CN107076702B - 确定样品中的葡萄糖含量 - Google Patents

Abstract

使用未改性的铜金属电极测量葡萄糖的无酶方法是基于葡萄糖的直接氧化。电势施加到铜测量/工作电极，该电势通过单独的参比电极监测，并且体系内的电流通过反电极来平衡。然后能够以电化学方式确定样品中存在离子化的葡萄糖。本文公开了使用该新方法的方法、装置和测试体系。

Description

确定样品中的葡萄糖含量

引言

已知许多金属在碱性条件下可氧化糖类，这一观点已用于商业用途中，例如在用于通过HPLC(高效液相色谱法)监测糖类分离的流通检测器中。文献包含多个参考文件，所述参考文件描述了使用诸如铂、金、银和铜等金属检测包括葡萄糖在内的糖类；通常涉及复杂的处理和准备以在测量之前改性金属表面[Luo等人，电解化学杂志，1995年，第387卷，87-94页，铜电极处的糖类氧化特性(Characterisation of carbohydrate oxidation atcopper electrodes)；Marioli等人，Electrochim.Acta(《电化学学报》)，1992年，第37(7)卷，1187-1197页，铜电极处的糖类氧化电化学特性(Electrochemical characterisationof carbohydrate oxidation at copper electrodes)；Rahman等人，传感器，2010年10月，4855-4886页，基于纳米结构金属氧化物的葡萄糖生物传感器的综述(ComprehensiveReview of Glucose Biosensors Based on Nanostructured Metal-Oxides)；Toghill等人，国际电化学科学杂志，2010年，第5卷，1246-1301页，电化学无酶葡萄糖传感器：前景与评估(Electrochemical Non-enzymatic Glucose Sensors：A Perspective and anEvaluation)；Sivasankari等人，国际医药生物科技杂志，2012年，第2(1)卷，188-195页，基于铜铁氰化物薄膜改性GNP石墨复合电极的无酶电流式葡萄糖生物传感器(NON-ENZYMATICAMPEROMETRIC GLUCOSE BIOSENSOR BASED ON COPPER HEXACYANOFERRATE-FILMMODIFIED-GNP-GRAPHITE COMPOSITE ELECTRODE)；这些参考文件的内容通过引用的方式结合于此]。然而，迄今为止，文献或商业应用或未改性铜金属电极技术的用途开发中均未公开用于手指血中葡萄糖的无酶测量的即时检验。

发明内容

相关段落：

1.一种用于确定样品中的葡萄糖含量的方法，包括：使葡萄糖完全离子化，并且以电化学方式确定离子化的葡萄糖。

2.一种用于确定样品中的葡萄糖含量的方法，包括：当样品与未改性的铜电极接触时离子化葡萄糖，并且通过在一个或多个预定电压设置处检测电流的变化来确定离子化的葡萄糖的量。

3.如段落1或2所述的方法，其中使葡萄糖离子化的条件包括所述样品的碱性化。

4.如段落3所述的方法，其中所述碱性化包括将所述样品的pH增加到至少pH14。

5.如段落3所述的方法，其中通过将所述样品和强碱混合来引起所述碱性化。

6.如段落5所述的方法，其中所述强碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、铵、氢氧化铵或甲基铵。

7.如段落1至6中任一项所述的方法，其中电化学检测包括电催化。

8.如段落7所述的方法，其中所述电催化包括铜的氧化。

9.如段落8所述的方法，其中所述铜的氧化包括铜2+氧化成铜3+。

10.如段落1至9中任一项所述的方法，其中通过伏安法进行确定。

11.如段落9所述的方法，其中所述伏安法是扫描伏安法。

12.如段落9所述的方法，其中所述伏安法是循环伏安法。

13.如段落10或11所述的方法，其中所述伏安法扫描跨500到1200mV的范围。

14.如段落11或13所述的方法，其中所述扫描伏安法是正向和/或反向扫描。

15.如段落1至14中任一项所述的方法，其中所述样品是血液、等离子体、血浆、尿、泪、唾液或CSF。

16.如段落1至15中任一项所述的方法，进一步包括将所述样品和聚离子混合。

17.如段落16所述的方法，其中所述聚离子是聚阴离子。

18.如段落16所述的方法，其中所述聚离子是聚阳离子。

19.如段落16所述的方法，其中所述聚离子是聚两性离子。

20.如段落16所述的方法，其中所述聚离子是EDTA和/或聚乙烯亚胺。

21.如段落1至20中任一项所述的方法，进一步包括将所述样品和表面活性剂混合。

22.如段落21所述的方法，其中所述表面活性剂是山梨酸酯。

23.一种用于确定样品中的葡萄糖含量的装置，包括样品分析区，其中所述样品分析区包括电极和用于所述样品的碱性化的预置试剂。

24.如段落23所述的装置，其中所述电极包括金属或导电聚合物。

25.如段落23或24所述的装置，其中所述电极包括铜工作电极、银/氯化银参比电极和铂反电极。

26.如段落23或24所述的装置，其中所述工作电极、反电极和参比电极都是金。

27.如段落23或24所述的装置，其中所述工作电极和反电极是金，所述参比电极是银/氯化银。

28.如段落23或24所述的装置，其中所述电极包括金工作电极、银/氯化银参比电极和铂反电极。

29.如段落23或24所述的装置，其中所述工作电极、反电极和参比电极都是铜。

30.如段落23或24所述的装置，其中所述工作电极和反电极是铜，所述参比电极是银/氯化银。

31.如段落23至30中任一项所述的装置，其中所述铜和铂电极包括蒸发镀膜电极。

32.如段落23至31中任一项所述的装置，其中用于葡萄糖碱基化的所述试剂包括强碱。

33.如段落32所述的装置，其中所述强碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、铵、氢氧化铵或甲基铵。

34.如段落23至33中任一项所述的装置，其中用于葡萄糖碱基化的所述试剂还包括聚离子。

35.如段落34所述的方法，其中所述聚离子包括EDTA和/或聚乙烯亚胺。

36.如段落23至35中任一项所述的装置，其中用于样品碱基化的所述试剂还包括表面活性剂。

37.如段落23至36中任一项所述的装置，其中所述电极和用于所述样品碱基化的试剂是物理分离但流体连接的。

38.如段落23至37中任一项所述的装置，其中所述电极能够电催化电离的葡萄糖。

39.如段落25所述的装置，其中所述电极包括替代的电极布置。

40.如段落23至29中任一项所述的装置，其中以电化学方式确定葡萄糖，之后离子化和电催化葡萄糖。

41.如段落23至40中任一项所述的装置，其中能够在一个以上的电极电势处确定所述葡萄糖。

42.一种生物传感器，包括：

基层，其上设置有从第一端延伸至第二端的至少一个导电轨迹，其中所述导电轨迹包括铜；

在所述基层的所述第一端处的化验区，包括能够增加应用到所述化验区的样品的pH值的试剂；

在所述基层的第二端处的终端，用于将所述至少一个导电轨迹连接至处理器。

43.如段落42所述的生物传感器，进一步包括在所述第一端用于接收体液样品的毛细管室，其中所述毛细管室设置在所述化验区的上方，使得部分所述至少一个导电轨迹暴露在所述毛细管室内。

44.如段落42或43所述的生物传感器，其中所述基层具有设置在其上的至少三个导电轨迹，每个导电轨迹彼此电绝缘。

45.如段落44所述的生物传感器，其中所述至少三个导电轨迹包括铜，并且其中部分所述至少三个导电轨迹暴露在所述毛细管室内，而且其中所述毛细管室包含pH改变试剂。

46.如段落43至45中任一项所述的生物传感器，其中所述pH改变试剂设置在所述毛细管室的内表面上。

47.如段落44至46中任一项所述的生物传感器，其中所述pH改变试剂设置在所述基层上，但是不与所述毛细管室内的所述至少三个导电轨迹接触。

48.如段落43至45中任一项所述的生物传感器，其中所述pH改变试剂设置在所述毛细管室中。

49.如段落42至48中任一项所述的生物传感器，其中所述至少三个导电轨迹限定至少一个测量电极、至少一个参比电极和至少一个反电极，并且其中所述测量电极、反电极和参比电极位于所述化验区中的所述毛细管室内。

50.一种方法，包括：

离子化存在于全血中的葡萄糖，以及以电化学方式确定所述全血中存在离子化的葡萄糖。

51.如段落50所述的方法，其中离子化所述葡萄糖包括将所述全血与干燥的试剂组合。

52.如段落51所述的方法，其中所述干燥的试剂存在的量足以将所述全血的pH增加足以离子化所述葡萄糖的量。

53.如段落50至52中任一项所述的方法，其中在总体积小于约5微升的室中执行所述以电化学方式确定。

54.如段落50至53中任一项所述的方法，其中所述以电化学方式确定包括经由电化学回路以电化学方式确定离子化的葡萄糖，所述电化学回路包括与所述全血接触的至少一个铜电极。

55.如段落50至54中任一项所述的方法，其中所述方法在不存在酶/介体的情况下执行。

56.一种用于确定存在葡萄糖的测试条，包括：

毛细管室，其限定小于约2.5微升的总体积；

至少一个铜电极，与所述毛细管室电化学连接；以及

干燥的试剂，其以足以增加被引入所述毛细管室中的全血样品的pH的量存在，并且以足以离子化存在于所述全血中的葡萄糖的量来填充所述毛细管室的体积。

57.如段落56所述的装置，其中所述测试条包括三个如下配置的铜电极：

i)工作电极，在所述工作电极处测量葡萄糖氧化；

ii)反电极，其响应于所述工作电极处的反应供应或消耗电子；

iii)参比电极，其用来监测和保持在所述工作电极和反电极之间施加的电势。

58.如段落56或57所述的装置，其中所述毛细管室限定小于约2微升的体积。

59.如段落56或57所述的装置，其中所述毛细管室限定小于约1微升的体积。

60.如段落56或57所述的装置，其中所述毛细管室限定小于约0.5微升的体积。

61.如段落56至60中任一项所述的装置，其中所述干燥的试剂设置在不与所述一个或多个铜电极直接接触的所述毛细管室的表面上。

62.如段落56至61中任一项所述的装置，其中所述干燥的试剂包括碱和表面活性剂。

63.如段落62所述的装置，其中所述表面活性剂是聚乙烯醇，并且其中所述碱是氢氧化钠。

64.一种确定血液样品中葡萄糖的量的方法，所述血液样品使用如段落56至63所述的装置通过扎手指或替代位点获得，所述方法包括：

从存储隔室去除所述测试条；

将所述测试条插入计量表中，并遵从出现在所述计量表的显示器上的指令；

扎手指或替代位点以释放血滴；

将所述血滴与所述测试条上的样品口接触；

当所述计量表指示在所述测试条上采集到足够的样品时，从所述血滴移除所述测试条；

允许所述血液在所述测试条中反应至少1秒；以及

在所述计量表的显示器上显示血液葡萄糖浓度。

65.如段落64所述的方法，其中在显示葡萄糖浓度之前，所述血液在所述测试条中反应至少3秒。

66.如段落64所述的方法，其中在显示葡萄糖浓度之前，所述血液在所述测试条中反应至少5秒。

67.如段落64所述的方法，其中在显示葡萄糖浓度之前，所述血液在所述测试条中反应至少7秒。

68.如段落64所述的方法，其中在显示葡萄糖浓度之前，所述血液在所述测试条中反应至少10秒。

69.如段落64至68中任一项所述的方法，其中在所述测试条上采集不超过2.5微升的血液。

70.如段落64至68中任一项所述的方法，其中在所述测试条上采集不超过1.5微升的血液。

71.如段落64至68中任一项所述的方法，其中在所述测试条上采集不超过1微升的血液。

72.如段落64至68中任一项所述的方法，其中在所述测试条上采集不超过0.5微升的血液。

附图说明

图1示出了根据本发明的一般3电极设计的实施例。

图2示出了图1的延展区，其示出了将暴露于样品进行测试的电极设计。

图3：示出了离开放大暴露电极区的块掩膜的位置的简图。

图4：示出了位于3电极设计上方的典型毛细管室的位置的简图。

图5：使用3x铜电极(WE、CE、RE)对全羊血中小范围葡萄糖的电流响应。

图6：使用3x铜电极(WE、CE、RE)对0.5M NaOH中大范围葡萄糖的电流响应。

图7：快速chrono方法的电流响应，示出了大范围葡萄糖响应。

图8：刺入各种葡萄糖浓度的全羊血中的平均ACuTEGA信号，示出了每个值的SD和CofV(对于每个点而言，n＝5)。

图9：刺入葡萄糖的羊血中重复ACuTEGA葡萄糖化验的电流/时间曲线，示出了响应速度和精度(重复性)。

图10：刺入1、3、5mM葡萄糖的全羊血中的平均ACuTEGA信号，证明系统在临床重要范围内的充分性能(对于每个点而言，n＝5).

图11：在相同条件下葡萄糖和麦芽糖的对比ACuTEGA信号响应。注意15mM麦芽糖获得与1mM葡萄糖相同的信号。

图12：ACuTEGA体系跨最临床相关范围0-10mM的剂量响应曲线。

图13：ACuTEGA体系在达到30mM时的剂量响应曲线。

具体实施方式

已经开发了新的测量葡萄糖的无酶方法，并在此处公开。基于葡萄糖的直接氧化，使用未改性的铜金属电极进行葡萄糖无酶测量。电势施加到铜测量/工作电极，该电势通过单独的参比电极监测，并且体系内的电流通过反电极来平衡。然后能够以电化学方式确定样品中存在离子化的葡萄糖。本文公开了使用该新方法的方法、装置和测试体系。

表1中描述了铜基测量体系的数个示例性实施方式。在第一方面，铜工作电极与银/氯化银参比电极和铂反电极结合使用。在第二实施方式中，铜工作电极与银/氯化银参比电极和铂反/参比电极结合使用。在第三方面，铜工作电极与铜反/参比电极结合使用。而且，在第四方面，铜工作电极与铜参比电极和铜反电极结合使用。

表1.铜基测量体系

示例性铜基测量系统基于全铜三电极葡萄糖测定(ACuTEGA)技术。不希望受任何理论的约束，ACuTEGA可以通过直接氧化葡萄糖来工作，葡萄糖已转化成阴离子状态，其pH足以离子化葡萄糖。例如，在约13至14的pH下，葡萄糖被电催化氧化，在约900mV(对应铜参比电极)电势处到达峰值，针对每种氧化的葡萄糖分子产生6个甲酸盐分子和12个电子。当与更传统的酶基自我监测血液葡萄糖传感器相比时，这种氧化过程对每个氧化的葡萄糖分子产生3倍或6倍数量的电子。因此，与使用更传统的测量形式相比，使用ACuTEGA装置测量葡萄糖预计可以更敏感地确定较低浓度的葡萄糖，导致测量性能提高。

在使用此处描述的新方法充分离子化样品中的葡萄糖的条件下，已知干扰传统葡萄糖测量的因素并不损害离子化的葡萄糖的电化学确定。例如，在大约13到14的pH值下，在铜电极上没有检测到来自诸如抗坏血酸、对乙酰氨基酚、尿酸、多巴胺等物质的明显的反应，所述物质已知在接近中性的pH下干扰葡萄糖的测量。此外，使用铜电极在接近14的pH下进行的测量似乎不受被测血液的血球容量计的影响，这是已知的在传统的酶传感器装置中危害葡萄糖测量的另一个因素。当样品的pH上升到至少14时血液粘度明显增加，这似乎使得血液牢牢地保留在测试条的反应室中。粘度的明显增加似乎抵消了血球容积剂可能会对葡萄糖氧化成甲酸盐期间由电极测量的合成信号造成的影响。

一方面，描述了一种用于确定样品中的葡萄糖含量的方法，包括：使葡萄糖完全离子化并且以电化学方式确定离子化的葡萄糖。当样品与未改性的铜电极接触时，样品中的葡萄糖含量通常通过完全离子化样品中的葡萄糖来确定；离子化的葡萄糖的量通过在一个或多个预定电压设置处检测电流的变化来确定。使葡萄糖离子化的条件通常涉及样品的碱基化；通过与强碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化锰、氢氧化钙、铵、氢氧化铵或甲基铵)混合，样品的pH常常增加到至少13或14。

碱性溶液中葡萄糖氧化的电化学检测可以使用循环伏安法、计时电流法或其他技术来实现，这些技术在电势施加到发生葡萄糖氧化的工作电极或测量电极时检测电流的流动。一方面，铜电极上葡萄糖的氧化可以发生在铜从铜2+变成铜3+的过程中。通常，根据所使用的参比电极，可以使用范围在+500到+1200mV范围内的外加电势。例如，与使用铜参比电极相比，银/氯化银参比电极可以要求施加不同的电势。

强碱可以是按配方制造的额外添加剂，其在样品加入后帮助干燥的试剂干燥以及再悬浮；这种试剂可以包括聚离子，诸如聚阴离子、聚阳离子或聚两性离子。在一些配方中，聚离子可以是EDTA和/或聚乙烯亚胺。该配方可以进一步包括表面活性剂，例如山梨酸酯、聚乙烯醇、皂苷。

在另一方面，公开了一种用于确定样品中的葡萄糖含量的装置，包括样品分析区，所述样品分析区包括一个或多个电极以及用于样品的碱性化的预置干燥的试剂。电极可以使用金属或导电聚合物形成，包括例如铂、金、银、铜、锌、钌、钯、聚(3，4-乙烯二氧噻吩)、聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩。在一些实施方式中，电极可以包括铜工作电极、银/氯化银参比电极和铂反电极；或者工作电极、反电极和参比电极可以全部由金构成。在其他实施方式中，工作电极和反电极可以由金构成并且参比电极可以具有银/氯化银；或者电极可以包括金工作电极、银/氯化银参比电极和铂反电极。在示例性实施方式中，工作电极、反电极和参比电极可以全部由铜构成；或者工作电极和反电极可以由铜构成并且参比电极可以由银/氯化银构成。在一些实施方式中，用于样品的碱性化的电极和试剂是物理分离并且流体连接的；在其它情况下，试剂直接放置在电极上方。通常，制成电极的材料将能够直接测量样品中任何离子化的葡萄糖，导致与存在的葡萄糖的浓度成正比的信号。

在示例性实施方式中，公开了用于定量测量样品中的血糖的装置。例如，装置能够用于确定全血样品中的葡萄糖。该装置还可以用于确定等离子体、血浆、尿液和其他流体样品中存在葡萄糖。使用可用于个人使用的采血器通过扎手指或容易可达的其他位点较为容易地获得全血。还可以通过适当的合格抽血者使用静脉穿刺获得血液。在不需要酶或介体化合物的条件下，该装置利用铜电极确定样品内的葡萄糖。该装置可以是测试条，包括毛细管室、至少一个铜电极和干燥的试剂。在一些实施方式中，毛细管室与至少一个铜电极电化学连接。在一些实施方式中，干燥的试剂存在于毛细管室中。干燥的试剂可以足以将引入到毛细小于5μl管室中的样品(例如全血样品)的pH增加到至少13，优选至少14的量存在。毛细管室可限定小于5μl、小于4μl、小于3μl、小于2.5μl、小于1.5μl、小于1μl、小于0.5μl的总体积。

诸如测试条的装置可以单独存储或者存储为一包测试条。测试条可以和计量表一起使用。例如，测试条能够从其包装隔室或存储隔室移除，然后插入计量表中。用户通常使用测试条来确定从扎手指获得的血液样品中葡萄糖的量。用户首先将测试条从存储隔室移除，该存储隔室可以是单个箔袋或类似的设计成保持纸条“干燥”的装置，或者可以是容纳数个测试条的小瓶，其包含干燥剂材料以将纸条保持在“干燥”气氛中。一旦从保护容器移除，用户将测试条插入计量表中，并遵从出现在计量表的显示器上的指令。这种指令通常指示以下内容：扎手指或替代位点以释放血滴；放弃第一颗或两颗血滴；使血滴与测试条上的样品口接触；当计量表指示已采集了足够的样品时从血滴移除测试条；等待血液在测试条内反应；读取计量表显示器上的葡萄糖浓度。在计量表向用户显示葡萄糖读数前血液样品与测试条反应所花费的时间通常少于10秒，更多时候少于7秒，通常少于5秒，甚至可以少于3秒，且甚至可以少于1秒。因此该技术非常适合提供快速的测量结果，这在特定情况下可能是关键的。

本文还公开了包括基层、化验区和终端的生物传感器。生物传感器包括基层，其上设置有至少一个导电轨迹，该导电轨迹从基层的一端延伸至另一端。导电轨迹可以用铜形成。生物传感器还包括在基层的第一端处的化验区，其可以包括能够增加应用到化验区的样品的pH的干燥的试剂。位于基层另一端处的终端用于将至少一个导电轨迹连接至分析装置或计量表中的微处理器，生物传感器旨在和分析装置或计量表一起使用。通常，生物传感器将具有毛细管室，毛细管室在一端用于接收体液样品；毛细管室常常设置在化验区上方，使得部分至少一个导电轨迹暴露在毛细管室内。因此，当样品应用到生物传感器时，将在毛细管室内收集样品，样品在样品室中将与导电轨迹接触。在一些情况下，生物传感器能够在基层上具有至少三个导电轨迹，其中每个导电轨迹彼此电绝缘。在具体实施方式中，生物传感器包括至少三个用铜材料形成的导电轨迹，其中至少部分的三个单独导电轨迹暴露在毛细管室内，并且从而可以与应用至生物传感器的样品直接接触。通常，毛细管室将包括干燥的试剂，其能够改变应用至生物传感器的pH。pH改变试剂通常在毛细管室的内表面上干燥；然而，pH改变试剂也能够在基层上完全弄干，而不与毛细管室内的至少三个导电轨迹直接接触。导电轨迹通常表示至少一个工作或测量电极、至少一个参比电极和至少一个反电极，并且这些电极中的每一个均存在于化验区中毛细管室的边界内。

本公开进一步限定了测量可能存在于全血样品中的葡萄糖的方法。该方法通常包含：将存在于全血样品中的任意葡萄糖完全离子化，然后以电化学方式确定全血中存在离子化的葡萄糖。离子化葡萄糖的过程包括将全血与干燥的试剂组合，该干燥的试剂存在的量足以将全血的pH增加足以离子化葡萄糖的量。在总体积小于5微升的室内执行以电化学方式确定离子化的葡萄糖的量的方法，通常该室具有小于2.5μl的体积，在大多情况下为小于1μl的体积。能够使用电化学回路实现离子化的葡萄糖的电化学确定，该电化学回路包括要与全血接触的至少一个铜电极。所公开的方法的一方面在于其不需要存在用在许多用于自我监测血糖的商业系统中的酶或介体。

本公开还包括对测试条的描述，该测试条用于确定从受试者获得的流体样品中存在葡萄糖。测试条包括毛细管室，其限定通常小于约2.5微升，更通常小于1微升，以及在一些情况下小于0.5微升的总体积。测试条还包括至少一个与毛细管室电化学连接的至少一个铜电极；以及干燥的试剂，其以足以增加引入毛细管室中的全血样品的pH的量存在，并且以足以离子化存在于全血中的葡萄糖的量填充毛细管室的体积。测试条通常将包括至少三个布置如下的铜电极：i)工作电极，在工作电极处测量葡萄糖氧化；ii)反电极，其响应于工作电极处的反应供应或消耗电子；iii)参比电极，其用来监测和保持在工作电极和反电极之间施加的电势。干燥的试剂通常存在于毛细管室的表面上但不与一个或多个铜电极直接接触，其可以包含碱以及表面活性剂。碱能够包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化锰、氢氧化钙、铵、氢氧化铵或甲基铵，而表面活性剂能够包括山梨酸酯、聚乙烯醇或皂苷。

实施例

测试方法：

两种不同的电化学测试，循环伏安法(CV)和计时电流法(Chrono)用于表征铜工作电极的性能，以在碱性条件下直接测量葡萄糖。CV执行3V电势扫描，而Chrono施加单个固定电势。这两种方法在缓冲剂和血液环境下均提供了良好的检测。

电极制备：

镀铜聚酯由Vacuum Depositing公司(VDI LLC(美国肯塔基州路易斯维尔市))供应。聚对苯二甲酸乙二酯((PET))片用作(Lumirror T62，750量测标称值(约190微米))基层。铬和镍的连接层被溅射镀膜以用作连接层，从而提高铜层对PET的粘附。接下来，将通溅射镀膜到Cr/Ni连接层。连接层厚度大约为3-5nm，使用铜层，最大厚度约为40nm。不对纯铜金属表面执行处理或改性。传送由VDI LLC提供的原种铜涂敷的聚酯作为真实的材料，用于测试的装置由该材料制成。

在示例性实施方式中，首先从主体移除大约16cmx16cm的部分材料来制备测试传感器，注意不要污染表面。物品最终切割成约5mm宽x约35mm长的条。使用激光刻蚀拍打镀铜聚酯条以限定两个或多个单独的电绝缘轨迹；其一端用于实现与电位计或计量表的电连接，电位计或计量表供应所需的电压极化以执行CV或Chrono，以及获取对应于葡萄糖氧化的结果电流。

使用Ulyxe激光刻蚀系统(得利捷自动化(由Laserlines公司(英国)提供))，通过激光刻蚀限定三个单独的电机(WE、RE和CE)。Ulyxe具有在1064nm波长下工作的6w YAG激光器，已证实该波长会从PET背衬干净地移除铜和Cr/Ni连接层，从而使暴露于激光能量的区域中的PET暴露。激光系统通常使用以下设置操作：功率(80％)、频率(20,000Hz)、扫描速度(500mm/s)、点延迟(5μs)、喷丸时间(1.5μs)，仅单次扫描。所使用的镜头是F254。Ulyxe与过滤提取系统结合使用，该过滤提取系统移除由烧蚀步骤发散的蒸气碎片。

研究了电极的几种设计，每种设计在暴露给每个电极表面的铜金属面积上略有变化。示例性设计在图1中示出。

单独电极的配置在图2中更详细地示出。RE位于阵列的中心，RE继而由自身被CE包围的WE包围。

根据如何使用电极，采用不同的掩蔽技术。在一些情况下，体积不大于2.5微升的毛细管室粘附在电极正上方。在其他情况下，体积不大于1微升的毛细管室应用到电极上方。通常，电极的端部用非导电胶带或非传导绝缘墨水掩蔽。图3和图4描述了掩蔽部分铜金属的不同方法，作为控制可能通过样品接触的金属的表面积的一种方式。

一旦在PET基质上限定一些电极，电极用如图3和图4所示的绝缘材料掩蔽，并且从母片切除以得到一般尺寸为35x 5.5mm的传感器。

硬件：

使用以下设备。

·稳压器：

о由Whistonbrook技术公司提供。产品名称为Ezescan。通常所使用的型号是Ezescan 4。该产品是单项测试稳压器，具有用于WE、RE和CE的输入。对仪器提供软件，其允许执行CV和Chrono方法。用户接口允许参数由用户确定。

·传感器连接：

о9脚D-sub型连接器用于连接至Ezescan 4稳压器。7股铜芯线(导体面积＝0.22mm2)用于全部布线。插脚间具有1.27mm间距的pcb垂直滑动连接插座用于连接至铜电极。

材料：

氢氧化钠：能够使用任何高浓度低杂质等级。例如，西格玛奥德里奇编码S5881，＞98％纯度。

氢氧化钠：能够使用任何高浓度低杂质等级。例如，西格玛奥德里奇编码484016，＞90％纯度。

分析水：＜15MOhm.

葡萄糖：能够使用任何高浓度低杂质等级。例如，西格玛奥德里奇编码G8270，＞99.5％纯度。

通用微滴定板(或任何等同的小体积容器)

缓冲剂中葡萄糖的测量方法：

测量水缓冲剂样品中的葡萄糖时执行以下过程。该实施例描述了用图3所示的加罩电极进行测试。

1.在电极制备工序下如所述制备单独的电极。

2.将微丸溶解在分析水中来制备氢氧化物溶液，得到4M浓度。优选的阴离子是钾，虽然也可以使用钠。

3.将粉末溶解在分析水中来制备葡萄糖溶液，得到1M浓度。

4.对单独的微滴定板孔分配体积，得到最终体积200μl。当暴露区没入掩蔽区时，该体积足以覆盖电极的暴露区。该体积不是临界的，但是应足以覆盖暴露的电极。

a.加入氢氧化物溶液以获得所需浓度，例如0.5M。例如，200μl最终体积中25μl的4M原液。

b.向孔中加入葡萄糖溶液以得到所需浓度，例如，200μl最终体积中12μl的1M原液以得到30mM最终浓度。另外体积的葡萄糖加入孔中以得到不同的葡萄糖浓度。

c.用分析水使体积达到200μl。向孔中送气以确保所有溶液混匀。

5.采用连接导线，插入稳压器。

6.采用单个加罩电极并滑入连接器插头块中，确保电极与连接器插脚恰当地对齐。

7.将用户接口和稳压器软件一起使用，选择用于测试的方法，例如，循环伏安法。确保设置正确，例如，通常使用以下设置：

a.电势扫描范围：-1500mV正向扫描至+1500mV，再反向扫描回到-1500mV。

b.步长间隔＝10ms

c.电势步长＝10mV

d.扫描速度等于1v/s。

8.将电极端部浸入测试溶液中，确保传感器的暴露区没入测试溶液中。当准备好执行测试时，仅淹没电极。确保没有气泡困在或附着在电极表面。

9.开始扫描，保持电极尽可能平稳，以防止测试样品跨电极的表面移动。目的是在静态条件下执行测试。

10.扫描完成后，从测试溶液中移除电极以及连接器并丢弃。

11.保存数据文件。

12.数据通常被导入图形软件包中，诸如Microsoft Excel。数据被绘制为电势(mv，x轴)对电流(μA，y轴)。可以绘制多个图表来检查整个扫描曲线中的趋势。此外，从数据集提取具体数据(电流)，其与对应于存在葡萄糖时来自变化的响应的具体峰值有关。

全血中葡萄糖的测量方法：

如果要测试血液，如上所述使用的分析水用200μl全血替换。通常，将血液收集到仅含柠檬酸的试管中。柠檬酸钠用作抗凝血剂，最终浓度大约为0.3％。直到使用前，将全血在4-8℃下存储冷却。如果需要零葡萄糖基线，将血液放置在37℃保温箱中并用商用的葡萄糖检测装置监测，直到读数太低无法读取(通常＜1mM葡萄糖)。然后葡萄糖可以刺回到血枯中，以得到已知的可溶葡萄糖的浓度。加入血液样品中的葡萄糖体积的差异通过补给水来补偿。

测量全血样品中的葡萄糖时执行以下过程。该实施例描述了用图3所示的加罩电极进行测试。

1.在电极制备工序下如所述制备单独的电极。

2.将微丸溶解在分析水中来制备氢氧化物溶液，得到4M浓度。优选的阴离子是钾，虽然也可以使用钠。

3.将粉末溶解在分析水中来制备葡萄糖溶液，得到1M浓度。

4.对单独的微滴定板孔分配体积，得到最终体积200μl。当暴露区没入掩蔽区时，该体积足以覆盖电极的暴露区。该体积不是临界的，但是应足以覆盖暴露的电极。

a.向孔中加入血液样品。

b.向孔中加入葡萄糖溶液以得到所需浓度，例如，200μl最终体积中12μl的1M原液以得到30mM最终浓度。另外体积的葡萄糖加入孔中以得到不同的葡萄糖浓度。

c.向孔中送气以确保所有溶液混匀。

5.采用连接导线，插入稳压器。

6.采用单个加罩电极并滑入连接器插头块中，确保电极与连接器插脚恰当地对齐。

7.将用户接口和稳压器软件一起使用，选择用于测试的方法，例如，循环伏安法。确保设置正确，例如，通常使用以下设置：

a.电势扫描范围：-1500mV正向扫描至+1500mV，再反向扫描回到-1500mV。

b.步长间隔＝10ms

c.电势步长＝10mV

d.扫描速度等于1v/s。

8.在测试之前，向血液中加入氢氧化物溶液以获得所需浓度，例如0.5M。为此目的，加入200μl最终体积中25μl的4M原液。快速混合，因为血液中pH快速升高的效果是血液变得非常粘稠并且为凝胶状。

9.将电极端部浸入测试溶液中，确保传感器的暴露区没入测试溶液中。当准备好执行测试时，仅淹没电极。确保没有气泡困在或附着在电极表面。

10.开始扫描，保持电极尽可能平稳，以防止测试样品跨电极的表面移动。目的是在静态条件下执行测试。

11.扫描完成后，从测试溶液移除电极以及连接器并丢弃。

12.保存数据文件。

13.数据通常被导入图形软件包中，诸如Microsoft Excel。数据被绘制为电势(mv，x轴)对电流(μA，y轴)。可以绘制多个图表来检查整个扫描曲线中的趋势。此外，从数据集提取具体数据(电流)，其与对应于存在葡萄糖时来自变化的响应的具体峰值有关。

葡萄糖的计时电流法测量：

快速chrono方法可以用于样品的固定电势问诊。通常，该固定施加的电势是+900mV，尽管应该对其优化以反映电极阵列的形式。

样品制备的基本方法与针对循环伏安法所述的相同。

所使用的方法是快速Chrono，其具有以下参数：

·电势：+900mV

·步长：10ms

·完成测试的时间：5秒

一般响应：

循环伏安法数据：

图5示出了在0.5M NaOH中全羊血存在的条件下使用激光烧蚀电极阵列的葡萄糖响应的实施例。测试范围为0-10mM以显示采用该形式可能的差异。

图6示出了在仅0.5M NaOH中使用激光烧蚀电极阵列的葡萄糖响应的实施例。测试范围为0-30mM以显示采用该形式的大范围线性度。

计时电流法数据：

图7：使用快速chrono方法，所施加的电势为+900mV。在此实施例中，使用单独的电极条而非激光烧蚀阵列。该结果使用chrono单电势方法显示了葡萄糖响应的线性度。

以上图表显示了将葡萄糖加入仅0.5M NaOH以及具有0.5M NaOH的全羊血中的一般反应。

一般操作中的ACuTEGA：对于图3中描述的装置的一般测试而言，使用快速chrono方式，其中对应铜电极，电势位于约+900mV。条使用推入式连接器连接至阅读器，之后通常将小于1μL的手指针刺血应用至条的端部。当血液流入毛细管室中，其满足并再水合干燥的氢氧化钠到达电极阵列。使用图3和图4中所示的电极阵列的示例性设计。氢氧化物试剂的再水合几乎是瞬时的，使得葡萄糖快速氧化，其通常允许葡萄糖测量小于5秒，通常小于3秒，并且自样品导入起常常需要小于1秒，以确定样品内的葡萄糖浓度。图8中示出的数据表示当葡萄糖刺入葡萄糖耗尽的羊血时的剂量响应曲线。在5秒内捕获每个测量信号的chrono时间过程曲线图。时间/电流曲线在图9中示出，其清楚地示出了ACuTEGA中信号的快速响应和再现性。具体而言，可以看出在刚好1秒后实现了稳定响应；允许在该时间点确定要确定的样品的葡萄糖含量。

对于通过糖尿病受试者进行的常规葡萄糖测试而言，有必要在低于10mM，并且理想地低于5mM(推荐的血糖目标水平)的葡萄糖水平下获得良好的辨识和线性度；在此情况下，制备扎入1mM、3mM和5mM的一系列血液样品并化验。数据在图10中示出。

已示出ACuTEGA体系不受来自常规干扰物质的干扰的影响，干扰物质给酶驱动的测试(对乙酰氨基酚、抗坏血酸和尿素等，数据未示出)带来问题，但是市场力量现在要求葡萄糖测试应在葡萄糖和麦芽糖之间进行区别。麦芽糖是1，6-连接的葡萄糖二聚体，其有时能够在接受腹膜透析(对其注入腹膜內麦芽糊精溶液作为“渗透剂”，被称为“艾考糊精”)的患者和病情严重的癌症患者(其接收其中麦芽糊精作为赋形剂存在的肿瘤学药物)中发现。存在罕见的但是引人注意的情况，其中PQQ-葡萄糖脱氢酶基酶传感器已给出葡萄糖虚假升高的读数，导致过多的胰岛素用量。这是由于缺乏PQQ-GDH的特异性，其将使用麦芽糖作为基质来代替葡萄糖。据报道可以发现高达3mM的麦芽糖水平。就我们的知识所及，没有遇到更高的麦芽糖水平。

为了证实ACuTEGA对于麦芽糖具有足够的辨别力，用1mM和30mM之间的浓度制备每种糖的校准液。在相同条件下用ACuTEGA进行化验，给出的结果在图11中示出。

图11中的结果只是在ACuTEGA系统操作所必须的高pH下，临床相关浓度的麦芽糖示出了比葡萄糖低得多的电化学响应。通过响应的这种差异，可以确信，葡萄糖高达30mM(报道的最高临床水平的10倍)的病人的ACuTEGA葡萄糖值最多差约1mM，将不会导致血糖的误报，误报会错误地在低血糖状态下拒绝给予葡萄糖，或者错误地识别高血糖状态，导致胰岛素用量过多。

创建用扎手指获得的全血可靠地填充的1μl体积毛细管室

о毛细管室顶部(自粘的)是标准单位，已在研究规模上获得成卷的合适材料。

о使用亲水毛细管产生约1μL空隙容积。

о干燥的试剂放置在毛细管室内，继而在测试样品进入毛细管空间时再水合。

室内固态氢氧化钠的可靠沉积，不会腐蚀超薄铜膜并且不会阻碍毛细管填充。

о对电极室预加恰当体积和浓度的氢氧化钠对操作而言至关重要。

о在进行测量以前(小于5秒)，全血样品的pH要升高到葡萄糖离子化点以上，高于pH 13。

о为了达到稳定性，氢氧化物呈现为具有几个问题的干燥的试剂：氢氧化物与铜接触开始破坏过程，因此干燥的氢氧化物不能以与电极表面直接接触的方式存储。

干燥氢氧化物已在潜水艇和宇宙飞船中用作CO2洗涤剂，其中氢氧化物和二氧化碳快速反应以形成碳酸钠。当ACuTEGA室对空气打开时，在ACuTEGA室中也发生该反应。如果存储氛围不受控制，干燥试剂的pH下降。如果发生大量转化，血液pH不升高到足以离子化葡萄糖。

о将氢氧化物从简单水溶液干燥成纯净的氢氧化物，产生了非晶体构造，该构造过大而不能快速(在几秒内)溶解以在目标时间量程内允许测量。

о发现需要载体或“分散剂”。清洁剂Proteric-JS用于使氢氧化物干燥成较小的晶体，从而增加表面积，使得当应用血液时，氢氧化物能够快速溶解。

不损失存储效能(通过与二氧化碳反应)而血液立即均匀碱性化的氢氧化物的剂量。

о(干燥薄膜的)表面积体积比非常大。为此原因，即使空气中的CO2浓度足够低(约0.04％)，其被吸收以迫使pH下降。为克服此问题，在分子筛存在的条件下包装预剂量传感器。该材料将包装内空气的水分含量降低至几乎完全干燥并且同时吸收CO2。

о干燥的试剂位于毛细管室表面上，而非直接位于铜电极表面上。由于氢氧化物的腐蚀性质，氢氧化物试剂直接沉积到铜上是不起作用的。

о在实践中，预剂量干燥的氢氧化物几乎立即溶解在血液中，使pH充分升高以允许铜氧化化学过程起作用。

о

具有1μL室的干燥的预剂量系统的性能

干燥的系统通过小型的手工制造的毛细管室操作，与尺寸相似的通过湿润试剂和更大样品体积操作的电极相比，干燥的系统易于受到一些变化的影响。因此，毛细管室版本以严格的性能测试为准，以理解制造参数对干燥的制剂在毛细管室中再悬浮产生的影响。使用完全干燥的小型装置获得以下数据。

线性度：当在全血中测试0-10mM(短范围)及0-30mM(长范围)范围时观察到良好的线性度，分别如图12和图13所示。

使ACuTEGA与参考装置相关

ACuTEGA装置用于在非空腹耐受性测试期间测量葡萄糖。非糖尿病志愿者引用含葡萄糖的饮料。通过ACuTEGA、YSI STAT Plus分析器、商用自测血糖系统、Bayer ContourXT测试采自手指的血液样品。

通过对手指的柳叶刀穿刺抽取毛细管血液。1μL血滴应用至ACuTEGA毛细管室。使用如前所述的“快速chrono”方法进行电化学测量。由同样的穿刺获得的另一个血液样品也通过YSI分析器和Contour XT装置来测量。每隔30分钟测量血糖水平，之后使用每个装置在两小时时间内饮用含葡萄糖的饮料。第一血液样品中的葡萄糖含量表示基线水平；第二血液样品中的葡萄糖含量将增加到基线以上，第三和后面的葡萄糖水平和基线类似。每种技术的信号对应于希望的葡萄糖水平，并且由使用铜电极测量的信号表现出的变化与使用经典技术确定的葡萄糖水平的变化相关。

Claims (9)

1.一种生物传感器，包括：

基层，其上设置有从第一端延伸至第二端的至少一个导电轨迹，其中，所述导电轨迹包括铜；

在所述基层的所述第一端处的化验区，包括能够增加应用到所述化验区的样品的pH的干燥的试剂；

在所述基层的第二端处的终端，用于将所述至少一个导电轨迹连接至处理器；

进一步包括在所述第一端用于接收体液样品的毛细管室，其中，所述毛细管室设置在所述化验区上方，使得部分所述至少一个导电轨迹暴露在所述毛细管室内；并且

其中，所述能够增加应用到所述化验区的样品的pH的干燥的试剂设置在：

a.所述毛细管室的内表面上，并且所述干燥的试剂不与所述至少一个导电轨迹接触；或

b.所述基层上，所述基层具有设置在其上的至少三个导电轨迹，所述干燥的试剂不与所述毛细管室内的所述至少三个导电轨迹接触。

2.如权利要求1所述的生物传感器，其中，所述基层具有设置在其上的至少三个导电轨迹，每个导电轨迹彼此电绝缘。

3.如权利要求2所述的生物传感器，其中，所述至少三个导电轨迹包括铜，并且其中，部分所述至少三个导电轨迹暴露在所述毛细管室内。

4.根据权利要求2或3所述的生物传感器，其中，所述至少三个导电轨迹限定至少一个测量电极，至少一个参比电极和至少一个反电极，并且其中，所述测量电极、反电极和参比电极位于所述化验区中的所述毛细管室内。

5.一种用于确定存在葡萄糖的测试条，包括：

限定小于2.5微升总体积的毛细管室；

与所述毛细管室电化学连接的至少一个铜电极；以及

干燥的试剂，其以足以增加被引入所述毛细管室中的全血样品的pH的量存在，并且以足以离子化存在于所述全血中的葡萄糖的量来填充所述毛细管室的体积，

其中，所述干燥的试剂设置在不与所述至少一个铜电极直接接触的所述毛细管室的表面上。

6.如权利要求5所述的测试条，其中，所述测试条包括三个如下配置的铜电极：

i)工作电极，在所述工作电极处测量葡萄糖氧化；

ii)反电极，其响应于所述工作电极处的反应供应或消耗电子；以及

iii)参比电极，其用来监测和保持在所述工作电极和反电极之间施加的电势。

7.如权利要求5或6所述的测试条，其中，所述毛细管室限定小于2微升的体积。

8.如权利要求5或6所述的测试条，其中，所述干燥的试剂包括碱和表面活性剂。

9.如权利要求8所述的测试条，其中，所述表面活性剂是聚乙烯醇，所述碱是氢氧化钠。

Images