CN106974913A - 用于治疗或预防疟疾的疟原虫表面阴离子通道抑制剂 - Google Patents

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桑贾伊·A·德塞
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US Department of Health and Human Services
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Abstract

本发明提供了治疗或预防疟疾的方法，其包括，给动物施用有效量的式(I)的化合物：Q‑Y‑R1‑R2(I)，其中Q、Y、R1和R2如本文中所述。也提供了抑制动物中的寄生虫的疟原虫表面阴离子通道的方法。本发明也提供了药物组合物，其包含与任意一种或多种由式II、V和VI代表的化合物相组合的由式(I)表示的化合物。也提供了所述药物组合物在包括人类的动物中用于治疗或预防疟疾或用于抑制疟原虫表面阴离子通道的用途。本发明也提供了clag3氨基酸序列和有关的核酸、载体、宿主细胞、细胞群体、抗体和药物组合物。

Description

用于治疗或预防疟疾的疟原虫表面阴离子通道抑制剂
本申请是申请日为2012年4月11日、发明名称为“用于治疗或预防疟疾的疟原虫表面阴离子通道抑制剂”的中国专利申请No.201280028801.8的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本专利申请要求2011年4月12日提交的美国临时专利申请号61/474,583的权益，其通过引用整体并入本文。
通过引用并入电子提交的材料
在本文中通过引用整体并入计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，其与本文同时提交，并如下识别：一个名称为“709937ST25.txt”的84,990字节ASCII(文本)文件，日期为2012年3月6日。
背景技术
疟疾，是世界上最重要的传染病之一，是通过蚊子传播的，并且由4种疟原虫(Plasmodium)寄生虫(恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(P.Malariae))引起。症状包括发烧、寒战、头疼、肌肉疼、疲劳、恶心和呕吐、腹泻、贫血和黄疸。还可能发生抽搐、昏迷、严重贫血和肾衰竭。其保持为全球主要的死亡原因，特别是在5岁以下的非洲儿童中的主要死亡原因。尽管在流行地区在许多年内的重复感染导致部分的免疫性，但是这些成年人仍遭受显著的发病率和劳动力的丧失。在非洲每年由于疟疾导致的损失估计为120亿美元。
目前对于疟疾没有可用的有效疫苗。因此，治疗主要依赖于抗疟药，如氯喹。因为一些疟疾寄生虫对于每种可用的抗疟药具有获得性的耐受性，所以需要发现和研发新的抗疟药。
发明内容
本发明提供了治疗或预防疟疾的方法，其包括：给动物施用有效量的式I的化合物。也提供了抑制动物中的寄生虫的疟原虫表面阴离子通道的方法。本发明也提供了药物组合物，其包含与一种或多种抗疟疾化合物相组合的由式I表示的化合物，例如，由式II、V和VI表示的那些。也提供了所述药物组合物用于在动物(包括人类)中治疗或预防疟疾或用于抑制疟原虫表面阴离子通道的用途。预见到，本发明的化合物和/或药物组合物会通过任意数目的机制抑制疟原虫表面阴离子通道和/或治疗或预防疟疾，例如，通过抑制寄生虫clag3基因家族的一个或多个成员。本发明的化合物的实施方案具有一个或多个优点，包括、但不限于：对所述离子通道的高亲和力，对所述离子通道的高特异性，没有细胞毒性或低细胞毒性，不同于现有抗疟药的化学结构，和药物样特征。
本发明也提供了clag3氨基酸序列和有关的核酸、载体、宿主细胞、细胞群体、抗体和药物组合物。本发明也提供了治疗或预防动物中的疟疾的方法和在动物中刺激针对寄生虫的疟原虫表面阴离子通道的免疫应答的方法，所述方法包括：给所述动物施用有效量的本发明的clag3氨基酸序列和有关的核酸、载体、宿主细胞、细胞群体、抗体和药物组合物。
附图说明
图1的图显示了使用指定浓度的ISPA-28(μM)时山梨醇诱导的等位基因交换克隆HB33rec随时间(分钟)的渗透性裂解动力学(裂解百分比)，所述ISPA-28是根据本发明的一个实施方案的化合物(参见下面段落[0033]中的式A)。
图2的图显示了平均值±均值标准差(S.E.M)。HB33rec的ISPA-28剂量(μM)-应答(标准化的P)(圆圈)。该剂量应答是HB3和Dd2的剂量应答(分别是顶部和底部的实线)之间的中间值。
图3A的图显示了在PLM培养基中的Dd2(空心三角形)或HB3(实心圆圈)随ISPA-28浓度(μM)而变化的存活百分比。实线代表与双因素(two-component)指数式衰减的最佳拟合。
图3B的图显示了3μM ISPA-28对指定的亲本系和后代克隆的寄生虫生长抑制百分比的平均值±均值标准差。
图4A的图显示了下述情况下的PSAC抑制的ISPA-28剂量应答的平均值±均值标准差：在7C20系的运输选择之前(B)和之后(C)，随后进行PLM生长选择(A)。
图4B的图显示了下述情况下的2个clag3等位基因clag3.1和clag3.2的表达比：在7C20系的(运输)选择之前(未选择)和之后，随后进行PLM生长选择(生长)。条代表2-4个单独试验各自的重复的平均值±均值标准差。
图5A的图显示了Dd2-PLM28系中的PSAC抑制的ISPA-28剂量应答(黑色圆圈，最多5次测量各自的平均值±均值标准差)。实线反映了7C20中的clag3.1和clag3.2表达的剂量应答(分别是顶部和底部线)。
图5B的图显示了使用ISPA-28(PLM28-rev)，在clag3.1的基于运输的选择之前和之后，在对数标度上呈现的定量Dd2-PLM28中的clag3和嵌合基因的相对表达的比率。
具体实施方式
在恶性虐原虫在人红细胞(RBC)中大约48小时的周期过程中，恶性虐原虫必须增加红细胞(RBC’s)对宽范围溶质的渗透性。电生理学研究鉴定疟原虫表面阴离子通道(PSAC)是这些变化的分子机制。PSAC的功能特征不同于那些已知的人离子通道。这些特征包括非典型的门控(gating)、独特的药理学、和无比的选择性特性。罕见的特征是，尽管所述通道对阴离子和体积大的营养物的宽泛渗透性，但是PSAC具有相对于Cl-大于100,000-倍排出Na+的能力。在其它宽泛选择性通道中尚未报道这种单一小溶质的外排水平；这对于寄生虫存活是重要的，因为更高的Na+渗透性将在高Na+血清中产生感染的RBCs的渗透性溶解。
PSAC在寄生虫营养物获取中起重要作用。通过PSAC，糖、氨基酸、嘌呤、维生素、和磷脂生物合成的前体显著增加地被摄入到感染的RBCs中。这些溶质中的多种在未感染的RBCs中具有可以忽略的渗透性，并且必须由外界提供以在体外维持寄生虫生长。如通过感染了啮齿动物、鸟类、和灵长动物疟疾寄生虫的红细胞研究所确定的那样，PSAC在不同疟原虫物种中是保守的。通道的门控、电压依赖性、选择性、和药理学均是保守的，这表明PSAC是高度约束的(constrained)完整膜蛋白。其在红细胞膜上的表面位置赋予相对于埋藏在被感染的RBC内的寄生虫靶标的概念上的优点。PSAC在被感染的RBCs上的暴露位置迫使直接接近血清中的拮抗剂，并且通过药物排出排斥抗性。相反，在寄生虫区室内起作用的药物必须穿过至少三层膜障碍才能到达其靶标；针对氯喹和甲氟喹(mefloquine)的临床耐药性似乎与由其作用位点的外排相关。几乎所有可用的PSAC拮抗剂在体外以适当高于通道抑制所需要的那些浓度的浓度抑制寄生虫生长。
通过clag3疟原虫基因家族的成员，可以确定PSAC-抑制剂相互作用。Clag3.1(也被称作RhopH1(3.1)和PFC0120w)和clag3.2(也被称作RhopH1(3.2)和PFC0110w)是恶性疟原虫和间日疟原虫中的clag多基因家族保守成员。Clag3.1和clag3.2位于恶性疟原虫染色体3上。clag 3.1基因序列由Genbank登记号124504714和XM_001351064(SEQ ID NO:1)表示。SEQ ID NO:1阐述了不含非翻译区的clag3.1基因的mRNA序列。clag3.1基因的蛋白产物(被称作细胞粘连相关的无性蛋白3.1)的序列由Genbank登记号XP_001351100和CAB10572.2(SEQ ID NO:2)表示。clag3.2基因序列由Genbank登记号124504712和XM_001351063(SEQ ID NO:3)表示。SEQ ID NO:3阐述了不含非翻译区的clag3.2基因的mRNA序列。clag 3.2基因的蛋白产物(被称作细胞粘连相关的无性蛋白3.2)的序列由Genbank登记号XP_001351099和124504713(SEQ ID NO:4)表示。基于可得到的证据，clag3.1和clag3.2编码寄生虫PSAC。
本发明也提供了一种嵌合的clag3.1/clag3.2基因。SEQ ID NO:79阐述了不含非翻译区的嵌合的clag3.1/clag3.2基因的mRNA序列，SEQ ID NO:78阐述了嵌合的clag3.1/clag3.2基因的蛋白产物。SEQ ID NO:78的氨基酸残基1-1011对应于clag3.1蛋白SEQ IDNO:2的氨基酸残基1-1011。SEQ ID NO:78的氨基酸残基1012-1417对应于clag3.2蛋白SEQID NO:4的氨基酸残基1014-1416。基于可得到的证据，嵌合的clag3.1/clag3.2基因编码寄生虫PSAC。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防动物中的疟疾的方法，所述方法包括：给所述动物、优选人施用有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Q-Y-R1-R2 (I)，
其中：
Q选自：与芳基稠合的二氧代杂环、与杂环基团连接的杂环酰氨基、烷基、与杂环酰氨基稠合的杂环基团、芳氨基羰基、氨基、杂环酰氨基和杂环氨基，除了氨基以外，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、芳基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；
Y是键、S、SO2或酰氨基；
R1是选自下述的二价基团：具有至少一个氮原子的杂环、哌啶基、哌嗪基、芳基、具有至少一个与烷基氨基连接的氮原子的杂环、苯并稠合杂环基、与亚氨基四氢嘧啶(pyrimidino)基团稠合的杂环基、和与杂环酰氨基稠合的杂环基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；
R2选自：芳基烯基、杂环基羰基氨基、杂环基烷基氨基、四氢喹啉基烯基、四氢异喹啉基烷基、吲哚基烯基、二氢吲哚基烯基、芳基、芳氧基烷基、芳基烷基、二唑基和喹啉基烯基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基。
本发明的另一个实施方案提供了一种抑制动物中的寄生虫的疟原虫表面阴离子通道的方法，所述方法包括：给所述动物、优选人施用有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Q-Y-R1-R2 (I)，
其中Q、Y、R1和R2如上面所定义。
本发明的另一个实施方案提供了用于治疗或预防动物、优选人的疟疾的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Q-Y-R1-R2 (I)，
其中Q、Y、R1和R2如上面所定义。
本发明的另一个实施方案提供了用于抑制动物、优选人中的寄生虫的疟原虫表面阴离子通道的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Q-Y-R1-R2 (I)，
其中Q、Y、R1和R2如上面所定义。
本发明的另一个实施方案提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防动物、优选人的疟疾：
Q-Y-R1-R2 (I)，
其中Q、Y、R1和R2如上面所定义。
本发明的另一个实施方案提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于抑制动物、优选人中的寄生虫的疟原虫表面阴离子通道：
Q-Y-R1-R2 (I)，
其中Q、Y、R1和R2如上面所定义。
根据本发明的一个实施方案，式I中的Q选自：二氧代四氢喹喔啉基、哒嗪基杂环基、烷基、杂环基哒嗪基和芳氨基羰基烷基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基。
根据本发明的一个实施方案，式I中的R1选自：哌啶基、哌嗪基、哌啶基烷基氨基、苯并噻唑基、与亚氨基四氢嘧啶基团稠合的噻唑基和与哒酮稠合的噻唑基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基。
根据本发明的一个实施方案，式I中的R2选自：烷基芳基烯基、噻吩基羰基氨基、四氢喹啉基烯基、四氢异喹啉基烷基、烷氧基芳基、芳基、芳氧基烷基和芳基烷基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基。
根据本发明的一个实施方案，式I中的Y是SO2。例如，式I中的Q选自(在这里和在本申请的别处用波浪线表示连接点)：
甲基和异丁基。根据本发明的一个实施方案，式I中的R1选自：
根据本发明的一个实施方案，R2选自：
根据上述实施方案中的任一个，式I的化合物是：
根据本发明的一个实施方案，式I中的Y是S。例如，根据本发明的一个实施方案，式I中的Q选自：
根据本发明的一个实施方案，式I中的R1选自： 根据本发明的一个实施方案，式I中的R2选自：
根据本发明的一个实施方案，式I的化合物是：
根据本发明的一个实施方案，式I的Y是键。例如，在本发明的一个实施方案中，式I的化合物是:
根据本发明的一个实施方案，式(I)的Y是酰氨基。根据本发明的一个实施方案，Q是杂环酰氨基，R1是具有至少一个氮原子的杂环，且R2是二唑基。例如，在本发明的一个实施方案中，式I的化合物是：
ISPA-28。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物抑制恶性疟原虫Dd2的生长。
本发明的另一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含：
i)式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Q-Y-R1-R2 (I)，
其中：
Q选自：与芳基稠合的二氧代杂环、与杂环基团连接的杂环酰氨基、烷基、与杂环酰氨基稠合的杂环基团、芳氨基羰基、氨基、杂环酰氨基和杂环氨基，除了氨基以外，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、芳基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；
Y是键、S、SO2或酰氨基；
R1是选自下述的二价基团：具有至少一个氮原子的杂环、哌啶基、哌嗪基、芳基、具有至少一个与烷基氨基连接的氮原子的杂环、苯并稠合杂环基、与亚氨基四氢嘧啶基团稠合的杂环基、和与杂环酰氨基稠合的杂环基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；
R2选自：芳基烯基、杂环基羰基氨基、杂环基烷基氨基、四氢喹啉基烯基、四氢异喹啉基烷基、吲哚基烯基、二氢吲哚基烯基、芳基、芳氧基烷基、芳基烷基、二唑基和喹啉基烯基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；
和
ii)至少一种其它抗疟疾化合物。
所述抗疟疾化合物可以是任意合适的抗疟疾化合物，且可以通过任意机制起作用，且可以例如在任意位点抑制PSAC。在本发明的一个实施方案中，所述抗疟疾化合物是青蒿素、甲氟喹、氯喹或其衍生物。
在本发明的一个实施方案中，所述至少一种其它抗疟疾化合物是一种或多种选自下述的化合物：
a)式II的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R100是氢或烷基，且R200是芳基烷基，其任选地在所述芳基上被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；或R200是式(III)的基团：
其中n＝0-6；
或者R100和R200与它们所连接的N一起形成式IV的杂环：
其中X是N或CH；且
Y1是芳基、烷基芳基、二烷基芳基、芳基烷基、烷氧基芳基或杂环基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；且
R3-R10是氢或烷基；
(b)式V的化合物或其药学上可接受的盐：
其中
Z是具有一个或多个4-7元环的基团，其中至少一个所述环具有至少一个选自O、S和N的杂原子；且当存在两个或更多个4-7元环时，所述环可以是稠合的或未稠合的；其中所述环任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；
Ra是氢、烷基或烷氧基；
L是键、烷基、烷氧基、(CH2)r或(CH2O)s，其中r和s独立地是1-6；
Q1是杂环基团、芳基或杂环基芳基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；且
当L是烷基或烷氧基时，Q1不存在；
和
(c)式VI的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R11和R12独立地是氢、烷基、环烷基或芳基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；
R13-R15独立地选自：烷基、卤素、烷氧基、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。
在这点上，在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含与一种或多种在美国专利申请公开号2011/0144086(它是2009年7月15日提交的公开为WO 2010/011537的PCT/US09/50637的美国国家阶段申请)(它们各自通过引用并入本文)中公开的化合物相组合的至少一种式I的化合物。
根据本发明的一个实施方案，所述药物组合物包含式I的化合物和以下的任意一种或多种：
本发明的另一个实施方案提供了一种治疗或预防动物的疟疾的方法，所述方法包括：给所述动物施用有效量的式I的化合物和至少一种其它抗疟疾化合物。在一个实施方案中，所述至少一种其它抗疟疾化合物是一种或多种选自以下的化合物：式II的化合物、式V的化合物和式VI的化合物。
本发明的另一个实施方案提供了一种抑制动物中的寄生虫的疟原虫表面阴离子通道的方法，所述方法包括：给所述动物施用有效量的式I的化合物和一种或多种选自以下的化合物：式II的化合物、式V的化合物和式VI的化合物。
现在参考本文一般所用的术语，术语“烷基”是指直链或支链的烷基结构部分，例如，其包含1-12个碳原子，优选1-8个碳原子，更优选1-6个碳原子。所述结构部分的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、辛基、十二烷基等。
术语“芳基”是指未取代的或取代的芳香族碳环结构部分，如本领域常规所理解那样，并且包括单环或多环芳香族化合物，诸如例如，苯基、联苯基、萘基、蒽基、芘基等。例如，芳基结构部分通常包含6-30个碳原子，优选地6-18个碳原子，更优选地6-14个碳原子，最优选地6-10个碳原子。应该理解，术语芳基包括这样的碳环结构部分，所述碳环结构部分是平面的，且包括4n+2π电子，依据Hückel’s法则，其中n＝1、2或3。
术语“杂环”意指具有选自氮、硫、和/或氧的一个或多个杂原子的环形结构部分。优选地，杂环是5元或6元单环，并且包含选自氮、氧、和/或硫的一个、两个或三个杂原子。所述杂环的实例为吡咯啉基、吡喃基、哌啶基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、和吗啉基。
术语“烷氧基”包括连接在醚氧上的直链或支链的烷基基团。所述烷基与本文所述相同。所述取代基的实例包括甲氧基、乙氧基、叔-丁氧基等。
术语“卤素”用在本文中意指选自VIIA族的取代基，诸如例如，氟、溴、氯和碘。
为了本发明的目的，术语“稠合的”包括这样的多环化合物，其中一个环包含与一个或多个其它环共同的一个或多个原子，优选一个、两个或三个原子。
当指示了结构中原子数目的范围时(例如，C1-12、C1-8、C1-6或C1-4烷基、烷基氨基等)，特别考虑落入所指定范围内的任何子范围或单个碳原子数目也是可以使用的。因此，例如，关于本文所述的任何化学基团(例如，烷基、烷基氨基等)提及1-8个碳原子(例如，C1-C8)、1-6个碳原子(例如，C1-C6)、1-4个碳原子(例如，C1-C4)、1-3个碳原子(例如，C1-C3)或2-8个碳原子(例如，C2-C8)的范围，包括且特别描述适当的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12个碳原子，及其任一子范围(例如，适当地，1-2个碳原子、1-3个碳原子、1-4个碳原子、1-5个碳原子、1-6个碳原子、1-7个碳原子、1-8个碳原子、1-9个碳原子、1-10个碳原子、1-11个碳原子、1-12个碳原子、2-3个碳原子、2-4个碳原子、2-5个碳原子、2-6个碳原子、2-7个碳原子、2-8个碳原子、2-9个碳原子、2-10个碳原子、2-11个碳原子、2-12个碳原子、3-4个碳原子、3-5个碳原子、3-6个碳原子、3-7个碳原子、3-8个碳原子、3-9个碳原子、3-10个碳原子、3-11个碳原子、3-12个碳原子、4-5个碳原子、4-6个碳原子、4-7个碳原子、4-8个碳原子、4-9个碳原子、4-10个碳原子、4-11个碳原子和/或4-12个碳原子)。
根据本发明的一个实施方案，式II中的R3是氢。根据上述实施方案，式II中的R4-R7是氢。在一个实施例中，式II中的R100是氢，且R200是式III的基团，其中n＝1-6，优选地n＝2-4。
根据本发明的一个实施方案，其中R100和R200与它们所连接的N一起形成式IV的杂环。例如，式IV中的X是N。根据本发明，在式IV中，Y1是任选地被一个或多个取代基取代的芳基，所述取代基选自：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基、烷氧基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。例如，在式IV中，Y1是任选地被一个或多个取代基取代的苯基，所述取代基选自：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基、烷氧基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基，具体地，Y1是苯基或被一个或多个取代基取代的苯基，所述取代基选自：甲基、氯代、氟代和甲氧基。
根据上述实施方案中的任一个，所述式II的化合物是：
根据本发明的另一个实施方案，式IV中的X是CH。在一个特定实施方案中，Y1是芳基烷基或杂环，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。示例性地，Y1是苄基或哌啶基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。式II的具体化合物的例子是：
在本发明的另一个实施方案中，式II中的R100是氢，且R200是芳基烷基，其任选地在所述芳基上被取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基和甲酰基。作为一个例子，R200是芳基烷基，例如，苯基烷基诸如苯基丁基。这样的式II的化合物的一个具体例子是：
根据本发明的一个实施方案，式III的化合物的一个具体例子是：
根据本发明的另一个实施方案，在式V的化合物中，L是键或(CH2O)s，且Q1是杂环基团、芳基或杂环基芳基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。
根据一个实施方案，其中Z是具有一个或多个4-7元环的基团，其中至少一个所述环具有至少一个选自O、S和N的杂原子；且当存在两个或更多个4-7元环时，它们可以是稠合的或未稠合的；其中所述环任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。
在上面的实施方案中，Z是具有一个或两个4-7元环的基团，其中至少一个所述环具有至少一个选自O、S和N的杂原子；且当存在两个4-7元环时，它们可以是稠合的或未稠合的；其中所述环任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：卤素、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。
在式V的一个具体实施方案中，Q1是任选地被烷氧基取代的芳基，或Q1是饱和的或不饱和的杂环基团。例如，Q1是芳基诸如苯基或萘基。
式IV的化合物的例子是：
根据本发明的一个实施方案，在式V的化合物中，Q1是杂芳族基团，例如，吡啶基。这样的化合物的一个例子是：
根据本发明的另一个实施方案，在式V的化合物中，L是烷基，且Q1不存在。这样的化合物的例子是：
根据本发明的另一个实施方案，在式VI的化合物中，R13是烷基或烷氧基，且R14和R15是氢。在一个特定实施方案中，R13是甲基或甲氧基。
在式VI的化合物的以上实施方案中，具体地，R11是烷基，且R12是烷基、环烷基或芳基，其中所述芳基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。在一个特定实施方案中，R12是烷基、环烷基或芳基，其中所述芳基任选地被一个或多个烷基和/或烷氧基取代基取代。
式VI的化合物的例子是：
根据本发明的一个实施方案，在式VI的化合物中，R11是氢，且R12是环烷基或芳基，其任选地被一个或多个烷基和/或烷氧基取代基取代。示例性的式VI的化合物是：
根据本发明，将有效量的式I的化合物与任意一种或多种式II、V和VI的化合物组合施用，例如，施用下述组合：式I和II的化合物，式I和V的化合物，式I和VI的化合物，式I、II和V的化合物，式I、II和VI的化合物，式I、V和VI的化合物，或式I、II、V和VI的化合物，或其药学上可接受的盐。预见到，当采用2种或更多种化合物的组合时，这样的组合会提供协同作用，即增强的寄生虫杀死。所述杀死程度大于单一杀死的总和。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员已知的适当方法制备，或者通过商购来源获得，诸如从加州圣地亚哥的ChemDiv公司(ChemDiv Inc.,San Diego,CA)或英国HighPeak的Peakdale分子有限公司(Peakdale Molecular Limited,High Peak,England)获得。还参见WO 00/27851和美国专利号6,602,865和2,895,956。
本发明的另一个实施方案提供了包含SEQ ID NO:62、64、66、72、74或76、由其组成或基本上由其组成的clag3氨基酸序列，前提条件是，所述氨基酸序列不是SEQ ID NO:2、4或78。SEQ ID NO:62、64、66、74和76对应于3D7寄生虫系的clag3.1蛋白的氨基酸残基1063-1208、1232-1417、25-332、488-907和925-1044。SEQ ID NO:72对应于Dd2寄生虫系的clag3.1蛋白的氨基酸残基1063-1244。SEQ ID NO:62、64、66、72、74和76分别由核苷酸序列SEQ ID NO:63、65、67、73、75和77编码。
在这点上，本发明的一个实施方案提供了包含SEQ ID NO:62、64、66、72、74或76、由其组成或基本上由其组成的clag3氨基酸序列，前提条件是，所述氨基酸序列不是SEQ IDNO:2、4或78。
本发明的另一个实施方案提供了一种核酸，其包含编码本发明的氨基酸序列的核苷酸序列，前提条件是，所述核苷酸序列不是SEQ ID NO:1、3或79。例如，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:63、65、67、73、75或77、由其组成或基本上由其组成。
本发明的其它实施方案提供了一种包含本发明的核酸的重组表达载体，一种分离的包含本发明的重组表达载体的宿主细胞，包含本发明的宿主细胞的细胞群体，和特异性地结合本发明的氨基酸序列的抗体或其抗原结合部分。可以分离或纯化本发明的氨基酸序列、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体和/或抗体或其抗原结合部分。
本发明的另一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含：本发明的氨基酸序列、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体和/或抗体或其抗原结合部分；和药学上可接受的载体。
本发明的另一个实施方案提供了一种治疗或预防动物的疟疾的方法，所述方法包括：给所述动物施用有效量的本发明的氨基酸序列、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分和/或药物组合物。
本发明的另一个实施方案提供了一种在动物中刺激针对寄生虫的疟原虫表面阴离子通道的免疫应答的方法，所述方法包括：给所述动物施用有效量的本发明的氨基酸序列、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分和/或药物组合物。在一个实施方案中，刺激免疫应答包括：刺激特异性地结合疟原虫表面阴离子通道的抗体的产生。
本文所述的药学上可接受的载体，例如，媒介物(vehicles)、佐剂、赋形剂、或稀释剂，是本领域技术人员公知的，并且是公众容易获得的。优选地，所述药学上可接受的载体应该是对于活性化合物是化学惰性的一种载体和在使用条件下没有有害的副作用或毒性的一种载体。
载体的选择是由具体的活性试剂以及由用于施用组合物的具体方法所确定。因此，存在很多种适当的本发明药物组合物的制剂。下述用于口服、气溶胶、肠胃外、皮下、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、鞘内、直肠、和阴道施用的制剂仅是示例性的，并且决不是限制性的。
适于口服施用的制剂可以由下列组成：(a)液体溶液,如溶解在稀释剂如水、盐水或橙汁中的有效量的化合物；(b)胶囊,小香囊,片剂,锭剂,和药片，其每种包含作为固体或颗粒的预定量的活性成分；(c)粉剂；(d)在适当液体中的混悬液；和(e)适当的乳剂。液体制剂可以包括稀释剂，诸如水和醇类，例如，乙醇、苯甲醇、和聚乙烯醇，具有或不具有添加的药学上可接受的表面活性剂、混悬剂或乳化剂。胶囊形式可以是普通的硬壳或软壳明胶型，例如，其包含表面活性剂、润滑剂、和惰性填充剂，所述填充剂如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可以包括下列中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜耳胶、胶状二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、和药学相容载体。锭剂形式可以包括在调味剂(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄原胶)中的活性成分，以及软锭剂，所述软锭剂包括在惰性基质中的活性成分，所述惰性基质如明胶或甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶，乳剂，凝胶等，其除包含活性成分之外还包含本领域已知的所述载体。
本发明的化合物，单独或与其它适当的成分组合，可以制成通过吸入施用的气溶胶制剂。这些气溶胶制剂可以放置在加压可用的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。它们还可以被配制成用于非加压制剂的药物，如在喷雾器或雾化器中。
适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与目的接受者血液等渗的溶质，和包括水性和非水性无菌混悬液，其可以包括混悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂。所述化合物可以在药用载体中在生理可用的稀释剂中施用，如无菌液体或液体混合物，其包括水、盐水、水性葡萄糖和相关糖溶液，醇，如乙醇、异丙醇、或十六醇，二醇，如丙二醇或聚乙二醇，甘油缩酮，诸如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇,醚,如聚(乙二醇)400,油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂，如皂或去污剂，混悬剂，诸如果胶，卡波姆，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素，或乳化剂和其它药用佐剂。
可以用在肠胃外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成的油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林和矿物油。适用于肠胃外制剂中的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适当的脂肪酸酯的实例。适用于肠胃外制剂中的皂类包括脂肪碱金属、铵、和三乙醇胺盐，适当的去污剂包括(a)阳离子去污剂，诸如例如，二甲基二烷基铵卤化物,和烷基吡啶鎓卤化物,(b)阴离子去污剂,诸如例如，烷基、芳基、和烯属磺酸盐,烷基、烯属、醚和单酸甘油酯硫酸盐,和磺基丁二酸盐,(c)非离子去污剂，诸如例如，脂肪胺氧化物，脂肪酸链烷醇酰胺,和聚氧乙烯-聚丙烯共聚物,(d)两性去污剂，诸如例如，烷基-β-氨基丙酸酯，和2-烷基-咪唑啉季铵盐,和(3)它们的混合物。
肠胃外制剂典型地在溶液中包含约0.5-约25重量％的活性成分。在所述制剂中可以使用适当的防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除在注射部位的刺激，所述组合物可以包含一种或多种具有约12-约17的亲水性-亲脂性平衡(HLB)的非离子表面活性剂。在所述制剂中，表面活性剂的量在约5-约15重量％范围内。适当的表面活性剂包括聚乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，如失水山梨糖醇单油酸酯，和环氧乙烷与疏水碱的高分子量加合物，其通过氧化丙烯与丙二醇的缩聚形成。肠胃外制剂可以存在于单剂量或多剂量密封容器中，如安瓿和小瓶中，并且可以保存在冷冻-干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体(例如，水)而用于注射。可以由先前所述的各种无菌粉剂、粒剂和片剂制备即时使用的注射液和混悬液。
本发明的化合物可以制成可注射的制剂。本领域技术人员公知对于用于可注射组合物的有效药物载体的需求。参见，Pharmaceutics and Pharmacy Practice(制药和配药实践),J.B.Lippincott Co.,Philadelphia,Pa.,Banker和Chalmers,编,第238-250页(1982),和ASHP Handbook on Injectable Drugs(可注射药物的ASHP手册),Toissel,第4版,第622-630页(1986)。
另外，本发明的化合物可以通过与各种基质混合而制成栓剂，所述基质如乳化基质或水溶性基质。适用于阴道施用的制剂可以以子宫套、卫生棉条、膏剂、凝胶、糊剂、泡沫剂、或喷雾形式存在，其除包含活性成分外还包含本领域已知为适当的所述载体。
适当的载体及其制剂进一步描述在A.R.Gennaro,ed.,Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy(雷明顿：制药科学和实践)(第19版),Mack出版公司,Easton,PA(1995)中。
本发明化合物或其组合物可以潜在地作为药学上可接受的酸加合物，碱中和的或加合的盐施用，所述加合物通过与无机酸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，和有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、和反丁烯二酸反应形成，或通过与无机碱如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾和有机碱如单胺-、二胺-、三烷基胺和芳基胺和取代的乙醇胺反应形成。向盐的转化伴随着用至少化学计量量的适当的酸处理碱化合物。典型地，将游离碱溶解在惰性有机溶剂中，如二乙醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醇、甲醇等中，并且将酸添加在相似的溶剂中。将混合物保持在适当温度下(例如，0℃-50℃)。所得到的盐自然沉淀或者可以使用极性较小的溶剂由溶液中析出。
化合物的中性形式可以通过将盐与碱或酸接触并且以便利方式分离母体化合物而产生。化合物的母体形式在某些物理特性上不同于多种盐形式，诸如在极性溶剂中的溶解性方面，但是，所述盐与化合物的母体形式等同地用于本发明的目的。
本发明化合物或其盐、或其组合物的量或剂量应该足以影响哺乳动物中的治疗或预防响应。适当的剂量将取决于数种因素。例如，剂量还将通过可能伴随具体化合物或盐的施用的任何不利副作用的存在、性质和程度而确定。最终，考虑各种因素，如年龄、体重、一般健康状况、饮食、性别、待施用的化合物或盐、施用途径、和被治疗病症的严重性，主治医师将决定本发明的化合物用于治疗每名个体患者的剂量。作为示例且无意限制本发明，本文中描述的化合物的剂量可以是每天约0.1mg至约1g，例如，每天约5mg至约500mg。剂量的其它例子包括、但不限于：0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.5mg、0.6mg、0.75mg、1mg、1.5mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、17mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、125mg、140mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg或1000mg/kg体重/天。
下述实施例进一步举例说明本发明，但是，当然不应该解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
渗透性裂解实验和高通量抑制剂筛选
通过标准方法培养恶性疟原虫的实验室系，使用Percoll-山梨醇方法在营养子阶段进行富集，洗涤，并在25℃和0.15％血细胞比容再悬浮于含有指定浓度的抑制剂的280mM山梨醇、20mM Na-HEPES、0.1mg/ml BSA(pH 7.4)中；在山梨醇等渗替代以后，类似地测量脯氨酸、丙氨酸和苯基-三甲基氯化铵(PhTMA-Cl)的摄取。通过记录700-nm光在细胞混悬液中的透射率(具有Peltier温度控制的DU640分光光度计，Beckman Coulter)，连续跟踪渗透膨胀和裂解。将记录标准化至受感染细胞在透射率平台的100％渗透性裂解。通过达到部分裂解阈值所需的时间的内插，计算抑制剂剂量应答。将剂量应答拟合至2个兰格缪尔等温线的总和：
P＝a/(1+(x/b))+(1-a)/(1+(x/c)) (方程S1)
其中P代表在有浓度x的抑制剂存在下标准化的溶质渗透性，且a、b和c是常量。
使用通过NMR证实具有>90％纯度的50,000种化合物的市售文库(ChemDiv)，用HB3-和Dd2-感染的细胞在室温相同地进行使用该透射率测定的高通量筛选。以384-孔形式进行筛选，各个孔含有10μM终浓度的单一化合物。每个微量培养板具有2类对照。32个阳性对照孔接受PBS来替代山梨醇；这些孔中的红细胞没有裂解，因为PSAC具有低Na+渗透性。32个阴性对照孔接受含有DMSO、但是不含试验化合物的山梨醇。在多个时间点得到读出值，以允许以高通量形式估测抑制剂亲和力。通过质谱法证实ISPA-28的纯度和分子量。
基于在2h时间点的读出值，根据下式计算每种筛选化合物的活性：
其中％B是标准化的通道阻断，且Acpd代表来自含有试验化合物的孔的吸光度。Aneg和Apos代表板中阴性和阳性对照孔的平均吸光度。％B是抑制剂活性的定量测量。
使用加权差异统计(WDS)，选择对HB3-和Dd2-感染的细胞的摄取具有显著不同效力的抑制剂，其根据下式从2h时间点的％B值确定：
WDS＝|％BHB3-％BDd2|/(3*σpos) (方程S3)
其中σpos是板中阳性对照孔的标准差。分离株(isolate)-特异性的抑制剂具有≥1.0的WDS；较大的值对应于对2个筛选的寄生虫系的摄取的效力的较大差异。使用当地开发的代码(DIAdem 10.2和DataFinder,National Instruments)，将筛选的分析和数据采掘自动化。
电生理学
用石英片移液器(1-3MΩ)和1,000mM氯化胆碱、115mM NaCl、10mM MgCl2、5mMCaCl2、20mM Na-HEPES(pH 7.4)的对称浴槽和移液器溶液，得到记录。当存在时，将ISPA-28加入浴槽和移液器隔室中。封条电阻>100GΩ。在-100mV的强加膜电势得到记录，使用Axopatch 200B放大器(Molecular Devices)，作为从0mV的保持电位的阶梯来施加，在5kHz(8-极Bessel,频率装置)进行低通滤波，在100kHz数字化，并用Clampex9.0软件(MolecularDevices)记录。
使用当地开发的代码(DIAdem 8.1,National Instruments)，确定单通道开放概率和选通分析。将计数封闭通道持续时间的代码应用于作为10s持续时间的电压阶梯得到的记录，以保持封条完整性。它检测中间阈值交叉，使用邻近样品时间的线性插值，并针对66.4μs的高斯滤波器上升时间进行校正，如以前所详细描述的(Desai等人,Nanomedicine,1:58-66(2005))。将持续时间计数为16仓/十倍程，标准化为事件总数的百分比，并显示在平方根图上，其中将简单指数式衰减过程的时间常数显示为最大值(Sigworth等人,Biophys.J.52:1047-54(1987))。
ISPA-28效力的数量性状基因座(QTL)分析
选择443种多态微卫星标志物的独特集合，所述微卫星标志物区分Dd2和HB3亲本系(Su等人,Science,286:1351-53(1999))。通过DNA测序，鉴别出染色体3基因座内的5个额外单核苷酸多态性，并用于对后代克隆基因分型。如(Broman等人,Bioinformatics,19:889-90(2003))所述，通过用R/qtl软件(可得自http://www.rqtl.org/)执行QTL分析，使用该基因分型数据来搜索遗传杂交后代中与ISPA-28效力有关的遗传基因座。因为恶性疟原虫无性生殖阶段是单倍体，所述分析类似于重组近亲交配遗传杂交的分析。通过排列分析，确定在P＝0.05水平的显著性阈值。如在R/qtl软件包中所述，通过控制主要染色体3基因座，进行第二次扫描以搜索额外的QTL。
piggyBac转座酶介导的互补
使用piggyBac转座酶介导的互补(Balu等人.PNAS,102:16391-96(2005))，评价各个候选基因和在绘图的基因座内的保守可读框。用下面表1中列出的引物，从HB3基因组DNA进行每种候选物连同它的假定的内源5’启动子区域(在起始ATG上游的1-2kb)和3’UTR(在终止密码子下游的0.5kb)的PCR扩增，并插入pXL-BacII-DHFR载体的多克隆位点中；连接会将所述插入片段置于人二氢叶酸还原酶基因(hDHFR)附近，所述基因的产物允许通过抗叶酸剂WR99210进行选择。该整合盒侧接2个被piggyBac识别的反向末端重复(ITR)。将携带转基因的质粒与pHTH(一种辅助质粒，其编码转座酶，但是缺乏选择标记)一起共转染进Dd2中。转座酶的表达会促进转基因和hDHFR的基因组整合。
使用cDNA的染料-终止子测序来证实转基因表达，这基于已知的多态位点在序列色谱图中作为双峰的检测。简而言之，根据生产商的说明书，通过用SuperScriptIII试剂盒(Invitrogen)从总RNA反转录，制备cDNA。然后用基因特异性的引物扩增特定转录物。被注解为未表达的HB3等位基因要么通过该方法不可检测出，要么由于Dd2和HB3之间的多态性的缺乏而未检出。
表1
clag3的等位基因交换
通过Dd2clag3.1转基因向HB3基因组clag3.2中的单位点同源重组，实现等位基因交换。用引物
5’-cataagcggccgcGCCATTCAGACCAAGCAAGG-3’(SEQ ID NO:35)和
5’-ttaaactgcagCTTTTCAATTAATTTTATATTCTTTTGTTC-3’(SEQ ID NO:36)，从Dd2扩增含有clag3.1的3’部分(3219bp)和它的3’UTR(441bp)的DNA片段。将扩增子克隆进pHD22Y质粒(Fidock等人,PNAS,94:10931-36(1997))中的NotI和PstI位点之间。通过标准定位诱变，通过在该基因的终止密码子前面在框架内添加编码四-半胱氨酸和FLAG表位标签(FLNCCPCCMEPGSDYKDDDDK)(SEQ ID NO:37)的DNA序列，构建最终的转染质粒(pHD22Y-120w-flag-PG1)。在转染后5个月，通过PCR，检测向HB3中的同源重组。通过用ISPA-28进行山梨醇处理，富集重组寄生虫，并进行有限稀释以产生有限稀释克隆HB33rec。
用于PCR验证向HB3基因组中的同源重组的引物包括在表2中的那些：
表2
DNA印迹杂交
使用Wizard Genomic DNA提取试剂盒(Promega)，提取基因组DNA，用指定的限制性酶消化，在0.7％琼脂糖凝胶上在55V分离18小时，并印迹在带正电荷的尼龙膜(Roche)上。使用引物
(5’-ATTTCCAGAGAATGACCACAAC-3’(SEQ ID NO:43)和
5’-TTAAGATGGCCTGGGTGATTC-3’)(SEQ ID NO:44)，制备与hdhfr互补的DNA探针，并用地高辛配基-dUTP标记。在与DIG-Easy Hyb(Roche)预杂交以后，加入标记的探针，并在39℃杂交过夜。将印迹用0.1×SSC/0.5％SDS在53℃洗涤，并封闭。然后用抗-地高辛配基-AP Fab片段(以1:10,000的稀释度)和CDP-Star底物(Roche)检测探针结合。
通过实时PCR定量基因表达
使用两步实时PCR来定量clag基因的表达。基于通过DNA测序鉴别出的多态性，设计对5个clag基因中的每一个特异性的引物。使用正向和反向引物的可能排列的基因组DNAPCR产生了仅具有匹配引物对的扩增子，从而证实了特异性。使用的引物包括表3中的那些：
表3
按照生产商的方案，用Trizol试剂(Invitrogen)从同步的裂殖体阶段培养物收获总RNA。用TURBO-DNA-free试剂盒(Ambion)，除去残余基因组DNA污染物。使用SuperScriptIII试剂盒(Invitrogen)，用寡-dT作为引物，进行反转录。使用省略逆转录酶的阴性对照反应，以排除被基因组DNA污染的样品。用QuantiTect SyBr Green PCR试剂盒(Qiagen)和上面的clag基因-特异性的引物对，进行实时PCR。在iCycler iQ多色实时PCR系统(Bio-Rad)中跟踪扩增动力学。使用寄生虫基因组DNA的系列稀释物来构建每个引物对的标准曲线。使用rhopH2、rhopH3和PF7_0073作为负载对照。将提供的数据标准化为总clag3转录物丰度。
具有改变的ISPA效力的寄生虫的体外选择
使用PSAC介导的受感染细胞在未缓冲的280mM山梨醇溶液(含有ISPA化合物)中的渗透性裂解，选择具有改变的抑制剂效力的寄生虫。该策略是基于这样的寄生虫的挽救：所述寄生虫的通道通过ISPA的添加来阻断；它类似于山梨醇在寄生虫培养物的同步化中的应用(Lambros等人,J.Parasitol.,65:418-20(1979))。从裂解动力学和剂量应答确定最佳选择条件。使用培养物与5μM ISPA-28或4μM ISPA-43一起在室温的30min温育，在连续日进行同步化。与2个clag3基因有关的通道之间的ISPA-28亲和力的显著差异，产生了快速选择，通常在4-6个同步化内。在使用ISPA-43的反向选择中需要额外的同步化，这与亲和力的相对不大的差异相一致。
多克隆抗体生产
将编码Dd2clag3.1产物的C-端141个氨基酸的DNA序列克隆进pET-15b载体(Novagen)中，用于在大肠杆菌中过表达。使用标准的定位诱变来引入C-端FLAG表位标签，从而产生最终的质粒(pet15b-120w-4B)，其编码
NH2-MGSSHHHHHHSSGGTKKYGYLGEVIAARLSPKDKIMNYVHETNEDIMSNLRRYDMENAFKNKMSTYVDDFAFFDDCGKNEQFLNERCDYCPVIEEVEETQLFTTTGDKNTNKTTEIKKQTSTYIDTEKMNEADSADSDDEKDSDTPDDELMISRFHDYKDDDDK-CO2H(SEQ ID NO:61)(clag3.1产物用斜体字显示；六组氨酸和FLAG标签标有下划线)。在用pET-15b-120w-4B转化和用0.5mM IPTG诱导3小时以后，在BL21CodonPlus(DE3)RIL细胞系(Agilent Technologies)中生产重组蛋白。通过在有蛋白酶抑制剂(其结合于Ni-NTA Superflow珠子(Qiagen)上)存在下的超声处理，收获重组蛋白，在优化条件下用咪唑洗脱，并透析。在用于使用Precision Antibody(Columbia,MD)(一种OLAW检验过的设备)的标准小鼠免疫接种之前，在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上证实纯度和大小。通过ELISA，抗体滴度>1:100,000。
蛋白酶敏感性研究
将Percoll富集的同步的营养子-感染的细胞洗涤，并在补充了0.6mM CaCl2和1mMMgCl2的PBS中以5％血细胞比容用1-2mg/mL的得自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的链霉蛋白酶E(Sigma Aldrich)在37℃处理1h。通过加入20体积的含蛋白酶抑制剂(1mMPMSF、2μg/mL胃酶抑素和2μg/mL亮抑酶肽)的冰冷PBS，终止反应，并彻底洗涤。通过用山梨醇摄取测量检验PSAC活性，评价蛋白酶处理的有效性和蛋白酶抑制剂实现的阻断。通过测量全细胞裂解物的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶中的血红蛋白带强度，检验蛋白酶向红细胞胞质溶胶的可达性。用ImageJ软件(http://rsbweb.nih.gov/)定量带强度，并表明没有可检测的血红蛋白降解(与未经处理的对照组相比，99±2％的平均值，n＝7个单独试验)。
膜分级分离
在40体积的含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(7.5mM Na2HPO4,1mM EDTA,pH 7.5)中，使受感染细胞(经过或未经过先前的蛋白酶处理)发生溶血，并超速离心(70,000x g,4℃,1h)。将上清液收集为“可溶性的”级分，然后将沉淀物在4℃再悬浮于100mM Na2CO3、pH11中保持30min，然后离心(70,000x g)。用1/10体积的1M HCl中和“碳酸盐提取物”上清液。将最终的沉淀物用裂解缓冲液洗涤，然后在2％SDS中溶解为“膜”级分。
免疫荧光共焦显微术
将同步的寄生虫培养物洗涤，并用于在载玻片上制备薄涂片。将细胞风干，然后在100％甲醇(对于裂殖子，为冰冷的；对于营养子，为室温)中固定5min。在含有0.1％TritonX-100的10％山羊血清封闭溶液(Invitrogen)中温育以后，将针对clag3重组蛋白的第一抗体和第二抗体(Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG,Invitrogen)分别以1:50和1:500稀释度应用在相同缓冲液中，在抗体之间彻底洗涤。将细胞核用Hoechst 33342染色，然后在Fluoromount-G(SouthernBiotech)中固定。利用系列405nm和488nm激发，在100x油浸物镜下在Leica SP2共焦显微镜上拍摄双色荧光图像。在Imaris 6.0(Bitplane AG)中处理图像，并使用Huygens Essential3.1(Scientific Volume Imaging BV)均匀地去卷积。
免疫印迹
使蛋白样品变性，并在含100mM DTT的样品缓冲液(Invitrogen)中还原，在MES缓冲液(Invitrogen)中在4-12％Bis-Tris凝胶上运行，并转移至硝酸纤维素膜。在阻断(3％脱脂奶，在含有0.1％吐温20的150mM NaCl、20mMTrisHCl、pH 7.4中)以后，将抗-重组clag3产物或抗-FLAG(Cell Signalling Technology)以1:3000稀释度应用于封闭缓冲液中。洗涤后，用HRP-缀合的第二抗体(Pierce)(以1:3000稀释度)和化学发光底物(Immobilon,Millipore或SuperSignal West Pico,Pierce)检测结合。
计算分析
使用在FastTree 2.1程序中在默认参数下实现的近似最大可能性方法，进行clag产物和更疏远的相关RON的系统进化分析(Price等人,Mol.Biol.Evol.,26:1641-50(2009))。使用TMHMM和Phobius程序(Krogh等人,J.Mol.Biol.,305:657-80(2001)；Kall等人,Bioinformatics,21增刊1:i251-57(2005))，预测跨膜结构域。通过在PolyPhobius模式输入得自几个疟原虫物种的组2clag产物的多个比对，实现提高的跨膜结构域预测的置信度。
实施例1
本实施例证实了根据下面式(1a)和(2a)的化合物对PSAC的活性。本实施例也证实了化合物(1a)和(2a)在富含营养物的RPMI和PSAC限制培养基(PLM)中的体外生长抑制活性。式(1a)和(2a)的化合物是根据本发明的一个实施方案。
如以前所述(Biophysical J.84:116-23,2003)，测量产生PSAC介导的溶质摄取的50％阻断所需的化学抑制剂的浓度，即PSAC阻断的K0.5(表4)。所述化学抑制剂包括：
简而言之，通过在人红细胞中的体外培养，得到恶性疟原虫营养子，通过密度梯度离心进行富集，并用于在山梨醇裂解溶液(按mM计：280山梨醇,20Na-HEPES,0.1mg/ml BSA,pH 7.4)中的连续光散射渗透性裂解测定中。在该测定中，透射率(％T,在700nm测量)的增加与受感染的RBC的裂解直接关联，并以任意单位绘图。未受感染的RBC缺乏PSAC活性，且具有不可检测的低山梨醇渗透性。其它营养物溶质的摄取和膜片箝方法证实：该透射率测定会提供化合物(1a)和(2a)实现的PSAC抑制的定量测量。化合物(1a)和(2a)的PSAC抑制剂代表干预疟疾寄生虫的新颖策略，因为目前被批准的抗疟疾药(青蒿素、甲氟喹和氯喹)不会抑制PSAC活性(表4)。
使用96-孔形式的、针对寄生虫核酸的、基于SYBR Green I的荧光测定，定量PSAC抑制剂实现的体外寄生虫杀死。如下同步化寄生虫培养物：在5％D-山梨醇中温育，然后以1％寄生虫血症(parasitemia)和2％血细胞比容接种在用于寄生虫培养的标准培养基(补充了25mM HEPES、50mg/L次黄嘌呤和10％常规血清的RPMI 1640)或PSAC限制培养基(PLM，一种基于RPMI 1640制剂的新培养基，但是具有降低的异亮氨酸、谷氨酰胺和次黄嘌呤浓度，受感染细胞对所述3种营养物的摄取主要是通过PSAC)中。尽管RPMI 1640含有超过生理浓度的这些营养物，但是在PLM中的值更接近得自健康人供体的血浆中所测得的那些值。
不经培养基变化，在5％O2、5％CO2中在37℃将培养物维持3天。该温育以后，将SybrGreen I加入20mM Tris、10mM EDTA、0.016％皂苷、1.6％triton X100中。随后的荧光测量(在485/528nm的激发/发射)允许定量寄生虫生长，因为Sybr Green 1的荧光是寄生虫核酸含量的量度。表4显示了在RPMI 1640(RPMI IC50)或PLM(PLM IC50)中产生寄生虫存活的50％下降所需的每种PSAC抑制剂(式(1a)或(2a)的化合物)或对照抗疟疾药(青蒿素、甲氟喹或氯喹)的浓度。在PLM中试验以后，PSAC抑制剂(式(1a)或(2a)的化合物)所实现的提高杀死指示，所述PSAC抑制剂可能具有新颖的寄生虫杀死机制。这些数据支持PSAC在寄生虫营养物获取中的作用，因为营养物限制会提高PSAC抑制剂效力，但是不会显著改变青蒿素、甲氟喹或氯喹的杀死(参见IC50比率(RPMI/PLM))。
表4
实施例2
本实施例证实了分离株-特异性的抑制剂的鉴别，所述抑制剂可有效地抑制与特定寄生虫系有关的PSAC活性。本实施例也证实，根据本发明的抑制剂会与PSAC直接相互作用。
研究了对不同寄生虫系诱导的通道具有不同效力的小分子抑制剂。据推测，这样的抑制剂会结合所述通道上的一个或多个可变位点，所述位点可能源自寄生虫通道基因中的多态性，或者源自人通道的不同活化。为了发现这些抑制剂，使用了基于透射率的测定，所述测定跟踪受感染细胞在山梨醇(一种在感染后具有增加的渗透性的糖醇)中的渗透性裂解(Wagner等人,Biophys.J.,84:116-23(2003))。该测定已经被改造成384-孔形式，并用于发现高亲和力PSAC抑制剂(Pillai等人,Mol.Pharmacol.,77:724-33(2010))。在这里，针对被HB3和Dd2恶性疟原虫系感染的红细胞，使用该形式来筛选化合物文库。为了使命中的检测最大化，通过使用高浓度(10μM)的文库化合物，和通过在多个时间点读出每个微量培养板，在筛选中选择低严谨性(Pillai等人,Mol.Pharmacol.,77:724-33(2010))。8％的化合物满足或超过在2h的50％标准化阻断的阈值 这与低筛选严谨性相一致。定义了加权差异统计(WDS)，其将针对HB3和Dd2通道的测得效力差异标准化为每个微量培养板中的阳性对照孔的标准差[WDS＝│％BHB3-％BDd2│/(3*σpos)]。所有化合物中的86％对2个寄生虫系产生了不能辨别的作用(WDS≤1.0)。因而，大多数抑制剂结合位点是保守的。
尽管如此，小量化合物在2个筛选中产生了显著不同的活性。一种这样的抑制剂，名称为ISPA-28(分离株-特异性的PSAC拮抗剂，其基于下述的研究，下式A)，可再现地更有效地抑制Dd2-感染的细胞(与HB3-感染的细胞相比)的山梨醇摄取。使用ISPA-28的第二项研究揭示了半数最大亲和力的约800倍差异(对于Dd2和HB3，分别为56±5nM和43±2μM的K0.5值；P<10-10)。
还检验了ISPA-28对氨基酸丙氨酸和脯氨酸以及有机阳离子苯基-三甲铵(PhTMA)(已知在感染后具有渗透性增加的溶质(Ginsburg等人,Mol.Biochem.Parasitol.14:313-22(1985)；Bokhari等人,J.Membr.Biol.226:27-34(2008)))的摄取的影响。以与山梨醇的那些匹配的剂量应答，抑制每种溶质的渗透性。不受特定理论或机制的约束，据信，这些数据提供这些不同溶质使用单个共有运输机制的证据。
接下来试验了22个不同的实验室寄生虫系，仅用Dd2和W2发现了显著的运输抑制。因为Dd2通过从W2开始的长期药物选择而产生(Wellems等人,Nature,345:253-55(1990))，所以它们的通道的特征性的ISPA-28亲和力提示在寄生虫基因组中的稳定的可遗传的元件。
为了探究ISPA-28阻断的机制，进行了受感染的红细胞的膜片箝。使用全细胞构型，在不含已知抑制剂的实验中观察到在HB3-和Dd2-感染的细胞上的类似电流。这些电流表现出内向整流。以前的研究确定，它们主要由阴离子承载，渗透性排序为：SCN->I->Br->Cl-(Desai等人,Nature,406:1001-05(2000))。10μM ISPA-28会减小这些电流，但是对Dd2-感染的细胞具有显著更大的作用。在使用1.1M Cl-作为电荷载体的细胞结合的构型中，在两个系上检测到PSAC的离子通道活性特征(具有快速闪烁门控的约20pS斜率电导(Alkhalil等人,Blood,104:4279-86(2004))；在没有抑制剂时，得自2个系的通道是不能辨别的。但是，使用10μM ISPA-28的记录揭示了显著差异，因为Dd2通道受到几乎完全抑制，而HB3通道在很大程度上未受影响。因而，该化合物对单个PSAC记录的影响与对山梨醇和其它有机溶质的摄取的那些影响类似。
分析了得自延长记录的闭合持续时间，并确定，ISPA-28施加影响于长阻断事件的独特群体，但是仅在Dd2-感染的细胞上的记录中。与此同时，固有的通道封闭(其发生在没有抑制剂存在下)在两种寄生虫上是保守的，并且不受ISPA-28影响。
实施例3
本实施例证实了ISPA-28效力在Dd2 x HB3遗传杂交中的遗传，并且piggyback介导的互补涉及在PSAC活性中的clag 3.1和clag 3.2。
接下来检验了ISPA-28对红血细胞上的PSAC活性的效力，所述红血细胞被得自Dd2x HB3遗传杂交的重组后代克隆感染(Wellems等人,Nature,345:253-255(1990))。对于每个克隆，在没有和有7μM ISPA-28(最佳地区分亲本通道表型的浓度)存在下，检验了山梨醇摄取，并定量抑制尽管34个独立后代克隆中的几个表现出中间通道抑制，但是大多数类似于一个或其它亲本。使用数量性状基因座(QTL)分析来检索ISPA-28效力和可利用的微卫星标志物的遗传之间的关联。初次扫描鉴别出在染色体3的近端端部处的单个显著峰，其具有12.6的几率对数(LOD)评分。针对残余作用的二次扫描没有发现达到统计显著性的额外峰。
绘图的基因座含有42个预测的基因。尽管所述基因都与得自其它生物体的经典离子通道没有同源性，但是许多基因在其它疟原虫中是保守的，这从负责基因的PSAC活性在疟疾寄生虫中的保守预见到(Lisk等人,Eukaryot.Cell,4:2153-59(2005))。绘图的区域富含编码注定要输出至宿主胞质溶胶的蛋白的基因(通过模拟，P<10-4)，作为顶复门寄生虫亚端粒区域的典型。一些编码蛋白具有一个或多个经常涉入通道孔形成的预测跨膜结构域，但是该标准可能错失一些运输蛋白。PEXEL基序，其将寄生虫蛋白引导至宿主细胞(Marti等人,Science,306:1930-33(2004))，存在于某些基因中，但是该模块不是输出所普遍需要的(Spielman等人,Trends Parasitol.26:6-10(2010))。因而，计算分析提示几种候选物，但是没有明确地指示任何候选物作为离子通道组分。
选择DNA转染方案，并选择piggyBac转座酶来补足具有各个候选基因的HB3等位基因的Dd2寄生虫(Balu等人,PNAS,102:16391-96(2005))。利用该方法，成功地转染的寄生虫将携带两个亲本等位基因，并因此是候选基因的部分二倍体。尽管如此，预期所述亲本系之间的ISPA-28效力的显著差异会在与负责基因互补后产生运输表型的可检测的变化。由piggyBac赋予的随机整合的高效率允许快速地检查许多基因(Balu等人,BMC Microbiol.,9:83(2009))。
将14个基因与它们的得自HB3亲本的内源5’和3’UTR区域一起克隆进pXL-BacII-DHFR质粒中；还制备了第15个构建体，其含有保守的、但是没有注解的可读框(ORF 147kb)。将每个与编码转座酶的辅助质粒一起单个地转染进Dd2寄生虫中。针对hDHFR表达的选择产生了稳定地携带每个候选物的Dd2和HB3等位基因的寄生虫。因为据推测改变的通道表型需要HB3等位基因的表达，所以使用逆转录酶PCR来扩增每个基因的多态区域，并将扩增子测序，以确定两个亲本等位基因是否被转录；该方案证实了12种候选物的表达。进行了被每个转染子感染的红细胞对山梨醇摄取的抑制的ISPA-28剂量应答。2个表达PFC0110w(clag3.2)和PFC0120w(clag 3.1)的HB3等位基因的转染子产生了ISPA-28效力的显著变化(其K0.5值在Dd2和HB3的那些值之间)，这从携带得自2个亲本系的通道的细胞预见到(相对于Dd2，分别P＝0.01和P<10-7)。PFC0120w转染子的有限稀释克隆产生了克隆Dd2-pB120w，后者已经经历至少一个整合事件；它的ISPA-28K0.5与转染库不能辨别。对于2个基因，定量分析提示HB3等位基因的相对较低水平的表达，因为转染子K0.5值(95±8和140±12nM)更接近于Dd2(与HB3相比)的K0.5值。不受特定理论或机制的约束，据信，2个亲本等位基因的表达水平可能受整合位点的基因组环境、相关启动子效率和下面检验的基因沉默机制影响。
实施例4
本实施例证实了clag 3.1.和clag 3.2在PSAC活性中的作用。本实施例也证实，clag3基因沉默和转换的表达会决定抑制剂亲和力。
为了检验clag3产物促进PSAC活性的意外可能性，使用等位基因交换策略来将有效的ISPA-28段从Dd2系转移至HB3寄生虫。因为Dd2寄生虫表达clag3.1、但是不表达clag3.2(Kaneko等人,Mol.Biochem.Parasitol.,143:20-28(2005))，推测它们的clag3.1基因编码高ISPA-28亲和力。因此，构建了转染质粒，其携带得自Dd2clag3.1等位基因的3’末端的3.2kb片段，继之以终止密码子的符合读框的C-端FLAG标签、和所述片段基因的3’非翻译区(pHD22Y-120w-flag-PG1)。因为该质粒仅携带基因片段和且缺少驱动表达的前导序列，所以改变的运输表型需要重组进寄生虫基因组中。用该质粒转染HB3，并使用PCR来筛选向5个内源clag基因中的每一个内的整合。该方案检测向HB3clag3.2基因中的重组；有限稀释克隆会产生HB33rec，即携带单位点整合事件的没有残余游离型质粒的克隆。DNA测序指示在距离HB3clag3.2起始密码子3718和4011碱基对处的单核苷酸多态性之间的重组。该重组位点对应于下游多态性的成功转移，包括经识别的在4266-4415碱基对处的高变区；通过指纹法排除了其它实验室寄生虫系的污染。
对HB33rec的PSAC活性表现出ISPA-28效力的显著增加(图1)，从而进一步支持了clag3基因在山梨醇和营养物摄取中的作用。尽管该等位基因交换策略产生了基因替代(不同于用piggyBac实现的互补)，但是所述通道的ISPA-28亲和力再次是在HB3和Dd2的那些值之间的中间值(图2)。不受特定理论或机制的约束，据信，几个机制可能促进抑制剂亲和力的数量上的不完全转移。首先，在所述蛋白上的2个或更多个多态位点可能促进ISPA-28结合。如果这些位点中的一些是在重组事件的上游，则得到的嵌合蛋白可能具有不同于任一个亲本系的那些的功能性质。其次，所述通道可能含有额外未识别的亚基；在这里，可能需要转染(用Dd2等位基因替代每个促成性的HB3基因)来匹配Dd2的ISPA-28亲和力。最后，除了通过转染产生的嵌合clag3.2HB3-3.1Dd2基因以外，HB33rec也携带HB3寄生虫的内源性clag3.1基因。两种旁系同源物的表达也会产生中间ISPA-28亲和力。
为了探究这些可能性，对HB33rec-感染的细胞进行细胞结合的膜片箝。鉴别了表现出与每个亲本系的那些匹配的ISPA-28效力的各个通道分子。这些记录不包括需要同源通道群体的情形。
除了HB33rec的复杂行为以外，还观察到得自遗传杂交的某些后代具有比Dd2更低的ISPA-28亲和力，尽管遗传了完全得自Dd2亲本的绘图的染色体3基因座。因为恶性疟原虫中的亚端粒多基因家族对重组和频繁的基因转变事件敏感(Freitas-Junior等人,Nature,407:1018-22(2000))，所以对clag3旁系同源物和得自7C20和Dd2的邻近基因组DNA测序，但是没有发现DNA-水平差异。因此考虑了可能影响ISPA-28亲和力的表观遗传的机制。已经报道，clag3.1和clag3.2会经历相互排斥的表达(Cortes等人,PLoS Pathog.,3:e107(2007))。也针对恶性疟原虫中的其它基因家族记载的单等位基因表达和转换(Chen等人.Nature,394:392-95(1998)；Lavazec等人,Mol.Microbiol.,64:1621-34(2007))允许各个寄生虫表达多基因家族的单个成员。由无性生殖产生的子代寄生虫继续通过不完全理解的表观遗传的机制排它性地表达相同基因(Howitt等人,Mol.Microbiol.,73:1171-85(2009))。几代以后，一些子代可能转换为所述基因家族的其它成员的表达，从而提供促进免疫逃避的多样性(Sherf等人,Annu.Rev.Microbiol.,62:445-70(2008))。
进行逆转录酶PCR，并发现，Dd2几乎排它地表达clag3.1，而3个不一致的后代以可测量的水平表达clag3.2，从而提示表观遗传的调节。因此，使用在含有ISPA-28的山梨醇溶液中的渗透性裂解，将选择压力应用于后代培养物。ISPA-28的包含会优先赦免其通道具有高抑制剂亲和力的受感染细胞：这些细胞遭受更少的山梨醇摄取，并且不会裂解。在多个连续日施加的这些选择会造成寄生虫血症的显著下降。存活的寄生虫表现出提高的ISPA-28亲和力，其在数量上匹配Dd2亲本的亲和力。应用于HB3和3个遗传它的染色体3基因座的后代的相同选择没有改变ISPA-28亲和力，从而排除了所述选择对无关基因组位点的影响。
实时qPCR(其使用对5个clag基因中的每一个具有特异性的引物)揭示，使用山梨醇和ISPA-28的选择会在继承Dd2基因座的后代中可再现地增加clag3.1表达，同时减少clag3.2的表达。应用于亲本HB3系的选择没有影响，这与它的未变化的抑制剂亲和力一致。这些选择没有改变其它旁系同源物(clag2、clag8和clag9)的相对表达。
还将选择应用于HB33rec，其携带嵌合的clag3.2HB3-3.1Dd2转基因和HB3的天然clag3.1基因。不同于在同基因的HB3系上的效应的缺乏，这些同步化使转染子的ISPA-28亲和力增加至51±9nM的K0.5，从而匹配Dd2通道的值。通道表型的这种变化与转基因的近乎排它表达相关联，从而证实细胞子集对HB3clag3.1的表达导致了中间ISPA-28亲和力。这些发现也界定了ISPA-28的决定簇，所述决定簇结合被转移至HB33rec的Dd2clag3.1基因片段内的多态位点。
不受特定理论或机制约束，据信，恶性疟原虫多基因家族的表达转换经历几代而发生，并且将导致群体表型中的漂移。选择HB33rec中的嵌合基因以后，连续的体外繁殖导致了ISPA-28亲和力的逐渐减退，这与减少的转基因表达相关联。与其它多基因家族一样(Lavazec等人,Mol.Microbiol.,64:1621-34(2007))，在没有选择压力下连续培养以后，几个因素可能影响2个clag3基因的稳态ISPA-28亲和力和相对表达水平。
实施例5
本实施例证实了亮抑酶肽抗性的PSAC突变体中的ISPA-43和clag3突变的反向选择。
接下来寻找对2种Dd2clag3产物具有反转特异性的PSAC抑制剂。为此目的，在选择clag3.1表达之前和之后，使用后代克隆7C20，研究了得自实施例2的高通量筛选的命中。该二次筛选将ISPA-43鉴别为具有与ISPA-28相反的等位基因特异性的PSAC抑制剂(下面式B(对于与得自Dd2的clag3.1和clag3.2基因有关的通道，K0.5分别为32和3.9μM)。
最近，通过使用亮抑酶肽对HB3的体外选择(Lisk等人,Antimicrob.AgentsChemother.,52:2346-54(2008))，产生了具有改变的PSAC选择性、门控和药理学的稳定寄生虫突变体。对得自该突变体HB3-leuR1的Clag3基因测序，并鉴别出在它的clag3.2基因内的点突变，所述点突变将保守的A1210改变为苏氨酸，这与clag3基因在溶质摄取中的重要作用相一致。HB3-leuR1会沉默它的未修饰的clag3.1，并优先表达突变的clag3.2(表达比率为19.2±1.5)，这是对PSAC行为的直接作用所必需的。因为该突变是在预测的跨膜结构域内，所以它可能直接地造成观察到的通道门控和选择性的变化。
然后将含有4μM ISPA-43的山梨醇同步化应用于表达clag3.1的7C20培养物，并实现稳健的反向选择：存活寄生虫表现出低ISPA-28亲和力和反转的clag3表达谱。因而，可以在任一个clag3基因的纯化选择中使用抑制剂。因为通过在没有选择压力下的偏移或者通过用具有反转特异性的抑制剂选择替代旁系同源物都可以降低ISPA-28亲和力，所以这些研究减少了关于暴露于山梨醇或单一抑制剂的间接作用的担心。
最近，通过使用亮抑酶肽对HB3的体外选择(Lisk等人,Antimicrob.AgentsChemother.,52:2346-54(2008))，产生了具有改变的PSAC选择性、门控和药理学的稳定寄生虫突变体。对得自该突变体HB3-leuR1的Clag3基因测序，并鉴别出在它的clag3.2基因内的点突变，所述点突变将保守的A1210改变为苏氨酸，这与clag3基因在溶质摄取中的重要作用相一致。HB3-leuR1会沉默它的未修饰的clag3.1，并优先表达突变的clag3.2(表达比率为19.2±1.5)，这是对PSAC行为的直接作用所必需的。不受特定理论或机制的约束，据信，因为该突变是在预测的跨膜结构域内，所以它可能直接地造成观察到的通道门控和选择性的变化。
实施例6
本实施例证实，clag3产物暴露在宿主红细胞表面上。
为了直接地促进PSAC活性，据信，至少一些clag3产物会与宿主膜结合，据推测是作为嵌膜蛋白。因此，制备了针对2种clag3产物之间保守的羧基端重组片段的多克隆抗体。使用该抗体的共焦显微术证实了将这些蛋白局部化至宿主胞质溶胶和可能的红细胞膜以及在侵袭性裂殖子的棒状体内的报道(Vincensini等人,Mol.Biochem.Parasitol.,160:81-89(2008))。为了得到更明确的证据，使用免疫印迹法来检验这些蛋白对细胞外蛋白酶的敏感性。在没有蛋白酶处理下，在全细胞裂解物中检测到单个约160kDa带，这与clag3产物的预期大小相一致。在为预防细胞内蛋白消化所设计的条件下用链霉蛋白酶E处理，会减少全长蛋白的量，并揭示35kDa水解片段。相反，针对KAHRP(一种寄生虫蛋白，其与宿主膜细胞骨架相互作用，但是没有暴露(Kilejian等人,Mol.Biochem.Parasitol.,44:175-81(1991)))的单克隆抗体证实，细胞内蛋白在这些条件下具有水解抗性。如关于另一种蛋白酶所报道的(Baumeister等人,Mol.Microbiol.,60:493-04(2006))，链霉蛋白酶E处理会显著减少PSAC介导的山梨醇摄取；该作用对蛋白酶抑制剂是敏感的，这提示，在一个或多个暴露位点处的蛋白酶解会干扰运输。
受感染细胞裂解物的超速离心揭示，clag3产物是完全膜结合的；但是，一部分可以通过Na2CO3处理来释放，所述Na2CO3处理会剥离周围蛋白的膜(Fujiki等人,J.CellBiol.,93:97-102(1982))。因为该部分是蛋白酶不敏感的，所以它反映了与膜松散地结合的clag3产物的细胞内集合。C-端水解片段仅存在于碳酸盐抗性的不溶性级分中，从而指示整合膜蛋白。
因为多克隆抗体可能与得自其它染色体的clag产物交叉反应，所以接下来检验了HB33rec(其嵌合的clag3转基因编码C-端FLAG标签)中的蛋白酶敏感性。抗-FLAG抗体识别HB33rec中的单一整合嵌膜蛋白，且不识别得自亲本HB3系的蛋白，从而指示重组基因产物的特异性。在细胞裂解和分级分离之前的链霉蛋白酶E处理揭示了这样的水解片段：其与用针对天然蛋白的C-端产生的抗体所观察到的水解片段不能区分开。
对于在实施例7-10中描述的实验，进行下述操作：
寄生虫培养、PLM设计和生长抑制研究
通过标准方法，在补充了25mM HEPES、31mM NaHCO3、0.37mM次黄嘌呤、10μg/mL庆大霉素和10％混合人血清的RPMI 1640中，繁殖无性生殖阶段的恶性疟原虫实验室系。PLM是基于该标准培养基，并且在缺乏具有已知PSAC渗透性的单一组分的培养基中测量寄生虫生长以后进行设计：次黄嘌呤、泛酸钙和氨基酸Cys、Glu、Gln、Ile、Met、Pro和Tyr(Saliba等人,J.Biol.Chem.,273:10190-10195(1998))。PLM含有降低浓度的异亮氨酸(11.4μM)、谷氨酰胺(102μM)和次黄嘌呤(3.01μM)；在补充进该培养基中之前，在蒸馏水中充分透析人血清。
如以前所述(Pillai等人,Mol.Pharmacol.,77:724-733(2010))，以96-孔形式使用针对寄生虫核酸的基于SYBR Green I的荧光测定，定量生长抑制实验。以1％寄生虫血症和2％血细胞比容，将环状体期同步化的培养物接种在标准培养基或PLM中，并在5％O2、5％CO2下在没有培养基更换下在37℃维持72h。然后在含有SYBR Green I的20mM Tris、10mMEDTA、0.016％皂苷和1.6％triton X100、pH 7.5中裂解培养物，所述SYBR Green I处于生产商的推荐浓度的2倍(Invitrogen,Carlsbad,CA)。45min温育以后，通过测量荧光(激发/发射波长,485/528nm)，定量寄生虫DNA含量。对于每种抑制剂浓度，在减去得自20μM氯喹杀死的匹配培养物的背景荧光以后，计算一式三份测量的平均值。在使用ISPA-28的基于运输的选择以后，进行使用HB33rec寄生虫的生长抑制研究，以实现通过等位基因交换转染产生的嵌合clag3基因的表达。
运输抑制测定
使用基于受感染细胞在山梨醇中的渗透性裂解的定量透射率测定(Wagner等人,Biophys.J.,84:116-123(2003))，确定了PSAC阻断的抑制剂亲和力。使用Percoll-山梨醇方法在营养子阶段富集寄生虫培养物，洗涤，并在37℃和0.15％血细胞比容再悬浮于含有指定浓度的抑制剂的280mM山梨醇、20mM Na-HEPES、0.1mg/ml BSA(pH 7.4)中。PSAC介导的山梨醇摄取会产生渗透性裂解，其通过测量700nm光在细胞混悬液中的透射率进行连续跟踪(具有Peltier温度控制的DU640分光光度计,Beckman Coulter)。从达到部分裂解阈值所需的时间，计算抑制剂剂量应答。将ISPA-28剂量应答拟合至2个兰格缪尔等温线(Eq/S1)的总和。其它抑制剂具有被单个兰格缪尔等温线充分拟合的剂量应答。
为了检验寄生虫培养物中的可能抑制剂代谢，将Dd2寄生虫在含有40μM ISPA-28的标准培养基中在37℃培养72h。离心后，使用培养物上清液作为ISPA-28的来源，用于与新鲜制备的化合物在运输抑制研究中进行对比。
QTL分析
我们使用448种以前选择的区分Dd2和HB3亲本系的多态标志物(Nguitragool等人,Cell,145:665-677(2011))，在Dd2x HB3遗传杂交中寻找了与ISPA-28生长抑制效力有关的遗传基因座(Wellems等人,Nature,345:253-255(1990))。使用如(Broman等人,Bioinformatics,19:889-890(2003))所述的R/qtl软件(在http://www.rqtl.org/自由获得)和适合用于单倍体无性寄生虫的条件，进行QTL分析。用排列分析估测P＝0.5显著性阈值。在0.3和10μM ISPA-28的生长抑制数据鉴别出用3μM ISPA-28报道的相同基因座。通过控制clag3基因座，用二次扫描来寻找额外的QTL。
定量RT-PCR
使用以前开发的等位基因-特异性的引物(Nguitragool等人,Cell,145:665-677(2011))，使用两步实时PCR来定量clag基因表达。用TRIzol试剂(Invitrogen)从裂殖体阶段培养物收获RNA，用DNA酶处理以除去残余的基因组DNA污染物，并用于反转录(SuperScriptIII和寡-dT引发，Invitrogen)。不含逆转录酶的阴性对照反应物证实，不存在基因组DNA污染。用QuantiTect SyBr Green PCR试剂盒(Qiagen)、iCycler iQ多色实时PCR系统(Bio-Rad)和clag基因-特异性的引物，执行实时PCR。使用寄生虫基因组DNA的系列稀释物构建每个引物对的标准曲线。使用PF7_0073作为负载对照，因为它组成型地表达。然后从扩增动力学确定每个clag基因的转录物丰度。
关于clag3重组的PCR研究
用基因组DNA和等位基因-特异性的引物：3.1f(5’-GTGCAATATATCAAAGTGTACATGCA‐3’)(SEQ ID NO:68)、3.1r(5’-AAGAAAATAAATGCAAAACAAGTTAGA‐3’)(SEQ ID NO:69)、3.2f(5’-GTTGAGTACGCACTAATATGTCAATTTG‐3’)(SEQ ID NO:41)和3.2r(5’-AACCATAACATTATCATATATGTTAATTACAC‐3’)(SEQ ID NO:42)，表征了Dd2-PLM28的clag3基因座。还与这些引物一起使用从裂殖体阶段培养物制备的cDNA，以检验天然和嵌合clag3基因的表达。
DNA印迹
在有地高辛配基(DIG)-dUTP(Roche)存在下，使用5’-ATTTACAAACAAAGAAGCTCAAGAGGA‐3’(SEQ ID NO:70)和5’-TTTTCTATATCTTCATTTTCTTTAATTGTTC‐3’(SEQ ID NO:71)，通过PCR扩增从Dd2基因组DNA制备了clag3-特异性的探针。通过针对5个clag基因的全长PCR扩增子(用引物从Dd2基因组DNA产生)的印迹，证实了探针特异性。
用指定的限制性酶(New England BioLabs)消化基因组DNA，在0.7％琼脂糖中进行电泳，进行酸脱嘌呤化，转移和交联至尼龙膜。然后使印迹与上述DIG-标记的探针在DIGEasy Hyb(Roche)中在39℃杂交过夜，并用低和高严谨性缓冲液洗涤(2X SSC、0.1％SDS、23℃，随后1X SSC、0.5％SDS、50℃)，然后根据生产商的说明书进行DIG免疫检测。
哺乳动物细胞毒性
以4000个细胞/孔，在96-孔平板中用人HeLa细胞(ATCC#CLL-2)测量了PSAC抑制剂的细胞毒性。将培养物与每种抑制剂一起在补充了10％胎牛血清的最低必需培养基(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA)中在37℃温育72h。如(Marshall等人,Growth Regul.,5:69-84(1995))所述，使用活体染料MTS[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯酚)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑,内盐]定量细胞生存力。报道的CC50值是使MTS向甲 的转化减少50％的抑制剂浓度。
实施例7
本实施例证实，当培养基中的营养物可用性降低时，ISPA-28在体外杀死Dd2细胞。
ISPA-28会以高亲和力阻断Dd2-感染的细胞上的PSAC，且对得自HB3寄生虫的通道仅具有弱活性(K0.5分别为56±5nM和43±2μM)(Nguitragool等人,Cell,145:665-677(2011))。如果通道活性在细胞内寄生虫的生长中起作用，则预期该小分子抑制剂会干扰Dd2培养物的繁殖，但是赦免HB3的繁殖。初步的体外寄生虫生长研究揭示了不显著差异，两个寄生虫系在基于RPMI的培养基中表现出持续生长，尽管存在高ISPA-28浓度(各自的IC50值>40μM，关于差异，P＝0.35)。
经确定，在体外培养条件下，ISPA-28对Dd2通道的效力不受抑制剂代谢损害。ISPA-28也没有被血清蛋白或脂质显著吸附，已知所述吸附是会降低一些PSAC抑制剂和许多治疗剂的活性的现象(Matsuhisa等人,Chem.Engineering J.,34:B21-B27(1987))。因而，ISPA-28在标准体外培养条件下不会抑制Dd2寄生虫的生长。
一种可能性是，所述通道活性参与疟疾寄生虫的存活，但是在标准体外培养条件下，在有抑制剂存在下残余的低水平运输会充分满足寄生虫需要。与此相一致，甚至在高ISPA-28浓度下观察到在Dd2-感染的红细胞中持续的通道介导的摄取。用化合物(31)观察到显著更少的残余摄取，所述化合物(31)是对Dd2通道具有可比较的抑制性K0.5值的广谱PSAC抑制剂(Pillai等人,Mol.Pharmacol.,77:724-733(2010))(对于在10μM的这些抑制剂的对比，P<10-4)。使用这些抑制剂时残余通道活性的意外差异可能解释它们对体外寄生虫生长的不同效力(IC50值分别为约50μM和4.7μM；表5)。
表5
不受特定理论或机制约束，据信，在高ISPA-28浓度下的不完全阻断(尽管对于Dd2通道的低K0.5值)提示复杂的抑制机制。尽管丹曲林和呋塞米剂量应答被假定抑制剂和通道分子的1:1化学计量学的方程式适当地拟合，但是ISPA-28剂量应答没有较好地拟合。用双要素Langmuir方程式得到了改进的拟合。因为该双要素方程式与几种可能的机制相容，所以尚未确定ISPA-28化学计量学和通道阻断的精确模式。
不受特定理论或机制的约束，据信，如果PSAC在细胞内寄生虫的营养物获取中起作用(Desai等人,Nature,406:1001-1005(2000))，那么由ISPA-28实现的不完全抑制可能允许适当的营养物摄取。许多营养物以超生理浓度存在于一般用途RPMI 1640培养基中(Sato等人,Curr.Protoc.Cell Biol.,1:单元1.2(2001))。尽管存在几乎完全的通道阻断，但是在该培养基中的营养物的向内大浓度梯度会支持寄生虫营养物摄取。测量了具有PSAC介导的摄取的营养物，并选择异亮氨酸、谷氨酰胺和次黄嘌呤，因为它们从培养基的单独除去会不利地影响寄生虫培养物。异亮氨酸和谷氨酰胺剂量应答揭示，二者可以减少超过90％，对HB3或Dd2的繁殖具有可忽略的作用，这与标准培养基中的过量营养物相一致。选择了这些氨基酸以及次黄嘌呤(一种具有高PSAC渗透性的嘌呤)的阈值浓度(Gero等人,Adv.Exp.Med.Biol.,309A:169-172(1991)；Asahi等人,Parasitology,113:19-23(1996))。为了减小营养物摄取的向内梯度，制备了PSAC限制培养基(PLM)，其使用这些阈值，同时对于所有其它溶质而言遵循RPMI1640制剂。不受特定理论或机制的约束，据信，与RPMI 1640培养基相比，PLM培养基的减小的营养物含量会更接近地模仿在体内生理条件下的营养物可用性。Dd2和HB3寄生虫可以在PLM中连续繁殖(>2周)，尽管在稍微降低的速率。观察到，具有低寄生虫血症的培养物在PLM中较好地生长，但是速率随着寄生虫负荷增高而下降，这与营养物限制和培养物中的受感染细胞之间的竞争相一致。
不同于在标准RPMI 1640培养基中ISPA-28对寄生虫生长的差效力，使用PLM的研究揭示了Dd2寄生虫的有效杀死和对HB3的持续弱活性(IC50值分别为0.66±0.20μM和52±19μM；P<10-4；图3A)。尽管在营养物摄取和寄生虫生长之间存在非线性关联，但是这些IC50值与ISPA-28实现的PSAC阻断的运输K0.5值相当一致。
实施例8
本实施例证实了Dd2x HB3遗传杂交的后代中的ISPA-28生长抑制表型。
最近，使用独立的运输表型和该遗传杂交的连锁分析已经将2个得自寄生虫染色体3的clag3基因与宿主膜处的PSAC介导的溶质摄取相关联(Nguitragool等人,Cell,145:665-677(2011))。在这里，生长抑制研究揭示了后代克隆的宽范围的ISPA-28效力，许多后代模仿一个或另一个亲本。因为HB3和有些后代具有不可精确估测的高生长IC50值，所以使用在3μM ISPA-28(最佳地区分亲本表型的浓度)的生长抑制进行连锁分析(图3B)。该分析鉴别了ISPA-28生长抑制与clag3基因座的主要关联，从而提供了该基因座在抑制溶质运输和ISPA-28杀死寄生虫两者中的作用的证据。通过除去clag3基因座的作用，寻找额外的促成峰；该方案没有鉴别出其它统计上显著的基因组基因座。
绘图的基因座是在寄生虫染色体3的近端端部处，且含有大约40个基因。为了确定clag3基因是否负责ISPA-28介导的杀死，用HB33rec(通过HB3的等位基因交换转染产生的寄生虫克隆，以用得自Dd2的clag3.1的对应片段替代天然clag3.2基因的3’末端)进行了生长抑制研究。当表达该嵌合基因时，HB33rec表现出ISPA-28的高亲和力抑制(K0.5为51±9nM，相对于Dd2没有差异，P＝0.88)(Nguitragool等人,Cell,145:665-677(2011))。在这里，在生长抑制研究中与PLM一起使用HB33rec，并发现它在与Dd2匹配的水平对ISPA-28是敏感的。因为HB33rec在其它方面与抗性的HB3系是同基因的，所以该发现指示，ISPA-28主要通过对clag3产物和有关的通道活性的作用而杀死寄生虫。此外，检测ISPA-28介导的杀死对营养物限制的要求支持了PSAC在寄生虫营养物获取中的作用。
实施例9
本实施例证实了通过ISPA-28介导的杀死对抗性的clag3等位基因的选择。
大多数实验室寄生虫系携带2个clag3基因拷贝，二者都在染色体3基因座的有义链上。表观遗传的机制控制这些基因的表达，各个寄生虫优先表达2个等位基因之一。在无性复制后，大多数子代寄生虫继续表达相同的等位基因，但是少数子代寄生虫发生转换并表达另一个等位基因。在体内，疟疾寄生虫和其它病原体使用基因转换来逃避宿主针对关键性的表面暴露的抗原的免疫应答。
以前使用ISPA-28来检验clag3基因转换(Nguitragool等人,Cell,145:665-677(2011))。该化合物是与Dd2clag3.1基因表达有关的通道的有效的且特异性的抑制剂；它对通过Dd2clag3.2或任一个clag3在无关寄生虫系中的表达形成的通道几乎没有或没有活性。ISPA-28结合位点局限于clag3.1产物的C-端；在该区域内的短超变结构域暴露于红细胞表面处，且可以限定ISPA-28结合槽。通过在含有ISPA-28和山梨醇(一种具有高PSAC渗透性的糖醇)的溶液中的渗透性裂解，使用ISPA-28来选择表达Dd2clag3.1等位基因的细胞。山梨醇会针对该等位基因进行选择，因为渗透性裂解会消除其通道未被ISPA-28阻断的受感染细胞。应当指出，对3个继承了Dd2clag3基因座的后代克隆进行这些选择，但是没有对Dd2进行，因为该亲本系已经排它地表达clag3.1。这些选择对HB3或继承了它的clag3基因座的后代克隆没有作用，因为2个HB3等位基因中的任一个都不编码高亲和力ISPA-28抑制。
在这里，假定由ISPA-28实现的体外生长抑制也可以针对表达单个clag3基因的细胞进行选择。不受特定理论或机制的约束，据信，尽管山梨醇诱导的渗透性裂解会选择表达ISPA-28敏感的clag3.1的细胞，但是在PLM中的生长抑制将有利于表达抗性的clag3.2等位基因的细胞，因为仅仅其通道没有被ISPA-28阻断的寄生虫会满足它们的营养物需要。检验了后代克隆7C20，其携带Dd2clag3基因座且在未选择的培养物中表达2个等位基因(图4A-4B)。在山梨醇和ISPA-28中进行渗透性裂解选择以后，存活的寄生虫具有与Dd2亲本匹配的PSAC抑制剂亲和力，且主要表达clag3.1等位基因。然后在含有5μM ISPA-28的PLM中繁殖培养物共计10天；在该处理过程中对涂片的显微镜检查揭示了培养物的几乎完全灭菌。对在该第二处理中存活的寄生虫的运输研究揭示了ISPA-28亲和力的显著下降，从而指示使用PSAC抑制剂的体外繁殖可以用于选择改变的通道表型。RT-PCR证实了针对clag3.1的强阴性选择，以产生优先表达clag3.2的寄生虫群体。在其它染色体上的clag基因的表达也存在不大的变化，这提示，这些旁系同源物也可能促进PSAC活性。ISPA-28对体外生长抑制和对运输诱导的渗透性裂解的敏感性的相反作用，允许任一个clag3等位基因的纯化选择，并揭示了与通道表型的严格关联。
令人惊奇地，Dd2亲本系保持在未选择的培养物中排它表达clag3.1，尽管与7C20在clag3基因座处是同基因的(Nguitragool等人,Cell,145:665-677(2011))。为了探究可能的机制，寻找它来选择表达替代性的clag3.2等位基因的Dd2寄生虫。使用ISPA-43的渗透性裂解试验了运输选择，所述ISPA-43是一种在结构上独特的PSAC抑制剂，其对通过Dd2clag3.2的表达形成的通道的亲和力是clag3.1的10倍。尽管该方案已经成功地用于选择表达clag3.2的7C20寄生虫(Nguitragool等人,Cell,145:665-677(2011)，但是它不足以影响Dd2寄生虫中的通道表型，尽管历时4个月进行了重复选择。
用在含有ISPA-28的PLM中的生长抑制，尝试了阴性选择。在共计17天的2轮使用5μM ISPA-28的药物压力以后，在有限稀释后鉴别和表征了抗性细胞，以得到克隆Dd2-PLM28。与主要通过PSAC抑制的杀死相一致，使用该抗性克隆的运输研究揭示了抑制剂亲和力的显著下降(图5A)。尽管ISPA-28剂量应答在数量上与相同的基于PLM的选择以后的7C20寄生虫匹配(上面的实线,图5A)，但是全长clag3.2转录物仍然是不可检测的，从而排除了基因转换的简单预测。考虑了2个clag3基因之间的自发重组，并使用正向clag3.1引物和反向clag3.2引物鉴别了嵌合的clag3转录物；PCR证实，该嵌合体存在于选择的寄生虫的基因组中，但是在原始Dd2系中缺失。使用clag3特异性的探针的DNA印迹法在选择的克隆中检测出3个离散带，但是在未选择的Dd2寄生虫中仅检测出预期的2个带，其涉入在Dd2-PLM28中产生3个clag3基因的重组事件。约16kb的新带的大小与Dd2-PLM28中的clag3.1和clag3.2之间的同源重组相一致。DNA测序指示，该嵌合基因驱动它的5’非翻译区和来自clag3.1的基因的前约70％。在距离起始密码子3680和3965碱基对处的单核苷酸多态性之间的交换以后，该基因携带clag3.2的3’末端。因而，该嵌合基因由clag3.1启动子驱动，但是编码具有clag3.2的C-端可变结构域的蛋白。该改变的C-端导致对营养物摄取的降低的ISPA-28效力，并且因此导致该克隆在所述选择中的存活。不受特定理论或机制的约束，据信，提议的同源重组也会产生具有单个clag3基因和高ISPA-28亲和力的寄生虫，但是没有预见到该重组会幸免于在含有ISPA-28的PLM中的生长抑制选择。
然后使用定量RT-PCR来检验clag基因在Dd2-PLM28中的转录，并发现所述嵌合基因被优先表达(是clag3.1的8.9±1.3倍，P<0.002)。使用在含ISPA-28的山梨醇中的基于运输的选择，检验Dd2-PLM28是否可以经历表达转换。该二次选择产生了几乎排它地表达天然clag3.1的寄生虫(PLM-rev,图5B)。如预期的，运输研究揭示了与原始Dd2系相同的ISPA-28剂量应答。因而，新的嵌合的clag3基因可以经历表观遗传的沉默和与clag3.1的转换。该基因的启动子区域的DNA测序没有揭示相对于7C20的启动子区域的任何突变。
不受特定理论或机制的约束，据信，2个clag3基因之间的重组相对容易地发生，这与寄生虫的亚端粒区域中的频繁重组事件的报道相一致(Freitas-Junior等人,Nature,407:1018-22(2000))。还认为，这样的重组事件可能用于增加PSAC表型的多样性，在这里似乎会提供具有3个clag3基因的寄生虫在选择压力下的存活。
实施例10
本实施例证实了PSAC抑制剂在PLM和标准培养基中的生长抑制作用的对比。
呋塞米和丹曲林是已知的具有相对较低的PSAC亲和力的非特异性抑制剂。这些化合物也会被血清吸附，却是被批准用于其它人疾病的治疗剂。它们在标准培养基中对寄生虫生长仅是弱有效的，但是在PLM中具有显著提高的活性。还试验了8种高亲和力PSAC抑制剂，它们得自最近通过高通量筛选鉴别出的5种独特支架(Pillai等人,Mol.Pharmacol.,77:724-733(2010))。当降低营养物浓度时，每种表现出显著提高的效能，从而强化了所述通道在营养物获取中的作用的证据。效力的提高程度是可变的，但是许多化合物在营养物限制后表现出在寄生虫杀死方面的超过100倍提高(IC50比率,表5)。诸如抑制剂:通道相互作用的化学计量学和引起的通道阻断的浓度依赖性的变化、培养物中的化合物稳定性、以及血清的吸附等因素可能影响该比率。
为了探究治疗潜力，在体外检验了HeLa细胞细胞毒性。发现几种有效的PSAC抑制剂是无毒的，且对寄生虫杀死是高度特异性的(表6)。
表6
最后，用氯喹、甲氟喹和青蒿素(被批准的作用于细胞内寄生虫中的无关靶标的抗疟疾药)进行了体外生长抑制实验。这些药物不会抑制PSAC介导的溶质摄取。与PSAC抑制剂的提高杀死相比，这些药物在PLM中的有效性稍微低于在RPMI中(表5)，从而排除了改进的体外生长条件的非特异性作用。不受特定理论或机制的约束，据信，在营养物限制下PSAC抑制剂的寄生虫杀死的稳健提高不同于对现有抗疟疾药的作用，并且因此涉及新颖的作用机理。因为分离株-特异性的和广谱的PSAC抑制剂在PLM中表现出提高的效力，所以这些研究提供了PSAC对细胞内寄生虫的营养物摄取的影响的实验证据。
本文引用的所有的参考文献，包括出版物、专利申请和专利，通过引用以如同每一参考文献单独且特别表示通过引用结合的相同程度结合于此，并且在本文中完全阐述。
术语“一个”和”一种”和”所述”以及相似指示词在描述本发明的上下文中(特别是在后附权利要求中)的使用应该解释为涵盖单数和复数，除非另外在本文中指明或者明显与上下文相抵触。术语“包括”，“具有”，“包含”，和“含有”应该被解释为开放的术语(即，意指“包括，但不限于”)，除非另外指明。本文中数值范围的引用仅意欲作为单独引用落入该范围的每个独立值的速记方法，除非本文中另外指明，并且每个独立值结合在本说明书中，如同其在本文中独立地引用那样。本文所述的所有方法可以以任何适当的顺序进行，除非本文另外指明或者明显与上下文相抵触。本文提供的任何和全部实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意欲更好地举例说明本发明，并且不产生对本发明范围的限制，除非另外要求。在本说明书中没有任何语言应该被解释为指示对实施本发明是重要的任何未要求的元件。
本文记述了本发明的优选的实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。当阅读前述说明书后，对于本领域的普通技术人员，这些优选实施方案的变化可以变得显而易见。本发明人预计熟练的技术人员适当使用所有变化，并且本发明人意欲本发明以与本文具体描述不同的方式实施。因此，本发明包括在后附权利要求中引用的主题由现行法律所允许的所有改进和等价物。此外，本发明包括上述要素以其所有可能的变化的任意组合，除非本文另外指明，或者明显与上下文相抵触。
序列表
<110> 美国卫生和人力服务部
<120> 用于治疗或预防疟疾的疟原虫表面阴离子通道抑制剂
<130> 709937
<150> US 61/474,583
<151> 2011-04-12
<160> 79
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 4254
<212> DNA
<213> 恶性疟原虫
<400> 1
atggtttcat tttttaaaac tccaatcttt attttaatta tctttttata cttaaatgaa 60
aaggtaatat gttcaataaa tgaaaatcaa aatgaaaatg ataccattag tcaaaatgtc 120
aaccaacatg aaaatattaa tcaaaatgta aatgataatg acaatattga acaattaaaa 180
tccatgattg gaaatgatga actacataag aatttaacaa tattagaaaa attaatttta 240
gagtctttag aaaaagataa attaaaatat cctctcctta aacaaggaac tgaacaattg 300
atagatatat caaaatttaa taaaaaaaat attacagatg cggatgatga aacgtacatc 360
atacccaccg tccaatcaac gtttcacgat attgtgaaat acgaacatct tataaaagaa 420
caatcaatag aaatttacaa ttctgatata tcagataaaa ttaagaaaaa aatttttata 480
gtaagaacat tgaaaaccat aaaattaatg cttataccat taaactcgta caaacaaaat 540
aatgacttga aatctgcact cgaagaatta aataatgtat ttacaaacaa agaagctcaa 600
gaggaaagca gtccaatagg cgaccatggg acattcttta gaaaattgtt aacacatgtt 660
agaacaatta aagaaaatga agatatagaa aataaaggag aaacacttat attaggcgat 720
aataaaatag atgtaatgaa ttcaaacgat ttctttttta caaccaactc aaatgtaaaa 780
tttatggaaa atttagatga tataacaaat caatatggat taggtttgat taatcatcta 840
ggtcctcatt taatagcctt gggtcatttt accgtattaa aattagcact aaaaaattac 900
aaaaactatt ttgaagcaaa aagtattaaa ttttttagtt ggcaaaaaat tttagagttc 960
tccatgtctg atagatttaa agttcttgat atgatgtgtg accatgaatc tgtatactat 1020
tccgaaaaaa aacgtagaaa aacatattta aaagttgaca gatcaaatac atctatggaa 1080
tgtaatatat tggaatattt attacattat tttaataaat accaactaga aataattaaa 1140
actacacaag atactgattt tgacttacat ggtatgatgg aacataaata tataaaagat 1200
tatttctttt catttatgtg taatgatcct aaagaatgta ttatttatca tacgaatcaa 1260
tttaaaaaag aagccaacga agaaaacaca tttcctgaac aagaagaacc taaccgtcaa 1320
ataagtgcat ttaatttata tttaaattat tattatttca tgaaacgtta tagttcatat 1380
ggagtaaaaa agacattata tgttcattta ttaaatttaa ctggactttt aaattatgat 1440
acaagagcat acgtgacatc actttattta ccaggatatt acaacgctgt cgaaatgtct 1500
tttacggaag aaaaagagtt ttccaaactt tttgaaagct taatacaatg tattgaaaaa 1560
tgccattcag accaagcaag gcaaatatca aaagatagta atttacttaa taatataaca 1620
aaatgtgatt tgtgtaaagg agccttttta tatgctaata tgaaattcga tgaagttcct 1680
tcaatgttgc aaaaatttta cgtatattta actaaaggtc tcaaaataca aaaagtatca 1740
tcactaatca aaacgctaga tatatatcaa gattacagca attacttatc acatgatatt 1800
aattggtaca cattcctatt tttatttaga cttacaagtt ttaaagaaat tgcaaagaaa 1860
aatgttgctg aagcaatgta tttaaatata aaagatgaag acacattcaa caaaacggta 1920
gtaacaaact attggtaccc atctcctata aaaaaatatt atacattata tgttagaaaa 1980
catataccaa ataatttagt agatgaattg gagaaattaa tgaaaagtgg cactttagaa 2040
aaaatgaaaa aatctctcac ctttttagta catgtgaatt catttttaca attagatttt 2100
ttccatcaat taaatgaacc acctcttgga ttacctcgat catatccatt atcgttagtt 2160
ctcgaacata aatttaaaga atggatgaac agttcgccag caggtttcta tttttcaaat 2220
tatcaaaatc catatatcag aaaagatttg catgataaag ttttatcaca aaaatttgaa 2280
ccacctaaaa tgaatcagtg gaacaaagtt ttgaaatcat taattgaatg cgcatatgat 2340
atgtattttg aacagagaca tgttaaaaat ttatataaat atcataacat ttataatata 2400
aataacaaat taatgttaat gcgagattca atcgatttgt ataaaaacaa ttttgacgat 2460
gtgttatttt ttgcggatat atttaatatg agaaaatata tgacagctac accagtatat 2520
aaaaaagtaa aagacagagt gtaccataca ttgcatagta ttacaggaaa ttctgtcaat 2580
ttttataaat atggtattat atatggattt aaagtaaaca aagaaatatt aaaagaagtt 2640
gtcgatgaat tgtattccat ctataatttt aacaccgaca tatttacgga tacttccttt 2700
ttacaaaccg tttatttatt atttagaaga atagaagaaa cctataggac ccaaagaaga 2760
gatgataaaa ttagtgtgaa taacgttttt ttcatgaatg ttgctaataa ttattccaaa 2820
ttaaacaaag aagaaagaga aatcgaaata cataattcca tggcatcaag atattatgca 2880
aaaacgatgt ttgcagcatt tcaaatgtta ttttcaacaa tgttgagcaa caatgtagat 2940
aatcttgata aagcatatgg attaagtgaa aatatccaag tagcaacaag tacttccgct 3000
tttcttactt ttgcatatgt atataacgga agtataatgg atagtgtgac taacagttta 3060
ttgccaccat atgcgaagaa acctataaca caattaaaat atggaaaaac cttcgttttc 3120
tcaaactatt tcatgctagc atccaaaatg tatgatatgt taaattataa aaatttaagt 3180
cttttatgtg aatatcaggc tgtggcaagt gccaatttct actctgctaa aaaggtaggt 3240
cagtttcttg gaagaaaatt tttacccata actacatatt ttctagtaat gagaattagt 3300
tggacacatg cttttacaac tggacaacat ttgattagcg cttttggttc cccaagttct 3360
actgctaatg gtaaaagtaa tgctagtggt tataaatccc ctgaaagttt tttcttcact 3420
cacggacttg ctgctgaagc atccaaatat ttattttttt attttttcac aaatttatac 3480
cttgatgcct acaaatcttt tcctggagga tttggtcctg caataaaaga acaaactcaa 3540
catgttcaag aacaaaccta cgaacgcaaa ccgtcagttc atagttttaa tagaaatttt 3600
ttcatggaac tcgtaaatgg attcatgtat gccttttgtt tttttgcaat ttctcaaatg 3660
tatgcatatt ttgaaaatat taatttttat attacaagta atttccgttt cttggataga 3720
tattatggtg tattcaataa atattttata aactatgcca taattaaact taaagaaatt 3780
actagtgatc ttttaataaa atatgaacgt gaggcttatt taagtatgaa aaaatatggt 3840
tatttaggtg aagttattgc agctagactt tctccaaaag ataaaattat gaattatgtg 3900
cacgaaacta acgaagatat catgagtaat ttaagaagat atgatatgga aaatgctttc 3960
aaaaacaaaa tgtcaacata tgtagatgat tttgcttttt ttgatgattg cggaaaaaat 4020
gaacaatttt taaatgagag atgtgattat tgtcctgtaa ttgaagaggt cgaagaaaca 4080
caattattta ctaccactgg tgataaaaac actaataaga ccacggaaat aaaaaaacaa 4140
actagtacat atattgatac tgaaaaaatg aatgaagcgg attctgctga tagcgacgat 4200
gaaaaggatt ctgatactcc tgacgatgaa ttaatgatat cacgatttca ctaa 4254
<210> 2
<211> 1417
<212> PRT
<213> 恶性疟原虫
<400> 2
Met Val Ser Phe Phe Lys Thr Pro Ile Phe Ile Leu Ile Ile Phe Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Asn Glu Lys Val Ile Cys Ser Ile Asn Glu Asn Gln Asn Glu
20 25 30
Asn Asp Thr Ile Ser Gln Asn Val Asn Gln His Glu Asn Ile Asn Gln
35 40 45
Asn Val Asn Asp Asn Asp Asn Ile Glu Gln Leu Lys Ser Met Ile Gly
50 55 60
Asn Asp Glu Leu His Lys Asn Leu Thr Ile Leu Glu Lys Leu Ile Leu
65 70 75 80
Glu Ser Leu Glu Lys Asp Lys Leu Lys Tyr Pro Leu Leu Lys Gln Gly
85 90 95
Thr Glu Gln Leu Ile Asp Ile Ser Lys Phe Asn Lys Lys Asn Ile Thr
100 105 110
Asp Ala Asp Asp Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Thr Val Gln Ser Thr Phe
115 120 125
His Asp Ile Val Lys Tyr Glu His Leu Ile Lys Glu Gln Ser Ile Glu
130 135 140
Ile Tyr Asn Ser Asp Ile Ser Asp Lys Ile Lys Lys Lys Ile Phe Ile
145 150 155 160
Val Arg Thr Leu Lys Thr Ile Lys Leu Met Leu Ile Pro Leu Asn Ser
165 170 175
Tyr Lys Gln Asn Asn Asp Leu Lys Ser Ala Leu Glu Glu Leu Asn Asn
180 185 190
Val Phe Thr Asn Lys Glu Ala Gln Glu Glu Ser Ser Pro Ile Gly Asp
195 200 205
His Gly Thr Phe Phe Arg Lys Leu Leu Thr His Val Arg Thr Ile Lys
210 215 220
Glu Asn Glu Asp Ile Glu Asn Lys Gly Glu Thr Leu Ile Leu Gly Asp
225 230 235 240
Asn Lys Ile Asp Val Met Asn Ser Asn Asp Phe Phe Phe Thr Thr Asn
245 250 255
Ser Asn Val Lys Phe Met Glu Asn Leu Asp Asp Ile Thr Asn Gln Tyr
260 265 270
Gly Leu Gly Leu Ile Asn His Leu Gly Pro His Leu Ile Ala Leu Gly
275 280 285
His Phe Thr Val Leu Lys Leu Ala Leu Lys Asn Tyr Lys Asn Tyr Phe
290 295 300
Glu Ala Lys Ser Ile Lys Phe Phe Ser Trp Gln Lys Ile Leu Glu Phe
305 310 315 320
Ser Met Ser Asp Arg Phe Lys Val Leu Asp Met Met Cys Asp His Glu
325 330 335
Ser Val Tyr Tyr Ser Glu Lys Lys Arg Arg Lys Thr Tyr Leu Lys Val
340 345 350
Asp Arg Ser Asn Thr Ser Met Glu Cys Asn Ile Leu Glu Tyr Leu Leu
355 360 365
His Tyr Phe Asn Lys Tyr Gln Leu Glu Ile Ile Lys Thr Thr Gln Asp
370 375 380
Thr Asp Phe Asp Leu His Gly Met Met Glu His Lys Tyr Ile Lys Asp
385 390 395 400
Tyr Phe Phe Ser Phe Met Cys Asn Asp Pro Lys Glu Cys Ile Ile Tyr
405 410 415
His Thr Asn Gln Phe Lys Lys Glu Ala Asn Glu Glu Asn Thr Phe Pro
420 425 430
Glu Gln Glu Glu Pro Asn Arg Gln Ile Ser Ala Phe Asn Leu Tyr Leu
435 440 445
Asn Tyr Tyr Tyr Phe Met Lys Arg Tyr Ser Ser Tyr Gly Val Lys Lys
450 455 460
Thr Leu Tyr Val His Leu Leu Asn Leu Thr Gly Leu Leu Asn Tyr Asp
465 470 475 480
Thr Arg Ala Tyr Val Thr Ser Leu Tyr Leu Pro Gly Tyr Tyr Asn Ala
485 490 495
Val Glu Met Ser Phe Thr Glu Glu Lys Glu Phe Ser Lys Leu Phe Glu
500 505 510
Ser Leu Ile Gln Cys Ile Glu Lys Cys His Ser Asp Gln Ala Arg Gln
515 520 525
Ile Ser Lys Asp Ser Asn Leu Leu Asn Asn Ile Thr Lys Cys Asp Leu
530 535 540
Cys Lys Gly Ala Phe Leu Tyr Ala Asn Met Lys Phe Asp Glu Val Pro
545 550 555 560
Ser Met Leu Gln Lys Phe Tyr Val Tyr Leu Thr Lys Gly Leu Lys Ile
565 570 575
Gln Lys Val Ser Ser Leu Ile Lys Thr Leu Asp Ile Tyr Gln Asp Tyr
580 585 590
Ser Asn Tyr Leu Ser His Asp Ile Asn Trp Tyr Thr Phe Leu Phe Leu
595 600 605
Phe Arg Leu Thr Ser Phe Lys Glu Ile Ala Lys Lys Asn Val Ala Glu
610 615 620
Ala Met Tyr Leu Asn Ile Lys Asp Glu Asp Thr Phe Asn Lys Thr Val
625 630 635 640
Val Thr Asn Tyr Trp Tyr Pro Ser Pro Ile Lys Lys Tyr Tyr Thr Leu
645 650 655
Tyr Val Arg Lys His Ile Pro Asn Asn Leu Val Asp Glu Leu Glu Lys
660 665 670
Leu Met Lys Ser Gly Thr Leu Glu Lys Met Lys Lys Ser Leu Thr Phe
675 680 685
Leu Val His Val Asn Ser Phe Leu Gln Leu Asp Phe Phe His Gln Leu
690 695 700
Asn Glu Pro Pro Leu Gly Leu Pro Arg Ser Tyr Pro Leu Ser Leu Val
705 710 715 720
Leu Glu His Lys Phe Lys Glu Trp Met Asn Ser Ser Pro Ala Gly Phe
725 730 735
Tyr Phe Ser Asn Tyr Gln Asn Pro Tyr Ile Arg Lys Asp Leu His Asp
740 745 750
Lys Val Leu Ser Gln Lys Phe Glu Pro Pro Lys Met Asn Gln Trp Asn
755 760 765
Lys Val Leu Lys Ser Leu Ile Glu Cys Ala Tyr Asp Met Tyr Phe Glu
770 775 780
Gln Arg His Val Lys Asn Leu Tyr Lys Tyr His Asn Ile Tyr Asn Ile
785 790 795 800
Asn Asn Lys Leu Met Leu Met Arg Asp Ser Ile Asp Leu Tyr Lys Asn
805 810 815
Asn Phe Asp Asp Val Leu Phe Phe Ala Asp Ile Phe Asn Met Arg Lys
820 825 830
Tyr Met Thr Ala Thr Pro Val Tyr Lys Lys Val Lys Asp Arg Val Tyr
835 840 845
His Thr Leu His Ser Ile Thr Gly Asn Ser Val Asn Phe Tyr Lys Tyr
850 855 860
Gly Ile Ile Tyr Gly Phe Lys Val Asn Lys Glu Ile Leu Lys Glu Val
865 870 875 880
Val Asp Glu Leu Tyr Ser Ile Tyr Asn Phe Asn Thr Asp Ile Phe Thr
885 890 895
Asp Thr Ser Phe Leu Gln Thr Val Tyr Leu Leu Phe Arg Arg Ile Glu
900 905 910
Glu Thr Tyr Arg Thr Gln Arg Arg Asp Asp Lys Ile Ser Val Asn Asn
915 920 925
Val Phe Phe Met Asn Val Ala Asn Asn Tyr Ser Lys Leu Asn Lys Glu
930 935 940
Glu Arg Glu Ile Glu Ile His Asn Ser Met Ala Ser Arg Tyr Tyr Ala
945 950 955 960
Lys Thr Met Phe Ala Ala Phe Gln Met Leu Phe Ser Thr Met Leu Ser
965 970 975
Asn Asn Val Asp Asn Leu Asp Lys Ala Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Ile
980 985 990
Gln Val Ala Thr Ser Thr Ser Ala Phe Leu Thr Phe Ala Tyr Val Tyr
995 1000 1005
Asn Gly Ser Ile Met Asp Ser Val Thr Asn Ser Leu Leu Pro Pro
1010 1015 1020
Tyr Ala Lys Lys Pro Ile Thr Gln Leu Lys Tyr Gly Lys Thr Phe
1025 1030 1035
Val Phe Ser Asn Tyr Phe Met Leu Ala Ser Lys Met Tyr Asp Met
1040 1045 1050
Leu Asn Tyr Lys Asn Leu Ser Leu Leu Cys Glu Tyr Gln Ala Val
1055 1060 1065
Ala Ser Ala Asn Phe Tyr Ser Ala Lys Lys Val Gly Gln Phe Leu
1070 1075 1080
Gly Arg Lys Phe Leu Pro Ile Thr Thr Tyr Phe Leu Val Met Arg
1085 1090 1095
Ile Ser Trp Thr His Ala Phe Thr Thr Gly Gln His Leu Ile Ser
1100 1105 1110
Ala Phe Gly Ser Pro Ser Ser Thr Ala Asn Gly Lys Ser Asn Ala
1115 1120 1125
Ser Gly Tyr Lys Ser Pro Glu Ser Phe Phe Phe Thr His Gly Leu
1130 1135 1140
Ala Ala Glu Ala Ser Lys Tyr Leu Phe Phe Tyr Phe Phe Thr Asn
1145 1150 1155
Leu Tyr Leu Asp Ala Tyr Lys Ser Phe Pro Gly Gly Phe Gly Pro
1160 1165 1170
Ala Ile Lys Glu Gln Thr Gln His Val Gln Glu Gln Thr Tyr Glu
1175 1180 1185
Arg Lys Pro Ser Val His Ser Phe Asn Arg Asn Phe Phe Met Glu
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Leu Val Asn Gly Phe Met Tyr Ala Phe Cys Phe Phe Ala Ile Ser
1205 1210 1215
Gln Met Tyr Ala Tyr Phe Glu Asn Ile Asn Phe Tyr Ile Thr Ser
1220 1225 1230
Asn Phe Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Tyr Gly Val Phe Asn Lys Tyr
1235 1240 1245
Phe Ile Asn Tyr Ala Ile Ile Lys Leu Lys Glu Ile Thr Ser Asp
1250 1255 1260
Leu Leu Ile Lys Tyr Glu Arg Glu Ala Tyr Leu Ser Met Lys Lys
1265 1270 1275
Tyr Gly Tyr Leu Gly Glu Val Ile Ala Ala Arg Leu Ser Pro Lys
1280 1285 1290
Asp Lys Ile Met Asn Tyr Val His Glu Thr Asn Glu Asp Ile Met
1295 1300 1305
Ser Asn Leu Arg Arg Tyr Asp Met Glu Asn Ala Phe Lys Asn Lys
1310 1315 1320
Met Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Ala Phe Phe Asp Asp Cys Gly
1325 1330 1335
Lys Asn Glu Gln Phe Leu Asn Glu Arg Cys Asp Tyr Cys Pro Val
1340 1345 1350
Ile Glu Glu Val Glu Glu Thr Gln Leu Phe Thr Thr Thr Gly Asp
1355 1360 1365
Lys Asn Thr Asn Lys Thr Thr Glu Ile Lys Lys Gln Thr Ser Thr
1370 1375 1380
Tyr Ile Asp Thr Glu Lys Met Asn Glu Ala Asp Ser Ala Asp Ser
1385 1390 1395
Asp Asp Glu Lys Asp Ser Asp Thr Pro Asp Asp Glu Leu Met Ile
1400 1405 1410
Ser Arg Phe His
1415
<210> 3
<211> 4251
<212> DNA
<213> 恶性疟原虫
<400> 3
atggtttcat tttttaagac tccgatcatt attttttttt tcctcttatg tttaaatgaa 60
aaggtattat gttcaataaa tgaaaatgaa aatttaggcg aaaataaaaa cgaaaatgca 120
aatgtaaaca cacctgaaaa tttaaataaa cttctaaatg agtatgacaa tattgaacaa 180
ttaaaatcca tgataggaaa tgatgaacta cataagaatt taacaatatt agaaaaatta 240
attttagagt ctctagaaaa agataaatta aaatatcctc tccttaaaca aggaactgaa 300
caattgatag atatatcaaa atttaataaa aaaaatatta cagatgcgga tgatgaaacg 360
tacatcatac ctaccgtcca atcaagcttt cacgatattg taaaatatga acatcttata 420
aaagaacaat caatagaaat ttataattct gatatatcag ataaaattaa gaaaaaaata 480
tttattgtaa gaacattgaa aacaataaaa ttaatgctta taccattaaa ttcatacaaa 540
caaaataatg atttgaaatc tgcgctcgaa gaattaaata atgtatttac aaacaaagaa 600
gctcaaaagg aaagcagtcc aataggcgac catgggacat tctttagaaa attgttaaca 660
catgttagaa caattaaaga aaatgaagat atagaaaata aaggagaaac acttatatta 720
ggcgataata aaatagatgt aatgaattca aacgatttct tttttacaac caactcaaat 780
gtaaaattta tggaaaattt agatgatata acaaatcaat atggattagg tttgattaat 840
catttgggtc ctcatttaat agccttggga cattttgttg tattaaaatt agcactaaaa 900
aattacaaaa attattttga agcaaaaaat ataaaatttt ttagttggca aaaaatttta 960
gagttctcca tgtctgatag atttaaggtt cttgatatga tgtgtaacca tgaatctgta 1020
tattattccg aaaaaaaacg tagaaagaca tatttaaaag tcgacagatc aagcacatct 1080
atggaatgta atatattgga atatttatta cattatttta ataaatacca actagaaata 1140
attaaaacta cacaagatac agatttcgat ttacatggta tgatggaaca taaatatata 1200
aaagattatt tcttttcatt tatgtgtaac gatcctaaag aatgtattat ttatcatacg 1260
aatcaattta aaaaagaagc taacgaagaa aacacttttc ctgaacaaga agaacctaac 1320
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catgatacaa gagcatacgt gacatccctt tatttaccag gatattacaa cgctgtcgaa 1500
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gtatcatcac taatcaaaac gctagatata tatcaagatt acagtaattt cttatcacat 1800
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gtagataatc ttgataaagc atatggatta agtgaaaata tccaagtagc aacaagtact 3000
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agtttattgc caccatatgc gaagaaacct ataacacaat taaaatatgg aaaaaccttc 3120
gttttctcaa actatttcat gctagcatcc aaaatgtatg atatgttaaa ttataaaaat 3180
ttaagtcttt tatgtgaata tcaggctgtg gcaagtgcca atttctactc tgctaaaaag 3240
gtaggtcagt ttcttggaag aaaattttta cccataacta catattttct agtaatgaga 3300
attagttgga cacatgcttt tacaactgga caacatttga tttgcgcttt tgatcccaaa 3360
agatgtactc ctgattgtaa aaatagtact agttataaat ctcctcaaag ttttttttac 3420
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gttcaagaac aaacctacga acgcaaaccg tcagttcata gttttaatag aaattttttc 3600
atggaactcg taaatggatt catgtatgcc ttttgttttt ttgcaatttc tcaaatgtat 3660
gcatattttg aaaatattaa tttttatatt acaagtaatt tccgtttctt ggatagatat 3720
tatggtgtat tcaataaata ttttataaac tatgccataa ttaaacttaa agaaattact 3780
agtgatcttt taataaaata tgaacgtgag gcttatttaa gtatgaaaaa atatggttat 3840
ttaggtgaag ttattgcagc tagactttct ccaaaagata aaattatgaa ttatgtgcac 3900
gaaactaacg aagatatcat gagtaattta agaagatatg atatggaaaa tgctttcaaa 3960
aacaaaatgg ttacttatgt ggatgacttt gctttttttg atgattgtgg caaaaatgaa 4020
caatttttaa atgaaagatg tgattattgc cctgtaattg aagaggtgga agaaacacaa 4080
ttatttacta ccactggtga taaaaatact aatgagacca cggaaataaa aaaacaaact 4140
agtacatata ttgatactga aaaaatgaat gaagcggatt ctgctgatag cgacgatgaa 4200
aaggattttg atactcctga caatgaatta atgatcgcac gatttcatta a 4251
<210> 4
<211> 1416
<212> PRT
<213> 恶性疟原虫
<400> 4
Met Val Ser Phe Phe Lys Thr Pro Ile Ile Ile Phe Phe Phe Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Asn Glu Lys Val Leu Cys Ser Ile Asn Glu Asn Glu Asn Leu
20 25 30
Gly Glu Asn Lys Asn Glu Asn Ala Asn Val Asn Thr Pro Glu Asn Leu
35 40 45
Asn Lys Leu Leu Asn Glu Tyr Asp Asn Ile Glu Gln Leu Lys Ser Met
50 55 60
Ile Gly Asn Asp Glu Leu His Lys Asn Leu Thr Ile Leu Glu Lys Leu
65 70 75 80
Ile Leu Glu Ser Leu Glu Lys Asp Lys Leu Lys Tyr Pro Leu Leu Lys
85 90 95
Gln Gly Thr Glu Gln Leu Ile Asp Ile Ser Lys Phe Asn Lys Lys Asn
100 105 110
Ile Thr Asp Ala Asp Asp Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Thr Val Gln Ser
115 120 125
Ser Phe His Asp Ile Val Lys Tyr Glu His Leu Ile Lys Glu Gln Ser
130 135 140
Ile Glu Ile Tyr Asn Ser Asp Ile Ser Asp Lys Ile Lys Lys Lys Ile
145 150 155 160
Phe Ile Val Arg Thr Leu Lys Thr Ile Lys Leu Met Leu Ile Pro Leu
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Asn Asn Val Phe Thr Asn Lys Glu Ala Gln Lys Glu Ser Ser Pro Ile
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Gly Asp Asn Lys Ile Asp Val Met Asn Ser Asn Asp Phe Phe Phe Thr
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355 360 365
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His Asp Thr Arg Ala Tyr Val Thr Ser Leu Tyr Leu Pro Gly Tyr Tyr
485 490 495
Asn Ala Val Glu Met Ser Phe Thr Asp Asp Lys Glu Phe Ser Thr Leu
500 505 510
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Met Tyr Ala Tyr Phe Glu Asn Ile Asn Phe Tyr Ile Thr Ser Asn
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Phe Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Tyr Gly Val Phe Asn Lys Tyr Phe
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Gly Tyr Leu Gly Glu Val Ile Ala Ala Arg Leu Ser Pro Lys Asp
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Val Thr Tyr Val Asp Asp Phe Ala Phe Phe Asp Asp Cys Gly Lys
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tattcggtac ctttgtaata tacctttatg cgttgaca 38
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<223> 合成的
<400> 61
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Gly Thr Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Tyr Leu Gly Glu Val Ile Ala Ala Arg Leu Ser Pro Lys
20 25 30
Asp Lys Ile Met Asn Tyr Val His Glu Thr Asn Glu Asp Ile Met Ser
35 40 45
Asn Leu Arg Arg Tyr Asp Met Glu Asn Ala Phe Lys Asn Lys Met Ser
50 55 60
Thr Tyr Val Asp Asp Phe Ala Phe Phe Asp Asp Cys Gly Lys Asn Glu
65 70 75 80
Gln Phe Leu Asn Glu Arg Cys Asp Tyr Cys Pro Val Ile Glu Glu Val
85 90 95
Glu Glu Thr Gln Leu Phe Thr Thr Thr Gly Asp Lys Asn Thr Asn Lys
100 105 110
Thr Thr Glu Ile Lys Lys Gln Thr Ser Thr Tyr Ile Asp Thr Glu Lys
115 120 125
Met Asn Glu Ala Asp Ser Ala Asp Ser Asp Asp Glu Lys Asp Ser Asp
130 135 140
Thr Pro Asp Asp Glu Leu Met Ile Ser Arg Phe His Asp Tyr Lys Asp
145 150 155 160
Asp Asp Asp Lys
<210> 62
<211> 146
<212> PRT
<213> 恶性疟原虫
<400> 62
Cys Glu Tyr Gln Ala Val Ala Ser Ala Asn Phe Tyr Ser Ala Lys Lys
1 5 10 15
Val Gly Gln Phe Leu Gly Arg Lys Phe Leu Pro Ile Thr Thr Tyr Phe
20 25 30
Leu Val Met Arg Ile Ser Trp Thr His Ala Phe Thr Thr Gly Gln His
35 40 45
Leu Ile Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ser Ser Thr Ala Asn Gly Lys Ser
50 55 60
Asn Ala Ser Gly Tyr Lys Ser Pro Glu Ser Phe Phe Phe Thr His Gly
65 70 75 80
Leu Ala Ala Glu Ala Ser Lys Tyr Leu Phe Phe Tyr Phe Phe Thr Asn
85 90 95
Leu Tyr Leu Asp Ala Tyr Lys Ser Phe Pro Gly Gly Phe Gly Pro Ala
100 105 110
Ile Lys Glu Gln Thr Gln His Val Gln Glu Gln Thr Tyr Glu Arg Lys
115 120 125
Pro Ser Val His Ser Phe Asn Arg Asn Phe Phe Met Glu Leu Val Asn
130 135 140
Gly Phe
145
<210> 63
<211> 438
<212> DNA
<213> 恶性疟原虫
<400> 63
tgtgaatatc aggctgtggc aagtgccaat ttctactctg ctaaaaaggt aggtcagttt 60
cttggaagaa aatttttacc cataactaca tattttctag taatgagaat tagttggaca 120
catgctttta caactggaca acatttgatt agcgcttttg gttccccaag ttctactgct 180
aatggtaaaa gtaatgctag tggttataaa tcccctgaaa gttttttctt cactcacgga 240
cttgctgctg aagcatccaa atatttattt ttttattttt tcacaaattt ataccttgat 300
gcctacaaat cttttcctgg aggatttggt cctgcaataa aagaacaaac tcaacatgtt 360
caagaacaaa cctacgaacg caaaccgtca gttcatagtt ttaatagaaa ttttttcatg 420
gaactcgtaa atggattc 438
<210> 64
<211> 186
<212> PRT
<213> 恶性疟原虫
<400> 64
Thr Ser Asn Phe Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Tyr Gly Val Phe Asn Lys
1 5 10 15
Tyr Phe Ile Asn Tyr Ala Ile Ile Lys Leu Lys Glu Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Leu Leu Ile Lys Tyr Glu Arg Glu Ala Tyr Leu Ser Met Lys Lys Tyr
35 40 45
Gly Tyr Leu Gly Glu Val Ile Ala Ala Arg Leu Ser Pro Lys Asp Lys
50 55 60
Ile Met Asn Tyr Val His Glu Thr Asn Glu Asp Ile Met Ser Asn Leu
65 70 75 80
Arg Arg Tyr Asp Met Glu Asn Ala Phe Lys Asn Lys Met Ser Thr Tyr
85 90 95
Val Asp Asp Phe Ala Phe Phe Asp Asp Cys Gly Lys Asn Glu Gln Phe
100 105 110
Leu Asn Glu Arg Cys Asp Tyr Cys Pro Val Ile Glu Glu Val Glu Glu
115 120 125
Thr Gln Leu Phe Thr Thr Thr Gly Asp Lys Asn Thr Asn Lys Thr Thr
130 135 140
Glu Ile Lys Lys Gln Thr Ser Thr Tyr Ile Asp Thr Glu Lys Met Asn
145 150 155 160
Glu Ala Asp Ser Ala Asp Ser Asp Asp Glu Lys Asp Ser Asp Thr Pro
165 170 175
Asp Asp Glu Leu Met Ile Ser Arg Phe His
180 185
<210> 65
<211> 558
<212> DNA
<213> 恶性疟原虫
<400> 65
acaagtaatt tccgtttctt ggatagatat tatggtgtat tcaataaata ttttataaac 60
tatgccataa ttaaacttaa agaaattact agtgatcttt taataaaata tgaacgtgag 120
gcttatttaa gtatgaaaaa atatggttat ttaggtgaag ttattgcagc tagactttct 180
ccaaaagata aaattatgaa ttatgtgcac gaaactaacg aagatatcat gagtaattta 240
agaagatatg atatggaaaa tgctttcaaa aacaaaatgt caacatatgt agatgatttt 300
gctttttttg atgattgcgg aaaaaatgaa caatttttaa atgagagatg tgattattgt 360
cctgtaattg aagaggtcga agaaacacaa ttatttacta ccactggtga taaaaacact 420
aataagacca cggaaataaa aaaacaaact agtacatata ttgatactga aaaaatgaat 480
gaagcggatt ctgctgatag cgacgatgaa aaggattctg atactcctga cgatgaatta 540
atgatatcac gatttcac 558
<210> 66
<211> 308
<212> PRT
<213> 恶性疟原虫
<400> 66
Ser Ile Asn Glu Asn Gln Asn Glu Asn Asp Thr Ile Ser Gln Asn Val
1 5 10 15
Asn Gln His Glu Asn Ile Asn Gln Asn Val Asn Asp Asn Asp Asn Ile
20 25 30
Glu Gln Leu Lys Ser Met Ile Gly Asn Asp Glu Leu His Lys Asn Leu
35 40 45
Thr Ile Leu Glu Lys Leu Ile Leu Glu Ser Leu Glu Lys Asp Lys Leu
50 55 60
Lys Tyr Pro Leu Leu Lys Gln Gly Thr Glu Gln Leu Ile Asp Ile Ser
65 70 75 80
Lys Phe Asn Lys Lys Asn Ile Thr Asp Ala Asp Asp Glu Thr Tyr Ile
85 90 95
Ile Pro Thr Val Gln Ser Thr Phe His Asp Ile Val Lys Tyr Glu His
100 105 110
Leu Ile Lys Glu Gln Ser Ile Glu Ile Tyr Asn Ser Asp Ile Ser Asp
115 120 125
Lys Ile Lys Lys Lys Ile Phe Ile Val Arg Thr Leu Lys Thr Ile Lys
130 135 140
Leu Met Leu Ile Pro Leu Asn Ser Tyr Lys Gln Asn Asn Asp Leu Lys
145 150 155 160
Ser Ala Leu Glu Glu Leu Asn Asn Val Phe Thr Asn Lys Glu Ala Gln
165 170 175
Glu Glu Ser Ser Pro Ile Gly Asp His Gly Thr Phe Phe Arg Lys Leu
180 185 190
Leu Thr His Val Arg Thr Ile Lys Glu Asn Glu Asp Ile Glu Asn Lys
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Gly Glu Thr Leu Ile Leu Gly Asp Asn Lys Ile Asp Val Met Asn Ser
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Asn Asp Phe Phe Phe Thr Thr Asn Ser Asn Val Lys Phe Met Glu Asn
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Leu Asp Asp Ile Thr Asn Gln Tyr Gly Leu Gly Leu Ile Asn His Leu
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Gly Pro His Leu Ile Ala Leu Gly His Phe Thr Val Leu Lys Leu Ala
260 265 270
Leu Lys Asn Tyr Lys Asn Tyr Phe Glu Ala Lys Ser Ile Lys Phe Phe
275 280 285
Ser Trp Gln Lys Ile Leu Glu Phe Ser Met Ser Asp Arg Phe Lys Val
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Leu Asp Met Met
305
<210> 67
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<212> DNA
<213> 恶性疟原虫
<400> 67
tcaataaatg aaaatcaaaa tgaaaatgat accattagtc aaaatgtcaa ccaacatgaa 60
aatattaatc aaaatgtaaa tgataatgac aatattgaac aattaaaatc catgattgga 120
aatgatgaac tacataagaa tttaacaata ttagaaaaat taattttaga gtctttagaa 180
aaagataaat taaaatatcc tctccttaaa caaggaactg aacaattgat agatatatca 240
aaatttaata aaaaaaatat tacagatgcg gatgatgaaa cgtacatcat acccaccgtc 300
caatcaacgt ttcacgatat tgtgaaatac gaacatctta taaaagaaca atcaatagaa 360
atttacaatt ctgatatatc agataaaatt aagaaaaaaa tttttatagt aagaacattg 420
aaaaccataa aattaatgct tataccatta aactcgtaca aacaaaataa tgacttgaaa 480
tctgcactcg aagaattaaa taatgtattt acaaacaaag aagctcaaga ggaaagcagt 540
ccaataggcg accatgggac attctttaga aaattgttaa cacatgttag aacaattaaa 600
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atagccttgg gtcattttac cgtattaaaa ttagcactaa aaaattacaa aaactatttt 840
gaagcaaaaa gtattaaatt ttttagttgg caaaaaattt tagagttctc catgtctgat 900
agatttaaag ttcttgatat gatg 924
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
gtgcaatata tcaaagtgta catgca 26
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
aagaaaataa atgcaaaaca agttaga 27
<210> 70
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
atttacaaac aaagaagctc aagagga 27
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
ttttctatat cttcattttc tttaattgtt c 31
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<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Cys Glu Tyr Gln Ala Val Ala Ser Ala Asn Phe Tyr Ser Ala Lys Lys
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Val Gly Gln Phe Ile Gly Arg Lys Phe Leu Pro Ile Thr Thr Tyr Phe
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Leu Val Met Arg Ile Ser Trp Thr His Ala Ile Thr Thr Gly Gln His
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Leu Ile Pro Gln Leu Thr Asp Pro Glu Tyr Gly Gln Thr Pro Lys Gly
50 55 60
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Asn Tyr Arg Ala Pro Gly Ser Phe Phe Phe Thr His Gly Leu Ala Ala
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Asp Ala Tyr Lys Ser Phe Pro Gly Gly Phe Gly Pro Ala Ile Lys Glu
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Gln Thr Gln His Val Gln Glu Gln Thr Tyr Glu Arg Lys Pro Ser Val
130 135 140
His Ser Phe Asn Arg Asn Phe Phe Met Glu Leu Ala Asn Gly Phe Met
145 150 155 160
Tyr Ala Phe Cys Phe Phe Ala Ile Ser Gln Met Tyr Ala Tyr Phe Glu
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Asn Ile Asn Phe Tyr Ile
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
tgtgaatatc aggcggtagc aagtgcaaat ttctactctg ctaaaaaggt agggcaattt 60
attggaagaa aatttttacc cataactaca tattttctag taatgagaat tagttggaca 120
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tatttatttt tttatttttt cacaaattta taccttgatg cctacaaatc ttttcctgga 360
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tatgcttttt gtttttttgc tatttcacaa atgtatgcat attttgaaaa tattaatttt 540
tatatt 546
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<220>
<223> 合成的
<400> 74
Leu Tyr Leu Pro Gly Tyr Tyr Asn Ala Val Glu Met Ser Phe Thr Glu
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35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
Glu Ile Ala Lys Lys Asn Val Ala Glu Ala Met Tyr Leu Asn Ile Lys
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Asn Asn Leu Val Asp Glu Leu Glu Lys Leu Met Lys Ser Gly Thr Leu
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Glu Lys Met Lys Lys Ser Leu Thr Phe Leu Val His Val Asn Ser Phe
195 200 205
Leu Gln Leu Asp Phe Phe His Gln Leu Asn Glu Pro Pro Leu Gly Leu
210 215 220
Pro Arg Ser Tyr Pro Leu Ser Leu Val Leu Glu His Lys Phe Lys Glu
225 230 235 240
Trp Met Asn Ser Ser Pro Ala Gly Phe Tyr Phe Ser Asn Tyr Gln Asn
245 250 255
Pro Tyr Ile Arg Lys Asp Leu His Asp Lys Val Leu Ser Gln Lys Phe
260 265 270
Glu Pro Pro Lys Met Asn Gln Trp Asn Lys Val Leu Lys Ser Leu Ile
275 280 285
Glu Cys Ala Tyr Asp Met Tyr Phe Glu Gln Arg His Val Lys Asn Leu
290 295 300
Tyr Lys Tyr His Asn Ile Tyr Asn Ile Asn Asn Lys Leu Met Leu Met
305 310 315 320
Arg Asp Ser Ile Asp Leu Tyr Lys Asn Asn Phe Asp Asp Val Leu Phe
325 330 335
Phe Ala Asp Ile Phe Asn Met Arg Lys Tyr Met Thr Ala Thr Pro Val
340 345 350
Tyr Lys Lys Val Lys Asp Arg Val Tyr His Thr Leu His Ser Ile Thr
355 360 365
Gly Asn Ser Val Asn Phe Tyr Lys Tyr Gly Ile Ile Tyr Gly Phe Lys
370 375 380
Val Asn Lys Glu Ile Leu Lys Glu Val Val Asp Glu Leu Tyr Ser Ile
385 390 395 400
Tyr Asn Phe Asn Thr Asp Ile Phe Thr Asp Thr Ser Phe Leu Gln Thr
405 410 415
Val Tyr Leu Leu
420
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
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tccaaacttt ttgaaagctt aatacaatgt attgaaaaat gccattcaga ccaagcaagg 120
caaatatcaa aagatagtaa tttacttaat aatataacaa aatgtgattt gtgtaaagga 180
gcctttttat atgctaatat gaaattcgat gaagttcctt caatgttgca aaaattttac 240
gtatatttaa ctaaaggtct caaaatacaa aaagtatcat cactaatcaa aacgctagat 300
atatatcaag attacagcaa ttacttatca catgatatta attggtacac attcctattt 360
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ttaaatataa aagatgaaga cacattcaac aaaacggtag taacaaacta ttggtaccca 480
tctcctataa aaaaatatta tacattatat gttagaaaac atataccaaa taatttagta 540
gatgaattgg agaaattaat gaaaagtggc actttagaaa aaatgaaaaa atctctcacc 600
tttttagtac atgtgaattc atttttacaa ttagattttt tccatcaatt aaatgaacca 660
cctcttggat tacctcgatc atatccatta tcgttagttc tcgaacataa atttaaagaa 720
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gttaaaaatt tatataaata tcataacatt tataatataa ataacaaatt aatgttaatg 960
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taccatacat tgcatagtat tacaggaaat tctgtcaatt tttataaata tggtattata 1140
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tataatttta acaccgacat atttacggat acttcctttt tacaaaccgt ttatttatta 1260
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Ser Val Asn Asn Val Phe Phe Met Asn Val Ala Asn Asn Tyr Ser Lys
1 5 10 15
Leu Asn Lys Glu Glu Arg Glu Ile Glu Ile His Asn Ser Met Ala Ser
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Arg Tyr Tyr Ala Lys Thr Met Phe Ala Ala Phe Gln Met Leu Phe Ser
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Thr Met Leu Ser Asn Asn Val Asp Asn Leu Asp Lys Ala Tyr Gly Leu
50 55 60
Ser Glu Asn Ile Gln Val Ala Thr Ser Thr Ser Ala Phe Leu Thr Phe
65 70 75 80
Ala Tyr Val Tyr Asn Gly Ser Ile Met Asp Ser Val Thr Asn Ser Leu
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Leu Pro Pro Tyr Ala Lys Lys Pro Ile Thr Gln Leu Lys Tyr Gly Lys
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Thr Phe Val Phe Ser Asn Tyr Phe
115 120
<210> 77
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
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gaaagagaaa tcgaaataca taattccatg gcatcaagat attatgcaaa aacgatgttt 120
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gcatatggat taagtgaaaa tatccaagta gcaacaagta cttccgcttt tcttactttt 240
gcatatgtat ataacggaag tataatggat agtgtgacta acagtttatt gccaccatat 300
gcgaagaaac ctataacaca attaaaatat ggaaaaacct tcgttttctc aaactatttc 360
<210> 78
<211> 1417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
Met Val Ser Phe Phe Lys Thr Pro Ile Phe Ile Leu Ile Ile Phe Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Asn Glu Lys Val Ile Cys Ser Ile Asn Glu Asn Gln Asn Glu
20 25 30
Asn Asp Thr Ile Ser Gln Asn Val Asn Gln His Glu Asn Ile Asn Gln
35 40 45
Asn Val Asn Asp Asn Asp Asn Ile Glu Gln Leu Lys Ser Met Ile Gly
50 55 60
Asn Asp Glu Leu His Lys Asn Leu Thr Ile Leu Glu Lys Leu Ile Leu
65 70 75 80
Glu Ser Leu Glu Lys Asp Lys Leu Lys Tyr Pro Leu Leu Lys Gln Gly
85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
Ile Tyr Asn Ser Asp Ile Ser Asp Lys Ile Lys Lys Lys Ile Phe Ile
145 150 155 160
Val Arg Thr Leu Lys Thr Ile Lys Leu Met Leu Ile Pro Leu Asn Ser
165 170 175
Tyr Lys Gln Asn Asn Asp Leu Lys Ser Ala Leu Glu Glu Leu Asn Asn
180 185 190
Val Phe Thr Asn Lys Glu Ala Gln Glu Glu Ser Ser Pro Ile Gly Asp
195 200 205
His Gly Thr Phe Phe Arg Lys Leu Leu Thr His Val Arg Thr Ile Lys
210 215 220
Glu Asn Glu Asp Ile Glu Asn Lys Gly Glu Thr Leu Ile Leu Gly Asp
225 230 235 240
Asn Lys Ile Asp Val Met Asn Ser Asn Asp Phe Phe Phe Thr Thr Asn
245 250 255
Ser Asn Val Lys Phe Met Glu Asn Leu Asp Asp Ile Thr Asn Gln Tyr
260 265 270
Gly Leu Gly Leu Ile Asn His Leu Gly Pro His Leu Ile Ala Leu Gly
275 280 285
His Phe Thr Val Leu Lys Leu Ala Leu Lys Asn Tyr Lys Asn Tyr Phe
290 295 300
Glu Ala Lys Ser Ile Lys Phe Phe Ser Trp Gln Lys Ile Leu Glu Phe
305 310 315 320
Ser Met Ser Asp Arg Phe Lys Val Leu Asp Met Met Cys Asn His Glu
325 330 335
Ser Val Tyr Tyr Ser Glu Lys Lys Arg Arg Lys Thr Tyr Leu Lys Val
340 345 350
Asp Arg Ser Ser Thr Ser Met Glu Cys Asn Ile Leu Glu Tyr Leu Leu
355 360 365
His Tyr Phe Asn Lys Tyr Gln Leu Glu Ile Ile Lys Thr Thr Gln Asp
370 375 380
Thr Asp Phe Asp Leu His Gly Met Met Glu His Lys Tyr Ile Lys Asp
385 390 395 400
Tyr Phe Phe Ser Phe Met Cys Asn Asp Pro Lys Glu Cys Ile Ile Tyr
405 410 415
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580 585 590
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Glu Thr Tyr Arg Thr Gln Arg Arg Asp Asp Lys Ile Ser Val Asn Asn
915 920 925
Val Phe Phe Met Asn Val Ala Asn Asn Tyr Ser Lys Leu Asn Lys Glu
930 935 940
Glu Arg Glu Ile Glu Ile His Asn Ser Met Ala Ser Arg Tyr Tyr Ala
945 950 955 960
Lys Thr Met Phe Ala Ala Phe Gln Met Leu Phe Ser Thr Met Leu Ser
965 970 975
Asn Asn Val Asp Asn Leu Asp Lys Ala Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Ile
980 985 990
Gln Val Ala Thr Ser Thr Ser Ala Phe Leu Thr Phe Ala Tyr Val Tyr
995 1000 1005
Asn Gly Ser Ile Met Asp Ser Val Thr Asn Ser Leu Leu Pro Pro
1010 1015 1020
Tyr Ala Lys Lys Pro Ile Thr Gln Leu Lys Tyr Gly Lys Thr Phe
1025 1030 1035
Val Phe Ser Asn Tyr Phe Met Leu Ala Ser Lys Met Tyr Asp Met
1040 1045 1050
Leu Asn Tyr Lys Asn Leu Ser Leu Leu Cys Glu Tyr Gln Ala Val
1055 1060 1065
Ala Ser Ala Asn Phe Tyr Ser Ala Lys Lys Val Gly Gln Phe Ile
1070 1075 1080
Gly Arg Lys Phe Leu Pro Ile Thr Thr Tyr Phe Leu Val Met Arg
1085 1090 1095
Ile Ser Trp Thr His Ala Phe Thr Thr Gly Gln His Leu Ile Ala
1100 1105 1110
Ala Phe Asn Pro Pro Thr Ser Thr Thr Asp Gly Lys Cys Ser Ala
1115 1120 1125
Pro Ser Tyr Lys Ser Pro Glu Ser Phe Phe Phe Thr His Gly Leu
1130 1135 1140
Ala Ala Glu Ala Ser Lys Tyr Leu Phe Phe Tyr Phe Phe Thr Asn
1145 1150 1155
Leu Tyr Leu Asp Ala Tyr Lys Ser Phe Pro Gly Gly Phe Gly Pro
1160 1165 1170
Ala Ile Lys Glu Gln Thr Gln His Val Gln Glu Gln Thr Tyr Glu
1175 1180 1185
Arg Lys Pro Ser Val His Ser Phe Asn Arg Asn Phe Phe Met Glu
1190 1195 1200
Leu Val Asn Gly Phe Met Tyr Ala Phe Cys Phe Phe Ala Ile Ser
1205 1210 1215
Gln Met Tyr Ala Tyr Phe Glu Asn Ile Asn Phe Tyr Ile Thr Ser
1220 1225 1230
Asn Phe Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Tyr Gly Val Phe Asn Lys Tyr
1235 1240 1245
Phe Ile Asn Tyr Ala Ile Ile Lys Leu Lys Glu Ile Thr Ser Asp
1250 1255 1260
Leu Leu Ile Lys Tyr Glu Arg Glu Ala Tyr Leu Asn Met Lys Lys
1265 1270 1275
Tyr Gly Tyr Leu Gly Glu Val Ile Ala Ala Arg Leu Ser Pro Lys
1280 1285 1290
Asp Lys Ile Met Asn Tyr Leu His Glu Thr Asn Asp Asp Val Met
1295 1300 1305
Ser Asn Leu Arg Arg Tyr Asp Met Glu Asn Ala Phe Lys Asn Lys
1310 1315 1320
Met Val Thr Tyr Val Asp Asp Phe Ala Phe Phe Asp Asp Cys Gly
1325 1330 1335
Lys Asn Glu Gln Phe Leu Asn Glu Arg Cys Asp Tyr Cys Pro Val
1340 1345 1350
Ile Glu Glu Val Glu Glu Thr Glu Leu Phe Thr Thr Thr Gly Asp
1355 1360 1365
Lys Asn Thr Asn Glu Thr Thr Glu Ile Lys Lys Gln Thr Ser Thr
1370 1375 1380
Tyr Ile Asp Thr Glu Lys Met Asn Glu Ala Asp Ser Ala Asp Ser
1385 1390 1395
Asp Asp Glu Lys Asp Phe Asp Thr Pro Asp Asn Glu Leu Met Ile
1400 1405 1410
Ala Arg Phe His
1415
<210> 79
<211> 4251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
atggtttcat tttttaaaac tccaatcttt attttaatta tctttttata cttaaatgaa 60
aaggtaatat gttcaataaa tgaaaatcaa aatgaaaatg ataccattag tcaaaatgtc 120
aaccaacatg aaaatattaa tcaaaatgta aatgataatg acaatattga acaattaaaa 180
tccatgattg gaaatgatga actacataag aatttaacaa tattagaaaa attaatttta 240
gagtctttag aaaaagataa attaaaatat cctctcctta aacaaggaac tgaacaattg 300
atagatatat caaaatttaa taaaaaaaat attacagatg cggatgatga aacgtacatc 360
atacccaccg tccaatcaac gtttcacgat attgtgaaat acgaacatct tataaaagaa 420
caatcaatag aaatttacaa ttctgatata tcagataaaa ttaagaaaaa aatttttata 480
gtaagaacat tgaaaaccat aaaattaatg cttataccat taaactcgta caaacaaaat 540
aatgacttga aatctgcact cgaagaatta aataatgtat ttacaaacaa agaagctcaa 600
gaggaaagca gtccaatagg cgaccatggg acattcttta gaaaattgtt aacacatgtt 660
agaacaatta aagaaaatga agatatagaa aataaaggag aaacacttat attaggcgat 720
aataaaatag atgtaatgaa ttcaaacgat ttctttttta caaccaactc aaatgtaaaa 780
tttatggaaa atttagatga tataacaaat caatatggat taggtttgat taatcatcta 840
ggtcctcatt taatagcatt gggtcatttt accgtattaa aattagcact aaaaaattac 900
aaaaactatt ttgaagcaaa aagtattaaa ttttttagtt ggcaaaaaat tttagagttc 960
tccatgtccg atagatttaa ggttcttgat atgatgtgta accatgaatc tgtatattat 1020
tccgaaaaaa aacgtagaaa aacatattta aaagttgaca gatcaagcac atcgatggaa 1080
tgtaatatat tggaatattt attacattat tttaataaat accaactaga aataattaaa 1140
actacacaag atactgattt tgacttacat ggtatgatgg aacataaata tataaaagat 1200
tatttctttt catttatgtg taatgatcct aaggaatgta ttatttatca tacgaatcaa 1260
tttaaaaaag aagccaacga agaaaacaca tttcctgaac aagaagaacc taatcgtgaa 1320
ataagtgcat ataatttata tttaaattat tactatttca tgaaacgtta tagttcatat 1380
ggagtaaaaa aaacattata tgttcattta ttaaatttaa ctggactttt aaattatgat 1440
acaagatctt atgtgacatc actttattta ccaggatatt acaacgctgt cgaaatgtct 1500
tttacggaag aaaaagagtt ttccaaactt tttgaaagct taatacaatg tattgaaaaa 1560
tgccattcag accaagcaag gcaaatatca aaagatagta atttacttaa tgatataaca 1620
aaatgtgatt tgtgtaaagg agcattctta tattctaaca tgaaattcga tgaagttcct 1680
tcaatgttgc aaaaatttta cttatattta actaaaggtc tcaaaataca aaaagtatca 1740
tcactaatca aaacgctaga tatatatcaa gattacagta attttttatc acatgatatt 1800
aattggtaca cattcctatt tttatttaga cttacaagtt ttaaagaaat ttcaaagaaa 1860
aatgttgctg aagcaatgta tttaaatata aaagatgaag atacgttcaa caaaacgata 1920
gtaacaaact attggtaccc atctcctata aaaaaatatt atacattata cgttagaaaa 1980
cacataccaa ataatttagt agatgaattg gagaaattaa tgaaaagtgg cactttagaa 2040
aaaatgaaaa aatctctcac ctttttagta catgtgaatt catttttaca attagatttt 2100
tttcatcaac ttaatgaacc acctcttgga ttacctcgat catatccttt atccttagtt 2160
cttgaacata aatttaaaga atggatggac agttcgcccg ccggatttta tttttcaaat 2220
tatcaaaatc catatatcag aaaagatttg catgataaag ttttatcaca aaaatttgaa 2280
ccacctaaaa tgaatcagtg gaacaaagtt ttgaagtcat taattgaatg cgcatatgat 2340
atgtattttg aacagagaca tgttaaaaat ttatataaat atcataacat ttataatata 2400
aataacaaat taatgttaat gagagattca attgatttat ataaaaccca ttttgacgac 2460
gtattatttt ttgcggatat atttaatatg agaaaatata tgacagctac accagtatat 2520
aaaaaagtaa aagacagagt gtaccataca ttgcatagta ttacaggaaa ttctgtcaat 2580
ttttataaat atggtattat atatggattt aaagtaaaca aagaaatatt aaaagaagtt 2640
gtcgatgaat tgtattccat ctataatttt aacaccgaca tatttacgga tacttccttt 2700
ttacaaaccg tttatttatt atttagaaga atagaagaaa cttataggac ccaaagaaga 2760
gatgacaaaa taagtgtgaa taacgttttt ttcatgaatg ttgctaataa ttattccaaa 2820
ttaaacaaag aagaaagaga aatcgaaata cataattcca tggcatcaag atattatgca 2880
aaaacgatgt ttgcagcatt tcaaatgtta ttttcaacaa tgttgagcaa caatgtagat 2940
aatcttgata aagcatatgg attaagtgaa aatatccaag tagcaacaag tacttccgct 3000
tttcttactt ttgcatatgt atataacgga agtataatgg atagtgtgac taacagttta 3060
ttgccaccat atgcgaagaa acctataaca caattaaaat atggaaaaac cttcgttttc 3120
tcaaactatt tcatgctagc atccaaaatg tatgatatgt taaattataa aaatttaagt 3180
cttttatgtg aatatcaggc tgtggcaagt gccaatttct actctgctaa aaaggtaggt 3240
cagtttattg gaagaaaatt tttacccata actacatatt ttctagtaat gagaattagt 3300
tggacacatg cttttacaac tggacaacat ttgattgccg cttttaatcc cccaacttct 3360
actactgatg gtaaatgtag tgctcctagt tataaatccc ctgaaagttt tttctttact 3420
cacggacttg ctgctgaagc atccaaatat ttattttttt attttttcac aaatttatac 3480
cttgatgcct acaaatcttt tcctggagga tttggtcctg caataaaaga acaaactcaa 3540
catgttcaag aacaaacgta tgaacgcaaa ccatcagttc atagttttaa tagaaatttt 3600
ttcatggaac tcgtaaatgg attcatgtat gccttttgtt tttttgctat ttcacaaatg 3660
tatgcatatt ttgaaaatat taatttttat attacaagta atttccgttt cttggataga 3720
tattatggtg tattcaataa atattttata aactatgcca taattaaact taaagaaatt 3780
actagtgatc ttttaataaa atatgaacgt gaggcttatt taaatatgaa aaaatatggt 3840
tatttaggtg aagttattgc agctagactt tctcctaaag ataaaattat gaattatttg 3900
cacgaaacta acgacgatgt catgagtaat ttaagaagat atgatatgga aaatgctttc 3960
aaaaacaaaa tggttactta tgtggatgac tttgcttttt ttgatgattg tggcaaaaat 4020
gaacaatttt taaatgaaag atgtgattat tgtcctgtaa ttgaagaggt ggaagaaaca 4080
gaattattta ctaccactgg tgataaaaac actaatgaga ccacggaaat aaaaaaacaa 4140
actagtacat atattgatac tgaaaaaatg aatgaggcgg attccgctga tagcgacgat 4200
gaaaaggatt ttgatactcc tgacaatgaa ttaatgatcg cacgatttca t 4251

Claims (27)

1.式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防动物中的疟疾的药物的应用：
Q-Y-R1-R2 (I)，
其中：
Q选自由以下组成的组：与芳基稠合的二氧代杂环、与杂环基团连接的杂环酰氨基、烷基、与杂环酰氨基稠合的杂环基团、芳氨基羰基、氨基、杂环酰氨基和杂环氨基，除了氨基以外，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、芳基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；
Y是键、S、SO2或酰氨基；
R1是选自由以下组成的组的二价基团：具有至少一个氮原子的杂环、哌啶基、哌嗪基、芳基、具有至少一个与烷基氨基连接的氮原子的杂环、苯并稠合杂环基、与亚氨基四氢嘧啶基团稠合的杂环基、和与杂环酰氨基稠合的杂环基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；
R2选自由以下组成的组：芳基烯基、杂环基羰基氨基、杂环基烷基氨基、四氢喹啉基烯基、四氢异喹啉基烷基、吲哚基烯基、二氢吲哚基烯基、芳基、芳氧基烷基、芳基烷基、二唑基和喹啉基烯基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基。
2.根据权利要求1所述的应用，其中寄生虫的疟原虫表面阴离子通道被抑制。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中Q选自由以下组成的组：二氧代四氢喹喔啉基、哒嗪基杂环基、烷基、杂环基哒嗪基和芳氨基羰基烷基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其中R1是哌啶基、哌嗪基、哌啶基烷基氨基、苯并噻唑基、与亚氨基四氢嘧啶基团稠合的噻唑基、与哒酮稠合的噻唑基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其中R2选自由以下组成的组：烷基芳基烯基、噻吩基羰基氨基、四氢喹啉基烯基、四氢异喹啉基烷基、烷氧基芳基、芳基、芳氧基烷基、芳基烷基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其中Y是SO2。
7.根据权利要求6所述的应用，其中Q选自由以下组成的组：
甲基和异丁基。
8.根据权利要求7所述的应用，其中R1选自由以下组成的组：
9.根据权利要求6所述的应用，其中R2选自由以下组成的组：
10.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述化合物是：
11.根据权利要求1或2所述的应用，其中Y是S。
12.根据权利要求11所述的应用，其中Q选自由以下组成的组：
13.根据权利要求11所述的应用，其中R1选自由以下组成的组：
14.根据权利要求11所述的应用，其中R2选自由以下组成的组：
15.根据权利要求11所述的应用，其中所述化合物是：
16.根据权利要求1或2所述的应用，其中Y是键。
17.根据权利要求16所述的应用，其中所述化合物是
18.根据权利要求1所述的应用，其中Y是酰氨基。
19.根据权利要求18所述的应用，其中Q是杂环酰氨基，R1是具有至少一个氮原子的杂环，且R2是二唑基。
20.根据权利要求18-19中的任一项所述的应用，其中所述化合物是
21.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述式(I)的化合物与至少一种其它抗疟疾化合物组合使用。
22.根据权利要求21所述的应用，其中所述至少一种其它抗疟疾化合物选自由以下组成的组：
a)式II的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R100是氢或烷基，且R200是芳基烷基，其任选地在所述芳基上被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；或R200是式(III)的基团：
其中n＝0-6；
或者R100和R200与它们所连接的N一起形成式IV的杂环：
其中X是N或CH；且
Y1是芳基、烷基芳基、二烷基芳基、芳基烷基、烷氧基芳基或杂环基，
其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；且
R3-R10是氢或烷基；
(b)式V的化合物或其药学上可接受的盐：
其中
Z是具有一个或多个4-7元环的基团，其中至少一个所述环具有至少一个选自O、S和N的杂原子；且当存在两个或更多个4-7元环时，所述环可以是稠合的或未稠合的；其中所述环任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；
Ra是氢、烷基或烷氧基；
L是键、烷基、烷氧基、(CH2)r或(CH2O)s，其中r和s独立地是1-6；
Q1是杂环基团、芳基或杂环基芳基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、
氨基羰基和甲酰基；且
当L是烷基或烷氧基时，Q1不存在；
和
(c)式VI的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R11和R12独立地是氢、烷基、环烷基或芳基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；
R13-R15独立地选自由以下组成的组：烷基、卤素、烷氧基、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。
23.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述动物是人。
24.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述化合物抑制恶性疟原虫(P.falciparum)Dd2的生长。
25.一种药物组合物，其包含：
i)式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Q-Y-R1-R2 (I)，
其中：
Q选自由以下组成的组：与芳基稠合的二氧代杂环、与杂环基团连接的杂环酰氨基、烷基、与杂环酰氨基稠合的杂环基团、芳氨基羰基、氨基、杂环酰氨基和杂环氨基，除了氨基以外，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、芳基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；
Y是键、S、SO2或酰氨基；
R1是选自由以下组成的组的二价基团：具有至少一个氮原子的杂环、哌啶基、哌嗪基、芳基、具有至少一个与烷基氨基连接的氮原子的杂环、苯并稠合杂环基、与亚氨基四氢嘧啶基团稠合的杂环基、和与杂环酰氨基稠合的杂环基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；
R2选自由以下组成的组：芳基烯基、杂环基羰基氨基、杂环基烷基氨基、四氢喹啉基烯基、四氢异喹啉基烷基、吲哚基烯基、二氢吲哚基烯基、芳基、芳氧基烷基、芳基烷基、二唑基和喹啉基烯基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、巯基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羟基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；
和
ii)至少一种其它抗疟疾化合物。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述至少一种其它抗疟疾化合物选自由以下组成的组：
a)式II的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R100是氢或烷基，且R200是芳基烷基，其任选地在所述芳基上被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；或R200是式(III)的基团：
其中n＝0-6；
或者R100和R200与它们所连接的N一起形成式IV的杂环：
其中X是N或CH；且
Y1是芳基、烷基芳基、二烷基芳基、芳基烷基、烷氧基芳基或杂环基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；且
R3-R10是氢或烷基；
(b)式V的化合物或其药学上可接受的盐：
其中
Z是具有一个或多个4-7元环的基团，其中至少一个所述环具有至少一个选自O、S和N的杂原子；且当存在两个或更多个4-7元环时，所述环可以是稠合的或未稠合的；其中所述环任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；
Ra是氢、烷基或烷氧基；
L是键、烷基、烷氧基、(CH2)r或(CH2O)s，其中r和s独立地是1-6；
Q1是杂环基团、芳基或杂环基芳基，它们中的每一个任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：卤素、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；且
当L是烷基或烷氧基时，Q1不存在；
和
(c)式VI的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R11和R12独立地是氢、烷基、环烷基或芳基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由以下组成的组：烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；
R13-R15独立地选自由以下组成的组：烷基、卤素、烷氧基、羟基、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，所述药物组合物包含式I的化合物和以下中的一种或多种：
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