CN107106729A - 基于具有形态发生活性的非晶形聚磷酸钙的生物活性伤口敷料和牙齿涂层 - Google Patents

基于具有形态发生活性的非晶形聚磷酸钙的生物活性伤口敷料和牙齿涂层 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于与牙釉质、牙骨质和牙本质表面强结合的非晶形聚磷酸钙(Ca‑聚P)纳米颗粒或微粒，封闭由于釉质缺损而暴露于牙齿表面的牙本质小管的方法。本发明的方法也可用于制备具有形态发生活性的牙齿植入物。本发明另一方面涉及在视黄醇包封之后(“视黄醇/aCa‑聚P纳米球或微球”)，将此类纳米颗粒或微粒掺入伤口敷料和例如通过静电纺丝制备的相关材料中。得到的本发明的视黄醇/aCa‑聚P纳米球或微球纤维垫显示出抗微生物特性和伤口愈合特性，并且发现其以协同作用的方式增加编码瘦素和瘦素受体以及脂肪酸结合蛋白4(FABP4)的基因的表达。本发明的材料是第一种可用于通过影响瘦素/瘦素受体的表达来促伤口愈合的材料。

Description

基于具有形态发生活性的非晶形聚磷酸钙的生物活性伤口敷 料和牙齿涂层
本发明涉及基于与牙釉质、牙骨质和牙本质表面强结合的非晶形聚磷酸钙(Ca-聚P)纳米颗粒或微粒，封闭由于釉质缺损而暴露于牙齿表面的牙本质小管的方法。本发明的方法也可用于制备具有形态发生活性的牙齿植入物。本发明另一方面涉及在视黄醇包封之后(“视黄醇/aCa-聚P纳米球或微球”)，将此类纳米颗粒或微粒掺入伤口敷料和例如通过静电纺丝制备的相关材料中。得到的本发明的视黄醇/aCa-聚P纳米球或微球纤维垫显示出抗微生物特性和伤口愈合特性，并且发现其以协同作用的方式增加编码瘦素和瘦素受体以及脂肪酸结合蛋白4(FABP4)的基因的表达。本发明的材料是第一种可用于通过影响瘦素/瘦素受体的表达来促伤口愈合的材料。
发明背景
龋齿和牙齿过敏症属于全世界最常见的疾病。它们造成的公共卫生系统的费用是巨大的。由于釉质或牙骨质损失，牙本质小管变得暴露于牙齿表面。后果是诸如牙本质过敏症、龋齿和牙髓炎症的一系列牙科疾病/损伤的风险增加。釉质和牙骨质的去矿化由细菌生物膜的形成引起，特别是由产酸的变异链球菌(Streptococcus mutans)引起。
生理学上，牙釉质和牙本质通过去矿化和再矿化过程经历持久的重塑。然而，这些过程，特别是牙齿修复是缓慢的。可以施用钙和磷酸根离子以及氟化物，以便部分地重构去矿化后留下的表面下损伤上的晶体残余。与原生矿物质相比，再矿化的晶体对酸更加耐受，但是更难溶并且更易碎。牙釉质、牙本质和牙骨质的生物矿物主要由羟基磷灰石(HA)组成。通过某些生长因子(例如牙釉蛋白和成釉蛋白)和酶(例如ALP和碳酸酐酶)等控制HA沉积物的形成。
牙本质被称作牙本质小管的管状结构网络所贯穿。这些管受釉质(冠)和牙骨质(根)的防护，其形成针对外部物理和化学影响如温度变化和酸的牙髓保护层，并防止神经突起和牙本质过敏症的影响。伸入牙本质层并向牙齿表面开口的牙本质小管的直径在1-2.5μm变化。牙齿过敏症患者具有更大量的开口的牙本质小管和/或直径比正常管大的管。
已经采取的再封闭以及使牙本质小管脱敏的策略包括：用草酸钠阻塞牙本质小管(Greenhill JD,Pashley DH(1981)The effects of desensitizing agents on thehydraulic conductance of human dentin in vitro.J Dent Res 60:686-698；RusinRP,et al.(2010)Effect of a new desensitizing material on human dentinpermeability.Dent Mater 26:600-607)。然而：形成的矿物质缓慢溶解于人工唾液中(Suge T,et al.(1995)Duration of dentinal tubule occlusion formed by calciumphosphate precipitation method:In vitro evaluation using synthetic saliva.JDent Res 74:1709-1714)。
应用氟化钠，其经历仅保持与表面相对松散附连的晶体的瞬变形成(SchlueterN,et al.(2009)Tin-containing fluoride solutions as anti-erosive agents inenamel:An in vitro tin-uptake,tissue-loss,and scanning electron micrographstudy.Eur J Oral Sci 117:427-434)。
通过用例如下述所列的产品来再封闭牙齿表面，从而阻塞更多牙本质小管表面暴露的部分(达到10μm深)：舒适达(Sensodyne)、诺华敏(NovaMin)和高露洁(Colgate)舒缓抗过敏牙膏(Sensitive Pro-Relief)(Petrou I,et al.(2009)A Breakthrough therapyfor dentin hypersensitivity:How dental products containing 8％arginine andcalcium carbonate work to deliver effective relief of sensitive teeth.J ClinDent 20:23-31；Ayad F,et al.(2009)Comparing the efficacy in reducing dentinhypersensitivity of a new toothpaste containing 8.0％arginine,calciumcarbonate,and 1450 ppm fluoride to a commercial sensitive toothpastecontaining 2％potassium ion:An eight-week clinical study on Canadian adults.JClin Dent 20:10-16；Vahid-Golpayegani M,et al.(2012)Remineralization effect oftopical novamin versus sodium fluoride(1.1％)on caries-like lesions inpermanent teeth.J Dent(Tehran)9:68-75)。然而：已发现这些尝试不足以针对牙齿所暴露于的日常机械力进行保护(Moritz A,et al.(1998)Long-term effects of Co2laserirradiation on treatment of hypersensitive dental necks:Results of an in vivostudy.J Clin Laser Med Surg 16:211-215；Orchardson R,Gilliam D(2006)Managingdentin hypersensitivity.J Am Dent Assoc 137:990-998；Chiang YC,et al.(2014)Amesoporous silica biomaterial for dental biomimetic crystallization.ACS Nano8:12502-12513)。
此外，本发明产品的其它应用市场-伤口愈合市场快速增长。在2021年，估计世界伤口处理市场将达到超过$185亿。主要的市场细分是先进的伤口护理的市场和溃疡治疗的终止，特别是糖尿病足溃疡处理的市场。伤口愈合过程包括至少四个阶段(参见综述：GuoS,Dipietro LA.Factors affecting wound healing.J Dent Res 2010；89:219-229)：a)止血，b)发炎，c)增殖，以及d)重塑。
阶段1：在伤口处理之后立即开始的止血阶段期间，发生血管收缩和纤维蛋白凝块形成。
阶段2：在出血被控制之后，释放促炎性细胞因子和生长因子，包括血小板来源的生长因子、成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。同样地，发生了有助于预防出血的中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞以及血小板的连续浸润。这些细胞的功能是清除入侵的微生物，以及移除受损组织区域内的细胞碎片。这些细胞产生并释放具有形态发生活性的聚合物，例如来自血小板的聚磷酸盐(聚P)(Morrissey JH,Choi SH,Smith SA.Polyphosphate:anancient molecule that links platelets,coagulation,and inflammation.Blood2012；119:5972-5979；L,et al.Putting polyphosphates to the test:evidenceagainst platelet-induced activation of factor XII.Blood 2013；122:3818-3824)。
阶段3：在肉芽组织形成期间，特别是在皮肤伤口修复的早期阶段期间，赋予新基质(neostroma)其颗粒外观的新生毛细血管以及巨噬细胞、成纤维细胞和血管迁移至伤口内。
阶段4：重塑发生，其导致疤痕形成。特别地，在该阶段期间，对于功能性再生，参与重塑的细胞的相互作用需要由成纤维细胞来合成细胞外基质。
影响伤口愈合的主要因子包括：
(i)氧化/超氧化物自由基的形成，其参与能量产生和/或氧化杀伤病原体，和/或
(ii)经由微生物的感染，所述微生物通常局限于皮肤表面，但有可能侵入下面的组织层。
在伤口愈合期间释放的细胞因子和生长因子启动并维持细胞间的相互作用，并控制浸润细胞的再生应答。除了这些蛋白因子，视黄酸及其前体视黄醇是有效的促进再生的刺激物(Jetten AM.Multi-stage program of differentiation in human epidermalkeratinocytes:Regulation by retinoids.J Invest Dermatol 1990；95:44S–46S；Fisher GJ&Voorhees JJ.Molecular mechanisms of retinoid actions in skin.FASEBJ 1996；10:1002-1013)。视黄酸通过激活控制参与视黄酸酯化、由其前体的合成以及代谢的通路的基因，引起差异性基因表达(Lee D,et al.Retinoid-responsivetranscriptional changes in epidermal keratinocytes.J Cell Physiol 2009；220:427-439)；同时，在角化细胞分化期间视黄酸下调编码脂质代谢的基因的表达。与视黄酸相比，视黄醇已被证明显著改善伤口愈合(Keleidari B,et al.The effect of vitamin Aand vitamin C on postoperative adhesion formation:A rat model study.J Res MedSci 2014；19:28-32)。
视黄醇代谢转化为视黄酸，特别是在体内通过酶介导的两步转化，经视黄醛转化为视黄酸，并引起视黄酸核受体复合物内的差异性基因表达(Wang L,et al.Regulationof alpha 2(I)collagen expression in stellate cells by retinoic acid andretinoid X receptors through interactions with their cofactors.Arch BiochemBiophys 2004；428:92-98)。作为应答，细胞增殖和分化被调节。
经由内皮祖细胞功能的恢复，伤口愈合的新方面是下述发现：全身施用和局部施用的瘦素改善了小鼠中伤口的上皮再形成(Frank S,et al.Leptin enhances wound re-epithelialization and constitutes a direct function of leptin in skinrepair.J Clin Invest 2000；106:501-509)。此外，已经显示在修复阶段期间，位于伤口周边的角化细胞表达瘦素受体。此外，瘦素在体外引发针对人角化细胞的促有丝分裂刺激。那些数据通过以下发现被证实：ob/ob(瘦素无效)和db/db(瘦素受体无效)小鼠品系在皮肤伤口修复中显示出严重缺损(Lee GH,et al.Abnormal splicing of the leptin receptorin diabetic mice.Nature 1996；379:632-635；Friedman JM,Halaas JL.Leptin and theregulation of body weight in mammals.Nature 1998；395,763-770)。
静电纺丝技术可用于制备由与高表面区域松散连接的纤维组成的三维(3D)多孔垫。该技术利用电场力以产生直径范围为2nm至数微米的聚合物纤维(参见综述：AgarwalS,Wendorff JH,Greiner A.Progress in the field of electrospinning for tissueengineering applications.Adv Mater 2009；21:3343-3351；Baji A,etal.Electrospinning of polymer nanofibers:Effects on oriented morphology,structures and tensile properties.Composites Sci Technol 2010；70:703-718)。
先前，发明人描述了由聚P钙盐组成的纳米颗粒材料，所述聚P钙盐是非晶形的纳米尺寸或微米尺寸且生物可降解的，并且保留了无机聚合物的形态发生活性(Müller WEG,et al.A new polyphosphate calcium material with morphogeneticactivity.Materials Lett 2015；148,163-166；专利申请GB 1420363.2(2014)，通过引入并入)。可将形成该材料的聚P纳米颗粒或微粒设计为非晶形的磷酸钙纳米颗粒[aCa-聚P-NP]。
此外，发明人描述了使视黄醇包含于那些纳米颗粒或微粒中以制备由包封于Ca-聚P壳内的视黄醇内含物组成的纳米球或微球的方法。这些纳米球或微球被称为非晶形Ca-聚P/视黄醇纳米球或微球[视黄醇/aCa-聚P-N/MS]。该材料引起III型胶原在单一组分视黄醇和aCa-聚P-N/MP不具有生物活性的浓度下表达(GB 1502116.5)。此外，下述关于聚P的专利申请被认为是相关的：GB1406840.7和GB1403899.6。
相关的进一步研究揭示，聚P包含抗菌活性(LorencováE,et al.Antibacterialeffect of phosphates and polyphosphates with different chain length.J EnvironSci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng 2012；47:2241-2245)。
发明详述
本发明基于两种通用方法。
A)由Na-聚P和钙盐制备纳米颗粒或微粒的方法，所述Na-聚P和钙盐：(i)在颗粒形成之后保留了它们的非晶形状态，并且(ii)显示已知来自Na-聚P的形态发生活性(GB1420363.2，将其内容通过引用并入本文)。由较后的颗粒aCa-聚P-NP形成的polyP材料通过如下特性来表征。该材料：
a)是非晶形的(非晶态)；b)具有不同寻常的硬度(例如，1.3GPa的弹性模量[磷：钙配比为1:2的Ca-聚P2颗粒])；c)由直径为约0.2μm(Ca-聚P2颗粒)的纳米颗粒或微粒组成；d)可在温和条件下制备(室温)；e)具有形态发生活性(诱导骨碱性磷酸酶活性和骨羟基磷灰石的形成)；以及f)是生物可降解的(通过碱性磷酸酶降解)；
B)制备由纳米颗粒或微粒和视黄醇一起组成的纳米球或微球(视黄醇/aCa-聚P-NS)的方法(GB1502116.5，将其内容通过引用并入本文)，其显示下述特性：
1.尺寸高度同质(尺寸～45nm)。该尺寸对于胞吞作用的细胞摄取是最优的(ZhangS,et al.Size-dependent endocytosis of nanoparticles.Adv Mater 2009；21:419-424)；与纳米颗粒相比，aCa-聚P-NP是更大(>50μm尺寸)的砖样颗粒。2.视黄醇和聚P这两种组分的协同作用。3.视黄醇和聚P这两种组分对I型和II型胶原，并且特别是III型胶原的表达的协同效应。4.在细胞外间隙中通过酶法水解，以及聚P(或其水解产物正磷酸盐)和视黄醇的释放。5.由网格蛋白介导的胞吞作用来摄取的合适尺寸。6.两种活性组分聚P和视黄醇，经由细胞外途径(细胞膜结合受体的激活)以及经由跨膜/细胞内途径(通过胞吞作用)的双重生物效应；以及7.无细胞毒性。
迄今为止，仅开发了少数将预防微生物浸润和刺激伤口细胞再生相结合的伤口敷料(Abrigo M,McArthur SL,Kingshott P.Electrospun nanofibers as dressings forchronic wound care:advances,challenges,and future prospects.Macromol Biosci2014；14:772-792)。在当前的本领域状态下，未开发出生物活性静电纺丝网(Abrigo M,McArthur SL,Kingshott P(2014)Electrospun nanofibers as dressings for chronicwound care:advances,challenges,and future prospects.Macromol Biosci 14:772-792)。
在本发明的第一方面，本发明的发明人成功开发将参与伤口愈合的细胞的抗菌特性与形态发生活性组合的网/垫。他们将视黄醇包封进由聚P纳米颗粒或微粒形成的纳米球或微球，并成功将其制备为由聚(D,L-丙交酯)(PLA)构成的静电纺丝纤维。出人意料地，那些垫保留了形态发生活性，以增加脂肪酸结合蛋白4(FABP4)以及瘦素和其受体的表达，这由未嵌入PLA中的聚P纳米球或微球引发。
发明人还证实，制备为纳米颗粒或微粒的聚P，如果与视黄醇一起施用，并包装进纤维垫，则其引发MC3T3-E1细胞中编码瘦素/瘦素受体以及编码FABP4的基因的协同表达。这两种级联均不仅参与调控细胞的整体能量代谢，还参与调控细胞生长和分化控制。
此处描述的发明涉及在形成适合作为用于伤口愈合的抗微生物和再生敷料的3D垫的情况下，将以上纳米球或微球掺入由PLA组成的静电纺丝纤维中的方法。可以根据本发明如下所述来制备由掺入有非晶形视黄酸/Ca-聚P纳米球或微球的3D静电纺丝PLA纤维垫组成的本发明材料：
a)将纤维材料与乳化剂混合，并将混合物溶解于有机溶剂中，
b)添加第二协同作用的生物活性组分，
c)添加非晶形聚磷酸钙纳米颗粒或微粒(aCa-聚P-N/MP)，以及
d)对混合物进行静电纺丝。
该程序在室温下进行，并且优选在避光条件下进行。
作为优选实例，可以利用聚(D,L-丙交酯)(PLA)作为纤维材料，聚(乙二醇)作为乳化剂，异丙醇作为有机溶剂，Na-聚P作为聚P盐(链长：约30个磷酸盐单元)，氯化钙作为钙盐以及视黄醇作为第二协同作用的生物活性组分，按如下所述制备掺入有非晶形视黄醇/Ca-聚P纳米球或微球(视黄醇/aCa-聚P-N/MS)的3D静电纺丝PLA纤维垫。
A)制备纳米颗粒或微粒：
i)在室温，将于30ml蒸馏水中的2.8g CaCl2，滴入溶于50ml蒸馏水的1g Na-聚P中，
ii)在程序期间，用NaOH水溶液将pH调节至10.0，
iii)搅拌12h，
iv)通过过滤收集得到的aCa-聚P-NP纳米颗粒或微粒(比例为，磷酸根：Ca2+＝2)；以及
v)在50℃干燥纳米颗粒或微粒。
B)制备PLA纤维，并掺入纳米颗粒：
i)将PLA与PEG混合(以80wt％：20wt％的比例)，然后以20％(w/v)的终浓度添加至氯仿中，
ii)将PLA/PEG-氯仿悬液在40℃搅拌6h，直至聚合物完全溶解，
iii)向PLA溶液中添加视黄醇，以得到20wt％(相对于PLA)的终浓度，
iv)以10wt％的固定浓度，向含有视黄醇的PLA溶液中添加Ca-聚P纳米颗粒或微粒(aCa-聚P-N/MP)，以及
v)在进行静电纺丝之前即刻将悬液进行超声处理，持续15min。
C)静电纺丝
a)将所述溶液注入配备有与高压电源相连的钝头不锈钢针头(18规格)的塑料注射器内，
b)在17kV的电压下，以每小时1ml的进料速率旋转所述溶液；在该过程期间，将喷嘴和收集器之间的距离维持在150mm，
c)除了垫的静电纺丝，在所有情况中，使用金属网作为收集器，以及
d)将从收集器中移出的纤维垫干燥过夜。
聚P分子的链长范围可以是，约3至约1000个磷酸盐单元。用具有大约30个磷酸盐单元的平均链长的聚P分子得到了最优结果。
“约”或“大约”一般意为给定数值+/-10％。
可将根据本发明的技术用于制备伤口敷料或伤口敷料的组分。含有视黄醇和聚P纳米颗粒或微粒(非晶形聚磷酸钙纳米球或微球；视黄醇/aCa-聚P-N/MS)的基于PLA的纤维垫，作为生物活性网发挥功能。迫切需要此类网作为慢性伤口的敷料。
本发明又一方面涉及通过以上所述的方法获得的材料在基于瘦素和瘦素受体的有利诱导作用的医疗中的应用/用途。优选这样的治疗，其中所述医学病况选自伤口愈合不足。
由包含视黄醇和聚P纳米颗粒或微粒的基于PLA的纤维垫引发瘦素和瘦素受体的表达，所述纤维垫是具有再生、伤口愈合特性的新型敷料。可掺入伤口敷料中以增加这些基因的表达的材料，目前还是未知的。发明人出人意料地发现，包含包封的视黄醇的aCa-聚P-NP纳米颗粒或微粒(视黄醇/aCa-聚P-NS)以协同方式增加这两种基因的表达。
本发明又一方面涉及本发明的纳米球或微球在药物递送中的应用。
此处描述的本发明的方法还涉及非晶形聚磷酸钙材料的创新用途，其以具有约300nm(直径)尺寸范围的微粒的形式，用于(再)封闭暴露于牙齿表面的牙本质小管，以及填充牙体缺损(牙釉质、牙骨质和牙本质中的缺损)。本发明基于下述发明人意料之外的发现：这些Ca-聚P微粒能够在HA表面形成紧密结合的聚P层。这一发现是出人意料的，因为聚P的钙盐或钙复合物不结合这些表面。如果在颗粒制备期间利用1:1的磷酸根比钙的比例，可能的解释是微粒表面游离的离子化合价的存在，其未被钙离子饱和并且能够与HA材料的暴露于表面的钙相互作用。
本发明又一方面涉及下述发现：这些聚磷酸钙(Ca-聚P)微粒能够刺激成骨细胞前体细胞分化为成熟的成骨细胞(表达参与HA形成的碱性磷酸酶)。
依然出人意料的是，尽管它们的直径(300nm)在允许受体介导的胞吞作用的范围(约50nm)之外，Ca-聚P微粒也显示出此种生物活性。
可将本发明的方法用于再封闭暴露于牙齿表面的牙本质小管，以及包被牙齿以改善牙齿过敏症并预防蛀牙(预防龋齿的应用)。还可将本发明的方法用于制备牙齿植入物，所述植入物通过诱导成骨细胞前体细胞的分化并激活成熟的成骨细胞而引起身体自身的牙齿材料(HA)形成。
在牙齿表面形成的聚P层，被证实具有与天然釉质类似的硬度和弹性模量。
用于本发明方法的Ca-聚P微粒的优选平均尺寸(直径)范围为约50nm至约500nm，优选300nm。
用于本发明的方法的Ca-聚P微粒的优选组成是约0.1比约10(磷酸根比钙)的重量比，优选0.5比1的重量比，并且最优选1比1的重量比。
Ca-聚P微粒的聚P组分的链长范围可以是3至1000个磷酸盐单元。用具有大约200至20，并且最好约40个磷酸盐单元的平均链长的聚P分子得到最优结果。
聚P材料是生物可降解的，并且与通过常规技术制备的Ca-聚P盐相比，其显示出更优的形态发生活性。
本发明的方法的又一方面是，该方法在改善牙本质过敏症或者预防龋齿中的应用/用途。
本发明的方法的另一方面是，该方法在制备刺激成牙本质细胞前体细胞和成牙本质细胞的分化和激活的牙齿植入物中的应用/用途。
现在将在下述优选实例中进一步描述本发明，但是其不限于此。出于本发明的目的，将本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。在附图列表中，
图1显示了基于PLA的静电纺丝垫的制备。(A)将基础纤维基质PLA溶于氯仿中。(B)向该溶液中添加视黄醇(20wt％)，随后添加纳米颗粒或微粒(aCa-聚P-N/MP)(20wt％)。短暂搅拌时间之后，即刻将悬液超声处理，然后进行(C)静电纺丝。嵌入图(a)中示出了纺织垫，SEM图片；(b)中描绘了含有其整合的视黄醇/Ca-聚P纳米颗粒(视黄醇/Ca-聚P-NP)的纤维的放大的示意图。显示了由下述材料形成的制备的垫：(D)单独的PLA，(E)PLA和视黄醇，以及(F)PLA、视黄醇和Ca-聚P。
图2显示了包封于纳米颗粒或者与视黄醇一起的纳米球中的聚P对细胞活力的影响(XTT比色测定)。如所示，将MC3T3-E1细胞与不同浓度的聚P(以μg/ml给出)或视黄醇(μM)孵育72h。然后用XTT分析细胞。将细胞暴露于不同浓度的Na-聚P，与Ca2+复合的仅包含聚P的aCa-聚P-NP纳米颗粒，除聚P之外还包含视黄醇的视黄醇/aCa-聚P-NS纳米球，以及视黄醇。结果表示为平均值(n分别＝10次实验)±平均值的标准误；*p<0.01。
图3显示了用耐尔蓝A对MC3T3-E1细胞进行的染色。将细胞在下述情况下孵育72h：(A)不添加任何组分；或者(B)添加3μg/ml Na-聚P；(C)添加aCa-聚P-NP；或者(D)添加视黄醇/aCa-聚P-NS；以及(E)添加3μM视黄醇。观察到聚P-视黄醇处理的细胞明显为粉红色，而对照呈蓝色。
图4显示了在未处理的MC3T3-E1细胞(斑点柱)，或者在暴露于3μg/ml的可溶Na-聚P(空心柱)、aCa-聚P-NP纳米颗粒(交叉线)、视黄醇/aCa-聚P-NS纳米球(黑色柱)，或者在暴露于3μM视黄醇(斜线)3d的细胞中，测定的编码FABP4受体以及瘦素或瘦素受体的基因的稳定状态表达。在孵育之后，将RNA从培养物中分离，并利用GAPDH作为参考基因，通过RT-qPCR进行分析。在各培养系列中，表达比率与GAPDH相关；将得到的比率设定为1。显示了SD(5次实验/时间点)；*p<0.01。
图5显示了如下文“材料和方法”部分所述的PLA(PLA)、视黄醇(ret)、包含20wt％视黄醇的PLA(PLA-ret)，以及最终由视黄醇和aCa-聚P-NP纳米颗粒组成的PLA(PLA-ret/aCa-聚P-NP)的FTIR光谱。光谱记录为(A)波数4000至775cm-1，以及(B)波数2000至775cm-1。
图6显示了用于静电纺丝的聚合物的EDX分析。用下述材料进行分析：(A)仅PLA聚合物，(B)除视黄醇之外还包含的PLA纤维材料，或者(C)在纺织过程之前补充有aCa-聚P-NP纳米颗粒的PLA。标记C、O、Na、P和Ca的信号。
图7显示了细胞培养之后纤维垫的SEM分析。切割精确匹配的垫样本，并将其浸没于24孔板内；接种5·103个细胞/孔，并持续孵育3d。然后取垫，将其固定并脱水，随后进行SEM分析。(A和B)仅用PLA纺成的纤维垫；可鉴定出极少的细胞/细胞簇(-c)。(C和D)相比之下，在孵育期间观察到，在由PLA/视黄醇/aCa-聚P-NS形成的纤维上形成了紧密的细胞层(cl)。偶然地，在边缘区域(r)内，可以分辨由紧密堆积的细胞(在C中右侧)至较少定居的区域的转变(左侧)。分界线用两个单箭头标记。
图8显示了RT-qPCR分析，以评估FABP4、瘦素和瘦素受体这三种基因的转录本的数目。接种之后，将MC3T3-E1细胞在下述材料之上培养3d：仅由PLA制备的垫(数目不可测定[n.d.])，由PLA和aCa-聚P-NP制备的纺织纤维(交叉线柱)，或者由PLA和视黄醇/aCa-聚P-NP制备的纺织纤维(黑色柱)。FABP4、瘦素和瘦素受体的表达值参考GAPDH的表达。反过来，那些数目与在用于接种的细胞(从培养板底部分离之后，随后处理持续2h的时间)中测量的研究的基因和GAPDH的表达值相关；将那些比率设定为1。显示了SD(5次实验/时间点)；*p<0.01。
图9显示了聚P和视黄醇对脂肪酸结合蛋白4(FABP4)和瘦素/瘦素受体的表达的可能影响。已经提出，聚P经MAPK信号转导通路(p38)MAPK通路和/或mTOR复合物1和2发挥作用。FABP4表达可能包含转录因子Ets1。该通路正向地作用于与聚P/DLL4-NOTCH信号转导通路以及Foxo1相关联的FABP4表达水平。在与其受体(VEGFAR)结合并激活DLL4(δ样配体-4)之后，VEGFA(血管内皮生长因子)诱导NOTCH信号转导的旁分泌激活，导致FABP4表达。其间，NOTCH受体的胞内结构域(NICD)转位至细胞核，并与由Foxo1和DNA结合蛋白RBP-Jκ组成的转录因子复合物结合，由此诱导FABP4转录。FABP4蛋白迁移至细胞质，并结合RA(视黄酸)。已提出RA与FABP4再次进入细胞核，并形成RXR-RAR(视黄酸X受体-视黄酸受体异二聚体)。在该转录复合物中，在RA应答元件(RARE)处，编码瘦素和瘦素受体的基因的转录增加。RA经视黄醇(Rol)合成，这由细胞经STRA6(膜转运蛋白)吸收，其中其结合CRBP(细胞视黄醇结合蛋白)，通过ADH4(乙醇脱氢酶4)经历至RAL(视黄醛)并最终至RA的氧化，最终经CRABP(视黄酸结合蛋白)转位至细胞核，在RXR/RAR复合体形成的情况下，其在此结合DNA的RARE(视黄酸响应元件)。总之，聚P引起结合蛋白FABP4的上调，这促进视黄醇对瘦素和瘦素受体的表达的影响。增加的FABP4合成和RAR转录促进活性这两项(arm)，正向地影响细胞分化和再上皮化。
图10显示了非晶形的Ca-聚P微粒(aCa-聚P-MP)及推测的其与牙齿的磷酸钙表面的相互作用。(A和B)aCa-聚P-MP；SEM分析。(C)推测的所述微粒与牙齿的羟基磷灰石(HA)釉质的相互作用。釉质(en)形成牙本质(de)区域周围的牙冠，并在牙髓(pu)周围。矿物质釉质和牙本质由主要由PO4 3-和Ca2+离子构造的HA板组成。在既有的牙腔内(龋齿或蛀牙)，填充aCa-聚P-MP。已提出，微粒内的Ca2+离子形成至釉质的HA的桥接。
图11显示了含有聚P的来自根部区域的牙齿样品的涂层。将牙齿样本在10mg/mL的Na-聚P[Ca2+](A和C)或aCa-聚P-MP(B和D)中孵育2d。然后取样，将其进行切片并通过光学显微镜进行检查。从切割区域(A和B)或相应的表面(C和D)拍摄照片。标记不同的层：粘合层(ce)和牙本质(de)层以及聚P层。
图12显示了在与aCa-聚P-MP孵育之后，牙齿样品上聚P层的形成；SEM。并行地，将牙齿样本浸没于Na-聚P[Ca2+]或aCa-聚P-MP(各10mg/mL)中，持续2d。然后在洗涤之后，将样本切割，然后通过SEM进行分析。从暴露于Na-聚P[Ca2+]的样本拍摄图片A、C和E，同时从在aCa-聚P-MP中孵育的牙齿样本拍摄B、D和F的那些照片。在所有样本中均观察到粘合层(ce)和牙本质(de)层，而仅在用aCa-聚P-MP处理的那些样本中观察到另外的聚P层(聚P)。在Na-聚P[Ca2+]样本中牙本质小管是暴露的(E；..::dt::..)，而在aCa-聚P-MP样本表面未观察到来自牙本质小管的开口(F)。
图13显示了含聚P的涂层的动力学；SEM。(A)具有牙本质小管(dt)开口的牙本质表面。(B和C)将根部样本与aCa-聚P-MP孵育30min；微粒(Ca-聚P-MP)在管的开口中累积。(D和E)在层形成的条件下，与aCa-聚P-MP的更长孵育时间导致聚P沉积的扩大；在更高的放大率下，可以分辨单个微粒。
图14显示了聚P在牙齿表面沉积的时间进程；EDX分析。(A)未处理的釉质。用aCa-聚P-MP将釉质样品处理30min(B)或2d(C)；在孵育2d之后的样本中观察到P和Ca信号的强烈增加。
图15显示了釉质上的聚P涂层的机械特征。制备来自人牙齿的切片，并直接测量或者在补充有10mg/mL aCa-聚P-MP的盐水溶液中孵育。在25℃的孵育进行3h或2d。孵育之后，将样品干燥10min，然后测量。显示了对照样本(实线)或聚P处理2d(断线)或3h(点线)后，样本的典型载荷穿透深度曲线。给出了82mN的压入载荷。在曲线内标记以下载荷-穿透阶段：负载阶段、最大载荷处的停留期以及卸载部分。
图16显示了暴露于聚P之后，hMSC中ALP转录本水平的增加。细胞未被处理或者暴露于30μg/mL Na-聚P[Ca2+]或aCa-聚P-MP。在第1天、第3天和第7天，收集样本。收获细胞，提取RNA，并进行qRT-PCR分析；针对未处理的细胞(对照；空心柱)以及Na-聚P[Ca2+](Na-聚P；交叉线)和aCa-聚P-MP处理的培养物(Ca-聚P-MP；实心柱)，测定与参考基因GAPDH的表达相关联的表达水平。对于四个独立的实验，数据表示为平均值±SD。利用未配对的t检验评估组间的差异。*p<0.05。
图17显示了aCa-聚P-MP双重作用模式的概要。微粒与牙齿表面强附连，特别是在牙本质小管(dt)暴露的开口中。那些管位于牙本质(de)内，其通常由釉质(en)层覆盖。第一作用模式(形态发生)：在牙本质小管内，微粒通过成牙本质细胞(od)释放的酶ALP经历水解。与成牙本质细胞一致，ALP和Ca-聚P的水解产物正磷酸盐形成羟基磷灰石(HA)，并由此修复牙本质小管。第二作用模式(再封闭)：终止之后，微粒(aCa-聚P-MP)在蛀牙表面形成涂层。
实施例
在下述实施例中，仅本发明的方法描述了具有约30至约40个磷酸盐单元的平均链长的聚P分子。可以通过利用具有较低或较高链长(如100至20个单位)的聚P分子得到类似的结果。
负载聚P和聚P-视黄醇的纳米颗粒/纳米球对细胞生长的影响
在下述实验中，发明人成功证实了如果将聚P和视黄醇一同施用于细胞，其对细胞生长和代谢显示出交互效应。分别添加的这两种化合物，在体外均对细胞显示出各种各样的合成代谢影响。作为实例，聚P引起对生物矿化/羟基磷灰石形成的诱导效应，其与编码碱性磷酸酶的基因的诱导增加并行(Müller WEG,et al.Inorganic polymeric phosphate/polyphosphate as an inducer of alkaline phosphatase and a modulator ofintracellular Ca2+level in osteoblasts(SaOS-2 cells)in vitro.ActaBiomaterialia 2011；7；2661-2671)。同样地，视黄醇有助于一系列过程中的合成代谢通路，例如胚胎发育或者上皮细胞分化和造血细胞分化的调控(Miano JM,et al.Retinoidreceptor expression and all-trans retinoic acid-mediated growth inhibition invascular smooth muscle cells.Circulation 1996；93:1886-1895)。在本文所述的实验中，利用MC3T3-E1细胞，发现在72h孵育期间，在低于3μg/ml的浓度下，与Ca2+复合的无颗粒Na-聚P以及通过非晶形Ca-聚P形成的纳米颗粒，对于细胞的数目无影响(图2)。然而，如果以10μg/ml的浓度向细胞中添加纳米颗粒制备物(aCa-聚P-NP)，则基于XTT还原分析，在孵育期间测量到活细胞数目的显著增加。以3μM的浓度作为单一组分添加的视黄醇，也不显著影响细胞生长。
如果将视黄醇包封于基于Ca-聚P的纳米颗粒，并由此形成视黄醇/Ca-聚P纳米球，则测量到细胞生长的强扩增(图2)。尽管在3μg/ml的浓度下，视黄醇/aCa-聚P-NS将XTT分析中的吸光度从≈1.3A260个单位增加至2.88个单位，在包含10μg/ml的分析中该数值增加至4.18个单位。3μg/ml纳米球中视黄醇的浓度为大约0.3μg/ml(≈1μM)，发现视黄醇的水平不改变细胞的生长。这是反映在本文使用的系统中，Ca-聚P与视黄醇一起协同作用的第一指示。
用耐尔蓝A对生长为单层的细胞进行染色(图3)。将细胞与3μg/ml Na-聚P、aCa-聚P-NP或视黄醇/aCa-聚P-NS，以及与3μM视黄醇孵育。在对照中(图3A)，细胞主要被染成蓝色，而暴露于可溶的Na-聚P(图3B)、聚P纳米颗粒(图3C)、纳米球(图3D)或视黄醇(图3E)的所有细胞明显呈浅色/亮粉色。该结果被认为是，在聚P以及视黄醇存在下，孵育的细胞比对照含有更多脂肪酸、脂色素(chromolipid)和/或磷脂的指示。此外，显而易见的是，与对照相比，在聚P处理的细胞以及视黄醇处理的细胞中，细胞层的密度更高。
聚P和视黄醇对基因表达(FABP4、瘦素和瘦素受体)的影响
利用看家基因GAPDH作为参考，通过RT-qPCR评估脂肪酸结合蛋白4(FABP4)以及瘦素和相应的瘦素受体的表达水平。MC3T3-E1细胞未被处理，或者被暴露于3μg/ml可溶的Na-聚P、aCa-聚P纳米颗粒或视黄醇/aCa-聚P纳米球。在该系列，也包括用游离的视黄醇(3μM)进行的孵育。将细胞的孵育时间设定为3d。然后，提取RNA，并测定表达水平，并且其与GAPDH相关联；该比率设定为1。
如果将细胞与Ca2+复合的可溶的Na-聚P孵育，相对于未处理的对照，所有FABP4、瘦素和瘦素受体这三种基因的表达水平没有显著改变(图4)。然而，添加聚P纳米颗粒、aCa-聚P-NP引起FABP4(2.3倍)、瘦素(4.2倍)和瘦素受体基因(3.8倍)稳定状态表达的显著上调。如果向细胞添加纳米球、视黄醇/aCa-聚P-NS，则增加更显著；在那些分析中，FABP4(5.8倍)、瘦素(11.6倍)和瘦素受体基因(8.3倍)的转录本的数量增加。如果将细胞单独暴露于视黄醇，则仅测量到非显著的增加(图4)。
静电纺丝垫的制备
如果嵌入静电纺丝纤维垫中，测定视黄醇和非晶形的Ca-聚P纳米颗粒对FABP4、瘦素和瘦素受体的表达的影响。如下文“方法”部分所概述的，将组分视黄醇和Ca-聚P纳米颗粒掺入基于PLA的纤维网中(图1)。如下文“方法”部分所概述的，将PLA与PEG以80wt.％：20wt.％的比例混合，然后溶于氯仿中。随后以20wt％(相对于PLA)向PLA溶液中添加视黄醇。此外，也添加aCa-聚P-NP纳米颗粒，到达10wt％的终浓度。将形成的悬液进行超声处理，并用于静电纺丝程序。
制备具有高至20cm直径的垫，其由平均网格尺寸为10-20μm的≈2μm纤维纺成。如果纤维包含视黄醇，则垫的颜色变为淡黄色；因此必须避光保护它们。尽管纯的PLA垫呈白色(图1D)，由PLA/视黄醇溶液纺成的垫(图1E)以及由PLA/视黄醇/aCa-聚P-NP悬液纺成的垫呈黄色(图1F)。
垫的特征
进行FTIR分析以评估PLA:纳米球纤维垫内的结构改变和/或分子链相互作用。包括下述样本：PLA基质、视黄醇、含有20％视黄醇的PLA，以及含有20％视黄醇和20％Ca-聚P纳米颗粒的PLA。如图5中所示，测试的所有5个样本均引起PLA聚酯的明显峰值，其中在1746/1749cm-1处具有强羰基带(C＝O)，在2982和2930以及在1445和1380cm-1处具有CH3的C-H弯曲振动，以及在1300-1000cm-1处具有不对称的C-O伸缩振动。相对于纯的PLA样本，PLA中的羰基C＝O的吸收带从1746cm-1移位至1749cm-1或1748cm-1；在添加视黄醇和Ca-聚P之后，该吸收强度也移位(图5)。此外，在1300至1000cm-1的波数范围内，对于伸缩振动也发生类似的移位。
视黄醇的FTIR光谱显示了在1549cm-1处的特征性视黄醇带(视黄醇的羟基)，该信号在包含视黄醇的PLA的光谱中消失(图5)。此外，在视黄醇中，波数1100至800cm-1范围各种各样的信号。这些发现指示，包封有组分聚P和视黄醇的PLA显示出与PLA基质的弱相互作用。
PLA纤维材料(图6A)以及PLA/视黄醇纺织材料(图6B)的EDX分析，仅显示预期的C和O的信号。相比之下，如果分析PLA-aCa-聚P-NP聚合物，则除C和O之外，还出现Ca、P和Na的信号(图6C)。Na峰反映来源于原始的Na-聚P材料，用于至不可溶的Ca-聚P的转化的剩余的Na+。
包含聚P的纤维垫的功能研究
将MC3T3-E1细胞接种于纺织垫的圆片样本上，并孵育3d。在第一系列实验中，在孵化固定之后取垫，脱水，然后进行SEM分析。结果显示，在单独用PLA纺织的那些纤维垫上，几乎观察不到细胞(图7A和7B)。相比之下，如果将细胞培养在补充有aCa-聚P-NP或视黄醇/aCa-聚P-NP的PLA上，则观察到紧密填充的细胞层(图7C和7D)。
为了定量支持不同垫的细胞活性功能特性，通过RT-qPCR分析测定在此研究的FABP4、瘦素和瘦素受体这三种基因的稳定状态表达水平。表达值与参考基因GAPDH的表达相关联；最后使那些值与在用于接种(在脱离之后即刻处理2h的时长)的细胞中测量的那些基因和GAPDH的比率成比例。观察到，给不出培养在纯的PLA垫上的细胞中的基因的可靠表达值，因为仅存在少数细胞存活于那些纤维上(图8)。相比之下，FABP4、瘦素和瘦素受体的稳定状态表达水平，在PLA-aCa-聚P-NP纤维垫上分别经历1.2倍、2.3倍和2.6倍的显著升高。如果在PLA-视黄醇/aCa-聚P-NS纤维上生长3d，观察到那些基因分别3.7倍、5.8倍和6.1倍的同样的强诱导(图8)。
基于这些实验，我们得出如下结论：如果补充有aCa-聚P-NP或视黄醇/aCa-聚P-NP，则如对编码FABP4、瘦素和瘦素受体的基因的表达所监测的，那些PLA纤维引发形态发生活性。
与Na-聚P孵育的牙齿相对于与aCa-聚P-MP孵育的牙齿：光学显微镜
将人牙齿样品浸没于Na-聚P[与Ca2+复合]或aCa-聚P-MP的溶液或悬液(10mg/mL)中。在持续2d的孵育时间段之后，取样，通过粘合-牙本质区向内切片，并通过光学显微镜检查(图11)。在用Na-聚P[Ca2+]处理的样品中，在粘合表面未观察到附加层(图11A)。未观察到对照、未处理的样本切片之间的差异(图片未显示)。相比之下，如果来自类似的区域，检查用aCa-聚P-MP处理切片，在粘合顶部观察到明显的50-μm厚的附加层(聚P层)(图11B)。对来自用Na-聚P[Ca2+]处理的样本的粘合层的表面检查显示了粗质地(图11C)，而聚P(aCa-聚P-MP)处理的牙齿的表面粗糙度更精细(图11D)。
与Na-聚P孵育的牙齿相对于与aCa-聚P-MP孵育的牙齿：SEM分析
并行地，通过SEM检查样本(图12)；用各聚P样本将它们处理2d。再次，用10mg/mLNa-聚P[Ca2+]处理的那些样品，在粘合顶部未显示出任何可见的附加层(图12A和12C)。在仅含有薄的粘合层的区域，当观察横断面时，暴露出牙本质小管(图12E)。然而，如果检查用10mg/mL aCa-聚P-MP处理的样本，它们覆盖≈50μm厚的附加的聚P层(图12B和12D)。未检测到对照样本、未用聚P处理的样本或者用Na-聚P[Ca2+]处理的样本之间的差异(未显示)。
在用aCa-聚P-MP孵育期间，含有聚P的牙齿涂层取决于孵育期(图13)。在任何聚P制备物均不存在的情况下(图13A)或者在与Na-聚P[Ca2+]孵育之后，在根部的牙本质区域的表面观察到一些牙本质小管(未显示)。如果将那些牙齿样本暴露于aCa-聚P-MP持续30min，则全部牙本质小管已填充聚合物(图13B)；在较高放大率下，可以看到那些管的开口内的微粒(图13C)。如果孵育时间延长至2d，则在低放大率下，通过SEM可以分辨(几乎)同质的聚P涂层(图13D)；在较高的分辨率下，可以看到微粒(图13E)。
聚P沉积物的EDX分析
采用EDX光谱学技术以表征牙齿根部釉质表面上的聚P沉积。分析未处理的釉质表面的元素分布显示，O、P和Ca的特征信号尤其显示牙齿的矿物质部分，而显著的C信号反映牙齿的有机成分。此外，观察到低的Na和Mg的量(图14A)。在用10mg/mL aCa-聚P-MP进行持续30min短的孵育期期间，仅测量到低的P和Ca信号(图14B)；然而，在2d的孵育期之后，P和Ca信号大幅增加，这反映了来自所述微粒的聚P的沉积(图14C)。
聚P涂层的机械特性
用三角形Berkovich金刚石压痕计进行硬度测量。对于每个给定的值，在(聚P)釉质上进行30次单一测量。施加82mN的最大负载，导致最大1000nm的位移。通常，压痕的最大穿透深度是250±21nm。在一组内，所有负载位移曲线均显示出与图15中给出的形状类似的形状。显示了三组实验中各组的典型测试周期中的典型负载、保持和卸载阶段。在卸载部分，通过拟合幂律函数计算最大负载下的接触刚度。反过来，将在最大负载处得到的函数的斜率，用于计算压痕的接触深度。应用Oliver和Pharr描述的算法(Oliver WC和Pharr GM(1992)An improved technique for determining hardness and elastic modulususing load and displacement sensing indentation experiments.J Mater Res 7:1564-1583)，用该参数计算马氏硬度和降低的弹性模量。对于未处理的釉质，计算出4.33±0.69GPa的马氏硬度以及101.61±8.52GPa的降低的弹性模量(平均测量30次)。聚P包被的釉质样本的各值仅略微下降；在3h孵育期之后[2d孵育期]，计算出3.85±0.64[4.05±0.59]GPa的马氏硬度以及94.72±8.54[85.62±5.33]GPa的降低的弹性模量。
aCa-聚P-MP的功能分析：hMSC细胞中的ALP表达
在聚P存在或不存在下，培养在条件培养基存在下分化为成牙本质细胞的基质细胞hMSC。作为聚P样本，Na-聚P[Ca2+]和aCa-聚P-MP均在30μg/mL的浓度下使用。在单独的分析中，在孵育1、3或7d之后收获细胞，以测定ALP基因的表达水平。结果显示，在聚P不存在下的7-d孵育期期间，ALP的稳定状态表达几乎不变，与参考基因GAPDH表达的比率大约为0.02(图16)。相比之下，如果向培养物中添加Na-聚P[Ca2+]，则测量到表达水平显著增加至0.53±0.01。如果将细胞暴露于aCa-聚P-MP，则观察到更强的影响。尽管在3d的孵育期之后，测得ALP转录本水平2.6倍的显著增加，在总共7d的孵育期期间该数值进一步增加至7倍。
新型基于aCa-聚P-MP的牙齿再封闭生物材料
非晶形的Ca-聚P微粒(aCa-聚P-MP)强结合牙齿表面，并通过碱性磷酸酶(ALP)经历在牙本质小管水解为正磷酸盐。反过来，该产物引发形态发生活性，在这期间编码ALP的基因得到诱导；该过程有助于蛀牙的牙本质小管内羟基磷灰石的修复。最后，通过Ca-聚P层再封闭牙本质小管(图17)。
方法
材料
可以从例如Merck Millipore(#106529；Darmstadt；Germany)或者从ChemischeFabrik Budenheim(Budenheim；Germany)获得具有30至40个磷酸盐单元的平均链长的聚磷酸钠(Na-聚P)，从例如Sigma(#95144；≥97.5％,Mr 286.45；Taufkirchen；Germany)获得全反式视黄醇。
Ca-聚P纳米颗粒和微粒以及Ca-聚P/视黄醇纳米球的制备
按照描述的程序，进行略微改变来制备非晶形的磷酸钙纳米颗粒或微粒(aCa-聚P-NP或aCa-聚P-MP)(Müller WEG,et al.A new polyphosphate calcium material withmorphogenetic activity.Materials Lett 2015；148:163-166；GB 1420363.2)。aCa-聚P-NP：简言之，在室温下，向溶于50ml蒸馏水的1g Na-聚P中，逐滴添加溶于30ml蒸馏水的2.8gCaCl2。在该程序期间，用NaOH水溶液将pH调节至10.0。搅拌12h之后，经Nalgene过滤单元(孔径0.45μm；Cole-Parmer)通过过滤收集纳米颗粒。将得到的aCa-聚P-NP(比率为磷酸根：Ca2+＝2)在50℃下干燥。aCa-聚P-MP：简言之，将10g Na-聚P溶于蒸馏水中，并在室温添加14.2g CaCl2·2H2O。在制备期间，将pH调节至10.0。搅拌(4h)之后，收集颗粒，用乙醇洗涤并在60℃干燥。
在避光条件下制备非晶形的视黄醇/Ca-聚P纳米球、视黄醇/aCa-聚P-NS。向Na-聚P溶液(100ml水中含有1g)中逐滴添加含有2.8g CaCl2的视黄醇溶液(100mg/50ml无水乙醇)。为了避免相位分离，向Na-聚P溶液中添加2g聚(乙二醇)(PEG)(P5413；Sigma-Aldrich；平均分子量8,000)。搅拌6h之后，通过过滤收集形成的颗粒。应用基于SbCl3的光谱技术，发现纳米球包含100mg/g视黄醇(≈1μM)(Subramanyam GB,Parrish DB.Colorimetricreagents for determining vitamin A in feeds and foods.J Assoc Off Anal Chem1976；59:1125-1130)。与在视黄醇不存在下形成的纳米颗粒(aCa-聚P-NP)相比，所述纳米球的颜色呈淡黄色。
通过FTIR进行化学表征
可以例如通过应用傅里叶变换红外光谱学，证实纳米颗粒和微粒内的聚P的聚合物特征；可以使用X射线衍射分析来证明材料是非晶形的。微粒的平均尺寸是300nm，并且它们在100至600nm的尺寸范围内变化(图10A和10B)。可以利用例如具有Golden Gate ATR辅助设备的Varian 660-IR光谱仪(Agilent)，应用衰减全反射(ATR)模式的傅里叶变换红外(FTIR)光谱学。记录波数4000至600cm-1下的光谱。
聚(乳酸)纤维垫的制备
如所述制备基于聚(乳酸)的纳米纤维(Müller WEG,et al.Biosilica-loadedpoly(ε-caprolactone)nanofibers mats provide a morphogenetically activesurface scaffold for the growth and mineralization of the osteoclast-relatedSaOS-2 cells.Biotechnol J 2014；9:1312-1321)；图1中给出了示意图。从Sigma(分子量75,000-120,000；P1691)获得聚(D,L-丙交酯)(PLA)。将PLA与PEG混合(以80wt.％：20wt％的比例)，然后以20％(w/v)的终浓度添加至氯仿中。将PLA/PEG-氯仿悬液在40℃搅拌6h，直至达到聚合物的完全溶解。向PLA溶液中添加视黄醇，以得到20wt％的终浓度(相对于PLA)。如所指示的，以10wt％的混合浓度向已包含视黄醇的PLA溶液中添加根据Müller等人(Müller WEG,et al.A new polyphosphate calcium material with morphogeneticactivity.Materials Lett 2015；148:163-166)所述制备的Ca-聚P纳米颗粒(aCa-聚P-NP)。在静电纺丝之前即刻将悬液进行超声处理，持续15min，以确保纳米球在PLA溶液中的适当分散。
用具有一些适应于基于PLA的纺织材料的改变的静电纺丝单元进行静电纺丝(Spraybase；Profector Life Sciences,Dublin；Ireland)。将溶液注入配备有与高压电源相连的钝头不锈钢针头(18规格)的塑料注射器。在17kV的电压下，以每小时1ml的进料速率旋转溶液；在所述过程期间，将喷嘴与收集器之间的距离维持在150mm。除了垫的静电纺丝之外，在所有情况中均使用金属网作为收集器。将纤维垫从收集器中移出，并干燥过夜。在整个程序期间，尽可能地避免曝光。
MC3T3-E1细胞的培养
在包含20％胎牛血清(FCS；Gibco)的a-MEM(Gibco-Invitrogen,Darmstadt；Germany)中，培养小鼠颅骨细胞MC3T3-E1细胞(ATCC-CRL-2593；#99072810；Sigma)。此外，该培养基补充有2mM l-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和50μg/ml庆大霉素。在培养箱中，于37℃和5％CO2下，在25cm2瓶或24孔板中孵育细胞。在达到80％的汇合度之后，利用胰蛋白酶/EDTA分离细胞，然后以5·103个细胞/ml的密度再培养。以5·103个细胞/孔的密度接种细胞。每3天更换培养基/血清。
如所指示的，向细胞中添加以下聚P制备物：(i)与Ca2+化学计量地复合的“Na-聚P”(摩尔比为1:2[磷酸盐单体：Ca2+]；Müller WEG,et al.Inorganic polymeric phosphate/polyphosphate as an inducer of alkaline phosphatase and a modulator ofintracellular Ca2+level in osteoblasts(SaOS-2cells)in vitro.Acta Biomaterialia2011；7:2661-2671)，(ii)“aCa-聚P-NP”纳米颗粒，(iii)“视黄醇/aCa-聚P-NS”纳米球，或者(iv)“视黄醇”。将视黄醇溶于乙醇(1mg/ml)中，然后稀释于DMSO(二甲亚砜)中。进行孵育，持续3d。
在指示的实验中，将圆形纤维垫样本(直径15mm)插入24孔板的各孔中，并以5·103个细胞/孔的密度接种MC3T3-E1细胞。然后将分析物孵育3d，并进行显微镜分析以及聚合酶链式反应分析。
人多能基质细胞的培养
在条件培养基存在下，人多能基质细胞(hMSC)从发育的牙胚细胞分化为成牙本质细胞；如(Huo N,et al.(2010)Differentiation of dermal multipotent cells intoodontogenic lineage induced by embryonic and neonatal tooth germ cell-conditioned medium.Stem Cells Dev 19:93-104)所述制备条件培养基。关于hMSC培养程序的描述已经公开(Wang XH,et al.(2014)The marine sponge-derived inorganicpolymers,biosilica and polyphosphate,as morphogenetically active matrices/scaffolds for differentiation of human multipotent stromal cells:Potentialapplication in 3D printing and distraction osteogenesis.Marine Drugs 12:1131-1147)。在责任伦理委员会批准之后，可以从知情同意的供体的骨髓抽取物获得人细胞。在湿润的培养箱中，于37℃和5％CO2下进行孵育。将第六代用于研究。在补充有20％胎牛血清(FCS；Gibco Invitrogen)以及100个单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素的α-MEM(Biochrom)中孵育细胞。此外，向分析物中添加5％的条件培养基。
在条件培养基存在下，第三代之后在聚P不存在或者在30μg/mL Na-聚P[Ca2+]或aCa-聚P-MP存在下，继续在48孔板中培养细胞(Cat.no.677102；Greiner)。然后收获细胞用于qRT-PCR分析。
细胞活力分析
可以利用例如“细胞增殖试剂盒II”(Roche)，通过比色XTT方法([Na-3’[1-(苯基氨基-羰基)-3,4-四唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸])测定细胞增殖/细胞活力。在650nm下测定吸光度，并将其减去背景值(500nm)。在实施例所述的实验中，在72h之后测定活细胞。
细胞染色
如(Nakanishi T,Kato S.Impact of diabetes mellitus on myocardial lipiddeposition:an autopsy study.Pathol Res Pract 2014；210:1018-1025)所述，用耐尔蓝A(Basic Blue 12,Nile blue sulfate；Sigma N0766)对MC3T3-E1细胞进行染色。该染色试剂在组织样本中明显，中性脂质(甘油三酯、胆固醇脂、类固醇)呈粉色，而酸(脂肪酸、脂色素、磷脂)被染成蓝色。
反转录定量实时PCR分析
可以通过应用反转录定量实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)，测定基因表达水平。如实施例所述的各实验所指示，在3μg/ml聚P(以可溶形式，或以纳米颗粒/纳米球)或者3μM视黄醇存在或不存在下，在培养基/血清中孵育细胞，持续3d。然后收获细胞，分离它们的RNA，并进行RT-qPCR。在实施例所述的实验中，使用与各小鼠基因匹配的下述引物对：脂肪酸结合蛋白4(小家鼠(Mus musculus)；登录号NM_024406)Fwd：5’-CGATGAAATCACCGCAGACGAC-3’[nt278至nt299](SEQ ID NO：1)，和Rev：5’-ACCACCAGCTTGTCACCATCTC-3’[nt412至nt392](SEQID NO：2)；产物大小135bp；瘦素(小家鼠；NM_008493)Fwd：5’-GAAGAGACCGGGAAAGAGTGACAG-3’[nt2888至nt2911](SEQ ID NO：3)，和Rev：5’-TGACCAAGGTGGCATAGCACAG-3’[nt3040至nt3019](SEQ ID NO：4)；大小153bp；以及瘦素受体，转录本变体2(小家鼠；NM_010704)Fwd：5’-GTGTGAGGAGGTACGTGGTGAAG-3’[nt2570至nt2592](SEQ ID NO：5)，和Rev：5’-CCGAGGGAATTGACAGCCAGAAC-3’[nt2708至nt2686](SEQ ID NO：6)；大小139bp。将GAPDH[甘油醛3-磷酸脱氢酶(Mus GAPDH；NM_008084)用作参考基因Fwd：5’-TCACGGCAAATTCAACGGCAC-3’[nt200至nt220](SEQ ID NO：7)，和Rev：5’-AGACTCCACGACATACTCAGCAC-3’[nt338至nt316；大小139bp](SEQ ID NO：8)。
为了定量hMSC中编码ALP的基因的表达水平，在30μg/mL Na-聚P[Ca2+]或aCa-聚P-MP存在下，将细胞孵育1、3和7d，收获细胞，分离RNA，并进行qRT-PCR。可以使用匹配人ALP基因(登录号NM_000478.4)的引物对Fwd：5′-TGCAGTACGAGCTGAACAGGAACA-3′(SEQ ID NO.9)[nt1141至nt1164]，和Rev：5′-TCCACCAAATGTGAAGACGTGGGA-3′(SEQ ID NO.10)[nt1418至nt1395；PCR产物长度278bp]，以及使用匹配参考基因GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶；NM_002046.3)的引物对Fwd：5′-CCGTCTAGAAAAACCTGCC-3′(SEQ ID NO.11)[nt845至nt863]，和Rev：5′-GCCAAATTCGTTGTCATACC-3′(SEQ ID NO.12)[nt1059至nt1078；215bp]。
可以例如在iCycler(Bio-Rad)中，应用各iCycler软件进行扩增。在确定Ct值之后，计算各转录本的表达。测定各基因的表达水平，并且计算的值与未处理的细胞中基因的表达值相关联；将该值设定为1。
牙齿的体外孵育
为了测定aCa-聚P-MP再封闭牙本质层的效果，并核查微粒封闭牙本质小管的效力，使用人牙齿。在使用牙齿之前，机械清除软组织，在3％次氯酸钠中处理5h以移除剩余的软组织，然后于4℃在100％相对湿度的室中保存。
将牙齿样品浸没于盐水(0.90％[w/v]NaCl)中，如文中所提及的，所述盐水包含10mg/mL的与Ca2+化学计量地复合的aCa-聚P-MP或Na-聚P(摩尔比为2:1/磷酸盐单体：Ca2+[Müller WEG,et al.(2011)Inorganic polymeric phosphate/polyphosphate as aninducer of alkaline phosphatase and a modulator of intracellular Ca2+level inosteoblasts(SaOS-2cells)in vitro.Acta Biomater 7:2661-2671])。在25℃进行孵育。然后如(Wang XH,et al.(2014)Enzyme-based biosilica and biocalcite:biomaterialsfor the future in regenerative medicine.Trends Biotechnol 32:441-447)所述，通过在牙髓内部切开1-2mm厚的圆片，而对样本进行切片；如所指示的，该测量中包括牙本质或釉质区域以及粘合层。
显微分析
例如用配备有低电压(<1kV；近表面有机表面的分析)探测器的HITACHI SU 8000(Hitachi High-Technologies Europe GmbH)，进行扫描电子显微镜检查(SEM)。在各孵育之后，将牙齿样本在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中洗涤三次。经蒸馏水短暂遍历之后，将样本干燥并进行检查。如所提及的，切开样本。可以例如用配备有VH-Z100变焦镜头的VHX-600数码显微镜(Keyence)，进行数码光学显微镜检查。
电子显微镜检查
对于扫描电子显微(SEM)分析，例如可以应用HITACHI SU 8000电子显微镜。为了使与纺织垫相连的细胞可视化，在孵育之后移出样品，并进行固定、脱水和风干。
X射线能量色散谱
可以例如用与扫描电子显微镜(例如，Nova 600Nanolab；FEI)相连，在10kV下操作，具有30-45s的收集时间的EDAX Genesis EDX System，进行EDX光谱学。在实施例所述的实验中，通过EDX分析了大约10μm2的面积。
机械纳米压痕测定
利用例如NanoTest Vantage系统(Micro Materials Ltd)，通过深度敏感压痕，在25℃评估未处理的或者包被聚P的牙齿样品的表面。利用三面Berkovich金刚石压头，以在涂层表面产生三角形的压痕标记；齿顶圆角半径测量大约50-100nm。总共进行30次单一测量。负载率以及卸载率固定为0.5mN s-1。为了测定“蠕变效应”，在最大负载处引入30s停留期。在卸载曲线中，将在10％的最大负载处的第二停留期(60s)用于测定系统的热漂移。根据Oliver和Pharr方法(Oliver WC and Pharr GM(1992)An improved technique fordetermining hardness and elastic modulus using load and displacement sensingindentation experiments.J Mater Res 7:1564-1583)，用卸载数据计算样本的马氏硬度和降低的模量。对于计算，可以使用软件“NanoTest Platform Four V.40.08(MicroMaterials Ltd)”。
统计分析
可以利用配对的学生t检验对结果进行统计学评估。
序列表
<110> 维尔纳·恩斯特·路德维格·格奥尔格·米勒
<120> 基于具有形态发生活性的非晶形聚磷酸钙的生物活性伤口敷料和牙齿涂层
<130> M32732WO03
<150> GB1420363.2
<151> 2014-11-17
<150> GB1505629.4
<151> 2015-04-01
<150> GB1510772.5
<151> 2015-06-19
<160> 12
<170> PATENTIN VERSION 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 小家鼠(MUS MUSCULUS）
<400> 1
CGATGAAATC ACCGCAGACG AC 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 2
ACCACCAGCT TGTCACCATC TC 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 3
GAAGAGACCG GGAAAGAGTG ACAG 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 4
TGACCAAGGT GGCATAGCAC AG 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 5
GTGTGAGGAG GTACGTGGTG AAG 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 6
CCGAGGGAAT TGACAGCCAG AAC 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 7
TCACGGCAAA TTCAACGGCA C 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 8
AGACTCCACG ACATACTCAG CAC 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(HOMO SAPIENS)
<400> 9
TGCAGTACGA GCTGAACAGG AACA 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
TCCACCAAAT GTGAAGACGT GGGA 24
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
CCGTCTAGAA AAACCTGCC 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
GCCAAATTCG TTGTCATACC 20

Claims (25)

1.固体生物相容且可生物降解的非晶形聚磷酸钙微粒，其
i)在HA表面形成紧密结合的聚磷酸盐层，
ii)具有与天然釉质接近的硬度和弹性模量，
iii)能够引发前体细胞分化为成牙本质细胞，以及
iv)激活前体成牙本质细胞中碱性磷酸酶的表达，
其用于封闭暴露于牙齿表面的牙本质小管并填充牙釉质、牙骨质和牙本质中的缺损的用途。
2.制备掺入有包含至少一种生物活性组分的纳米球或微球的三维(3D)静电纺丝纤维垫的方法，其包括下述步骤：
i)提供所述纤维垫材料，并将所述纤维材料与乳化剂混合，
ii)将所述混合物溶解于合适的溶剂中，优选有机溶剂，
iii)添加所述至少一种生物活性组分，
iv)将非晶形聚磷酸钙纳米颗粒或微粒(aCa-聚P-N/MP)添加至来自iii)的所述混合物中，以及
v)将所述混合物进行静电纺丝，以形成掺入有所述纳米球或微球的3D静电纺丝纤维垫。
3.如权利要求1或2所述用途的非晶形聚磷酸钙微粒，其中所述聚磷酸钙微粒被表征为0.1比10(磷酸比钙)的重量比，优选0.5比1或者1比1(磷酸比钙)的重量比。
4.如权利要求1至3中任一项所述用途的非晶形聚磷酸钙微粒，其中所述聚磷酸盐的链长范围为约3至约1000个磷酸盐单元，优选范围为约10至约100个磷酸盐单元，并且最优选约40个磷酸盐单元。
5.如权利要求1至4中任一项所述用途的非晶形聚磷酸钙微粒，其中所述聚磷酸钙微粒的平均尺寸范围为约50nm至约500nm。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述3D静电纺丝纤维垫由聚(D,L-丙交酯)(PLA)组成。
7.如权利要求2或6所述的方法，其中所述乳化剂是聚(乙二醇)。
8.如权利要求2、6或7中任一项所述的方法，其中将PLA和PEG以80wt％:20wt％的比例混合。
9.如权利要求2或6-8中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂是异丙醇。
10.如权利要求2或6-9中任一项所述的方法，其中所述生物活性组分是视黄醇。
11.如权利要求10所述的方法，其中将所述视黄醇以20wt％(相对于PLA)添加至PLA溶液中。
12.如权利要求2-5或6-11中任一项所述的方法，其中将所述非晶形聚磷酸钙纳米颗粒或微粒添加至10wt％的终浓度。
13.如权利要求1或3-5所述用途的非晶形聚磷酸钙微粒，其用于再封闭牙本质小管以改善牙本质过敏症或者用于龋齿预防。
14.制备刺激成牙本质细胞前体细胞和成牙本质细胞的分化和激活的牙齿植入材料的方法，其包括使权利要求1或3-5中任一项所公开的固体生物相容且可生物降解的非晶形聚磷酸钙微粒包含于所述牙齿植入材料中。
15.制备刺激成牙本质细胞前体细胞和成牙本质细胞的分化和激活的牙膏的方法，其包括使权利要求1或3-5中任一项所公开的生物相容且可生物降解的非晶形聚磷酸钙微粒包含于所述牙膏中。
16.制备用于再封闭牙本质小管并由此改善过敏症的牙膏的方法，其包括使权利要求1或3-5所公开的固体生物相容且可生物降解的非晶形聚磷酸钙微粒包含于所述牙膏中。
17.按照权利要求6所制备的牙齿植入材料或者按照权利要求15或16所制备的牙膏。
18.如权利要求17所述的牙齿植入材料或牙膏，其用于刺激成牙本质细胞前体细胞和成牙本质细胞的分化和激活。
19.如权利要求17所述的牙膏，其用于再封闭所述牙本质小管并由此改善过敏症。
20.掺入有包含至少一种生物活性组分的纳米球或微球的三维(3D)静电纺丝纤维垫，其通过如权利要求2-5或6-12中任一项所述的方法来制备。
21.权利要求20所述的三维(3D)静电纺丝纤维垫用于制备伤口愈合材料的用途。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述材料是伤口敷料或伤口敷料的组分。
23.权利要求20所述的三维(3D)静电纺丝纤维垫用于药物递送的用途。
24.权利要求20所述的三维(3D)静电纺丝纤维垫，其基于诱导瘦素和/或瘦素受体基因和/或分子来用于医学病况治疗的用途。
25.如权利要求24所述用途的三维(3D)静电纺丝纤维垫，其中所述医学病况选自伤口愈合不充分。
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