CN106990518A - 一种血涂片自聚焦显微成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血涂片自聚焦显微成像方法，包括放置血涂片的载物台、驱动载物台运动的聚焦电机及载物台运动过程中拍摄血涂片图片的拍摄设备，包括：S1制备血涂片并将其置于载物台上，载物台位于聚焦起点；S2聚焦电机驱动载物台以第一预设速度朝向聚焦终点运动；S3在步骤S2载物台运动过程中，拍摄设备以预设频率拍摄血涂片的图片，并记录拍摄位置；S4采用聚焦评价函数对获取的图片进行处理，通过处理后的图片得到焦平面所在位置，进而得到血涂片中白细胞的清晰成像。其采用的聚焦评价函数对拍摄设备拍摄的图片进行处理，以此根据处理后的图片得到血涂片的成像，无需人工进行聚焦，节约人力物力。

Description

一种血涂片自聚焦显微成像方法

技术领域

本发明涉及成像技术领域，特别涉及一种血涂片自聚焦显微成像方法。

背景技术

血涂片检验是诊断许多疾病的一种重要方法，血涂片中白细胞的数量、形态、所占比例等方面的信息能够帮助医生进行疾病的诊断。因此，对白细胞进行准确、快速分类计数，是当今医疗界面临的直接技术难题，也是医院提高工作效率首要问题。

目前，医院一般通过血液分析仪法和显微镜法两种方法检验血液中白细胞的种类和数量。血液分析仪法的优点在于速度快、重复性好且准确度高，但是不能准确识别细胞形态及其病理学变化，一旦发现异常患者，需要进一步采用显微镜法进行检查。

虽然显微镜法能够分类准确，及时发现细胞形态及病理变化，但速度慢、效率低下、需要专业人员反复操作显微镜、不适合大量人群筛选，尤其是显微镜的聚焦过程，即便是专业人员，仍需要耗费大量的时间。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种血涂片自聚焦显微成像方法，有效解决现有技术中需要人工进行显微镜聚焦的技术问题。

一种血涂片自聚焦显微成像方法，包括放置血涂片的载物台、驱动载物台运动的聚焦电机及载物台运动过程中拍摄血涂片图片的拍摄设备，所述显微成像方法中包括：

S1制备血涂片并将其置于载物台上，所述载物台位于聚焦起点；

S2聚焦电机驱动载物台以第一预设速度朝向聚焦终点运动；

S3在步骤S2载物台运动过程中，拍摄设备以预设频率拍摄血涂片的图片，并记录拍摄位置；

S4采用聚焦评价函数对获取的图片进行处理，通过处理后的图片得到焦平面所在位置，进而得到血涂片中白细胞的清晰成像。

在本技术方案中，通过聚焦电机移动载物台连续拍摄图片，运用图片处理算法分析拍摄图片前后的清晰度找出最佳焦平面。相比主动式聚焦(通过增加辅助设备测量距离实现聚焦，常用的辅助设备包括激光、红外线、相位法、超声波等方式，该方法缺点是增加了额外成本、扩大了设备体积，不利于系统集成，且易受外界干扰，离焦方向的判别和探测范围的限制导致聚焦后图片不理想)，这里采用的被动式聚焦(通过相机连续拍摄图片，分析拍摄图片前后的清晰度获取系统聚焦状态)更加直接和高效，有利于系统集成、降低成本、提高了白细胞图片质量输出标准，无需人工进行聚焦，节约人力物力。

进一步优选地，在步骤S4中，所述聚焦评价函数采用下式改进的灰度方差法：

其中，H为图片中有效像素的高度值，W为图片中有效像素宽度，i(x,y)为图片中各像素点的灰度值。

在本技术方案中，采用改进的灰度值方差法作为聚焦评价函数，其计算速度快、运算时间短、灵敏度高、具有普适性。此外，采用该方法计算血涂片中的白细胞图片结果具有单峰性、无偏性、平滑性、区分度高等优点。与其他被动式聚焦结合粗聚焦评价函数、细聚焦评价函数的方式相比，具有明显的优越性、高效性，且降低了复杂度。

进一步优选地，在步骤S4中还包括采用下式减少相邻像素点相似性的步骤：

|i(x,y)-i(x+1,y)|≤TH

|i(x,y)-i(x,y+1)|≤TH

其中，i(x,y)是图像在x,y坐标对应像素点灰度值(一般以图片左上角为像素原点)，i(x+1,y)为i(x,y)在水平方向(对应x轴)上相邻点像素点的灰度值，i(x,y+1)为i(x,y)在垂直方向(对应y轴)上相邻点像素点的灰度值，TH为预设阈值。

在本技术方案中，通过该方法增加图片中像素的特征点，减少相邻像素点的相似性，进一步提高聚焦评价函数计算结果的区分度和清晰度。

进一步优选地，在步骤S3之后还包括：

S5根据预设规则将拍摄设备拍摄的图片裁剪为预设大小；

在步骤S4中，采用聚焦评价函数对裁剪后的图片进行处理，通过处理后的图片得到焦平面所在位置，进而得到血涂片中白细胞的清晰成像。

在本技术方案中，为了防止由于拍摄设备拍摄的图片过大导致图片处理过程中耗时长的技术问题，将图片裁剪为预设大小，且在该过程中有选择性的进行裁剪，增加图片的锐度和边缘特征从而大大提高了聚焦效果，此外加快了聚焦速度、节省了聚焦时间。

进一步优选地，在步骤S5，所述预设规则具体包括：

当拍摄设备拍摄的图片存在梯度大、对比度大且能提高图片聚焦质量的区域，以该区域为中心裁剪出预设大小；

当拍摄设备拍摄的图片不存在梯度大、对比度大且能提高图片聚焦质量的区域，以该图片的中心点为中心裁剪出预设大小。

进一步优选地，在步骤S4之后还包括：

S6根据步骤S4的图片处理结果，结合PID(Proportion IntegrationDifferentiation，比例积分微分)控制算法形成闭环控制系统，控制聚焦电机以第二预设速度运动，自动找到最佳焦平面所在位置。

在本技术方案中，结合PID控制算法形成闭环控制系统，减少聚焦评价函数的迭代运算次数，提高聚焦系统的稳定型，减少聚焦电机持续运行的时间，且提高最佳焦平面所在位置的精确度。

进一步优选地，在步骤S6中，所述PID控制算法具体为：

err(k)＝F_k-F_k-1

其中，k表示聚焦电机第k次运行，F_k表示第k次图片改进的灰度方差算法计算结果，F_k-1表示第k-1次图片改进的灰度方差算法计算结果，err(k)表示第k次与第k-1图片计算结果差值，U(k)表示聚焦电机在第k次聚焦后的运行距离，且U(k)的正负值表示聚焦电机运动方向。

进一步优选地，在步骤S6中，当所述PID控制算法中第k次与第k-1图片计算结果差值err(k)或聚焦电机在第k次聚焦后的运行距离U(k)满足预设条件，聚焦电机停止运行。

进一步优选地，在步骤S6中，当所述PID控制算法中第k次与第k-1图片计算结果差值err(k)<0.005或聚焦电机在第k次聚焦后的运行距离U(k)<0.5μm(微米)，聚焦电机停止运行。

由于聚焦过程大部分为模糊状态，故在本发明中，将整个自聚焦过程分为两个运行阶段，其中，在第一运行阶段中，通过聚焦评价函数对拍摄设备拍摄得到的图片进行处理快速找出焦平面所在区间，通常在5mm内，这一运行阶段相当于粗调；另外，在此过程中，为了减少聚焦评价函数运算时间(计算整张图片和计算图片中某个部分都能得出该图片的清晰度)，进一步对拍摄图片进行裁剪；在第二运行阶段(在第一运行阶段确定的5mm范围内进一步进行聚焦(细调焦))中，结合PID控制算法对聚焦电机进行反馈控制，以此完成显微镜的自动聚焦，提高显微镜的使用效率、节省专业人员反复操作显微镜时间，降低人力成本。另外，聚焦得到的血涂片中的白细胞图片清晰，以此能够清楚的观察到白细胞的形态以及病理学变化(能够清晰的观察到0.2-0.4微米的细小胞浆颗粒)，相比于其他被动式聚焦方法(很难观察到白细胞的胞浆颗粒特征，无法达到临床上白细胞分类的要求)，大大提高了白细胞图片质量输出标准，减少漏诊几率。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地解释。

图1为本发明中血涂片自聚焦显微成像方法一种实施方式流程示意图；

图2为如图1所示自聚焦显微成像方法一实例中得到的聚焦电机运动轨迹示意图；

图3为本发明中血涂片自聚焦显微成像方法另一种实施方式流程示意图；

图4为本发明中拍摄设备拍摄的图片不存在梯度大、对比度大区域时裁剪图片前后对比图；

图5为本发明中拍摄设备拍摄的图片存在梯度大、对比度大区域时裁剪图片前后对比图；

图6为如图3所示自聚焦显微成像方法一实例中拍摄到的14张图片中第2张、第8张以及第12张聚焦效果图；

图7为如图6所示自聚焦显微成像方法实例中拍摄到的14张图片聚焦评价函数计算后得到的方差对比图；

图8为本发明中血涂片自聚焦显微成像方法另一种实施方式流程示意图；

图9为如图8所示自聚焦显微成像方法一实例中拍摄到的14张图片中第4张、第7张、第8张以及第10张聚焦效果图；

图10为如图9所示自聚焦显微成像方法实例中PID反馈控制过程中得到的聚焦电机运动轨迹示意图；

图11为如图9所示自聚焦显微成像方法实例中拍摄到的14张图片中第1张、第2张、第4张、第5张、第13张以及第15张进一步聚焦后得到的效果图；

图12为如图8所示自聚焦显微成像方法实例中聚焦电机的完整运动轨迹示意图。

具体实施方式

如图1所示为本发明提供的血涂片自聚焦显微成像方法一种实施方式流程示意图，包括放置血涂片的载物台、驱动载物台运动的聚焦电机及载物台运动过程中拍摄血涂片图片的拍摄设备，显微成像方法中包括：S1制备血涂片并将其置于载物台上，载物台位于聚焦起点；S2聚焦电机驱动载物台以第一预设速度朝向聚焦终点运动；S3在步骤S2载物台运动过程中，拍摄设备以预设频率拍摄血涂片的图片，并记录拍摄位置；S4采用聚焦评价函数对获取的图片进行处理，通过处理后的图片得到焦平面所在位置，进而得到血涂片中白细胞的清晰成像。

在本实施方式中，首先将制作好的血涂片置于镜载物台上，完成显微镜预备操作；之后将载物台置于聚焦起点位置。此后载物台在聚焦电机的驱动下以第一预设速度运动聚焦至终点位置，且在这期间，拍摄设备(如相机等)每隔一定间距拍摄一张图片并记录拍摄图片位置。

在一实例中，聚焦起点与聚焦终点之间的距离为70mm(毫米)，且聚焦电机(最小步长精度0.2μm)的第一预设速度为20mm/s(毫米每秒)，拍摄设备每隔5mm拍摄一张图片，且使用600线增量编码器记录拍摄图片的拍摄位置信息。以此，当载物台从聚焦起点运动到聚焦终点时，拍摄设备一共进行了14次拍摄，获得血涂片在14个不同位置图片，且每张图片的像素为4080*3072，聚焦电机的运动轨迹如图2所示，其中，横坐标表示运动次数k(1≤k≤14)，纵坐标表示聚焦电机移动位置记录(这里描述的聚焦电机移动具体指聚焦电机驱动载物台移动，为了方便描述，将载物台移动/运动直接表述为聚焦电机移动/运动，下同)。在其他实例中，还可以将第一预设速度设定为其他的速度值，如15mm/s、25mm/s等；拍摄设备也可以采用其他频率进行拍摄，如，每隔8mm/10mm拍摄一次，根据实际情况进行设定，在此不做具体限定。

根据上述方法采集到图片后，采用聚焦评价函数对拍摄设备拍摄的图片进行处理，并根据处理后的图片得到聚焦平面。具体，在该过程中，采用改进的灰度方差法作为聚焦评价函数，如式(1)和式(2)，得到各图片的方差F_{mod_var}：

其中，H为图片中有效像素的高度值，W为图片中有效像素宽度，x和y为图片中像素点坐标，i(x,y)为图片中各像素点的灰度值。在该改进的方差法中，其在现有灰度方差值的基础上除以均值以缩小聚焦因子量纲，使结果更具有平滑性、强壮性、无偏性、单峰性。

此外，在步骤S4中还包括采用如式(3)所示的方法减少相邻像素点相似性的步骤：

其中，i(x+1,y)为i(x,y)在水平方向上相邻点像素点的灰度值，i(x,y+1)为i(x,y)在垂直方向上相邻点像素点的灰度值，TH为预设阈值。在处理过程中，若图片中某一点满足(3)式中的关系则舍弃该点，将有效像素点减少，增加图片中像素的特征点，减少相邻像素点的相似性，进一步提高聚焦评价函数计算结果的区分度和清晰度。在实际应用中，阈值TH可根据具体观察对象设定，在一实例中，将其设置为5。

对上述实施方式进行改进得到本实施方式，如图3所示，在本实施方式中，显微成像方法中包括：S1制备血涂片并将其置于载物台上，载物台位于聚焦起点；S2聚焦电机驱动载物台以第一预设速度朝向聚焦终点运动；S3在步骤S2载物台运动过程中，拍摄设备以预设频率拍摄血涂片的图片，并记录拍摄位置；S5根据预设规则将拍摄设备拍摄的图片裁剪为预设大小；S4采用聚焦评价函数对裁剪后的图片进行处理，通过处理后的图片得到焦平面所在位置，进而得到血涂片中白细胞的清晰成像。

为了防止由于拍摄设备拍摄的图片(如像素为4080*3072)过大导致图片处理过程中耗时长的技术问题，在本实施方式中，将图片裁剪为预设大小(如裁剪为255*255)，且在该过程中有选择性的进行裁剪。

在一实例中，假若在步骤S3中，拍摄得到14张图片，且像素为4080*3072，由于拍摄的原图片素大，处理的数据量相应变大，无疑影响聚焦评价函数的计算时间和系统的运行速度。以此，采用上述方法依次将14张图片裁剪为像素255*255的图片，并且有选择性的裁剪图片内容，增加图片的锐度和边缘特征以此提高聚焦效果。

具体，当拍摄设备拍摄的图片不存在梯度大、对比度大且能提高图片聚焦质量的区域，即拍摄该图片时，聚焦过程处于模糊状态，无法找到像素梯度大/对比度大的区域，则在裁剪过程中，以该图片的中心点为中心将图片裁剪为255*255大小的图片，如图4(a)和图4(b)所示，其中，图4(a)为裁剪前图片，图4(b)为裁剪后图片。更具体来说，在该实例中，图片的梯度大小通过各图片的梯度值进行比较而来，梯度大即为采用聚焦评价函数对图片进行得到的结果的清晰度高，如上述1-14张图片梯度计算的结果呈现抛物线，梯度值越大的图片清晰度越高；图片的对比度根据灰度图像的特征值计算得到(同一图片中不同区域的对比度比较结果，选取对比度值变化较大的区域)，采用的对比度算法中包括识别、裁剪等。

当拍摄设备拍摄的图片存在梯度大/对比度大且能提高图片聚焦质量的区域，则以该区域为中心裁剪出预设大小。如图5(a)所示，在该图片的区域A、区域B、区域C以及区域D中，出现了相对梯度较大、对比度较大的区域，即区域B，以此，在裁剪过程中，以区域B为中心将图片裁剪为255*255大小的图片，如图5(b)所示。更具体来说，上述对比度大的区域具体为图片转换为像素值(灰度值)后出现大的波动(能够区分图片内容)的区域，若图片中出现特征物比如(白细胞或者杂质)，图片中的灰度值就会出现明显变化；梯度大即为采用聚焦评价函数对图片进行得到的结果的清晰度。

基于此，将图片进行裁剪之后，采用聚焦评价函数对裁剪后的图片进行处理，在图片处理过程中，将式(1)所示改进的灰度方差法作为聚焦评价函数，之后采用式(3)所示的方法减少相邻像素点相似性。具体，拍摄设备拍摄到的14张图片中，第2张、第8张以及第12张在处理后(包括剪裁和图片处理)得到的白细胞聚焦效果图如图6(a)、图6(b)以及图6(c)所示。各图片中经过聚焦评价函数得到的方差如图7所示，其中，纵坐标表示方差，横坐标表示第k(1≤k≤14)次拍摄的图片，从图中可以看出，对于拍摄到的14张图片，采用聚焦评价函数进行计算后的结果为第8张图片对应焦点最佳区域，即距离聚焦起点35mm左右(聚焦起点与聚焦终点之间的距离为70mm，每隔5mm拍摄一张，共14张)，可见，使用该聚焦评价函数计算的图片结果具有单峰性、区分度高、聚焦图片质量高的特点，根据峰值对应的图片所在的位置信息确定焦平面的位置。

此外，如表1所示为裁剪前后图片处理时间对比表(自聚焦评价函数的运算时间)，从表格中可知，相比于像素为4080*3072图片的处理速度，像素为255*255图片的处理速度要快20倍，如，同时处理10张图片时，像素为4080*3072图片的总处理时间为14.28s，像素为255*255图片的总处理时间为0.69s，显然处理时间大大减少了，以此大大提高了自聚焦的速度。另外，对于单张图片的处理速度来说，处理一张裁剪后的图片(像素为255*255图片)只需0.07s，速度高效，大大提高了系统的稳定性。

表1：裁剪前后图片处理时间对比表

对上述实施方式进行改进得到本实施方式，如图8所示，在本实施方式中，S1制备血涂片并将其置于载物台上，载物台位于聚焦起点；S2聚焦电机驱动载物台以第一预设速度朝向聚焦终点运动；S3在步骤S2载物台运动过程中，拍摄设备以预设频率拍摄血涂片的图片，并记录拍摄位置；S5根据预设规则将拍摄设备拍摄的图片裁剪为预设大小；S4采用聚焦评价函数对裁剪后的图片进行处理，通过处理后的图片得到焦平面所在位置；S6根据步骤S4的图片处理结果，结合PID控制算法形成闭环控制系统，控制聚焦电机以第二预设速度运动，自动找到最佳焦平面所在位置。

为了尽快找到最佳焦平面，节省聚焦时间，在本实施方式中，结合聚焦评价函数的计算结果和PID控制算法中的K_p、K_i以及K_d形成闭环控制系统，减少聚焦评价函数的迭代运算次数，提高聚焦系统的稳定型，减少聚焦电机持续运行的时间，且提高最佳焦平面所在位置的精确度。具体该PID控制算法如式(4)和式(5)所示：

err(k)＝F_k-F_k-1 (5)

其中，k表示聚焦电机第k次运行，F_k表示第k次图片计算结果，F_k-1表示第k-1次图片计算结果，err(k)表示第k次与第k-1图片计算结果差值，U(k)表示聚焦电机在第k次聚焦后的运行距离，且U(k)的正负值表示聚焦电机运动方向；K_p、K_i、K_d为实验得出的初值，需要通过反复聚焦试验效果得出，以此每一个显微镜模型的得出的K_p、K_i、K_d初值都不一样，故在此对K_p、K_i、K_d不做具体限定，根据实际情况而定。

另外，在本实施方式中，PID反馈系统对聚焦电机运动的控制与聚焦电机的停止密切关联，若聚焦电机该过程中的运动和聚焦电机停止运动判断不准确，则会导致最佳焦平面位置不精确，图片不够清晰，聚焦电机聚焦时间过长。以此，在本实施方式中，将聚焦电机停止运动的条件设定为：err(k)<0.005或U(k)<0.5μm，若满足其中一种条件即自动聚焦成功，聚焦电机停止运动。在一实例中，PID反馈系统对聚焦电机运动进行控制后，如图5(b)所示的裁剪后的图片如图5(c)所示。

在一实例中，聚焦起点与聚焦终点之间的距离为70mm，且聚焦电机以20mm/s的速度驱动载物台从聚焦起点运动到聚焦终点，且在此过程中，拍摄设备每隔5mm拍摄一张图片(像素为4080*3072)，使用600线增量编码器记录拍摄图片的拍摄位置信息，得到如图2所示的聚焦电机运动轨迹(第一运行阶段)。将采集到的图片依次裁剪为255*255大小的图片并采用聚焦评价函数对其进行计算(经过裁剪后14张图片中，第4张、第7张、第8张以及第10张在处理后得到的白细胞聚焦效果图如图9(a)、图9(b)、图9(c)以及图9(d)所示)之后，结合PID控制算法对聚焦电机进行反馈，控制聚焦电机以10mm/s的速度快速找到最佳焦平面，具体，在PID控制算法中，K_p＝5mm，K_i＝0.05mm，K_d＝5mm，得到如图10所示的聚焦电机运动轨迹(第二运行阶段)，其中，横坐标表示运动次数k(1≤k≤17)，纵坐标表示聚焦电机移动位置记录，聚焦电机在运行了17次后停止运行，得到距离起始位置37.5mm处的最佳焦平面(经过聚焦评价函数的处理过后的14张图片中，第1张、第5张以及第15张进一步聚焦后得到的效果图如图11(a)、图11(b)以及图11(c)，第2张、第4张以及第13张进一步聚焦后得到的效果图如图11(d)、图11(e)以及图11(f))，得到清晰的白细胞图片，完成自聚焦过程。

基于以上描述可知，在本实施方式中，为了寻找最佳焦平面的位置，聚焦电机分为两个阶段运行进行，其中，在第一运行阶段中：聚焦电机以20mm/s的速度运动并每隔5mm拍照记录，找出焦平面所在位置，减少第二运行阶段运行时间；在第二运行阶段中：聚焦电机在PID控制算法的控制下以10mm/s的速度快速找出最佳焦平面，且根据聚焦电机运动条件(err(k)<0.005或U(k)<0.5μm)自动停止运行，聚焦电机完整的运动轨迹如图12所示。

Claims (9)

1.一种血涂片自聚焦显微成像方法，其特征在于，包括放置血涂片的载物台、驱动载物台运动的聚焦电机及载物台运动过程中拍摄血涂片图片的拍摄设备，所述显微成像方法中包括：

S1制备血涂片并将其置于载物台上，所述载物台位于聚焦起点；

S2聚焦电机驱动载物台以第一预设速度朝向聚焦终点运动；

S3在步骤S2载物台运动过程中，拍摄设备以预设频率拍摄血涂片的图片，并记录拍摄位置；

S4采用聚焦评价函数对获取的图片进行处理，通过处理后的图片得到焦平面所在位置，进而得到血涂片中白细胞的清晰成像。

2.如权利要求1所述的显微成像方法，其特征在于，在步骤S4中，所述聚焦评价函数采用下式改进的灰度方差法：

$F_{\mathrm{mod}\_\mathrm{var}}=\frac{1}{H\&CenterDot;W\&CenterDot;u}\underset{x}{\&Sigma;}\underset{y}{\&Sigma;}{\left(i\right(x,y)-u)}^2$

$u=\frac{1}{H\&CenterDot;W}\underset{x}{\&Sigma;}\underset{y}{\&Sigma;}i(x,y)$

其中，H为图片中有效像素的高度值，W为图片中有效像素宽度，i(x,y)为图片中各像素点的灰度值。

3.如权利要求2所述的显微成像方法，其特征在于，在步骤S4中还包括采用下式减少相邻像素点相似性的步骤：

|i(x,y)-i(x+1,y)|≤TH

|i(x,y)-i(x,y+1)|≤TH

其中，i(x+1,y)为i(x,y)在水平方向上相邻点像素点的灰度值，x和y为图片中像素点坐标，i(x,y+1)为i(x,y)在垂直方向上相邻点像素点的灰度值，TH为预设阈值。

4.如权利要求1-3任意一项所述的显微成像方法，其特征在于，在步骤S3之后还包括：

S5根据预设规则将拍摄设备拍摄的图片裁剪为预设大小；

在步骤S4中，采用聚焦评价函数对裁剪后的图片进行处理，通过处理后的图片得到焦平面所在位置，进而得到血涂片中白细胞的清晰成像。

5.如权利要求4所述的显微成像方法，其特征在于，在步骤S5，所述预设规则具体包括：

当拍摄设备拍摄的图片存在梯度大且对比度大的区域，以该区域为中心裁剪出预设大小，其中，梯度大小由不同图片的梯度值比较得到，对比度大小由同一图片不同区域的对比度值比较得到；

当拍摄设备拍摄的图片不存在梯度大且对比度大的区域，以该图片的中心点为中心裁剪出预设大小。

6.如权利要求1或2或3或5所述的显微成像方法，其特征在于，在步骤S4之后还包括：

S6根据步骤S4的图片处理结果，结合PID控制算法形成闭环控制系统，控制聚焦电机以第二预设速度运动，自动找到最佳焦平面所在位置。

7.如权利要求6所述的显微成像方法，其特征在于，在步骤S6中，所述PID控制算法具体为：

$U\left(k\right)=K_p\left(err\right(k)+K_i\underset{k}{\&Sigma;}err(k)+K_d(err\left(k\right)-err\left(k-1\right)\left)\right)$

err(k)＝F_k-F_k-1

其中，k表示聚焦电机第k次运行，F_k表示第k次图片改进的灰度方差算法计算结果，F_k-1表示第k-1图片改进的灰度方差算法计算结果，err(k)表示第k次与第k-1图片计算结果差值，U(k)表示聚焦电机在第k次聚焦后的运行距离，且U(k)的正负值表示聚焦电机运动方向。

8.如权利要求7所述的显微成像方法，其特征在于，在步骤S6中，当所述PID控制算法中第k次与第k-1图片计算结果差值err(k)或聚焦电机在第k次聚焦后的运行距离U(k)满足预设条件，聚焦电机停止运行。

9.如权利要求8所述的显微成像方法，其特征在于，在步骤S6中，当所述PID控制算法中第k次与第k-1图片计算结果差值err(k)<0.005或聚焦电机在第k次聚焦后的运行距离U(k)<0.5μm，聚焦电机停止运行。