CN107090509A - 一种竞争性内源rna网络的识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种竞争性内源RNA网络的识别方法,涉及生物技术领域。竞争性内源RNA网络的识别方法包括:从细胞中提取总RNA,对所述总RNA进行鉴定、构建文库并测序;筛选差异表达的转录本;筛选差异表达的microRNA;分别识别各差异表达的转录本的microRNA结合位点;检测各差异表达的转录本在所述结合位点的竞争关系,从而识别基因表达的竞争性内源RNA网络。该方法将转录因子等经典的调控元件与竞争性内源RNA假说相结合,从新的角度探索了发生在细胞中的复杂调控过程,更好的阐明了不同调控元件在细胞中的作用机理。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是一种竞争性内源RNA网络的识别方法。
背景技术
竞争性内源RNA(ceRNA)假说是近几年来提出的一种全新的基因表达调控模式假说,其核心内容为:MicroRNA (miRNA)是一类真核生物的内源性小分子单链RNA长度约为20-24个核苷酸,在生物进化中相对保守,不编码蛋白质。mRNA、假基因转录物和长链非编码RNA(lncRNA)等转录本通过microRNA应答元件竞争结合相同的microRNA来调控各自的表达水平,从而影响细胞的功能。
目前各种RNA和小RNA测序手段已经十分成熟,通过测序手段找到各种样本中具有显著表达差异的各种转录本,但是却无法识别他们之间所具有的关系,无法更加精确的阐明不同转录本之间的调控机理。miRanda、TargetScan等众多软件和手段被用来寻找不同转录本中的microRNA应答元件,但是其无法验证拥有同一个microRNA应答元件的不同转录物之间是否构成竞争性调控关系。不仅如此,ceRNA调控网络与实际生物学问题的联系,比如,该ceRNA网络具体通过怎样的机理发挥着调控作用,ceRNA网络又在生物体内受到怎样的调控尚未被清楚地认识。
发明内容
本发明的发明目的在于:针对上述存在的问题,提供一种竞争性内源RNA网络的识别方法,该方法将转录因子等经典的调控元件与竞争性内源RNA假说相结合,从新的角度探索了发生在细胞中的复杂调控过程,更好的阐明了不同调控元件在细胞中的作用机理。
本发明采用的技术方案如下:
一种竞争性内源RNA网络的识别方法,其包括:
从细胞中提取总RNA,对所述总RNA进行鉴定、构建文库并测序;
筛选差异表达的转录本;
筛选差异表达的microRNA;
分别识别各差异表达的转录本的microRNA结合位点;
检验各差异表达的转录本在所述结合位点的竞争关系,从而识别基因表达的竞争性内源RNA网络。
由于采用了上述技术方案,识别出了基因表达的竞争性内源RNA网络。该方法将转录因子等经典的调控元件与竞争性内源RNA假说相结合,从新的角度探索了发生在细胞中的复杂调控过程,更好的阐明了不同调控元件在细胞中的作用机理。
本发明的实施例以识别肝癌细胞(HepG2)中p53的竞争性内源RNA网络为例,具体说明本发明的竞争性内源RNA网络的识别方法。
本发明较佳的实施例中,构建文库后,检测文库浓度和插入片段大小,并对文库的有效浓度进行定量。
对总RNA进行鉴定,包括对RNA的纯度以及完整性进行鉴定,其标准为:浓度>50ug/ml,总量>3ug,体积≥10ul;RIN值≥7.0;28S/18S≥1.0;基线无上抬或轻微上抬;5S峰正常;OD260/280:1.7-2.2;OD260/230≥0.5;260吸收峰正常不偏移。
文库浓度即对构建的文库进行浓度检测,>1ng/ul即可判合格。文库有效浓度是指有P5、P7序列的片段的浓度。
由于采取了上述技术方案,文库质量得以保证。
本发明较佳的实施例中,测序为高通量测序,测序读长为PE150。
高通量测序为大规模地全基因组重测序提供了方便,节约时间和成本。本发明中使用HiSeq 4000平台进行测序,序列拼接效果好、测序速度快。测序读长由预实验确定,其能提高定位的准确性和效率。
本发明较佳的实施例中,选差异表达的转录本包括:去掉原始测序序列中带接头和低质量的reads得到Clean Reads,将Clean Reads比对到人参考基因组、组装转录本、融合生成的注释文件、识别差异表达的转录本,并对差异表达的转录本进行筛选。本发明中,主要针对差异表达的mRNA和lncRNA进行筛选。
本发明较佳的实施例中,对差异表达的转录本进行筛选的标准为:q<0.05,|log2(Fold change)|≥1。
原始测序序列中带有接头和低质量的reads将降低信息分析的质量,必须除去。本发明使用Hisat2(2.03-beta)将clean reads比对到人参考基因组(hg19)后使用Cufflins(1.3.0)进行转录本组装,灵敏度高,得到的转录本可靠程度高。本发明中使用Cufflinks进行转录本组装,Cufflinks组装输出的转录本本身具有高可靠性。
本发明较佳的实施例中,筛选差异表达的转录本之后,进行测序结果的准确性验证。
本发明较佳的实施例中,进行测序结果的准确性验证包括:处理细胞,使基因表达上调或下调;提取总RNA,将差异表达的转录本反转录成cDNA以检测其表达水平。
由于采取了上述技术方案,验证了测序结果的准确性,进而保证了整个实验发方法的准确性和科学性。将差异表达的转录本反转录成cDNA后,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)定量,检测转录本的表达与基因表达的一致性,从而验证测序结果的准确性。
本发明较佳的实施例中,筛选差异表达的microRNA包括:根据已知的调控基因的microRNA的测序数据,统计reads count,利用edgeR计算,以q值<0.05,|log2(Foldchange)|≥1为标准,筛选得到差异表达的microRNA。
根据已知的调控基因的microRNA的测序数据筛选差异表达的microRNA,利用了经典调控元件理论,节约实验时间。
本发明较佳的实施例中,分别识别各差异表达的转录本的microRNA结合位点包括:识别差异表达的microRNA与差异表达的转录本之间的第一结合位点;根据RNA结合蛋白Ago2与RNA结合的高通量数据得到靶位点,将该靶位点转换为人参考基因组版本得到第二结合位点;识别第一结合位点与第二结合位点的重合位点即为microRNA在相应转录本上作用的结合位点。
microRNA成熟后,需要Ago2蛋白结合形成RISC(RNA沉默复合体),microRNA靶向识别靶位点,Ago2则能够破坏靶位点从而使基因沉默。因此,通过Ago2的结合位点,能够进一步辨别预测到的microRNA是否足够可靠,从而降低结合点预测的假阳性。
本发明较佳的实施例中,检验各差异表达的转录本在所述结合位点的竞争关系包括:用超几何检验检测各差异表达的转录本在所述结合位点的竞争关系。
超几何检验是一种传统的统计学方法,通过这个检验,将竞争性内源RNA位点识别的问题变成一个数学问题,可以用来衡量。每个mRNA或者lncRNA都具有多个microRNA的结合位点,那么对于一对潜在的ceRNA对来说,各自拥有K和M个不同microRNA的结合位点,这一对ceRNA共有microRNA的结合位点有c个,那么c是否在原本的M和K中占有足够的比重,能够产生足够明显的作用,两个ceRNA之间microRNA结合情况的改变,能够对原本的ceRNA表达产生影响。检验式如下:
计算所得的p值使用Benjamini-Hochberg 校正(FDR<0.01)。
综上所述,由于采用了上述技术方案,本发明的有益效果是:
1.识别了肝癌细胞系中的竞争性内源RNA的调控网络,进一步完善p53在肝癌细胞中发挥功能的机理。
2.将转录因子等经典的调控元件与竞争性内源RNA调控理论相结合,从新的角度探索了发生在细胞中的复杂调控过程,更好的阐明不同调控元件在细胞中的作用机理。
附图说明
本发明将通过实施例并参照附图的方式说明,其中:
图1是竞争性内源RNA网络的识别方法的技术路线图。
图2总RNA的nanodrop峰图。
图3是不同lncRNA对RNA测序结果的验证图。
图4是不同mRNA对RNA测序结果的验证图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征,或公开的所有方法或过程中的步骤,除了互相排斥的特征和/或步骤以外,均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征,除非特别叙述,均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即,除非特别叙述,每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1
构建测序文库
人肝癌细胞(HepG2)复苏后,用含有10%胎牛血清(Hyclone),100U/mL青霉素和100U/mL链霉素(Hyclone)的DMEM培养基(Gibco)置于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行培养。取对数期细胞以5.0×106个/mL的密度接种于60mm培养皿中,待长至80%左右,实验组加入1µg/mL的阿霉素(北京华丰)处理HepG2细胞,对照组加入等体积PBS。24h后0.25%(质量百分数)胰酶消化后离心收集细胞。收集的HepG2细胞,按TRIzol(Invitrogen)实验说明书抽提细胞总RNA,随后鉴定RNA的纯度及完整性。随后送样测序。样品检测合格后,进行文库构建,使用Qubit2.0和Agilent 2100对文库的浓度和插入片段大小进行检测,使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量,以保证文库质量。库检合格后,用HiSeq4000进行高通量测序,测序读长为PE150。
经检验,所提取的总RNA浓度为1714.7ng/μL,体积为17μL,总量为29.1μg。RIN值为9.60;28S/18S为1.80;基线正常;5S峰正常;OD260/280为2.02;OD260/230为1.76,260吸收峰正常不偏移,即RNA样品合格。RNA的nanodrop峰图由图2所示。
原始测序结果(原始测序序列)是由HiSeq 4000产生的双端数据序列,经过FastQC质量检测,共产生91296400个clean reads,绝大多数reads长度在150bp,整体GC含量在53~54%之间。reads的总体map率为84%,mapped reads中,uniquely mapped为80%,总体结果较好,初步证实测序结果较为可靠。
实施例2
筛选差异表达的mRNA和lncRNA以及microRNA
HiSeq 4000得到的原始图像经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列,结果以FASTQ文件格式存储。过滤原始测序序列中带接头和低质量的reads,得到CleanReads。使用Hisat2(2.03-beta)将clean reads比对到人参考基因组(hg19),使用Cufflins(1.3.0)组装转录本,利用cuffmerge将生成的多个注释文件融合,并以Cuffdiff识别差异表达RNA,利用edgeR计算,按照q值<0.05,|log2(Fold change)|≥1为阈值进行筛选分别得到差异表达的lncRNA和mRNA。
从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库获取到通过小RNA测序(Small RNA-seq)在肝癌细胞HepG2中对p53调控microRNA的测序数据,accession numbers为:GSM1923400、GSM1923402、GSM1923401、GSM1923403,使用miARma-Seq(v1.5)统计readscount,利用edgeR计算,以q值<0.05,|log2(Fold change)|≥1为标准,筛选得到差异表达的microRNA。
经过质量控制的数据比对到人类基因组h19版本,两个样本总共组装出了407508个转录本,其中包含331972个mRNA,75536个lncRNA。本次测序共鉴定出2849个差异表达mRNA和617个lncRNA,使用microRNA测序数据共得到207个显著差异表达microRNA。
实施例3
测序结果的准确性验证
HepG2细胞在10cm培养皿中按照实施例1中的培养条件培养至80%左右,0.25%(质量百分数)胰酶消化后,以5.0×105个/孔铺在60 mm培养皿中,过夜培养。待细胞长至70%左右,对照组加入含10% FBS的DMEM培养基,实验组加入终浓度为1 μg/mL的阿霉素,放置37℃,5%CO2培养箱中培养。48h后,0.25%(质量百分数)胰酶消化后离心收集细胞,并用Trizol提取总RNA,使用oligo(dT)引物和M-MLV反转录酶反转录RNA为cDNA,随机检测部分mRNA与lncRNA的表达水平以验证测序结果准确性。
通过阿霉素处理,细胞中p53活性升高。qRT-PCR验证结果表明p53表达水平增高了三倍左右,证明成功有效的构建了细胞系。MDM2和PTEN验证的结果存在了相应的表达量下调现象,CDKN1A的则出现了相应的表达量水平增高现象,几个mRNA表达量变动的水平与RNA-Seq测序的结果基本一致。具体结果见图3和图4。两组qRT-PCR的结果,能够验证RNA-Seq测序过程中,mRNA和lncRNA的上下调趋势一致,证明RNA-Seq测序结果可靠。两种技术中的表达倍数差异,应当是由于两次实验的间隔和技术种类的区别导致的误差。
实施例4
分别识别差异表达的转录本的microRNA应答元件
利用miranda-aug2010预测所有差异表达的microRNA与RNA(包括mRNA和lncRNA)之间的靶位点记为第一结合位点,除-sc和-en参数分别设定为150和-8.0以外,均使用默认参数。
从GEO下载得到文献报道的RNA结合蛋白Ago2与RNA(包括mRNA和lncRNA)结合的高通量数据(HITS-CLIP、PAR-CLIP、iCLIP),所有结合位点通过LiftOver工具转换为h19基因组版本得到第二结合位点,识别第一结合位点与第二结合位点的重合位点(> 1bp),即认为该重合位点处,存在Ago蛋白的结合现象,该位点即为microRNA在相应RNA上作用的结合位点。
实施例5
超几何检验识别竞争性内源RNA网络
用超几何检验检测一对潜在的竞争性内源RNA(mRNA和lncRNA)之间的竞争关系。检验式为:
式中,N表示预测得到的能够与靶转录本(mRNA和lncRNA)相互做用的microRNA总数,K是能够与该ceRNA对中候选ceRNA相互作用的microRNA数,M则是与该ceRNA对中另一个RNA相互作用的microRNA数,c则表示能够同时与与该ceRNA对中两个RNA作用的microRNA数。计算所得的p值使用Benjamini-Hochberg 校正(FDR<0.01)。
对经过Ago2位点矫正过之后,存在有共同microRNA的每一对RNA之间进行超几何检验,计算得到相应的q值,最终按照q<0.01的标准筛选得到了24779对潜在的ceRNA,从而组成了竞争性RNA调控网络。该网络中一共有mRNA 1923个,lncRNA 505个,以及207个microRNA。
需要说明的是,本发明的实施例以识别肝癌细胞(HepG2)中p53的竞争性内源RNA网络为例,具体说明本发明的竞争性内源RNA网络的识别方法,该方法具有通用性,适用于其他细胞系中其他基因的竞争性内源RNA网络的识别。本发明实施例中使用的软件种类及版本也不用当理解为对本发明中方法的限制。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合,以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
Claims (10)
1.一种竞争性内源RNA网络的识别方法,其特征在于,其包括:
从细胞中提取总RNA,对所述总RNA进行鉴定、构建文库并测序;
筛选差异表达的转录本;
筛选差异表达的microRNA;
分别识别各差异表达的转录本的microRNA结合位点;
检测各差异表达的转录本在所述结合位点的竞争关系,从而识别基因表达的竞争性内源RNA网络。
2.根据权利要求1所述的竞争性内源RNA网络的识别方法,其特征在于,筛选差异表达的转录本之后,进行测序结果的准确性验证。
3.根据权利要求1或2所述的竞争性内源RNA网络的识别方法,其特征在于,构建文库后,检测文库浓度和插入片段大小,并对文库的有效浓度进行定量。
4.根据权利要求3所述的竞争性内源RNA网络的识别方法,其特征在于,测序为高通量测序,测序读长为PE150。
5.根据权利要求1或2所述的竞争性内源RNA网络的识别方法,其特征在于,选差异表达的转录本包括:去掉原始测序序列中带接头和低质量的reads得到Clean Reads,将CleanReads比对到人参考基因组、组装转录本、融合生成的注释文件、识别差异表达的转录本,并对差异表达的转录本进行筛选。
6.根据权利要求5所述的竞争性内源RNA网络的识别方法,其特征在于,对差异表达的转录本进行筛选的标准为:q<0.05,|log2(Fold change)|≥1。
7.根据权利要求2所述的竞争性内源RNA网络的识别方法,其特征在于,进行测序结果的准确性验证包括:处理细胞,使基因表达上调或下调;提取总RNA,将差异表达的转录本反转录成cDNA以检测其表达水平。
8.根据权利要求1或2所述的竞争性内源RNA网络的识别方法,其特征在于,筛选差异表达的microRNA包括:根据已知的调控基因的microRNA的测序数据,统计reads count,利用edgeR计算,以q值<0.05,|log2(Fold change)|≥1为标准,筛选得到差异表达的microRNA。
9.根据权利要求1或2所述的竞争性内源RNA网络的识别方法,其特征在于,分别识别各差异表达的转录本的microRNA结合位点包括:识别差异表达的microRNA与差异表达的转录本之间的第一结合位点;根据RNA结合蛋白Ago2与RNA结合的高通量数据得到靶位点,将该靶位点转换为人参考基因组版本得到第二结合位点;识别第一结合位点与第二结合位点的重合位点即为microRNA在相应转录本上作用的结合位点。
10.根据权利要求1或2所述的竞争性内源RNA网络的识别方法,其特征在于,检验各差异表达的转录本在所述结合位点的竞争关系包括:用超几何检验检测各差异表达的转录本在所述结合位点的竞争关系。
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