于网络的系统，其中对象的细胞介导免疫应答力数据通过客户服务器或其他结构平台提供到中央处理器，其分析和对比对照且任选考虑其他信息例如患者年龄，性别，体重，和其他医学条件，然后提供报告，例如，疾病严重性或进展或状态或疾病发展可能性指数的风险因子。因此也提供商业方法，其中在运输管中收集血液，然后在定义位点分析细胞介导的免疫应答力，然后所述结果通过客户服务器或其他结构平台以电子报告形式送达临床护理提供者。
因此，基于知识的计算机软件和硬件也形成本公开内容的部分。这有助于临床护理确定包括感染、炎症癌症或药物或毒剂的病症是否诱导或与免疫抑制相关。
本公开内容提供的试验可用于现有或新开发的与病理学行业相关的基于知识的结构或平台。例如，试验结果通过通讯网络(例如因特网)或电话联系传到处理系统，其中算法被存储并用于产生预测后验概率值，其转换成细胞介导免疫应答力或免疫抑制指数，再以诊断或预测报告形式转入终端使用。本报告也形成临床护理管理和个性化医疗的基础。
因此，所述试验可采用试剂盒或基于计算机系统的形式，包括在淋巴细胞暴露于本发明组合物之后检测所述免疫效应物分子的浓度的所需试剂，和用以协助确定并传送报告至临床医师的计算机硬件和/或软件。
例如，本发明包括允许用户测定对象细胞介导的免疫应答力状态的方法，所述方法包括：
(a)通过通讯网络接收免疫效应物分子的水平或浓度形式的数据，所述数据相校对照提供与细胞介导的免疫应答力状态的相关性，其中在淋巴细胞暴露于本发明组合物之后检测所述免疫效应物分子；
(b)通过单变量或多变量分析处理对象数据以提供免疫应答力值；
(c)根据免疫应答力值结果，与预定值相比，测定对象状态；和
(d)通过通信网络将对象状态指示转移到用户。
提及“单变量”或“多变量”分析，包括执行单变量或多变量解析函数的算法。
便利地，所述方法一般还包括：
(a)使用户使用远程终端站测定数据；和
(b)通过通讯网络从终端站向基站转移数据。
所述基站能包括第一和第二处理系统，其中所述方法包括：
(a)转移数据到第一处理系统；
(b)转移数据到第二处理系统；和
(c)使第一处理系统执行单变量或多变量解析函数以产生细胞介导免疫应答力值。
所述方法还可包括：
(a)转移单变量或多变量解析函数的结果到第一处理系统；和
(b)使第一处理系统测定对象状态。
本情况中，所述方法也包括一下的至少一个：
(a)通讯网络和第一处理系统之间通过第一防火墙转移数据；和
(b)在第一和第二处理系统之间通过第二防火墙转移数据。
所述第二处理系统可以连接到适应存储预定数据和/或单变量或多变量解析函数的数据库，所述方法包括：
(a)查询数据库以得到至少所选预定数据或访问数据库中单变量或多变量解析函数；和
(b)对比所选预定数据和对象数据或产生细胞免疫应答力或免疫抑制的水平的预测的可能性指数。
所述第二处理系统能连接到数据库，所述方法包括在数据库中存储数据。
所述方法还包括使基站：
(a)测定支付信息，支付信息代表用户支付条款；和
(b)响应测定支付信息进行对比。
本公开内容还提供相对细胞介导的免疫应答力或免疫抑制测定对象状态的基站，所述基站包括：
(a)存储方法；
(b)处理系统，处理系统适合于：
通过通讯网络从所述用户接收对象数据，所述数据包括免疫效应物分子的水平，其中，所述免疫效应物分子的水平相较对照与细胞介导的免疫应答力状态相关联，其中，在淋巴细胞暴露于本发明组合物之后测定所述免疫效应物分子；
(d)完成算法函数，包括对比数据与预定数据；
(e)根据包括对比的算法函数结果测定对象状态；和
(c)通过通讯网络输出对象状态指示到用户。
所述处理系统能适应从适于测定数据的远程终端站接受数据。
所述处理系统可以包括：
(a)第一处理系统，适用于：
(i)接受数据；和
(ii)根据包括对比数据的单变量或多变量解析函数测定对象状态；和
(b)第二处理系统，适用于：
(i)从处理系统接受数据；
(ii)完成包括对比的单变量或多变量解析函数；和
(iii)转移结果到第一处理系统；
所述处理系统能连接到数据库，所述处理系统适合在数据库中存储数据。
根据此实施方式，免疫效应物分子水平可以单独筛选或联合其他生物标记或疾病指示物。“改变”的水平指免疫效应物分子浓度的增加或提高或下降或降低。
免疫效应物分子浓度或水平的测定能基于相对对照的浓度建立诊断方法。或者，诊断规则是基于统计和机器学习算法的应用。这种算法使用训练数据(有已知疾病或细胞介导的免疫应答力状态)中观察到的效应分子和疾病状态之间的关系来推断关系，然后用于预测未知状态对象的状态。能用算法来提供对象有某一水平细胞介导的免疫应答力和/或病症的可能性指数。算法执行单变量或多变量解析函数。
因此，本公开内容提供基于统计和机器学习算法的应用的诊断规则。这种算法使用训练数据(有已知免疫状态)中观察到的效应分子和细胞介导免疫应答力或免疫抑制之间的关系来推断关系，然后用于预测未知免疫状态患者的状态。本数据分析领域从业者认识到，训练数据中推断关系的很多不同形式能在没有实质性改变本发明情况下使用。
本公开内容还包括使用训练数据的知识库，对比对象免疫效应物分子水平和已知细胞介导的免疫应答力水平以产生算法，在输入未知免疫应答力水平对象中包括相同免疫效应物分子水平的第二数据知识库后，提供可能性参数，预测细胞介导的免疫应答力的性质。
术语“训练数据”包括相对于对照的免疫效应物分子水平的知识，其中在淋巴细胞暴露于本发明组合物后测定免疫效应物分子。“对照”包括对象免疫效应物分子水平与“正常”免疫应答力的对比，或可根据试验统计上测定水平。
因此，术语“训练数据”包括免疫效应物分子水平。
免疫效应物分子的水平或浓度提供输入测试数据，本文称为“第二数据知识库”。第二数据知识库视作相对于对照或输入包括已知免疫状态的对象免疫效应物水平信息的“第一数据知识库”产生的算法。第二数据知识库来自未知状态对象，涉及细胞介导的免疫应答力。算法输出或与对照对比是对象有某一水平的免疫应答力或免疫抑制的可能性或风险因子，本文称为“可能性指数”。
从免疫效应物分子水平得到的数据是输入数据。包括免疫效应水平的输入数据与对照作比较，或输入到算法中，所述算法提供对象有例如免疫抑制病症的可能性风险值。也可监控治疗方案以确定任何免疫抑制的出现。免疫抑制水平可以增加对象继发感染或复发(例如肿瘤治疗或病原性感染治疗期间)的风险。
如上所述，诊断免疫应答力或免疫抑制病症的方法，通过免疫效应物分子水平测定对象加强先天和/或获得性免疫应答程度，由已知免疫状态对象的第一数据知识库或相同效应分子水平产生的算法中，提供第二数据知识库。同时提供检测免疫应答力方法，包括测定对象样品先天和/或获得性免疫系统刺激后免疫效应物分子出现和/或速度。“速度”指对象样品中效应分子浓度随着时间而改变。
如上所述，本文所用的术语“样品”指包含一种或多种淋巴细胞的任何样品，包括但不限于：全血、全血部分、组织提取物和新鲜收获的细胞。
本公开内容的方法可用于诊断和疾病分级。本发明也可用于监控病症进展和监控特定治疗是否有效。特别地，所述方法能用于监控手术，肿瘤治疗或其他或药物或暴露于毒剂后的免疫抑制。
在一个实施方式中，本公开考虑监控对象免疫抑制的方法，包括：
(a)提供来自对象的样品；
(b)测定通过本发明组合物刺激后的免疫效应物分子的水平；
其中，免疫效应物的水平相较对照提供与细胞介导的免疫应答力状态的关联性，并使所述水平用于算法以提供对象具有某一免疫应答力水平的可能性指数。
(c)重复步骤(a)和(b)，在稍晚的时间点，对比步骤(b)结果与步骤(c)结果，其中可能性指数的差异指示对象病症的进展。
上述“算法”或“算法函数”包括执行单变量或多变量解析函数。不同结构和平台可以用作上面描述的补充。应理解可以使用适于完成本发明的任何结构形式。然而，一个有利技术是使用分布式结构。特别地，许多终端站可以在不同地理位置提供。这能通过降低数据带宽成本和需求来增加系统效率，和保证如果一个基站堵塞或发生错误，其他站点可以接管。这也允许负载共享或其他以确保可随时访问系统。
此情况中，需要确保基站包括相同信息和签名，从而能使用不同终端站。
还应理解在一个实施例中，终端站可以是便携式设备，例如PDA，移动手机等，能通过通讯网络例如因特网转移对象数据到基站，和接受报告。
在上述方面，术语“数据”是指在涵盖蛋白质抗原的整个长度的长度为约7至14个氨基酸残基的一系列重叠肽刺激后免疫效应物的水平或浓度。所述“通讯网络”包括因特网和移动电话网络和电话线。当使用服务器时，一般是客户服务器或更特定是简单对象应用协议(SOAP)。
本公开内容的一方面包括通过检测对本发明组合物的应答力确定对象的细胞介导的免疫应答力的试验。在一个实施方式中，一个或多个样品，例如外周血液样品，血液组分或支气管肺泡灌洗液的白细胞富集样品，可从有或怀疑发生特定疾病(例如自体免疫疾病，病原体感染或暴露于蛋白质毒剂)的对象获得，通过测定来自效应T细胞(如CD4+T细胞和CD8+T细胞)的效应分子检测免疫应答力。
所述免疫结合方法包括检测或定量样品中反应成分含量的方法，所述方法需要检测或定量在结合过程中形成的任何免疫复合物。此处，在用本发明组合物刺激淋巴细胞之后，可以得到怀疑包括细胞因子的样品，将样品和抗体接触，然后检测或定量特定情况下形成免疫复合物的量。
所选的生物样品和抗体在有效情况下接触充分的时间段以形成免疫复合物(初级免疫复合物)一般是向样品中加入组合物和孵育混合物一段足够长的时间以使抗体与任何存在的效应分子形成(即与之结合)免疫复合物。之后，样品-抗体组合物例如组织切片，ELISA平板，酶联免疫斑点，斑点印迹或Western印迹，一般会经清洗以去除任何非特异性结合抗体物质，使仅特异性结合在所述初级免疫复合物中的抗体被检测。
在一个具体的实施方式中，本公开内容指导用于检测人对象内疾病或病症的存在、不存在、水平或阶段的方法，所述方法包括使含有至少10％反应混合物总体积的全血接触本发明组合物，并检测T细胞的免疫效应物分子水平的存在或升高，其中，所述免疫效应物分子的存在或水平指示所述疾病或病症。
在另一个实施方式中，本公开内容提供伴随上述方法使用的试剂盒。在一个实施方式中，考虑免疫检测试剂盒。在另一个实施方式中，考虑用于分析来自有或怀疑发生金属或化学诱导疾病的对象的样品的试剂盒。在一个更具体的实施方式中，考虑用于分析来自有或怀疑发生疾病的对象的样品的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒用于在疾病状态已经发展之前或之后或在对象接受药物或暴露于毒剂或污染物之前或之后评估对象的细胞介导的免疫应答力。如果还使用抗原，试剂盒还可包括特定抗原。
试剂盒的免疫检测试剂可以用各种形式中的任何一种，包括与给定抗体或抗原相关或连接的检测标记，与第二结合配体相关或连接的检测标记。示例性第二配体是有第一抗体或抗原结合亲和性的第二抗体，和有人体抗体结合亲和性的第二抗体。
适用于本发明试剂盒的其它合适免疫检测试剂包括含二抗与三抗的双组分试剂，所述二抗对一抗或抗原有结合亲和性，所述三抗对二抗有结合亲和性，所述三抗连接有可检测标记。
所述试剂盒还可包括适当等分的标记或未标记抗原或效应分子组合物，可用作制备检测试验的标准曲线。
所述试剂盒可包含抗体-标记偶联物，其可为全偶联形式、中间体形式或待试剂盒用户偶联的单独部分。所述试剂盒的组分可在水性介质中或以冻干形式包装。
任何试剂盒的容器用具通常包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器用具，其中可放置测试试剂，抗体或抗原，且通常适当等分装。当提供第二或第三结合配体或额外组分时，试剂盒通常也包括第二，第三或其他额外容器，其中可放置此配体或组分。本发明教导的试剂盒通常还包含用于市售的封闭约束形式的含有抗体、衍生自抗原的肽的器具，以及任何其他试剂容器。此类容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其中保留所需小管。
本文还考虑的是一种检测对象内细胞介导的免疫应答或其水平的改进试验，所述试验包括将所述对象的淋巴细胞和抗原孵育，并检测效应分子的存在或升高，所述改进包括使所述淋巴细胞与本发明组合物孵育。
本公开内容还提供治疗患有病原感染、自体免疫疾病或癌症或具有发展所述病症或疾病的倾向的对象的方法，所述方法包括使该对象的淋巴细胞来源接触本发明组合物，并检测T细胞的免疫效应物分子水平的存在或升高，其中，所述免疫效应物分子的存在或升高指示该对象的细胞介导应答力的水平，其指示所述病症或疾病的存在、不存在、水平或阶段，然后治疗所述病症或疾病。
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Claims (15)

1.包含ESAT-6的至少一个片段和CFP-10的至少一个片段的组合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述片段包含至少两组肽，第一组包含长度为约7至14个氨基酸残基的至少一种肽，第二组包含16个或更多氨基酸残基的至少一种肽。
3.如前述权利要求中至少一项所述的组合物，其中所述7至14个氨基酸的肽由CD8+淋巴细胞识别，并且所述16个或更多氨基酸的肽由CD4+淋巴细胞识别。
4.如前述权利要求中至少一项所述的组合物，其还包含至少一种糖。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述糖是非还原糖，优选海藻糖。
6.一种检测对象中细胞介导的免疫应答活性的方法，所述对象优选人，所述方法包括
使来自对象的淋巴细胞接触权利要求1-5中至少一项所述的组合物，和
检测来自免疫细胞的免疫效应物分子的存在或升高，
其中，免疫效应物分子的存在或水平指示该对象中细胞介导的应答力的水平。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述样品是未稀释的全血，其中优选所述全血收集在含肝素的管中。
8.如权利要求6-7中至少一项所述的方法，其中所述免疫效应物分子是细胞因子，优选IFN-γ。
9.如权利要求6-8中至少一项所述的方法，其中所述免疫效应物用对其具有特异性的抗体来检测，优选使用ELISA。
10.权利要求6-9中至少一项所述的方法，其中所述对象具有选自：分枝杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、伯疏氏螺旋体属、大肠杆菌、沙门氏菌属、梭状芽孢杆菌属、志贺菌属、变形杆菌属、芽孢杆菌属、疱疹病毒、乙型或丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)的病原体的所致的感染或由其导致的疾病。
11.权利要求6-10中至少一项所述的方法，其中所述对象处于疾病中，所述疾病是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)所致的感染或结核病(TB)。
12.如权利要求6-11中至少一项所述的方法，其中所述细胞介导免疫应答的量级与疾病的状态、发展和/或严重程度相关。
13.一种使用户能够测定对象的细胞介导的免疫应答力状态的方法，所述方法包括：
(a)通过通讯网络接收免疫效应物分子的水平或浓度形式的数据，其相对于对照提供与来自该用户的细胞介导的免疫应答力状态的相关性，该免疫效应物分子在淋巴细胞暴露于权利要求1-5中至少一项所述的组合物之后检测；
(b)通过单变量或多变量分析处理对象数据以提供免疫应答力值；
(c)根据免疫应答力值的结果，与预定值相比，确定对象的状态；和
(d)通过通信网络将对象状态的指示转移到用户。
14.如权利要求6-13中任一项所述的方法，其中所述组合物在存在至少一种糖，优选非还原糖，优选海藻糖的情况下与淋巴细胞接触。
15.权利要求1-5中任一项所述的组合物或权利要求6-14中任一项所述的方法用于测定细胞介导的免疫应答的用途。
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