CN107106630A - 用于皮肤病变或皮肤病理的百合鳞茎的提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗需要细胞重塑或组织修复的病理的百合鳞茎的有机提取物。需要细胞重塑或组织修复的皮肤病变或皮肤病理包括：创伤愈合、瘢痕疙瘩、加速光化性老化、烧伤特别是由于放射治疗而引起的烧伤、以及痤疮。本发明还涉及用于治疗需要细胞重塑或组织修复的病理的组合物，其特征在于，该组合物包含百合鳞茎的有机提取物作为活性成分。
Description
如今，因代谢偏差或代谢减缓而导致的很多皮肤病变或皮肤病理都未进行治疗或者经不当疗法进行治疗。其中可以列举一些例子，比如加速光化性老化、创伤愈合、痤疮、细菌引起创伤后的病症。
在所有因外部侵害或细胞代谢紊乱而导致的情况中，都牵涉到被视为真皮的重要细胞的成纤维细胞。
事实上，表皮组织和真皮组织通过称为基底膜的蛋白质薄层分隔开来。基底膜主要由基质成分例如IV型和VII型胶原、硫酸乙酰肝素、V型昆布氨酸和巢蛋白构成。基底膜用作通道，特别地，对来自表皮和真皮的消息进行存储和保存以随后向这两个组织进行释放。
成纤维细胞负责以胶原、糖蛋白(弹性蛋白、纤连蛋白等)、蛋白聚糖(硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸等)的形式产生超过99％的真皮细胞外基质(MEC)并且产生相关酶，例如金属蛋白酶(MMP)、弹性蛋白酶以及负责MEC重塑的透明质酸酶。在正常情况下，成纤维细胞具有间叶细胞的表型，主要作用是MEC的合成和重塑。
然而，在一些条件下，例如在愈合时，成纤维细胞改变特性以获得不同的表型，以使其能够满足修复过程的要求。为此，成纤维细胞表达α肌动蛋白并且转化成具有不同蛋白质谱的肌成纤维细胞。
在不受该假设的约束的情况下，发明人假设存在针对成纤维细胞的每个表型进行改变的信号并且力图重现由角质细胞所发射的信号以修复真皮的成纤维细胞的皮肤生长表型。
在长期研究之后，发明人出乎意料地发现，在百合(lilium)鳞茎中存在可以将成纤维细胞转化成肌成纤维细胞的信号的证据。
因此，本发明涉及用于将成纤维细胞转化成肌成纤维细胞的百合鳞茎的提取物。
该转化预期可以用于治疗痤疮。
在一个实施方式中，来自经百合鳞茎的有机提取物处理的角质细胞培养物的介质将成纤维细胞转化成肌成纤维细胞。
该转化预期可以用于研究角质细胞之间的信号(相互交流)。
因此，本发明涉及用于需要细胞重塑或组织修复的皮肤病变或皮肤病理的百合鳞茎的有机提取物。
本发明涉及用于治疗需要成纤维细胞表型转化的人类皮肤的百合鳞茎的有机提取物。
需要细胞重塑或组织修复的皮肤病变或皮肤病理特别是：
创伤愈合、瘢痕疙瘩、加速光化性老化、烧伤(特别是由于放射治疗引起的烧伤)以及痤疮。
因此，本发明涉及用于创伤愈合的百合鳞茎的有机提取物。
因此，本发明涉及用于治疗瘢痕疙瘩的百合鳞茎的有机提取物。
因此，本发明涉及用于治疗加速光化性老化的百合鳞茎的有机提取物。
因此，本发明涉及用于治疗烧伤、特别是由于放射治疗引起的烧伤的百合鳞茎的有机提取物。
因此，本发明涉及用于治疗痤疮的百合鳞茎的有机提取物。
按照伤口一词的出现率，伤口被定义为皮肤表层或粘膜完整性的切断，该切断可能源自非常多的病因。最常见的是出于机械、热或化学的原因，伤口也可能是由先前存在的进行性病理而产生的伤口，例如溃疡。
瘢痕疙瘩是皮肤的良性纤维瘤(非癌性的)，其通常发展成皮肤病变。瘢痕疙瘩的形成不是由病变的严重性决定的，而是在成纤维细胞产生超量的胶原的情况下由于伤口的不正常愈合而形成的。
与环境因素或光化性老化相关的外源性老化对应于与长期日光照射和位于光辐照区相关的皮肤的临床变化、组织学变化和功能特性变化。皮肤老化、特别是光化性皮肤老化与突发的皮肤癌之间存在着联系，这是因为它们都和一些与太阳辐射相关的细胞变化相关。
烧伤是由于热而导致的皮肤(与空气接触的覆盖中空器官内部的细胞层)的病变。引起烧伤的原因有很多，可以由火焰直接引起、可以是化学原因(酸、氟等)、机械原因(摩擦、皮肤磨损)或电原因(非穷举列表)。
在皮肤病理之中，痤疮被视为人类、特别是青少年中最普遍的皮肤病理。
发病机理表现在毛皮脂滤泡上，并且归因于以下多个因素：
-痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes，P.acnes)增殖
-滤泡过度角化
-存在促炎活性
-类固醇生成调节
-皮脂分泌增加
-癸二酸脂质性质改变。
皮脂排泄物增加以及特别是癸二酸脂质性质改变是与痤疮的发展相关的两个重要事项。因此，已经观察到在痤疮病变中亚油酸的比率下降、与重要的去饱和酶活性有关的单不饱和脂肪酸/多不饱和脂肪酸之比降低以及脂类改变(氧化作用、脂质过氧化等)比率的增加。这些改变可能与一些代谢途径、特别是PPAR途径相互冲突，从而引发皮脂腺细胞中负责产生促炎脂类的5-脂氧合酶以及环氧合酶的活性。
此外，毛皮脂腺的角化细胞、皮脂腺细胞和巨噬细胞可以经由不同的受体(TLR、CD1、CD14等)被痤疮丙酸杆菌激活。该激活导致在痤疮病变中释放具有促炎特性的细胞因子/趋化因子。
男性激素(雄激素)在痤疮的发病机理中、特别是在该病发展的初始阶段中起至关重要的作用。因此，已经观察到在皮脂腺中雄激素及其受体的更高表达。皮脂腺表达了从胆固醇或DHEA(脱氢表雄酮)(例如5α-还原酶)生产睾酮所需要的整个酶系统。雄激素既刺激皮脂腺细胞增殖又刺激脂肪生成。
目前大多数治疗基于以下3个主要方面：
-抗生素：其通常涉及通过口服治疗来抑制痤疮丙酸杆菌(P.acnes)。该细菌于1896年被首次发现，此后该细菌被认为是痤疮病变的主要病理学原因。然而，即使在没有任何病理情况下，痤疮丙酸杆菌也是正常皮肤微生物群的一部分。
-抗炎药：其涉及具有抑制炎症效果的一系列多个治疗：
○异维A酸
○刺激IL-1拮抗剂表达的外肽酶抑制剂
○过氧化苯甲酰，H2O2
○5％氨苯砜凝胶
○1磷酸鞘氨醇纳米颗粒
○脱氧核糖核酸I
○负责阻止视黄酸代谢的试剂
-抗雄激素：其涉及基于诸如炔雌醇这样的避孕药进行治疗。
文献中从未提及真皮在痤疮的发病机理中的作用，然而真皮和表皮由于相互之间存在大量交换而密切相关。事实上，表皮组织和真皮组织通过称为基底膜的蛋白质薄层分隔开来。基底膜主要由基质成分构成，例如IV型和VII型胶原、硫酸乙酰肝素、V型昆布氨酸和巢蛋白。基底膜用作通道，并且特别地对来自表皮和真皮的消息进行存储和保存以随后向这两个组织进行释放。
如前所述，在一些条件下，例如在愈合时，成纤维细胞改变特性以获得不同的表型，这使其能够满足修复过程的要求。为此，成纤维细胞表达α肌动蛋白并且转化成具有不同蛋白质谱的肌成纤维细胞。可以设想这些新合成的消息在痤疮发病机理的调节中起重要作用。
在下面描述的示例中，发明人通过一系列实验来实现该信号的功能效果的客观化。
本发明还涉及百合的提取物在痤疮的局部治疗中的应用。
本发明尤其涉及用于治疗痤疮的百合鳞茎的有机提取物。
在一个实施方式中，百合是川百合(lilium davidii)。
提取物是通过本领域技术人员已知的常规方法获得的。通过固/液提取的常规技术来获得植物提取物，固相由植物材料构成而液相由溶液构成。
可单独或组合使用的方法为：
浸渍，其中接触阶段被保持在常温下。
煎熬或回流，其中接触阶段被保持在溶剂的沸腾温度下。
蒸煮，其中接触阶段被保持在前两种情况之间的温度下。
浸泡，包括将沸腾的溶剂倾倒在固体上然后放置冷却一定时间。
浸滤或渗滤，其在于使溶剂通过生物质。
这些方法经常相互进行组合或者与诸如蒸馏、水蒸气蒸馏、精馏等这样的其他方法进行组合。
可以连续地或混合地使用多种溶剂。
可以借助于例如高压(超临界CO2)、微波、超声波等技术来改进这些方法。
在一个实施方式中，根据本发明的百合的有机提取物通过在有机介质中浸渍、然后在中度真空下通过蒸馏溶剂进行浓缩而获得。
有机介质由选自丙酮或甲醇的溶剂构成。
提取物通过与适于施用至皮肤的一种或更多种辅料或赋形剂混合或结合而被并入皮肤病用组合物中。
在一个实施方式中，本发明涉及百合鳞茎的有机提取物，其特征在于，该百合鳞茎的有机提取物被并入选自简单或复合乳剂或油剂的赋形剂中。
在一个实施方式中，百合鳞茎的有机提取物以选自由以下构成的组的溶形式而被并入赋形剂中：溶液、混悬液、分散体和/或泡状形式。
在一个实施方式中，赋形剂呈现为选自由以下构成的组的形式：洗剂、膏剂、乳剂、凝胶剂、膏状凝胶剂、粉剂、固体棒、气雾剂、泡沫剂、油剂、洗剂和喷雾剂。
可以根据本领域技术人员已知的技术，尤其是专用于制备乳剂的技术，来制备用于制备包含百合提取物的组合物的赋形剂。
在一个实施方式中，合适的赋形剂是乳剂或油剂。这种乳剂优选地选自由以下构成的组：简单乳剂、复合乳剂、水包油(H/E)乳剂、油包水(E/H)乳剂、油包水包油(H/E/H)乳剂、水包油包水(E/H/E)乳剂。
适于化妆品应用的赋形剂呈现为选自由以下构成的组的形式：膏剂、乳剂、凝胶剂、膏状凝胶剂、粉剂、固体棒、气雾剂、泡沫剂、油剂、洗剂和喷雾剂。
此外，根据本发明的组合物还可以包含选自包括以下的组中的配方助剂或辅料：脂肪、有机溶剂、离子增稠剂或非离子增稠剂、柔软剂、抗氧化剂、阻光剂、稳定剂、润肤剂、硅酮、α羟酸、抗泡沫剂、保湿剂、维他命、香料、防腐剂、表面活性剂、填料、螯合剂、聚合物、抛射剂、碱化剂或酸化剂、乳化剂、粘度控制剂、乳液稳定剂、调理剂、增溶剂和染色剂。
在乳化剂之中，包括：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两亲性表面活性剂例如苄泽(Brij)、吐温(Tween)、聚氧乙烯、聚氧乙烯酯、卵磷脂、神经酰胺、伪神经酰胺、季铵化神经酰胺。
作为增稠剂或胶凝剂，包括：植物胶、细菌胶或动物胶(例如瓜尔胶)、结兰胶、生物糖胶或阿拉伯胶。还可以包括合成胶凝剂，例如丙烯酰胺聚合物、丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸聚合物或丙烯酸共聚物(例如卡波姆)。在一个实施方式中，增稠剂或胶凝剂可以选自网状聚丙烯酸、瓜尔胶、黄原胶、和改性或非改性纤维素(例如羟丙基瓜尔胶、甲基羟乙基纤维素(HEC)和羟丙基甲基纤维素(HPMC))。
作为硅酮，包括：硅油或六甲基硅烷。
脂肪可以由油或蜡或其混合物构成，并且还包括脂肪酸、脂肪醇以及脂肪酸酯。油可以选自动物油、植物油、矿物油或合成油，特别地选自凡士林油、石蜡油、挥发或非挥发的硅酮油、异构烷烃、聚α烯烃、含氟油和全氟油。类似地，蜡可以选自已知的动物蜡、化石蜡、植物蜡、矿物蜡或合成蜡。
在有机溶剂中，包括：醇和低级多元醇。
本发明还涉及用于治疗需要细胞重塑或组织修复的病理的百合鳞茎的有机提取物，其特征在于，干提取物在包含所述提取物的组合物中的含量为组合物总重量的2.5×10-3至2％。
在一个实施方式中，干提取物的含量为组合物总重量的0.01至0.2％。
在一个实施方式中，干提取物的含量为组合物总重量的0.05％。
在一个实施方式中，治疗痤疮的日剂量为0.5g/天至1.5g/天的上述组合物。
本发明还涉及用于治疗需要细胞重塑或组织修复的病理的组合物，其特征在于，该组合物包含百合鳞茎的有机提取物作为活性成分。
本发明还涉及用于治疗创伤愈合的组合物，其特征在于，该组合物包含百合鳞茎的有机提取物作为活性成分。
本发明还涉及用于治疗瘢痕疙瘩的组合物，其特征在于，该组合物包含百合鳞茎的有机提取物作为活性成分。
本发明还涉及用于治疗光化性老化的组合物，其特征在于，该组合物包含百合鳞茎的有机提取物作为活性成分。
本发明还涉及用于治疗烧伤、特别是由于放射治疗引起的烧伤的组合物，其特征在于，该组合物包含百合鳞茎的有机提取物作为活性成分。
本发明还涉及用于治疗痤疮的组合物，其特征在于，该组合物包含百合鳞茎的有机提取物作为活性成分。
在该组合物的一个实施方式中，百合是川百合。
本发明还涉及一种组合物，其特征在于，百合提取物通过在有机介质中浸渍，然后在中度真空下通过蒸馏溶剂进行浓缩而获得，有机介质由选自丙酮或甲醇的溶剂构成。
在一个实施方式中，根据本发明的组合物包含选自简单或复合乳剂或油剂的赋形剂。
在一个实施方式中，赋形剂呈现为选自由以下构成的组的形式：洗剂、膏剂、乳剂、凝胶剂、膏状凝胶剂、粉剂、固体棒、气雾剂、泡沫剂、油剂、洗剂和喷雾剂。
在一个实施方式中，百合鳞茎的有机提取物在组合物中的含量为组合物总重量的0.2至5％。在一个实施方式中，百合鳞茎的有机提取物的含量为组合物总重量的0.5至5％。
在一个实施方式中，根据本发明的组合物，其特征在于，还包含另外的药物活性成分或化妆品活性成分。
在一个实施方式中，所述药物活性成分选自抗炎药。
在一个实施方式中，所述化妆品活性成分选自对UV-A和/或UV-B有活性的防晒剂、亲水的防晒剂或亲脂的防晒剂。防晒剂例如选自肉桂酸衍生物、水杨酸衍生物、樟脑衍生物、三嗪衍生物、二苯甲酮衍生物、二苯甲酰甲烷衍生物、β,β-二苯基丙烯酸酯衍生物、p-氨基苯甲酸衍生物、聚合物防晒剂和硅酮防晒剂。
示例
示例1
川百合的水醇提取物的制备
获得并鉴别约5kg的川百合鳞茎，然后用淡水清洗鳞茎。在对份额进行标注之后，将川百合鳞茎粉碎并且干燥。
根据准则88/344实施在约15L丙酮中进行浸渍的步骤。
通过在约40℃(250mmHg)的真空下进行第一蒸发来对过滤之后所获得的提取物进行浓缩。通过测量成纤维细胞的α-肌动蛋白表达来进行第一活性测试。
在去除所有溶剂后获得约1g的提取物。
示例2
包含川百合鳞茎有机提取物的组合物
以下对根据本发明的组合物进行描述：
组合物1：
组合物2：
示例3
根据本发明的组合物对人成纤维细胞的α-SMA表达的效果
该实验的目的是测量在用包含百合提取物的膏剂中的丙酮提取物对成纤维细胞进行处理之后α肌动蛋白的表达率。
该实验基于用抗α肌动蛋白一抗对细胞进行免疫标记，然后与缀合了荧光素(FITC)的二抗进行反应，之后使用谱荧光计对荧光强度进行量化。
提取物的制备
将根据示例1所获得的提取物悬浮在无水乙醇溶液中。针对我们的实验配制了3种稀释液：40mg/ml、20mg/ml和10mg/ml的乙醇。并且对于每种稀释液，将每5μl的稀释液与1ml培养基进行混合。从而得到最终浓度为200μg/ml、100μg/ml和50μg/ml的培养基。
成纤维细胞的处理：
使铺满培养物的细胞胰蛋白酶化、计数，然后以50,000细胞/孔的密度接种在8孔板中。经过一夜孵育，去除上清，并且只将新的介质(对照孔)或将含有不同浓度提取物的介质加入相应的孔中。然后将培养物孵育48小时。
细胞的固定：
经过两天的孵育，在常温下将细胞在含有0.1％的triton X-100的4％多聚甲醛溶液中固定和透化30分钟。
非特异性位点的饱和：
为了避免由于将抗体固定在非特异性位点而造成的背景噪声，在常温下将固定的细胞在含有0.5％的BSA的PBS缓冲液中孵育15分钟。
间接免疫荧光法：
在PBS缓冲液中冲洗3次之后，借助于使用特异性抗体(小鼠单克隆，圣塔克鲁兹(Santa-Cruz))的间接免疫荧光法技术来显示α-SMA蛋白。然后，将150μl预先在PBS-BSA缓冲液中稀释的抗体加入每个孔。在常温下孵育45分钟之后，使用PBS冲洗孔3次。将150μl缀合了荧光素的抗鼠免疫球蛋白二抗的溶液加入每个孔。在常温下避光孵育30分钟后，用PBS缓冲液连续冲洗4次细胞毯。
荧光的测量：
使用能够溶解荧光素的裂解缓冲液来避光裂解细胞。由此获得的荧光上清被转移至黑色晶片，然后在光谱荧光计(Fluoroskan)下看到485nm的激发波长和518nm的发射波长。
结果：
| 值1 | 值2 | 值3 | 平均值 | 标准差 | |
| 对照 | 0.544 | 0.518 | 0.495 | 0.519 | 0.020 |
| 百合：50μg | 0.779 | 0.796 | 0.786 | 0.787 | 0.007 |
| 百合：100μg | 0.971 | 0.91 | 0.942 | 0.941 | 0.025 |
| 百合：200μg | 0.836 | 0.938 | 0.852 | 0.875 | 0.045 |
表1
结论：
如图1所示的上述结果显示了，在存在百合提取物的情况下孵育48小时后的培养的人类成纤维细胞的α肌动蛋白的表达显著增长。无论使用哪种提取物稀释液都可以观察到该现象。然而，细胞应答随着使用的浓度的不同而发生变化。所以，如果浓度超过50μg更有效，则细胞似乎在中间浓度为100μg/ml时应答地更好。
示例4
川百合提取物与成纤维细胞SMα肌动蛋白表达的效果-剂量关系的证据
按照相同的规约，突出效果-剂量关系。
将所获得的结果总结在表2中并在图2和图3中示出。
表2
成纤维细胞的SMα肌动蛋白表达清楚地表明了效果-剂量关系。
示例5
通过对关键点进行计数而实现的川百合提取物与成纤维细胞表型向肌成纤维细胞表型转化的效果-剂量关系的证据
所应用的规约在J.A.Grimaud等人的Experentia 15，1977，33(7)890-892中有描述。
所获得的结果总结在表3中并在图4中示出。
| 值1 | 值2 | 值3 | 值4 | 值5 | 平均值 | 标准差 | |
| 对照 | 1.000 | 2.000 | 2.000 | 1.000 | 1.000 | 1.400 | 0.548 |
| 50μg/ml | 4.000 | 4.000 | 5.000 | 4.000 | 2.000 | 3.800 | 1.095 |
| 100μg/ml | 10.000 | 10.000 | 9.000 | 9.000 | 11.000 | 9.800 | 0.837 |
表3
示例6
患者临床试验
对患者进行组合物1的测试，该患者接受了对其病变的评分，并在三周内每日在待治疗区域施用该组合物。
表4：用于在临床试验中进行评估的痤疮临床病变标准化
表5：治疗之前和治疗之后脂溢性病变的程度
注意：脂溢没有出现在痤疮的临床表格中，而是分开进行评估。
表6：治疗之前和治疗之后病变的等级
N＝30；*P<0.01
**P>0.05
获得了痤疮病变的统计上的显著减少(P<0.01)。
结论
百合膏剂对患者的痤疮的整体效果
表7总结了有效性测量结果三周时，有效率超过70％。
Claims (16)
1.一种用于治疗需要细胞重塑或组织修复的病理的川百合鳞茎的提取物。
2.根据权利要求1所述的提取物，用于创伤愈合治疗。
3.根据权利要求1所述的提取物，用于治疗瘢痕疙瘩。
4.根据权利要求1所述的提取物，用于治疗光化性老化。
5.根据权利要求1所述的提取物，用于治疗烧伤，特别是由于放射治疗引起的烧伤。
6.根据权利要求1所述的提取物，用于治疗痤疮。
7.根据权利要求1所述的提取物，用于治疗需要成纤维细胞表型转化的人类皮肤。
8.根据权利要求7所述的提取物，用于将成纤维细胞转化成肌成纤维细胞。
9.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，源自角质细胞培养物的、经百合鳞茎的有机提取物处理的介质将成纤维细胞转化成肌成纤维细胞。
10.根据前述权利要求中任一项所述的提取物，其特征在于，所述提取物通过在有机介质中浸渍，然后在中度真空下通过蒸馏溶剂进行浓缩而获得。
11.根据前述权利要求中任一项所述的提取物，其特征在于，用于治疗痤疮的日剂量为0.5g/天至1.5g/天。
12.根据前述权利要求中任一项所述的提取物，其特征在于，所述提取物被并入赋形剂中，所述赋形剂选自简单或复合乳剂或油剂。
13.根据权利要求12所述的提取物，其特征在于，所述赋形剂选自简单或复合乳剂或油剂。
14.根据权利要求12或13中任一项所述的提取物，其特征在于，所述赋形剂呈现为以下形式：洗剂、膏剂、乳剂、凝胶剂、膏状凝胶剂、粉剂、固体棒、气雾剂、泡沫剂、油剂、洗剂和喷雾剂。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的提取物，其特征在于，所述提取物在所述赋形剂中的含量为所述赋形剂和所述提取物的总重量的0.2％至5％。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的提取物，其特征在于，所述赋形剂还包含另外的药物活性成分或化妆品活性成分。
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