CN107019817B

CN107019817B - 活性氧化物质生成材料及其用途

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Publication number: CN107019817B
Application number: CN201710093137.XA
Authority: CN
Inventors: T·J·布朗; A·S·拉弗尔; K·马兹奇; J·C·托勒; J·张
Original assignee: WL Gore and Associates Inc
Current assignee: WL Gore and Associates Inc
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2033-08-30
Also published as: WO2014036364A9; KR20150043401A; US20170087250A1; CN104582741A; HK1205957A1; US20140065199A1; US9549951B2; US9775901B2; ES2687111T3; EP2890407A4; JP6189960B2; US9259435B2; JP2015526257A; BR112015004331A2; AU2013308642A1; US20170087251A1; US20160120904A1; WO2014036364A1; AU2013308642B2; CN107019817A

Abstract

能够向靶向的治疗位点递送稳定化的自由基的材料。该材料包含半结晶、可水解降解的聚合物，其经电离辐射在其中产生稳定化的自由基。在暴露于含氧水性介质后，该材料产生可用于生物过程的活性氧化物质。

Description

活性氧化物质生成材料及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年8月31日提交的美国临时申请第61/695,432号的优先权。

技术领域

本申请涉及包含能够产生活性氧化物质(reactive oxidative species)的稳定化的自由基的材料及其用途。

发明背景

可通过几种方式提供医学装置的灭菌。两种常用的方式是环氧乙烷灭菌(EO)和通过暴露于电离辐射的灭菌。然而，在医学装置的生产中常见的某些聚合物和有机材料暴露于电离辐射已经显示导致了该聚合物或有机材料的一定水平的降解。聚合物或有机材料降解的程度被认为与吸收的电离辐射的剂量相关。因此，在由聚合或有机材料构成装置的情况中，所施加的辐射剂量应该足够高以对该装置进行灭菌，同时尽可能低以最小化发生的装置降解量。在用于永久性和可吸收的聚合物和共聚物的情况中，一般而言，用大约25kGy的剂量实现最终包装的装置的灭菌。

另外，当暴露于电离辐射时，某些聚合物发生链断裂，这可能导致沿着受影响的聚合物链形成自由基。这种类型的自由基通常已知在聚合物中仅在生成后的短时间内存在。自由基的高能量使它们变得不稳定，只要有可能就发生快速反应或重组。如果该自由基与其他自由基组合并且这些自由基在不同的聚合物链上，则会发生交联并且有效地增加了分子量。如果在经辐射的聚合物链上形成的自由基与另一种元素，诸如，但不限于氧结合，其可能产生降解反应并且可能降低总聚合物分子量。在其他情况中，一旦存在必需的条件，自由基反应的速率一般是非常快的。在自由基与氧分子发生反应的情况中，可以产生活性氧化物质(ROS)。

ROS是含化学反应性和生物活性氧的物质，如超氧化物、过氧化氢、单线态氧、羟基自由基、次氯酸根、过氧亚硝酸根和过氧羟基自由基(perhydroxy radical)及其组合。另外，由于存在未配对的价电子层电子，ROS是高度反应性的。

在生物学中，ROS发挥涉及免疫应答的关键功能。例如，在“呼吸爆发”期间通过微生物吞噬期间活化的嗜中性粒细胞天然产生超氧化物，并且其是由吞噬多形核白细胞(PMN)为了破坏细菌而使用的机制。有鉴于此，现有的抗菌药物疗法使用ROS，尤其是羟基自由基，作为杀菌作用的机制(Kohanski等，Cell,130,797-810(2007))。

ROS在细胞信号传递中也是有活性的，包括但不限于刺激细胞分裂、分化、迁移、凋亡和新生(Klebanoff,Annals Internal Medicine,93,480-9(1980))(Turrens,JrlPhysiol,552(2),335-44(2003))(Veal等，Molecular Cell,26,1-14(2007))。具体地，已经显示了ROS甚至在较低浓度(微摩尔至纳摩尔)下作用为关键的细胞信号转导分子以调节多种生物过程，如血管生成、细胞增殖和细胞迁移(Veal等，Mol Cell.；26(1):1-14(2007))(D'Autreaux等.m,Nature Reviews Molecular Cell Biology,8,813-824(2007))。也已经显示ROS在血小板活化中有影响(Krotz等，Arterioscler Throm Vase Biol；24:1988-96(2004))。参与这些生物过程将ROS置于调节多种生理和病理状态的关键角色上，包括但不限于一些癌症、心血管疾病、慢性伤口、衰老和神经变性。例如，已经在用于癌症治疗的光动力学疗法中证明了ROS在临床治疗中的用途(Dolmans等，Nature Reviews Cancer,3,380-7(2003))。

已知高水平的ROS抑制细胞增殖并且甚至诱导细胞凋亡。因此，这种ROS生成材料的一个应用是用于制备医学装置，例如支架和气囊，以处理体液管(包括血管、胆管、食道和结肠)中的狭窄和再狭窄。

狭窄是血管或其他管道中的非正常变窄，这是由细胞、胞外基质、脂质和其他细胞内容物不受控制的增殖和沉积所导致。因此，释放高水平的ROS的材料可用于通过诱导凋亡来抑制这类细胞增殖并解决狭窄。

再狭窄是指狭窄在治疗原始狭窄的介入之后的复发。再狭窄通常涉及已经变窄；接受治疗以清除堵塞并且随后再变窄的血管。再狭窄可在介入如经皮穿刺冠状动脉成形术和支架治疗之后发生。这些心血管介入诱导血管平滑肌细胞的不需要的增殖(新内膜增生)，这最终导致血管的再变窄。为了防止再狭窄，药物溶出支架(DES)在二十一世纪初被引入临床心脏病学。已经在心血管支架的表面上涂覆抗增殖药物，如紫杉醇(一种抗癌药物)和西罗莫司(一种免疫抑制药物)并且向血管壁局部释放。这些药物有效地抑制了血管平滑肌细胞增殖，并因此防止了支架内新内膜增生以及随后的再狭窄。

已经证明高水平的ROS，尤其是过氧化氢能够有效抑制平滑肌细胞(Deshpande,N.N.等,Mechanism of hydrogen peroxide-induced cell cycle arrest in vascularsmooth muscle(过氧化氢诱导血管平滑肌中细胞周期阻滞的机理).Antioxid RedoxSignal,2002.4(5):第845-54页)和其他细胞(Li,M.等,Hydrogen peroxide induces G2cell cycle arrest and inhibits cell proliferation in osteoblasts(过氧化氢诱导G2细胞周期阻滞并抑制骨细胞中的细胞增殖),Anat Rec(Hoboken),2009.292(8):第1107-13页)和(Chen,Q.和B.N.Ames,Senescence-like growth arrest induced by hydrogenperoxide in human diploid fibroblast F65cells(在人双倍体成纤维细胞F65细胞中由过氧化氢诱导的衰老样生长阻滞),Proc Natl Acad Sci U S A,1994.91(10):第4130-4页)的增殖。因此可使用ROS生成材料来制造医疗装置，如支架和气囊，其一旦展开即能够局部递送高水平的ROS以预防/治疗再狭窄。

迄今为止，由于其短暂存在的性质以及以治疗水平和持续时间向需要的治疗位点提供它们存在困难，ROS的益处受到限制。已经令人惊讶地发现，可在某些聚合物中形成稳定化的自由基，并且当暴露于含氧的水性环境中时，这种自由基能够反过来产生ROS。考虑到ROS的生物学相关性，能够在治疗位点延长ROS生成的材料、装置和方法在医学领域中是有优势的并在本文中预期得到。

发明内容

本发明涉及包含稳定化的自由基的材料及其用途和制备。

更具体地，本发明包括包含至少一种半结晶、可水解降解的聚合物的生物相容性材料，其中该聚合物在约30kGy至约50kGy的总剂量下接受电离辐射，并且其中生物相容性材料包含稳定化的自由基。在另一个实施方式中，预期含稳定化的自由基的生物相容性材料，其包含至少一种半结晶、可水解降解的聚合物，其中该聚合物在低于约50kGy的剂量下接受电离辐射并且通过非电离辐射的方法灭菌。本发明还涉及向治疗位点提供稳定化的自由基的方法，包括施加上述的生物相容性材料。

本发明的另一个实施方式涉及能够在治疗位点从生物相容性材料产生活性氧化物质的方法，该方法包括：向治疗位点施加包含稳定化的自由基的半结晶、可水解降解的聚合物的生物相容性材料；将所述生物相容性材料暴露于含氧的水性介质；并且相对于可与该生物相容性材料接触的大气氧增加氧的量。

本发明还包括能够多相产生活性氧化物质的生物相容性复合物，该复合物包括：至少一种包含稳定化的自由基的第一可水解降解的、半结晶聚合物；至少一种包含稳定化的自由基的第二可水解降解的、半结晶聚合物；并且其中所述至少第一聚合物与所述至少第二聚合物不同。本文中也预期当与水性介质接触时能够产生活性氧化物质的生物相容性复合物，该聚合物包含至少第一可水解降解、半结晶的聚合物和至少第二材料，该聚合物包含稳定化的自由基，该第二材料改变了所述活性氧化物质的产生特征。

在另一个实施方式中，设想了具有增加的产生活性氧化物质的能力的生物相容性材料，该生物相容性材料包含可水解降解的、半结晶的材料，其中该生物相容性材料已经过电离辐射同时保持在惰性气氛中。

本发明也包括可水解降解的半结晶聚合物，该聚合物包含浓度为每晶体熔点焓超过10个单位的稳定化的自由基。

本文中也预期含本发明的材料的装置。

附图说明

图1示出显示晶体和无定形材料的电子顺磁性共振(EPR)图谱，其中各图谱已沿着y-轴偏移以示区别。

图2是代表性的半结晶可水解降解的聚合物的差分扫描量热法(DSC)曲线。

图3示出代表性的半结晶可水解降解的聚合物在给定的温度范围中的自由基含量。

图4是无定形聚合物的DSC曲线。

图5示出无定形聚合物在给定的温度范围中的自由基含量的EPR图谱。

图6是代表性的半结晶可水解降解的聚合物(具体是聚二噁烷酮(polydioxanone))的DSC曲线。

图7示出显示代表性的半结晶可水解降解的聚合物(具体是聚二噁烷酮)在给定的温度范围中的自由基含量的EPR图谱。

图8示出显示代表性的半结晶可水解降解的聚合物(具体是聚(3-羟基丁酸酯))在给定的温度范围中的自由基含量的EPR图谱。

图9是代表性的半结晶可水解降解的聚合物(具体是P3OHB)的DSC曲线。

图10是经过各种条件的几种材料的每熔融焓下的自由基含量的示意图。

图11显示了在暴露于含氧水性介质后各个时间点上测量的经辐射的2:1-PGA/TMC共聚物样品的EPR图谱。

图12是以相对光单位，或RLU报告的连续光致发光测量值的示意图，该测量值是在暴露于含氧水性介质后各个时间点处测量的经辐射的2:1-PGA/TMC聚合物网(web)中存在ROS的指标。

图13是在暴露于含氧水性介质后各个时间点处测量的经辐射的2:1-PGA/TMC聚合物网的样品中过氧化氢含量的示意图。

图13a是过氧化氢从经辐射的2:1PGA/TMC共聚物网的样品中随时间释放的示意图。

图13b是过氧化氢从由90重量％的2:1-PGA/TMC和10重量％的聚二噁烷酮组成的经辐射的聚合物颗粒掺混物以及经辐射的2:1-PGA/TMC共聚物网随时间释放的比较的示意图。

图14显示了以RLU报道的连续光致发光测量值的比较性示意图，该测量值指示在各种大气条件下辐射的2:1-PGA/TMC共聚物网的样品的ROS含量。

图15是以RLU报告的连续光致发光测量值的比较性示意图，该测量值是已经γ辐射并随后暴露于环氧乙烷(EO)灭菌的2:1-PGA/TMC共聚物网中的ROS含量。

图16是图15的2:1-PGA/TMC网的超氧化物含量随时间变化的示意图。

图17是以RLU报告的连续光致发光测量值的示意图，该测量值指示固体试样形式的经辐射的2:1-PGA/TMC共聚物中的ROS含量。

图18是在暴露于含氧水性介质后各个时间点处静电纺丝形式的经辐射的2:1-PGA/TMC共聚物的超氧化物含量的示意图。

图19是以RLU报告的经辐射的2:1-PGA/TMC共聚物样品的连续光致发光测量值的示意图。样品测量值之间的差异表示由暴露于含氧水性介质后的样品产生的单线态氧和超氧化物水平。

图20是以RLU报告的连续光致发光测量值的示意图，该测量值表示不同辐射剂量水平下2:1-PGA/TMC共聚物样品中的ROS含量。

图21是JMP 10.2.2版(SAS研究院有限公司)血管的单向分析(组A和组B)。

发明详述

本发明是半结晶、可水解降解的生物相容性聚合材料，其在暴露于电离辐射之后含有稳定化的自由基。该材料能够向选择的靶向位置(诸如但不限于伤口或者体表或体内的其他位置)递送稳定化的自由基。在与含氧水性介质接触后，含自由基的材料可在延长的时间中产生活性氧化物质。

在一个方面，本发明涉及包含半结晶聚合物的递送介质，其已经暴露于受控制的剂量的电离辐射。处于本申请的目的，术语“聚合物”包括“均聚物”和“共聚物”。合适的聚合物是半结晶的，因为存在无定形区域和高度有序分子结构的区域(结晶区域)。根据化学结构，当聚合物从粘稠、无定形的状态(在晶体熔点以上)冷却至固态时，可形成聚合物晶体。在另外的实施方式中，可通过加热玻璃态聚合物至其晶体完整温度之后冷却来形成聚合物晶体。

在晶体中，聚合物链本身能够规则地取向成紧密堆积的区域。相邻的无定形区域堆积得更不规则并且不是致密的。由于晶体中聚合物卷的较紧密堆积，聚合物链移动被限定在聚合物的该相或区域中。结晶的聚合物的百分比被称为“结晶度百分比”。结晶度百分比对聚合物的性质发挥影响。可通过分析技术如差示扫描量热法(DSC)或光谱法通过将测试材料的结晶度水平与在饱和结晶条件下的类似对照材料的结晶度水平相关联来确定结晶度百分比。使用DSC来对(结晶)融化的潜热进行定量并且提供了融化该结晶部分所需的能量的估计。

当与水性介质反应时，聚合物或共聚物发生水解，从而导致聚合物或共聚物链的切割。水解可能进行至不同程度并且速率取决于环境和其他因素。当一些但不是全部的聚合物或共聚物链由于与水的反应而断裂时，发生部分水解。“基本由于水解而降解”表示相当部分的固体聚合物溶解于周围的水性流体中导致损失约20％或更多的固体质量，在一个实施方式中损失约40％或更多，在另一个实施方式中损失约50％或更多，在另一个实施方式中损失约75％或更多，并且在另一个实施方式中损失约95％或更多。适用于本发明的聚合物是可水解降解的，其定义为当暴露于接近中性pH的水性流体(例如水、血液、汗液)时化合物(例如，聚合物或聚合加合物)在0至24个月内由于水解而基本降解的特征，在一个实施方式中是0至12个月内，在另一个实施方式中是0至6个月内，并且在另一个实施方式中是0至1个月内。化合物接触的水性流体的温度可以在室温和约37℃之间。在体内，其他降解表示也可存在例如酶攻击。

一种可用于确定聚合物或聚合加合物是否是可水解降解的方法包括在合适的水性环境中通过以下表征所述聚合物的性质：(a)将聚合物或聚合加合物沉积在稳定的基材上，如支架，以制成聚合物或聚合加合物涂覆的基材；(b)对剩余的固体聚合物或聚合加合物涂覆的基材进行称重；(c)将聚合物或聚合加合物涂覆的基材浸入接近中性pH的水性流体中；和(d)对该基材进行周期性称重。如果在暴露一段合适的时间之后，留下较小量的剩余固体聚合物或聚合加合物，则聚合物或聚合加合物被认为是“可水解降解的”。

在医学应用中，希望生物相容的聚合物表示“在特定应用中具有合适的宿主应答下进行的能力”(The Williams Dictionary of Biomaterials(《韦氏生物材料词典》),DFWilliams,利物浦大学出版社,1999)的材料。此外，生物相容性聚合物可以是生物吸收性的。

“可生物吸收的”表示该物质在体内环境中在1至24个月的时间内基本降解；在一个实施方式中，在1至18个月的时间内；在另一个实施方式中，在1至12个月的时间内。适用于本发明的生物相容性、半结晶、可水解降解的聚合物包括但不限于聚(二噁烷酮)(PDO)、聚(乙交酯)(PGA)、聚(丙交酯)(PLA)、聚(ε-己内酯)、聚(酐)如聚(癸二酸)、聚(羟基烷酸酯)如聚(3-羟基丁酸酯)(P3OHB)、以及符合生物相容性、半结晶和可水解降解的定义的任意其他聚合物。用于本发现的生物相容性、半结晶、可水解降解的共聚物包括但不限于上述聚合物的共聚物，如聚(乙交酯)/三亚甲基碳酸酯(PGA/TMC)、聚(丙交酯)/三亚甲基碳酸酯(PLA/TMC)、聚(羟基丁酸酯/羟基戊酸酯)(PHB/PHV)、以及任意其他生物相容性、半结晶和可水解降解的共聚物。基于第一聚合物与第二聚合物的重量比来描述本文所提及共聚物(例如，2:1-PGA/TMC表示基于重量2份PGA比1份TMC)。

电离辐射是可单独从原子或分子中释放电子的颗粒或光子组成的辐射，其产生离子，该离子是带净电荷的原子或分子。可影响聚合物链的电离辐射的类型包括但不限于X-射线、电子束(e-束)和γ辐射。在不同类型的电离辐射中，渗透进制品的能量和深度是不同的。例如，γ辐射，其为从放射性来源发出的(电磁)光子，通常具有0.7(铯-137)至1.3(钴-60)兆电子伏(MeV)范围的能量。考虑到形式和能量，γ辐射是高度渗透性的，甚至能渗透到致密制品中，并且由此已经发现用作体相辐射模式(延伸到整个大体积运输)，通常用于灭菌。另一方面，E-束辐射是从电子枪发射的加速电子(颗粒)，并且因此可调节至1eV至>1MeV的宽能量范围。考虑到形式和能量范围，e-束辐射并不如γ辐射的渗透性，并且其渗透的深度还受到经辐射的制品密度的影响。因此，e-束已经发现应用于整个装置灭菌，和需要部分辐射到材料中的材料改性应用中，用于性质修饰或后续化学反应，同时使下层的材料、结构或基材不受影响。

吸收剂量或制品受到辐射的量通常以“戈瑞(gray)”或“拉德(rad)”的单位表示，其中1拉德＝0.01戈瑞(Gy)。更通常地，吸收的剂量以“千戈瑞”或“兆拉德”表示，其中1kGy＝0.1Mrad。在医学应用中，已经显示对材料的辐射可用于灭菌目的。在用于永久性和可吸收的聚合物和共聚物的情况中，一般而言，用大约25kGy的剂量实现最终包装的装置的灭菌。

然而，当暴露于电离辐射时，某些聚合物发生链断裂，这可能导致沿着受影响的聚合物链形成自由基。本文所用术语“自由基”定义为具有未配对的电子或开放的外层构造的原子、分子或离子。自由基可以具有正电荷、负电荷或零电荷。除了少数例外，这些未配对的电子会产生具有高度化学反应性的自由基。可通过本领域已知的任意方式将生物相容性、半结晶、可水解降解的聚合物暴露于电离辐射以在其中产生稳定化的自由基来实现本发明的材料。可以使用任意类型的电离辐射，如γ和e-束。易于通过γ辐射和e-束辐射(在足够高的eV能量下)来实现整个制品(体相)辐射。可使用较低能量的e-束处理来实现部分制品辐射。可使用任意量的电离辐射，在一个实施方式中，剂量为少于约50kGy，在另一个实施方式中，剂量为约30kGy至约50kGy。在另一个实施方式中，可以施加低水平的电离辐射，并通过另外的方法实现灭菌。在另一个实施方式中，生物相容性、半结晶、可水解降解的聚合物经过超过灭菌所需但低于聚合物基本降解所需剂量下的电离辐射。

然后，该材料可用于可控制地将这些稳定化的自由基在一段可控制的时间内递送至目标位置。如本文所用，“稳定化的自由基”表示在保护性基质如晶体或结晶结构中形成的自由基，并且因此不能在化学反应中发生反应或被消耗直至该基质充分降解至使该自由基暴露于周围环境。也可通过改变加工参数来影响稳定化的自由基的浓度，所述参数诸如但不限于电离辐射暴露的水平、持续时间和能量水平，半结晶聚合物内的结晶度，添加剂如清除剂的存在以及加工步骤的顺序。

在给定的材料中检测并分析自由基的合适工具是电子顺磁性共振(EPR)。该方法与文献中报道的ESR或电子自旋共振是同义词。在术语的简写中，仅存在EPR“信号”或“谱”确认在与EPR施加的磁场相互作用的给定材料中存在自由基。在没有自由基的情况中，会观察不到EPR谱，相反只会看见平坦的线。图1所示的EPR测量值显示在本发明的半结晶聚合实施方式(PDO，2:1-PGA/TMC，和P3OHB)中存在自由基。相反，图1中的无定形聚合物(d,l-丙交酯和pTMC)显示很少或没有EPR信号，这表示没有自由基。

此外，本发明的半结晶、可水解降解的聚合实施方式显示当半结晶聚合物的温度接近该晶体结构域的熔点时，自由基峰消失。例如，2:1-PGA/TMC共聚物的晶体熔点是约200℃，如图2所示，在180℃至200℃下观察到明显的熔化吸热。在熔化过程中，聚合物链的移动明显增加，这增加了自由基重组并与其他物质发生反应的可能性。如图3所示，室温、80℃和130℃条件下存在经45kGy的γ辐射的2:1-PGA/TMC的EPR信号。在180℃下，晶体结构域开始熔化并且EPR信号降低。无EPR峰表示从180℃冷却回室温并没有产生自由基。一旦自由基从熔化中的半结晶聚合物的晶体结构域中释放，它们不会自发再形成。

图4是上述示例的相同共聚单体的DSC曲线。[乙交酯(GA)和三亚甲基碳酸酯(TMC)]是具有无规链结构且很少或没有晶体结构域的1:1-PGA/TMC。在45kGy下的γ辐射之后，这种非结晶的、无定形共聚物形式没有显示出明显的EPR信号。如图5所示，该信号低于0.1(单位)。重要的是注意到在图5所反映的尺度对比图4所反映的尺度的变化。在加热后，痕量EPR信号在高达280℃下未改变。后续冷却回室温并没有产生明显的EPR信号。没有EPR信号表明这种无定形的、经辐射的、无规共聚物实际上不含稳定化的自由基。

可在图6中看到这种现象的另一个示例，其包括使用具有约110℃的晶体熔点的聚二噁烷酮(PDO)。如图7所示，在45kGy下的γ辐射之后，PDO半结晶可水解降解的聚合物在室温和加热至80℃之后显示出强的EPR信号。然而，一旦达到晶体熔点，EPR信号消失并且没有剩下自由基(图7)。

EPR测量值也显示在另一种本发明的可生物吸收的可水解降解的半结晶聚合实施方式(聚-3-羟基丁酸酯(P3OHB))中存在自由基。P3OHB具有约170℃的晶体熔点(图9)。如图8所示，经45kGy的γ辐射的P3OHB在室温和加热至80℃和130℃后有强EPR信号，但是该信号在温度进一步升高至晶体熔化以上的180℃时消失。从180℃冷却回室温并没有再次产生EPR信号。同样，一旦自由基通过熔化半结晶聚合物的晶体结构域释放，新的自由基不会自发再形成。

聚合物链的移动在聚合物的晶相中得到限制。对于给定剂量的电离能量，通过辐射产生的自由基的稳定性与晶相内移动的限制程度相关。DSC评估了熔化潜热以提供熔化结晶部分所需能量的估计(即，为了克服晶体的限制力)。通过将熔化吸热的面积在DSC痕迹上进行积分来确定熔化结晶部分所需的能量并且称为熔融焓。如上所述，使用EPR来检测自由基并且可提供对给定材料中自由基浓度的估计。通过对每单位重量样品的EPR谱进行二重积分来确定这种自由基浓度的估计(Eaton等的参考书《定量EPR》(Quantitative EPR)，第30页，2010)。两者的结合，其中二重积分的每单位重量样品的EPR强度除以熔融焓可得到每单位结晶度的自由基浓度的总体估计。具有更强黏力的晶相的材料实施方式更可能为形成的自由基提供安全的庇护场所。这种稳定化的自由基在半结晶、可水解降解的聚合物中更有效的储存可用于提供每种晶体更高浓度的自由基。图10表示在暴露于45kGy的γ辐射和在60kGy的γ辐射之后，对于半结晶、可水解降解、可生物吸收的2:1-PGA/TMC的样品每晶体熔融焓超过10个单位的高浓度自由基。所得的效果证明了在暴露于高水平的电离辐射的生物相容性、半结晶、可水解降解的聚合物中可存在高浓度的稳定化的自由基。在一个实施方式中，每晶体熔融焓的自由基浓度超过10个单位。在另一个实施方式中，每晶体熔融焓的自由基浓度超过15个单位。在另一个实施方式中，每晶体熔融焓的自由基浓度超过20个单位。

稳定化的自由基在生物相容性、半结晶、可水解降解的聚合物中得到保护，并且聚合物可控地接近暴露于发生聚合物水解的水性介质。水性介质的pH和/或温度也影响水解的速率以及由此接触稳定化的自由基的速率。合适的水性介质包括但不限于水、水性缓冲溶液、生物流体和水蒸气。一旦接触水性介质，自由基可与水性介质中溶解的氧发生反应。“含氧的水性介质”表示包含水、或其它能够使材料水解降解的物质，以及氧的任意流体。在生物系统中，合适的含氧水性介质包括但不限于伤口渗出物、血液、血清、汗和胞外流体。例如，水性介质会存在于体内、伤口床内、皮肤表面、任意粘膜表面以及其他区域。

在自由基与氧分子发生反应的情况中，可以产生活性氧化物质(ROS)。例如，当与溶解氧发生反应时，自由基将分子氧还原以产生超氧化物，O₂ ^·-。超氧化物是称为活性氧化物质或ROS的一大类活性化合物的一部分。超氧化物可自发或催化降解成过氧化氢(H₂O₂)。已经报道超氧化物还可与氮的氧化物(ΝΟ·)发生反应形成过氧亚硝酸根(ONOO-)。过氧化氢的水性芬顿反应也产生羟基(·ΟΗ)和过氧羟基(·ΟΟΗ)。上述和其他化合物如单线态氧(¹O₂)、次氯酸根(ClO-)及其全部组合均包括在ROS家族中。

由于自由基在本发明的材料的结晶部分中的稳定性，可在延长的时间段中产生ROS。“延长的时间段”表示持续超过最少24小时，在一个实施方式中持续超过一周，在另一个实施方式中持续超过一个月。

超氧化物的衰减本质要求选择检测方法。一种检测超氧化物的合适方法包括使用化学发光化合物如鲁米诺，或发光蛋白

(英国普利茅斯的骑士科技有限公司(Knight Scientific Ltd.))的另一种化合物，和合适的分光光度计如FLUOstar Omega微板读数仪(北卡罗来纳州卡雷的BMG实验室技术公司(BMG Labtech Inc.))。

会与超氧化物和其他ROS发生反应产生光或发光。通过姐妹样品孔之间的

化学发光信号差异来具体测定超氧化物的贡献，样品孔之一包含超氧化物歧化酶(SOD)，这是一种催化超氧化物歧化反应的酶，该反应中超氧化物被转化为氧和过氧化氢。本文中经辐射的实施方式证明稳定化的自由基的形成和存在，并且一旦暴露于含氧水性介质就产生超氧化物(O₂ ^·-)。此外，本文中经辐射的2:1-PGA/TMC共聚物实施方式证明在辐射剂量和ROS(包括超氧化物)生成之间的非线性趋势，尤其是在30kGy至50kGy之间的水平(图10)。

另一种能够通过本发明的材料和方法产生的ROS物质是单线态氧。通过合适的分光光度计，可以使用MCLA(2-甲基-6-(对-甲氧基苯基)-3,7-(二氢咪唑并[l,2α]吡嗪-3-酮))来检测单线态氧。在这种情况中，在姐妹样品之间测定单线态氧的贡献，样品之一包含叠氮化钠(NaN₃)，其猝灭单线态氧(Bancirova,Luminescence,26(6),685-88(2011))。本文中经辐射的实施方式证明稳定化的自由基的形成和存在，并且一旦暴露于含氧水性介质就产生单线态氧。

过氧化氢是另一种能够通过本发明的材料和方法产生的ROS物质。可以使用

红(俄勒冈州尤金市的分子探针公司(Molecular Probes))作为使用微板读数仪的过氧化氢的荧光探针。通过在含过氧化氢酶的姐妹样品中观察发光降低来对过氧化氢进行定量，过氧化氢酶将过氧化氢分解为水和氧。本文中经辐射的实施方式证明稳定化的自由基的形成和存在，并且一旦暴露于含氧水性介质就产生过氧化氢。

除了水性介质中存在的氧以外，在一些实施方式中，本发明的材料还包含氧发生剂。本文使用的术语“氧发生剂”定义为任意能够产生氧的组件。当包括在本发明的材料中时，由于额外的氧可与材料的稳定化的自由基发生反应，氧发生剂有利于潜在地驱动活性氧化物质的进一步产生。

考虑到在不同浓度和/或持续时间下ROS影响的生物过程的范围，可能需要通过改变氧可及性来修饰ROS产生的能力。

就ROS的化学反应性质而言，将额外的化合物结合入能够与ROS发生反应的本发明的材料是有优势的。例如，含氮化合物能够与ROS发生反应以产生氮的氧化物并且可结合入本文所述的材料或装置中。与ROS相似，氮的氧化物是多种生物过程的调节体并且已知在生理和病理状态下起到关键作用，包括但不限于心血管健康和疾病。

考虑到稳定化的自由基以可控制的方式发生反应并产生生物活性分子如ROS的能力，用于向所需的治疗位点提供它们的方法是治疗应用的基础。例如，本文所述的超氧化物生成材料可以放置在治疗位点上或周围，诸如但不限于伤口，使得产生的超氧化物能够在愈合过程中起到辅助作用。

治疗位点和包含稳定化的自由基的材料之间的接触可以是直接或间接的。例如，治疗组合物或其他医学材料的层可位于治疗位点和现有材料之间。

然后含稳定化的自由基的材料保持紧密靠近治疗位点持续需要的一段时间。

另外，在所需的治疗位点应用本发明的材料之后，可以采用用于在治疗位点增强ROS产生的不同机制。另外，通过采用包含稳定化的自由基的材料、将该材料暴露于含氧水性环境中并且调节与该材料可及的氧的量来进一步增强ROS产生。可通过例如高压氧疗法增加大气氧浓度来增加可及的氧。在另一个示例中，可通过局部氧疗法来调节局部大气氧浓度。可通过增加血液中的氧浓度来增加由血液递送的氧的量。例如，可通过增加可及的血红细胞的数量来增加血液的氧含量。另外，可通过波尔效应降低pH来增加血红细胞释放的氧。为了增加血液供氧的总量，可以在治疗位点增加灌注。

用于增加灌注的方法包括采用负压伤口疗法、手术或介入治疗。另外，如上所述，氧生成组分可包含在生物相容性、半结晶、可水解降解的材料中，因此增加了可与稳定化的自由基发生反应的氧。

根据所需的用途，包含稳定化的自由基的本发明的材料可采用多种形式，如任意一些的二维或三维构型，包括但不限于伤口敷料、烧伤敷料、软膏剂、悬浮剂、皮肤替代物、组织支架、片材、糊料、纤维、乳液、凝胶、胶束、涂层、溶液或粉末，或其组合。不同形式的包含稳定化的自由基的材料可以具有不同的比表面积，这反过来可影响ROS的生成。在一些情况中，生物相容性聚合材料可具有约0.001m²/gm至约50m²/gm的比表面积。“比表面积”表示在单位体积或单位质量中存在的所有颗粒、纤维、泡沫和/或多孔结构的可及表面的总和。这种比表面积取决于该材料的形状、尺寸、孔隙率和微结构。可通过气体吸附方法来测量。从基于由热解吸的气相色谱确定的比停留体积的BET公式来计算比表面积。通常使用氮气作为吸附剂。

一种潜在的形式是定义为柔性或刚性层的片材，其中其幅度或宽度与厚度之比超过10:1。对于该应用的目的而言，片材可由沉积纤丝的较平坦排列组成。“纤丝”表示相当长度的纤维。通过将放下或组装纤维制成的片材被称为网。网和其他材料可以是非织物的，表示它们可以由长纤维制成，通过化学、机械、热或溶剂处理结合在一起。此外，纤维被定义为圆柱形或管状结构，其中长度与直径之比一般超过100:1并且直径通常低于约5mm。合适的ROS生成片材可具有1μm至20mm的厚度。一些优选的实施方式具有100μm至10mm的厚度。可对该片材厚度和密度进行调整以向所需的表面形貌提供更大的顺应性，如符合治疗位点。

可对本发明的材料的柔软形式进行选择，使得其可有效应用于需要产生ROS的目标位置上。当以乳液、浆料或悬浮液形式使用时，可以通过注射器或其他合适的流体递送装置向身体提供ROS生成材料。当以糊料、凝胶或乳膏形式使用时，可以通过刮刀或其他合适的粘稠流体递送装置向治疗位点提供ROS生成材料。当以粉末或颗粒形式使用时，可通过任意合适的方式在所需的治疗位点上喷洒或喷射或沉积ROS生成材料。因为不同形式的ROS生成材料可能具有不同的比表面积和/或纵横比，所选的形式是一种影响在治疗位点处产生的ROS的浓度和持续时间的方法。

虽然该材料不必是多孔的，在某些情况中需要孔隙率或增加的表面积使得含氧水性介质能浸渗材料的开放空间。“多孔”表示该材料的体密度低于材料本身的固有密度。5％至99％范围的孔隙率一般足以增强位点处的生物流体接触并影响ROS生成。在一些环境中可使用10％至90％范围内的孔隙率。本文所述的多孔ROS生成材料的其他优势在于它们发挥组织支架功能的能力。作为组织支架，多孔ROS生成材料可诱导新血管生成、填充胶原性组织、用作细胞生长基质、刺激细胞向材料中迁移并促进细胞增殖和分化、和/或随着时间吸收。改变孔隙率可根据需要改变ROS生成特征以影响生物过程并且因此可根据所需的应用来调节。

本文的ROS生成材料的另一个有用特征是其可以三维形状提供或其可以是可成形的。“可成形的”表示一种结构符合或适应特定轮廓、形式、图案或拟合的能力。

可能需要三维形状或可成形的材料以在治疗位点或治疗位置处或其周围填充空隙或与接触不规则的形貌。所设想的实施方式包括但不限于塞、管、支架、绒毛、线圈、泡沫、悬带、夹、颗粒、芯片及其变化形式。

本发明的ROS生成材料的另一个优势在于其可由有颜色的或染色的材料、或天然有色材料形成以增强可视性。例如，可使用黄色的ROS生成材料以使肉芽组织容易地可视化，该组织的特征在于亮红色、圆石状的外观。

除了本发明的材料可采用的形式的范围外，还设想多种材料的复合物。本文所用的复合物是由两种或更多种具有明显不同的性质的组成材料组成的材料，使得当合并时，产生与单独组分不同特征的材料。具体地，能够多相生成ROS的复合物对影响数个受ROS的存在影响的生物过程而言是有价值的。例如，这些复合物可包含两个或更多个可水解降解、半结晶聚合物，各包含稳定化的自由基，但是在其ROS生成特征上不同。在暴露于水性介质之后，这些复合物材料会展现出活性氧化物质的多相生成。可实现ROS的多相生成，其中该复合物的组分聚合物含有不同量的稳定化的自由基。在一个实施方式中，可通过改变至少一种组分聚合物的水解降解速率来改变ROS的生成，由此改变稳定化的自由基的可及性。在另一个实施方式中，可通过改变至少一种组分聚合物的结晶度来改变ROS的生成，由此改变聚合物使自由基稳定化的能力。在另一个实施方式中，可通过改变对至少一种组分聚合物的辐射剂量来改变ROS的生成，由此改变链断裂期间形成的自由基的数量。在另一个其他实施方式中，可通过改变辐射剂量和渗透进聚合物或聚合物复合物的深度来改变ROS的生成。对于某些应用，设想到至少一种组分聚合物可以是可生物吸收的。

或者，设想一种复合物材料会提供ROS的最初突释和持续一段时间的ROS生成。在一个实施方式中，两种不同的可水解降解、半结晶的聚合物的复合物掺混物可用于在暴露于含氧水性介质后提供增强的ROS突释，该掺混物产生的活性氧化物质的量超过由已经过给定辐射剂量下的电离辐射的该至少两种单独的可水解降解半结晶聚合材料产生的活性氧化物质的加权平均量。

除了组分聚合物含稳定化的自由基的复合物以外，设想包括含至少一种稳定化的自由基的材料和至少一种不含稳定化的自由基的第二材料的复合物并且通过提供能够产生ROS的强化的、稳定的、部分永久的装置而有价值。可通过将第一材料涂覆在第二材料基材之上来实现这种包括含至少一种稳定化的自由基的材料和不含稳定化的自由基的至少一种第二材料的复合物。涂覆可通过将所需的第一材料溶解在溶液中并且将其施涂在基材第二材料，如膨胀的PTFE上，并去除溶剂来进行。此外，也可通过将第一材料的小颗粒溅射沉积在第二材料基材并随后结合或融合来进行涂覆。这种涂覆可在基材上的表面覆盖率以及厚度和孔隙率上变化。这种经涂覆的制品可在之后经过部分深度辐射以仅在可水解降解、半结晶聚合物层中产生稳定化的自由基。

设想一种包括含至少一种稳定化的自由基的材料和至少一种改变ROS生成特征(profile)的第二材料的复合物。可通过改变ROS的量、速率或持续时间或其组合物来实现修饰材料的效果。改变ROS特征的一个机制是第二材料改变稳定化的自由基的可及性。改变ROS生成的其它方法中，修饰材料可含有氧发生剂和/或干燥剂。在另一个实施方式中，修饰材料可含有清除组分，其清除的潜在靶标可包括氧、单线态氧、过氧化氢、超氧化物及其组合。

此外，修饰材料可含有酶如与超氧化物发生反应的超氧化物歧化酶，或与过氧化氢发生反应的过氧化氢酶。在第二材料中包含氧发生剂、干燥剂、清除组分和/或酶会改变生成的ROS的特征并且可根据具体应用调节。另外，修饰材料可参与与ROS的化学反应，由此改变其特征。此外，修饰材料可具有在接触水性介质后产生放热或吸热反应的能力。加入或去除热能可改变聚合物链的移动和/或其他化学反应的动力学，由此改变ROS生成的特征。

设想包括含至少一种稳定化的自由基的材料和治疗生物活性剂的复合物。本文中的生物活性剂可选自下组：自生、同种、异种或重组来源的骨引导物质、骨诱导物质、生长因子、趋化性因子、成形素、药物、蛋白质、肽、和生物活性分子如转化生长因子β(TGF-β)、骨形态生成蛋白(BMP)、抗生素、抗微生物剂、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板来源生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素、G型免疫球蛋白抗体及其组合。

考虑到ROS的生物学相关性，也设想ROS-生成制品与其他治疗化合物如抗生素或抗癌药物联用。ROS生成植入装置可以任意类型的全身给予的抗生素化合物如喹诺酮类、β-内酰胺类和氨基糖苷类联用，并且可通过允许永久植入物放置在受污染或感染的区域来产生更有效的治疗。这种组合也可在较低剂量的抗生素中有效，以减弱对这类化合物的抗药性并延长其寿命。此外，ROS生成装置可以与其他抗微生物剂联用，包括但不限于银、氯己定及其组合。所得的组合治疗可提供耐受细菌建群的植入物，同时能够放置在高度受污染或感染的区域。与抗癌药如拓扑异构酶II抑制剂如紫杉醇(tm)联用的ROS生成装置使得能够更有效的治疗，其中该装置提供ROS的局部递送并且能够采用较低全身剂量给予化疗药物。

修饰材料也可用作针对以下因素的屏障，包括但不限于水分和/或氧，其会影响自由基将氧还原为ROS。在另一个实施方式中，修饰材料可以作用为扩散屏障。扩散限制可包括反应性组分或反应产物，由此改变ROS生成特征。在含稳定化的自由基的材料和修饰材料的复合物中的一种或多种组分材料可含有其他化合物，如氧发生剂和/或含氮化合物，其会与ROS发生反应以产生氮的氧化物。

可预期本文所述的复合物以多种形式存在并且能够在多个时间段中产生ROS，包括一天、一周或一个月，由此增加了其潜在的应用范围。

在一个实施方式中，设想包含多层相似或不相似材料(如孔隙率上)的复合物以达到所需的厚度并且其中至少一层是非织物的可生物吸收的半结晶材料。这类复合物的合适厚度的范围为约100μm至超过约10mm。例如，更开放的孔层可以位于制品的一侧以促进组织内生长，同时可在相反的一侧使用更紧缩的孔层以已知组织内生长。

另外，本发明的材料可包含于任意可植入的医学装置中，如支架、网格、移植物或任意治疗性组合物。“可植入医学装置”表示通过手术、注射、放置或施加或其他合适的方式植入的任意物体，通过其物理存在或机械性质实现其主要功能。

实施例

实施例1：使用

试验检测的ROS测试方法

为了测定在特定样品中存在的ROS的量，采用FLUOstar Omega多模式微板读数仪(北卡罗来纳州卡雷的BMG实验室技术公司)，一般用于96-孔样品板。该读数仪具有双注射器容量，其能够向样品孔中注射试剂。微孔参数参照来自包含ROS敏感性发光蛋白

的ABEL试验试剂盒61M(骑士科技有限公司，15Wolseley Close商业园区，普利茅斯，PL23BY，英国)的方案。用反渗透/去离子(RO/DI)水洗涤注射器泵三次并且将读数仪设定到合适的温度(一般为37℃)。

在对聚合样品进行的测试中，通常使用约0.5cm的直径，其稍小于给定的孔的直径。考虑待分析的样品的目标数量，用缓冲溶液填充合适数量的孔，并且然后将聚合盘放到相应的孔中。

将样品孔板快速插入到微板中，并且开始并收集连续光致发光测量值(以相对光单位或RLU报告)。在15分钟的校准后，将

注射或吸移到含样品和缓冲溶液的各孔中。在另外的时间段中持续收集数据。

实施例2：使用

试验的超氧化物和其他ROS测定

为了测定给定样品中可由超氧化物贡献的信号，在实施例1所述的方法后，同时制备微板的姐妹样品孔，其中另外用超氧化物歧化酶(SOD)增强缓冲液。在ABEL-61M测试试剂盒中制备SOD。在实施例1和含SOD的姐妹孔之间标准化的RLU痕量的差异产生了可由超氧化物贡献的信号，通常以最大RLU报告。不包含超氧化物的其他“ROS”是对含SOD的样品孔记录的数据。

实施例3：使用微板上的MCLA试验的单线态氧测试方法

采用FLUOstar Omega多模式微板读数仪，其通常用于96-孔样品板。测试室温度设定为37℃。在对聚合样品进行的测试中，通常使用约0.5cm直径的圆盘，其稍小于给定的孔的直径。为检测超氧化物或单线态氧所使用的化学发光指示物是MCLA，或2-甲基-6-(对-甲氧基苯基)-3,7-(二氢咪唑并[l,2α]吡嗪-3-酮(Bancirova,Luminescence,26(6),685-88(2011))。MCLA购自俄勒冈州尤金市的分子探针公司。姐妹样品孔的制备过程如下：

1.经辐射的含缓冲的MCLA溶液的试样

2.经辐射的含缓冲的MCLA和SOD的试样

3.经辐射的含缓冲的MCLA和SOD和NaN₃的试样

4.经辐射的含缓冲的MCLA和NaN₃的试样

5.仅缓冲的MCLA

在孔制备后，将孔板快速插入到微板中，并且开始并收集约5分钟的连续光致发光测量值(以相对光单位或RLU报告)。样品1和样品2之间的RLU差异是由于超氧化物导致。1和4之间的RLU差异是由于单线态氧导致。1和3之间的RLU差异是由于超氧化物和单线态氧导致。来自孔5的RLU设置对照基线。

实施例4：经调节的DSC测试方法

在TA仪器Q2000DSC上使用采用以下设置的经调节的DSC模式进行经调节的DSC(MDSC)：

-使用2℃/分钟的以下加热速率进行-50℃至250℃的初始样品加热。使用60秒的+/-0.32℃的温度范围进行调节。

实施例5：标准DSC方法

在TA仪器Q2000DSC上使用以下设置进行DSC：-以10℃/分钟进行-50℃至300℃的初始样品加热。

实施例6：HC样品制备

通过将从供应商接收的团块或粉末热压制成固体片材来制备给定聚合材料的固体试样。各试样在50PSI下和大约在或超过通过DSC建立的熔点的温度下压制5分钟。将样品冷却，然后放置在-20℃下的冰箱中以在辐射之前保存。所有的试样受到45kGy的辐射(加利福尼亚州的Sterigenics-Corona公司)。

实施例7：EPR测试方法

通过在约9GHz下正常运行并且具有100kHz的磁场调节的Bruker Biospin X-带CW-EMX(马塞诸塞州比尔瑞卡)谱仪获得EPR谱。通常在不到1mW的微波能量下获得谱以避免信号饱和，并且运行多次重叠扫描以得到EPR谱。

实施例8：结晶和无定形EPR结果

如实施例6所示制备聚(d,l-乳酸)(皮力赛斯公司(Polysciences)目录号23976)、聚(3-羟基丁酸酯)(皮力赛斯公司目录号16916)和聚(二噁烷酮)(奥德里奇公司(Aldrich)目录号719846)的试样。按照实施例6制备聚(三亚甲基碳酸酯)(pTMC)，和2:1-PGA/TMC的嵌段共聚物团块的试样。在单独包装中，试样是环境密封的，并且经45kGy的目标的γ辐射(加利福尼亚州科罗娜的施洁公司)。样品保持在室温下。辐射与EPR测量之间的时间为约8周。对于各经辐射的样品，进行DSC以检测各实施例(4或5)中熔化吸热的存在。相似地，为了检测任何稳定化的自由基的存在，在各实施例7的经辐射样品上进行EPR。结果示于表1中。

表1-DSC和EPR结果

材料	结晶？*	稳定化的自由基？**
			聚(d,l-丙交酯)	否	否
聚(TMC)	否	否
			P3OHB	是	是
2:1PGA:TMC	是	是
			PDO	是	是

*表示通过观察DSC熔化峰所测定

**表示通过EPR谱的观察所测定

实施例9

通过EPR将45kGy(目标)经辐射的2:1-PGA/TMC的自由基浓度作为温度的函数来测量。根据美国专利号6,165,217制备2:1-PGA/TMC的嵌段共聚物。图3显示了随着温度升高EPR信号降低。当温度接近该半结晶聚合物的晶体熔点(Tm约200℃)时，EPR信号和因此的自由基浓度消失。一旦自由基在180℃下消失，在冷却至室温后它们不会再形成，如图3中的后来的室温线的平坦的EPR响应所示。

实施例10

通过EPR将经45kGy辐射的PDO的自由基浓度作为温度的函数来测量。从奥德里奇公司目录号719846订购半结晶PDO聚合物。图7显示了随着温度升高EPR信号降低。当温度接近该半结晶聚合物的晶体熔点(Tm约110℃)时，EPR信号和因此的自由基浓度消失。

实施例11

通过EPR将经45kGy辐射的1:1-PGA/TMC无规嵌段的自由基浓度作为温度的函数来测量。按照实施例6制备团块形式的1:1-PGA/TMC的无规嵌段共聚物。图5显示了在室温下非常小的EPR。这种小信号随着温度升高至PGA的晶体熔点(Tm约200℃)而降低。随后在室温下的测量值显示出比初始未加热的样品少的EPR信号。这种小EPR信号表明在初始样品中存在的少量自由基在加热至PGA熔点后消失并且在随后冷却回室温后没有形成自由基。

实施例12

通过EPR将经45kGy辐射的聚(3-羟基丁酸酯)(P3OHB)的自由基浓度作为温度的函数来测量。从皮力赛斯公司目录号16916获得P3OHB。样品经45kGy的辐射并且按照实施例7测量EPR信号。图8显示了室温下响应具有较高自由基浓度的经辐射材料的强EPR信号。这种自由基浓度和EPR信号然后随着温度的升高而降低。当温度接近该半结晶聚合物的晶体熔点(Tm约170℃)时，EPR信号和因此的自由基浓度消失。一旦自由基在180℃下消失，在冷却至室温后它们不会再形成，如后来的室温线的平坦的EPR响应所示。

实施例13-自由基随时间的稳定性

根据美国专利号6,165,217制备2:1-PGA/TMC。该网在不透空气/氧的聚合物包装中密封，该包装包含干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司(MultisorbTechnologies))以最小化聚合物不受控制的早期水解。然后在25kGy的目标剂量下对样品进行γ-辐射。来自大的经辐射网样品的子样品试样为约2.5cm x约8cm的尺寸。如在微量天平上所测量，各试样的初始重量为1.5至1.8g。各试样放置在含约250ml的3x磷酸盐缓冲盐水(PBS)(密苏里州圣路易斯市的西格玛化学公司，P3813)单独的8盎司螺旋盖瓶。瓶盖被螺旋密封并且放在设置为37℃的加热循环水浴中。水浴水位达到或超过各样品瓶中的水位。

在所选的时间段处，移去单独的样品瓶并且从该瓶中取出样品。样品在新鲜的纸巾上吸干并称重。然后将缓冲液浸泡的样品转移至环境真空室(无加热)中并经高度真空以去除残留的水。一旦达到恒定的样品重量则确定干燥。这在4-8个小时内观察到发生，虽然样品通常在真空下保持过夜。一旦干燥，各样品单独包装在具有新鲜干燥剂的不透性屏障包装中。如实施例7所述，在经辐射的水解的样品上进行室温下的X-带EPR测量。图11显示了长至17天的时间点处测量的EPR响应。

实施例14-ROS随时间变化

根据美国专利号6,165,217制备2:1-PGA/TMC。该网在不透空气/氧的聚合物包装中密封，该包装包含干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司)以最小化聚合物不受控制的早期水解。然后在25kGy的目标剂量下对样品进行γ-辐射。来自大的经辐射网样品的子样品试样为约2.5cm x约8cm的尺寸。如在微量天平上所测量，各试样的初始重量为1.5至1.8g。各试样放置在含约250ml的3x磷酸盐缓冲盐水(PBS)(密苏里州圣路易斯市的西格玛化学公司，P3813)单独的8盎司螺旋盖瓶。瓶盖被螺旋密封并且放在设置为37℃的加热循环水浴中。水浴水位达到或超过各样品瓶中的水位。

在所选的时间段处，移去单独的样品瓶并且从该瓶中取出样品。样品在新鲜的纸巾上吸干并称重。然后将缓冲液浸泡的样品转移至环境真空室(无加热)中并经高度真空以去除残留的水。一旦达到恒定的样品重量则确定干燥。这在4-8个小时内观察到发生，虽然样品通常在真空下保持过夜。一旦干燥，各样品单独包装在具有新鲜干燥剂的不透性屏障包装中。如实施例1所述，在经辐射的水解的样品上进行ROS测量。如图12所示，在长至17天的时间点处检测到ROS。

实施例15：超氧化物随时间变化

在所选的时间段处，移去单独的样品瓶并且从该瓶中取出样品。样品在新鲜的纸巾上吸干并称重。然后将缓冲液浸泡的样品转移至环境真空室(无加热)中并经高度真空以去除残留的水。一旦达到恒定的样品重量则确定干燥。这在4-8个小时内观察到发生，虽然样品通常在真空下保持过夜。一旦干燥，各样品单独包装在具有新鲜干燥剂的不透性屏障包装中。如实施例1和2所述，在经辐射的水解的样品上进行ROS测量。如图12所示，在长至17天的时间点处检测到超氧化物。

实施例16：Amplex红H₂O₂测试方法

通过对测试材料称重，然后放入500μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中来制备用于过氧化氢(H₂O₂)测定的样品溶液。

在室温下充分混合的条件下并在30分钟后，对100μl的所得上清进行取样。

通过将50μl的Amplex红DMSO溶液(俄勒冈州尤金市的分子探针公司)、100μl的辣根过氧化物酶溶液(HRP，10单位/ml，分子探针公司)和4.85ml的缓冲溶液混合来新鲜制备反应溶液。在96-孔板中，100μl的上清与等体积的反应溶液在各孔中混合并在室温下孵育30分钟。然后在Fluostar Omega微板读数仪上在540nm/580nm(激发/发射)处测量荧光信号。用约700U/ml的过氧化氢酶来制备姐妹样品孔(来自牛肝脏，西格玛-奥德里奇公司目录号C30)。Amplex孔和含过氧化氢酶的Amplex孔之间的RLU差异是由于过氧化氢导致的并且通过用于制备样品溶液的样品的重量标准化。

实施例17：从经辐射的2:1-PGA/TMC时间上释放过氧化氢。

在所选的时间段处，移去单独的样品瓶并且从该瓶中取出样品。样品在新鲜的纸巾上吸干并称重。然后将缓冲液浸泡的样品转移至环境真空室(无加热)中并经高度真空以去除残留的水。一旦达到恒定的样品重量则确定干燥。这在4-8个小时内观察到发生，虽然样品通常在真空下保持过夜。一旦干燥，各样品单独包装在具有新鲜干燥剂的不透性屏障包装中。按照实施例16在样品上检测H₂O₂并且在图13上报告。

实施例17A：从经辐射的2:1-PGA/TMC在3个月中释放过氧化氢。

根据美国专利号6,165,217制备2:1-PGA/TMC。该网在不透空气/氧的聚合物包装中密封，该包装包含干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司)以最小化聚合物不受控制的早期水解。然后在45kGy的目标剂量下对样品进行γ-辐射。来自大的经辐射网样品的子样品试样为约2.5cm x约8cm的尺寸。通过微量天平测量各试样的初始重量。各试样放置在含约250ml的3x磷酸盐缓冲盐水(PBS)(密苏里州圣路易斯市的西格玛化学公司，P3813)单独的螺旋盖瓶。瓶盖被螺旋密封并且放在设置为37℃的加热循环水浴中。水浴水位达到或超过各样品瓶中的水位。

在所选的时间段处，移去单独的样品瓶并且从该瓶中取出样品。样品经过干燥。一旦干燥，各样品单独包装在具有新鲜干燥剂的不透性屏障包装中。

为了检测过氧化氢，按照来自实施例16的稍加修改的方法。通过对测试材料进行称重，然后以约200mg/mL的样品重量与缓冲液体积之比的水平放入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中来制备H₂O₂的样品溶液。在室温下充分混合的条件下并在60分钟后，回收所得上清的子样品。

制备Amplex红DMSO溶液(俄勒冈州尤金市的分子探针公司)反应溶液。在96-孔板中，上述上清与各孔中的DMSO反应溶液混合并在37℃下孵育。然后在Fluostar Omega微板读数仪上在540nm/580nm(激发/发射)处测量荧光信号。用约100U/ml的过氧化氢酶(来自牛肝脏，西格玛-奥德里奇公司目录号C30)来制备姐妹样品孔。Amplex孔与含过氧化氢酶的Amplex孔之间的RLU差异是由于过氧化氢导致的。RLU信号通过与校准曲线相关联转化为过氧化氢的绝对浓度，该校准曲线由稀释的3％过氧化氢母液溶液产生。

对于水解的样品，图13a中报道了超过3个月检测到的过氧化氢。

实施例17B：聚合物掺混物增强过氧化氢产生

根据美国专利号6,165,217制备由90重量％的2:1-PGA/TMC和10重量％的聚二噁烷酮(PDO)(PDO购自勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim)，批号76013)组成的聚合物颗粒掺混物。网的样品在不透空气的聚合物包装中密封，该包装包括干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司)。在25kGy的目标剂量下对样品进行辐射。

对于较小的子样品，按照实施例16测定过氧化氢产生。RLU信号通过与校准曲线相关联转化为过氧化氢的绝对浓度，该校准曲线由稀释的过氧化氢母液溶液中产生。

上述掺混的样品的信号与之前的来自按照美国专利号6,165,217类似制备的未掺混的仅含2:1-PGA/TMC的样品数据相当，虽然其在45kGy的明显较高的目标剂量下辐射。对于较小的子样品，按照实施例16测定过氧化氢产生。RLU信号通过与校准曲线相关联转化为过氧化氢的绝对浓度，该校准曲线由稀释的过氧化氢母液溶液中产生。如图13b所报告，较低的经辐射的掺混物比未掺混的对应物产生明显较大量的过氧化氢。

实施例18：增强的ROS，惰性气氛对比空气

根据美国专利号6,165,217制备2:1-PGA/TMC共聚物网。网的样品在不透空气/氧的聚合物包装中密封，该包装包括干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司)。在即将封闭包装之前，通过干燥氮气吹扫去除包装内的环境空气。另一个样品包装在封闭之前没有用空气吹扫。随后密封的包装经45kGy的目标剂量下的γ-辐射(加利福尼亚州科罗娜的施洁公司)。

在接受以后，去除样品并且如实施例1所示运行

试验以测定ROS信号。通过实施例2所述的

测试来测定超氧化物的量。按照条件制备两个样品并且报告平均值。如

试验所估计，氮气气氛的经辐射的2:1-PGA/TMC比空气对应物产生明显较高的ROS(参见图14)。

实施例19：γ处理，EO灭菌的样品

按照美国专利号6,165,217制备2:1-PGA/TMC共聚物网并且经过目标20kGy的γ辐射(加利福尼亚州科罗娜的施洁公司)并且随后用环氧乙烷灭菌(佐治亚州亚特兰大的灭菌服务公司，GA 30336)并且按照实施例1和2测试。按照条件制备两个样品并且报告平均值。样品如图15所示产生ROS，包括如图6所示的超氧化物，如与空白对照样品相比在约20分钟处的较高峰所证实。

实施例20：含ROS的低表面积(HC'd)实施方式

从按照美国专利号4,243,775的材料制备2:1-PGA/TMC嵌段共聚物固体试样并按照本文的实施例6处理。基于压制的盘的几何参数计算该材料的表面积为约0.002m²/gm，随后用于ROS测定。

如图17所示，根据本文的实施例1进行ROS测定。

实施例21：高表面积，静电纺丝2:1-PGA/TMC

使用Pholasin测试方法测量作为时间的函数的通过经45kGy的γ辐射的静电纺丝形式的2:1-PGA/TMC产生的超氧化物。从含4重量％的2:1-PGA/TMC的六氟-2-丙醇(HFIP)溶液中制备四层静电纺丝样品。使用Elmarco NS Lab 500静电纺丝单元从该溶液中织造纤维，之后在120℃下持续5分钟至冷却结晶。通过将2:1-PGA/TMC纳米纤维的薄层静电织造在金属板上来产生第一层。为了增加层厚度，加入额外的溶液并且另外沉积3层静电纺丝2:1-PGA/TMC纤维。所得的样品由总共四层静电纺丝组成。纤维直径的范围从低于100nm至超过约1.5微米。使用45kGy剂量的e-束(加利福尼亚州科罗娜的施洁公司)对各样品进行辐射，按照实施例2进行测试并且结果如图18所示。通过BET测量该材料的比表面积并且发现为约4.3m²/gm。

实施例22：在经辐射的材料上检测单线态氧

根据美国专利号6,165,217制备2:1-PGA/TMC。该网在不透空气/氧的聚合物包装中密封，该包装包含干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司)以最小化聚合物不受控制的早期水解。然后在45kGy的γ目标剂量下对样品进行γ-辐射。按照实施例3测试经辐射的样品的试样。如图19所示证明了信号是由于超氧化物和单线态氧导致。

实施例23：经辐射的和未经辐射的材料在血管形成上的比较

如下制备环氧乙烷灭菌的、未经辐射的半结晶可水解降解的聚合材料(组A)。根据美国专利号6,165,217制备2:1-PGA/TMC共聚物网，在120℃下真空干燥过夜，在不透空气/氧的聚合物包装中包装，该包装包含干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司)以最小化聚合物不受控制的早期水解。通常从网上切下1cm的网圆盘，然后重新包装到不透空气/氧的聚合物包装中，该包装包含干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司)。为了对试样进行灭菌，它们被转移到可透过环氧乙烷(EO)的包装中并经过充分的环氧乙烷暴露用于灭菌(30分钟EO暴露)(犹他州盐湖城的尼尔森实验室公司(NelsonLabs))。接收该材料并重新包装到不透空气/氧的聚合物包装中，该包装包含干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司)直至需要用于其他用途。

如下制备经γ辐射的半结晶可水解降解的聚合材料(组B)。根据美国专利号6,165,217制备2:1-PGA/TMC共聚物网，在120℃下真空干燥过夜，在不透空气/氧的聚合物包装中包装，该包装包含干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司)以最小化聚合物不受控制的早期水解。通常从网上切下1cm的网圆盘，然后重新包装到不透空气/氧的聚合物包装中，该包装包含干燥剂包(Minipak，纽约州布法罗的Multisorb技术公司)。该盘然后经过45kGy的(正常)目标γ辐射(加利福尼亚州科罗娜的施洁公司)并且包装保持未打开直至用于其他用途。

出于评价体内ROS-生成装置的血管生成效果的目的，选择apoE-/-小鼠模型，由于其已经显示出与C57-野生型类似物相比受损的血管发展(Couffinhal等，Circulation,99,3188-98(1999))，并且成为广泛使用的用于研究血管生成的临床前模型(Silva等，Biomaterials,31(6),1235-41(2010))。使用来自组A和组B的无菌盘作为该研究中的治疗组，从而比较相同形式的ROS生成材料的效果。

来自各治疗组的一个盘被皮下植入ApoE-/-小鼠和野生型对照的左侧背部和右侧背部。生命中的时间点为3、7和14天。各时间点专用6只各种类型的小鼠。在处死之后，去除各植入物并且整体固定并转移至组织学实验室。每个盘处理三个截面并且用H&E(苏木精和曙红)以及CD31抗体染色。然后由有经验的组织学家手工评价各截面在100倍光学放大下植入物边缘内的血管计数并且通过JMP 10.2.2版(北卡罗来纳州卡雷的SAS研究院有限公司(SAS Institute))分析数据。在所有3天的植入物中没有观察到血管。在两种条件和小鼠类型中在7天和14天计算血管。

在比较组A中，在7天时发现apoE-/-小鼠对比野生型小鼠中血管计数差异不显著。然而，如下文所证明，这种血管计数差异在14天时达到统计学上显著，apoE-/-的血管计数低于野生型小鼠的血管计数。

JMP 10.2.2版(SAS研究院有限公司)血管的单向分析见图21(组A)。

平均和标准偏差

LSD阈值矩阵(正数表示一对平均数是显著不同的)

Levene检验(组间差异当量，p<0.05显示差异是不相等的)

Welch检验(方差分析表示相等，使得标准偏差不相等，prob<0.05显示组在统计学上不相等)

在ROS-生成组B中，如下文所证明，在7天和14天时apoE-/-和野生型小鼠之间的血管计数中存在统计学不显著的差异。这似乎表示在apoE-/-小鼠中存在的ROS生成组B材料消除了与野生型小鼠相比的血管计数中的差异。

JMP 10.2.2版(SAS研究院有限公司)血管的单向分析见图21(组B)。

平均和标准偏差

LSD阈值矩阵(正数表示一对平均数是显著不同的)

Levene检验(组间差异当量，p<0.05显示差异是不相等的)

(组B，7天)	(组B，14天)
		n/a	n/a

虽然本发明的之前所撰写的说明书使本领域普通技术人员能够制备并使用现在所认为的最佳方式，本领域普通技术人员会理解并认同存在本文的具体实施方式、方法和实施例的变化、组合和等同方式。本发明因此并不限于上述的实施方式、方法和实施例，但是也包含本发明范围和精神内的所有实施方式和方法。

Claims

1.一种具有增强的活性氧化物质生成的生物相容性材料，所述生物相容性材料包含第一可水解降解的半结晶聚合材料和第二可水解降解的半结晶聚合材料的掺混物；所述掺混物包含稳定化的自由基，在与水性介质接触之后，所述生物相容性材料能够多相产生活性氧化物质，并且所述第一聚合材料和第二聚合材料经过不同剂量的电离辐射，所述剂量的剂量率低于50kGy。

2.一种制备具有增强的活性氧化物质生成的生物相容性材料的方法，所述方法通过：

a.将第一可水解降解的半结晶聚合材料和第二可水解降解的半结晶聚合材料掺混，从而产生掺混物；并且

b.对所述掺混物进行给定辐射剂量的电离辐射以在其中产生稳定化的自由基，

其中，在暴露于含氧水性介质之后，由所述掺混物产生的活性氧化物质的量超过由第一可水解降解的半结晶聚合材料和第二可水解降解的半结晶聚合材料单独经过所述给定辐射剂量的电离辐射之后产生的活性氧化物质的加权平均量。

3.一种能够释放超氧化物的生物相容性装置，所述装置包含基材和生物相容性材料，所述生物相容性材料包含第一半结晶、可水解降解的聚合材料和第二半结晶、可水解降解的聚合材料，所述第一和第二聚合材料经过低于50kGy的剂量率的电离辐射并且通过非电离辐射的方法灭菌；所述聚合材料与所述基材的至少一部分接触,在与水性介质接触之后，所述生物相容性材料能够多相产生活性氧化物质。

4.一种能够释放超氧化物的生物相容性装置，所述装置包含基材和生物相容性材料，所述生物相容性材料包含第一半结晶、可水解降解的聚合材料和第二半结晶、可水解降解的聚合材料，所述聚合材料经过电离辐射同时保持在惰性气氛中；所述聚合材料与所述基材的至少一部分接触，在与水性介质接触之后，所述生物相容性材料能够多相产生活性氧化物质。

5.一种生物相容性材料，其包含：

a.第一半结晶、可水解降解的聚合物和第二半结晶、可水解降解的聚合物，其中所述第一聚合物和第二聚合物经过总剂量为30kGy至50kGy的电离辐射；所述聚合物包含稳定化的自由基；在与水性介质接触之后，所述生物相容性材料能够多相产生活性氧化物质；和

b.至少一种治疗活性剂。

6.一种生物相容性材料，其包含：

a.第一半结晶、可水解降解的聚合物和第二半结晶、可水解降解的聚合物，其中所述第一聚合物和第二聚合物经过剂量率低于50kGy的电离辐射并通过非辐射方法灭菌；所述聚合物包含稳定化的自由基；在与水性介质接触之后，所述生物相容性材料能够多相产生活性氧化物质；和

b.至少一种治疗活性剂。