CN106893735A - 用于促进鱼的生长的手段和方法 - Google Patents
用于促进鱼的生长的手段和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106893735A CN106893735A CN201611128302.2A CN201611128302A CN106893735A CN 106893735 A CN106893735 A CN 106893735A CN 201611128302 A CN201611128302 A CN 201611128302A CN 106893735 A CN106893735 A CN 106893735A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus subtilis
- fish
- tigh
- dna
- vega
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 title claims abstract description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 230000012010 growth Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 77
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 72
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 13
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 241000340701 Oreochromis urolepis hornorum Species 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 7
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 6
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 claims description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 241000276707 Tilapia Species 0.000 claims description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 abstract 4
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 95
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 20
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 17
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 16
- 241000276701 Oreochromis mossambicus Species 0.000 description 11
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 5
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 4
- 241000252229 Carassius auratus Species 0.000 description 4
- 241000277277 Oncorhynchus nerka Species 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 4
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 4
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000269978 Pleuronectiformes Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001454694 Clupeiformes Species 0.000 description 2
- SRUWWOSWHXIIIA-UKPGNTDSSA-N Cyanoginosin Chemical compound N1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](C)[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)N(C)C(=O)CC[C@H](C(O)=O)N(C)C(=O)[C@@H](C)[C@@H]1\C=C\C(\C)=C\[C@H](C)[C@@H](O)CC1=CC=CC=C1 SRUWWOSWHXIIIA-UKPGNTDSSA-N 0.000 description 2
- 241000269979 Paralichthys olivaceus Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 108010067094 microcystin Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- 101100176927 Bacillus subtilis (strain 168) bglS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100449954 Bacillus subtilis (strain 168) eglS gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 241000186320 Cellulomonas fimi Species 0.000 description 1
- 241000186221 Cellulosimicrobium cellulans Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101100031701 Escherichia coli (strain K12) bglF gene Proteins 0.000 description 1
- 108010028690 Fish Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 241000277338 Oncorhynchus kisutch Species 0.000 description 1
- 241001417867 Pangasianodon gigas Species 0.000 description 1
- 241000269801 Perca Species 0.000 description 1
- 241000269799 Perca fluviatilis Species 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241001622901 Scomberomorus commerson Species 0.000 description 1
- 241000238371 Sepiidae Species 0.000 description 1
- 241000276699 Seriola Species 0.000 description 1
- 241000063156 Squatina squatina Species 0.000 description 1
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 description 1
- 101100272383 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) bglT gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 241001233037 catfish Species 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009318 large scale farming Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036299 sexual function Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000035922 thirst Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了用于促进鱼的生长的手段和方法。具体地，本发明提供了一种工程质粒、重组蛋白、重组枯草芽孢杆菌、动物食物/饲料添加剂，制备重组枯草芽孢杆菌的方法，制备培养物溶解产物的方法，和提高鱼的生长速率的方法。使用本发明提供的动物食物/饲料添加剂喂养鱼，可以促进鱼的生长。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年12月9日提交的香港专利申请号15112136.3的优先权或权益，通过引用将其全文结合到本文中。
技术领域
本发明涉及用于促进鱼的生长的生物工程手段和方法。
背景技术
生长速率是渔业(fish farm)认为最重要的焦点之一，因为在生长性能和产量(由此获得的利润)之间存在直接关系。因此，在该行业中已经进行过不同的尝试以提高鱼的生长速率。
鱼生长激素(FSH)被提出用于促进鱼的生长。使用FSH促进鱼生长的一种方式是在溶解有FSH的水浴中浸泡鱼。然而，该方式存在较严格的限制。例如，在大规模中，以该方式使用FSH是低效的、昂贵的且不切实际的。第二，许多鱼不能以这种方式很好地吸收FSH。另一个限制在于，尚不清楚食用以这种FSH处理的鱼是否安全。
本发明寻求解决上述问题，或至少为公众提供有用的备选。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)宿主中表达编码荷那龙罗非鱼(Oreochromis hornorum)的鱼生长激素(tiGH)的基因的方法，该方法包括以下步骤：
—制备重组DNA表达盒(DNA cassette)，所述DNA表达盒从5’端到3’端包括：三对
—以串联的形式存在的vegA启动子(vegA)和lac操纵基因(lacO)、
枯草芽孢杆菌共有核糖体结合位点(RBS)、ATG起始密码子、
编码所述tiGH的DNA序列和编码6个组氨酸残基(6x His标签)的DNA低聚核苷酸序列；
—在枯草芽孢杆菌或大肠杆菌(E.coli)的穿梭载体中插入所述DNA表达盒，从而形成重组构建体3vegAtiGHH6；
—将所述重组构建体转化至所述枯草芽孢杆菌宿主中；
—使所述枯草芽孢杆菌宿主在细胞培养物中生长并且在细胞内表达所述tiGH；和
—使用French压力匀浆器(French press homogenizer)，通过机械溶解所述枯草芽孢杆菌，释放所述tiGH。
根据本发明的第二方面，提供了一种在枯草芽孢杆菌宿主中表达编码荷那龙罗非鱼的鱼生长激素(tiGH)的基因的方法，该方法包括以下步骤：
—制备重组DNA表达盒，所述DNA表达盒包括：至少一对vegA启动子(vegA)和lac操纵基因(lacO)、枯草芽孢杆菌共有核糖体结合位点、ATG起始密码子、编码所述tiGH的DNA序列和编码6个组氨酸残基(6x His标签)的DNA低聚核苷酸序列；
—在枯草芽孢杆菌或大肠杆菌的穿梭载体中插入所述DNA表达盒，从而形成重组构建体3vegAtiGHH6；
—将所述重组构建体转化至所述枯草芽孢杆菌宿主中；
—使所述枯草芽孢杆菌宿主在细胞培养物中生长并且在细胞内表达所述tiGH；和
—释放所述tiGH。
优选地，tiGH可以为22kDa的单一多肽。重组DNA表达盒从5’端到3’端可以包括：三对以串联的形式存在的vegA启动子(vegA)和lac操纵基因(lacO)、枯草芽孢杆菌共有核糖体结合位点、ATG起始密码子、编码所述tiGH的DNA序列和编码6个组氨酸残基(6x His标签)的DNA低聚核苷酸序列。穿梭载体可以具有6.62-kb大小的pMTLBs72。在IPTG诱导剂和/或氯霉素抗生素的存在下，可以使转化后的枯草芽孢杆菌宿主生长，直至对数晚期或稳定期。
在某些实施方式中，tiGH可以通过机械的方式从枯草芽孢杆菌宿主释放，例如，通过使用French压力细胞匀浆器(French pressure cell homogenizer)。所述方法可以包括将枯草芽孢杆菌宿主的细胞离心下来以获取tiGH的步骤。
根据本发明的第三方面，提供了一种制备鱼饲料的方法，该方法包括上述在枯草芽孢杆菌宿主中表达编码荷那龙罗非鱼的鱼生长激素(tiGH)的基因的方法。
优选地，由细胞溶解产生的细胞溶解产物可以涂覆在市售可得的鱼饲料颗粒上或另外混合在市售可得的鱼饲料颗粒中。
在某些实施方式中，所述方法可以包括使用每ml基本上含有55.56μl所述细胞溶解产物的琼脂溶液制备溶液的步骤，其中，所述细胞溶解产物可以由基本上1.112ml细胞培养物制备得到，由该细胞培养物制备细胞溶解产物。琼脂溶液可以基本上含有0.5％蔗糖和1％琼脂，并且可以基本上在50℃的温度下制备。混合的颗粒可以随后在室温下干燥。鱼饲料可以基本上包括1μg所述tiGH/1g饲料。
根据本发明的第四方面，提供了一种工程质粒，该工程质粒含有编码序列，其中，所述编码序列包括以下：-
a)至少一对vegA启动子(vegA)和lac操纵基因(lacO)；
b)共有核糖体结合位点(RBS)；
c)编码罗非鱼(tilapia)生长激素(tiGH)的基因；和
d)编码6-组氨酸密码子(6x His标签)的序列。
优选地，所述质粒从5’端到3’端可以含有至少三对可操作地连接在一起的vegA启动子(vegA)和lac操纵基因(lacO)。tiGH可以为荷那龙罗非鱼的生长激素。tiGH在编码序列的3’末端与6-组氨酸密码子可操作地连接。
根据本发明的第五方面，提供了由整合了所述质粒的宿主表达的重组蛋白。优选地，所述蛋白可以在枯草芽孢杆菌中表达。
根据本发明的第六方面，提供了含有上述工程质粒的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。重组枯草芽孢杆菌可以被配置以产生基因工程动物食物或饲料添加剂。重组枯草芽孢杆菌可以被配置以助于由其表达的tiGH的检测和纯化。
根据本发明的第七方面，提供了一种动物食物或饲料添加剂，其含有所述重组枯草芽孢杆菌的细胞、其溶解产物和/或由其表达的蛋白。所述动物食物或饲料添加剂可以分别为鱼食物或鱼食物添加剂。通过涂覆所述细胞、溶解产物和/或蛋白的方式，动物食物或饲料添加剂可以含有所述细胞、溶解产物和/或蛋白。动物食物或饲料添加剂可以含有培养物的溶解产物，其中悬浮着重组枯草芽孢杆菌和基本上以1:18的比率熔化的琼脂溶液，其中，所述熔化的琼脂溶液包括基本上0.5％(w/v)蔗糖。动物食物或饲料添加剂可以被配置用于喂养日本锦鲤(Japanese koi)，用于提高其生长性能。
根据本发明的第八方面，提供了一种制备重组枯草芽孢杆菌的方法，该方法包括在野生型枯草芽孢杆菌中整合上述质粒的步骤。
根据本发明的第九方面，提供了一种制备培养物溶解产物的方法，该方法包括由培养物制备溶解产物的步骤，上述重组枯草芽孢杆菌在所述培养物中生长。
根据本发明的第十方面，提供了一种提高鱼的生长速率的方法，该方法包括使用所述动物饲料或饲料添加剂喂养鱼的步骤。生长速率可以包括总体重或总身长或二者。鱼可以为日本锦鲤。
附图说明
现在将参照附图解释本发明的细节和一些实施方式，其中：
图1为显示根据本发明的重组DNA构建体的一种实施方式的示意图；
图2，包括A和B，为显示根据本发明制备鱼饲料或饲料添加剂的方法的一种实施方式的照片图像和图表；
图3，包括A和B，为根据本发明得到的示例性枯草芽孢杆菌细胞溶解产物的蛋白印迹分析的图像；
图4，包括A和B，为显示使用含有和不含有根据本发明的一种实施方式制备的重组生长激素的食物处理的鱼的实验结果的图；
图5，包括A和B，为显示使用和不使用根据本发明的一种实施方式的方法或手段处理的鱼的生长的图；
图6为显示分别使用和不使用根据本发明用于生长的方法和手段处理的两组鱼的重量的总体平均增加情况的图；
图7，包括A和B，为显示加入根据本发明的一种实施方式的生长激素的饲料颗粒的效果的图；
图8，包括A和B，为显示使用和不使用根据本发明的一种实施方式的鱼饲料或鱼添加剂处理对鱼的身长的影响的图；
图9为显示分别使用和不使用根据本发明用于生长的方法或手段处理的两组鱼的长度的总体平均增加情况的图；和
图10为显示分别使用和不使用生长激素对罗非鱼(tilapia)、鳟鱼(trout)、金鱼(goldfish)和燕鱼(scalar)的处理的结果的对比图。
具体实施方式
本发明涉及施用鱼生长激素(FGH)以提高鱼的生长速率。出于不同的原因，荷那龙罗非鱼生长激素(tiGH)为本发明的焦点之一。引出本发明的研究表明tiGH的重组形式不仅可以促进罗非鱼的硬骨鱼种属生长，而且还促进其它鱼的生长，例如，红鲑鱼(sockeyesalmon)，罗非鱼、金鱼、鳟鱼的幼体，以及鲤鱼(carp)和天使鱼(angelfish)的仔鱼。更具体地，在本发明的过程期间的实验证明工程枯草芽孢杆菌(即，GRAS)系统可以在枯草芽孢杆菌宿主的细胞质中有效且高效率地表达具有活性和功能性的重组tiGH(rtiGH)，在其C-末端含有6-组氨酸标签(rtiGH)。进行实验以证实产生的rtiGH的同一性，特别是通过蛋白印迹(Western blot)分析和质谱法。本发明还提出通过使用含有rtiGH的枯草芽孢杆菌的全细胞溶解产物产生的rtiGH制备鱼饲料的简易方法。在随机对照研究中进行测试以确定补充饲料与正常饲料促进鱼生长中的效力，采用日本锦鲤作为鱼模型的一个实例。在四个月的研究期间，比较处理组(分别为40.38g和2.17cm)和对照组(分别为31.58g和1.61cm)之间鱼的体重和长度。结论是处理组的鱼的生长显著快于对照组的鱼。喂食补充饲料的鱼显示出在所有时候都是健康的和身体发育良好的，活跃的并且渴望进食的。请参见图10的示例。
以下说明和实验更详细地证明本发明。
材料和方法
细菌菌株和培养基
用作rtiGH表达的宿主的枯草芽孢杆菌菌株1A751(eglSΔ102，bglT/bglSΔEV，npr，apr，his)从芽孢杆菌遗传库存中心，俄亥俄(Bacillus Genetics Stock Centre，Ohio)获得。用作重组DNA工作的中间体宿主的大肠杆菌菌株JM101(supE，thi，Δlac-proAB(F’，tra36，proAB+，lacIqZΔM15))如前所述。
枯草芽孢杆菌转化体于37℃下在补充10.5mg l-1氯霉素(Fluka)的2x LB培养基(20g l-1 Difco胰蛋白胨，10g l-1 Difco酵母提取物，20g l-1 NaCl)中生长。对于固体培养基，以1.5％(w/v)的浓度加入Bacto琼脂。分别使用氯化钙方法和Spizizen描述的方法使用重组质粒转化大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
鱼的种属和来源
(从香港Mermaid Koi中心)购买18条6-8个月大的日本锦鲤鱼仔鱼(18-25cm长；大多数：红白色)用于设置阴性实验。另一方面，44条10个月大的日本锦鲤鱼仔鱼(主要是红白色)由东河渔业有限公司(East River Fishing Limited)(中国广东省)友好捐赠，用于评价rtiGH的生物活性的随机对照研究。此外，8条锦鲤鱼(其中7条10个月大；1条22个月大)在玻璃缸(150cm×43cm×63cm)中单独喂养，并且喂食补充rtiGH的饲料。在5个月内监测它们的行为和外部特征。
质粒和重组tiGH的表达
6.62-kb枯草芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭载体pMTLBs72从芽孢杆菌遗传库存中心获得。质粒pMTLBs72由一部分枯草芽孢杆菌pBS72质粒和一部分大肠杆菌pBR322序列组成。它是在枯草芽孢杆菌中低拷贝数和稳定的质粒，具有约6个拷贝/染色体。使用pMTLBs72作为载体(未公布的数据)，如前构建改性质粒3vegAcenA。使用3vegAcenA，如下构建质粒3vegAtiGHH6。使用14个低聚引物：P1-P14(请参见显示为SEQ ID NOs.1-14的序列表)，通过PCR重叠延伸先合成中间体；所得到的产物使用SpeI和SmaI切割，随后与经相同的两种酶限制性切割的载体3vegAcenA连接，以形成3vegAtiGHH6。请参见图1。
为了表达rtiGH，新鲜的枯草芽孢杆菌1A751(3vegAtiGHH6)转化体在补充氯霉素的50ml 2x LB培养基中于37℃下生长8小时。所有培养物随后被接种至具有氯霉素的500ml2x LB培养基中，于37℃下生长，直至A600值等于1.0，接着通过加入IPTG，至0.1mM的终浓度。继续细胞培养20小时时间段。然后，将培养物离心并溶解细胞团。
细胞溶解
将保留的细胞团溶解在25ml磷酸盐缓冲液(PB；1.44g l-1 Na2HPO4和0.24g l-1KH2PO4；pH 7.4)，用压力细胞匀浆器(Stansted Fluid Power Ltd.，UK)将重悬液加工3次。收集溶解产物，用于分析和饲料制备。
rtiGH的分析
在12％(w/v)曲辛-SDS-聚丙烯酰胺凝胶(tricine-SDS-polyacrylamide gel)上分离的蛋白样品使用考马斯亮蓝R250(Coomassie Brilliant Blue R250)染色。使用His-探针抗体(H-3)(Santa Cruz，sc-8036)进行蛋白的蛋白印迹分析。通过如前所述的具有Mascot搜索的液相色谱法串联质谱法证实rtiGH的同一性。
补充细菌培养物溶解产物的鱼饲料的制备
在仅20秒的短时间内，0.9ml琼脂溶液(0.5％蔗糖，1％琼脂；50℃)以及50μl含有rtiGH(浓度100mg l-1)的细胞溶解产物的混合物显示被均匀地良好地吸附在5g鱼饲料(Aqua master，Koi Food，Wheat Germ，尺寸S)上。
为了制备补充rtiGH的鱼饲料，确定1g饲料含有1μg rtiGH；因此50μl rtiGH溶解产物被用于与0.9ml琼脂溶液混合。测定诱导的1A751(3vegAtiGHH6)培养物的溶解产物含有100mg l-1 rtiGH。确定1A751(3vegAtiGHH6)溶解产物的蛋白浓度为9.93g l-1，而宿主溶解产物(阴性对照)的蛋白浓度为9.78g l-1。由于相同浓度的溶解产物蛋白被用于制备各种饲料，1g对照饲料被校准为含有10μl宿主溶解产物。制备补充培养物溶解产物的饲料的示意性细节在图2中描述。最后，将涂覆的饲料在室温下空气干燥3天。
rtiGH的生物活性的评价
共享相同尺寸(168cm×64cm×16cm)的两个灰色塑料水槽用于喂养两组(处理组和对照组)鱼。两个槽中的所有变量保持相同。使用Qmax设定为2,200l h-1的再循环系统促进在其中换水。两个槽中的水条件如下保持恒定：温度23℃，pH为6，溶解的氧为6.3mg l-1。
在阴性实验中，给鱼喂食正常食物颗粒或补充缺乏rtiGH活性的枯草芽孢杆菌细胞溶解产物的食物颗粒。在随机对照研究中，给鱼喂食正常食物颗粒(对照组)或补充含有rtiGH的细胞溶解产物的食物颗粒(处理组)。以预定的时间间隔，对每一个鱼样品进行拍照(用于鉴定)和称重，并测量其身长。
结果
罗非鱼鱼生长激素在枯草芽孢杆菌中的表达
将通过基因组装得到的编码罗非鱼鱼生长激素(tiGH)的DNA序列克隆至3VegAcenA载体(未公布的数据)中，以形成表达rtiGH的构建体3VegAtiGHH6(参见图1)。在IPTG诱导下，枯草芽孢杆菌1A751(3VegAtiGHH6)培养物表现出表达高水平的细胞内rtiGH。当通过SDS-PAGE分析1A751的细胞溶解产物(3VegAtiGHH6)时，显示出明显的具有预期大小的rtiGH(22.6kDa)的条带(参见图3)。随后，通过质谱法证实该条带为tiGH(数据未显示)。rtiGH的产量估计为约100mg l-1。
涂覆有枯草芽孢杆菌细胞溶解产物的鱼食物颗粒的制备
加入鱼生长激素(FGH)的食物颗粒的常规用途不是新的。本发明的一个新颖性涉及将枯草芽孢杆菌溶解产物特定应用于鱼饲料的制备。虽然被认为是GRAS，但是枯草芽孢杆菌培养物存在令人反感的气味。为了解决枯草芽孢杆菌溶解产物具有不受鱼欢迎的气味的问题，本发明的另一方面涉及在食物颗粒上紧固地涂覆悬浮于细胞溶解产物中的rtiGH的有效方法。
在凝胶上显示的rtiGH良好的回收和完整的条带(参见图3)支持通过高压的细胞溶解方法为实际可行方法的结论。为了克服枯草芽孢杆菌溶解产物具有的令人讨厌的气味和在颗粒上涂覆溶解产物的效率低，解决软琼脂以及低水平的蔗糖的可加工性。使用该过程，细菌溶解产物均匀并且良好地涂覆在颗粒上(参见图2)。
选择日本锦鲤作为鱼模型
日本锦鲤(锦鲤)为在中国和日本最流行的观赏鱼之一。基于以下考虑，在研究中采用锦鲤作为鱼模型。锦鲤容易获得，不挑剔食物，快速生长，并且基本上被饲养用于观赏。
当给锦鲤喂食涂覆有枯草芽孢杆菌溶解产物的食物颗粒和涂覆有含有rtiGH的枯草芽孢杆菌溶解产物的食物颗粒时，鱼似乎很享受这两种类型的饲料，行为与喂食正常食物颗粒差不多相同。
枯草芽孢杆菌溶解产物对日本锦鲤的生长的作用
为了确定缺乏rtiGH的枯草芽孢杆菌细胞溶解产物对锦鲤的生长是否可能造成任何刺激作用，首先获得仅含有3VegA表达载体(数据未显示)的转化体枯草芽孢杆菌1A751(3VegA)。随后制备枯草芽孢杆菌1A751(3VegA)的培养物溶解产物，并且用于在食物颗粒上涂覆，从而产生用于比较的阴性对照(未经处理的颗粒)。将18条日本锦鲤分成两组，一组喂食未经处理的颗粒，另一组喂食正常食物颗粒。两组鱼的喂养方案(两次/天和0.5g/鱼)相同，研究持续50天。在研究结束时，关于在50天中鱼的总重量和长度变化进行评价(数据未显示)，生长性能不存在显著差异，随后得出结论认为缺乏rtiGH活性的枯草芽孢杆菌溶解产物对日本锦鲤的生长不具有刺激作用。
rtiGH的生长刺激活性
通过对以下两组锦鲤的饮食供给，测定rtiGH的生长刺激作用。处理组喂食涂覆有枯草芽孢杆菌1A751(3VegAtiGHH6)培养物溶解产物的食物颗粒，而对照组喂食正常颗粒。以每月的间隔对每一个个体锦鲤进行生长参数(重量和长度)的测量(参见图4，图7)。在研究的前两个月，两组中大多数个体的重量减轻(参见图4)，可能是鱼对各种环境影响的负反应的结果。后来，记录的两组中几乎所有的鱼的重量和长度测量结果均增加。到4个月实验结束时，处理组中的个体的重量和长度的增量显示出比对照组中的相应个体明显更好的性能(参见图5，图8)。处理组重量的总体平均增加量为27.9％，高于对照组(参见图6)，而前者的长度的总体平均增加量为34.8％，高于后者(参见图9)。
喂食补充rtiGH的食物颗粒的日本锦鲤的外部观察(external view)
为了得到关于喂食补充含有rtiGH的枯草芽孢杆菌溶解产物的食物颗粒的日本锦鲤(处理组)的行为和外部特征的一些观点，在第二批鱼(材料和方法)到达后立即从其中分离出八个个体。这些鱼随后在玻璃缸中单独喂养(材料和方法)，并且基本上采用与处理组相同的方式，仅喂食补充rtiGH的饲料。
喂养5个月后，所有鱼显示是健康的，多肉的(并且少数可能甚至被认为是短粗的)，灵敏的且颜色清晰的。鱼不害怕站在附近的观察者，并且主动围绕水槽游动。更重要地是，它们似乎在所有时间都是饿的，并且无论何时有人经过水槽时，它们都保持高度警惕食物供应。
具有高蛋白含量的鱼饲料的可用性是在养鱼中考虑的主要成本因素。然而，因为在养鱼中饲料转化效率(feed conversion efficiency,FCE)高；例如，在喂养鲑鱼的过程中，估计FCE在1.1kg饲料/kg鲑鱼的范围。因此，为了提高鱼的生长性能，在头脑中闪过的好主意是通过增加鱼饲料中的蛋白含量以提高FCE。用于在鱼饲料中增加蛋白含量的常用成分包括鱼蛋白水解产物、盐水虾、乌贼内脏、大豆和蓝绿海藻。
在沿着相同研究路线的科学努力中，近来生物技术的发展已经能够开发转基因鱼或基因改性的(GM)鱼，其中关注的鱼种属被基因突变，从而导致内源性生长激素的过度产生，以提高鱼的生长速率。尽管FDA批准使用GM鱼用于人消费，但是这个问题一直备受争议。关于鱼生长激素(FGH)的应用的一个良好的折中办法似乎将它作为鱼膳食中的饲料补充使用。
使用多种方式已成功表达和引入了不同鱼种属的重组FGH(rFGH)，包括注射、浸浴、口服孵育和供食至鱼模型，用于评价在既定的条件下它们促进生长的性能。然而，在真实情况下，由于养鱼涉及大规模养殖，前三种方法似乎不实用。关于第四种方法，供食(指的是给鱼喂食补充rFGH的食物颗粒)在技术上是可行的，只要生产关注的饲料的具有成本效益的方式是可用的即可。之前有报道表明补充表达橄榄比目鱼(olive flounder)的rFGH的冻干集胞藻(Synechocystis)(一种蓝绿海藻)的鱼饲料促进比目鱼类鱼的生长。然而，尽管饲料对生长性能具有正面影响，但是该报道未能解决存在于集胞藻中的毒素微囊藻素(Microcystin)对人健康造成的潜在危害作用。该重要的问题结合制备最终添加剂所需的相对长的时间，对所述喂养方法在养鱼中的广泛应用提出了困难挑战。
与此相反，关于本发明，rFGH表达宿主枯草芽孢杆菌被公认为是“GRAS”有机体应用。此外，其具有良好表征的遗传学，相对短的加倍时间(120分钟)，简易和简单的处理过程，以及最重要的是规模扩大方便的且具有成本效益的生产均支持采用枯草芽孢杆菌作为宿主用于重组应用的可行性。实际上，制备补充表达rtiGH的枯草芽孢杆菌的全细胞溶解产物的鱼饲料(参见图2；材料和方法)的方法不仅方便而且容易扩大规模使用。无论供应是小规模还是大规模进行，补充饲料，就像其正常的相应物一样，方便配送及接近被正在被喂食的鱼。
在实验前，计划四个月的相对长的时间(除去在阴性实验上消耗的开始的两个月)用于实验。随后确定观察下的鱼由于新的环境和测量操作可能显示出不舒服的反应，从而影响它们的食欲并且导致在研究中在饮食组成和生长性能之间得出的结论的错误解释。如预测的，在处理组(喂食补充rtiGH的饲料；参见图4A)和对照组(喂食正常饲料；参见图4B)中大多数个体似乎表现出对它们的新到达和/或随后的测量确定产生非预期反应。令人感兴趣的是，这些副作用仅影响两组鱼的体重(参见图4)，但是不影响身长(参见图7)。此外，在研究的第一个月和第二个月，鱼的重量减轻表现最明显。后来，鱼似乎适应了它们的环境并且恢复对食物的兴趣，因此使我们能够在饲料消耗和鱼的重量/长度增加之间得出相关性。
以上讨论的结果支持以下结论。首先，两组锦鲤鱼消耗一定的时间段以适应环境和/或将它们新引入的操作过程。第二，每一条鱼对新环境和/或新操作过程的反应不同，因此，需要监测个体鱼的反应。第三，由于适应需要时间，在研究的前两个月难以得出在饲料消耗和鱼的重量/长度增加之间可靠的相关性。第四，两组鱼的身长似乎对适应环境的反应不太敏感。然而，在研究的第三个月和第四个月，身长和体重的变化彼此密切一致，因此这使我们在饲料消耗和鱼的重量/长度增加之间得出相关性。
在研究的前两个月，不管可能引发处理组和对照组二者的鱼重量减轻的环境因素的可能存在(参见图3)，两组鱼的体重和长度的总体平均增加量的差异提供了区分正常的鱼饲料和补充rtiGH的饲料之间的性能的决定性支持证据。虽然两组鱼中所用成员经四个月的研究表现出较重的重量和较长的长度(参见图5和图8)，但是处理组的体重和长度的总体平均增加量分别为40.38g(参见图6)和2.17cm(参见图9)，明显高于未处理组的值，分别为31.58g(参见图6)和1.61cm(参见图9)。事实上，两组数据之间的不一致均显著不同，重量总体平均增加27.9％(参见图6)和长度总体平均增加34.8％(参见图9)。
因此，在本申请中提供的我们的结果支持在枯草芽孢杆菌中表达的rtiGH在促进日本锦鲤鱼的生长中具有生物活性的结论。此外，获得枯草芽孢杆菌的全细胞溶解产物的便利性提供了用于制备补充rtiGH的鱼饲料的简易手段。继续努力改进tiGH表达，蛋白含量和枯草芽孢杆菌的生长密度以及扩大规模生产的条件，所述方法可以证明是在养鱼中大规模应用的具有成本效益的方法。
生长速率是渔业认为最重要的点之一，因为在生长性能和利润产量之间存在直接关系。由垂体产生的鱼生长激素(FGH)，22kDa单一链多肽，不仅对生长具有积极影响，而且还具有多效性功能，这对于鱼在不利的条件(例如环境压力和感染)下更好地应对是关键的。
已经很好地表征了多种种属的FGH，并且它们的相应的重组体已经在不同的微生物宿主系统中表达，以用于研究。在多种FGH中，能在海水以及淡水中繁殖的成年罗非鱼之一荷那龙罗非鱼为本发明的焦点之一。罗非鱼的天然FGH(tiGH)为具有187个氨基酸的多肽，其与金枪鱼和黄尾鱼的FGH具有高水平(超过84％)的同源性，并且与鳟鱼和鲑鱼66％相同。TiGH还以重组体的形式在大肠杆菌和巴斯德毕赤氏酵母中表达。由于具有改进的可用性，已经对重组tiGH在影响鱼的生长速率的效力方面进行了充分的研究。在一个实施例中，尽管鳟鱼和鲑鱼的tiGH和FGH之间具有相对低水平(66％)的同一性，但是有报道表明来自大肠杆菌的纯化的重组tiGH不仅仅促进罗非鱼的硬骨鱼种属(Oreochromis mossambicus)的生长，而且还促进红鲑鱼(Oncorhynchus nerka)的生长。在另一个实施例中，由巴斯德毕赤氏酵母制备的重组tiGH表现出增强幼体的生长、存活和质量以及若干幼体和仔鱼的免疫，例如罗非鱼、金鱼和鳟鱼的幼体以及鲤鱼和天使鱼的仔鱼。
令人感兴趣的是，不像相对应的哺乳动物，显示可以口服给予FGH，以提高鱼的生长性能。该策略在硬骨鱼中表现良好，因为它们的肠上皮能吸收高分子量蛋白。如预期的，生物活性tiGH已显示被鱼肠良好吸收，以促进躯体生长。此外，口服给予FGH与其它种属的鱼的生长促进具有相关性，包括银鳟鲑鱼(coho salmon)、比目鱼(Paralichtysolivaceus)、鲈鱼(Perca fiuviatilis)和巨型鲶鱼(giant catfish)。更重要地是，在给予后90分钟，在鱼的血液、肠、肌肉或肝脏中不能检测到口服给予的FGH的踪迹。因此，口服给予FGH似乎提供了一种提高鱼的生长性能的安全方法。
使用FGH处理鱼样品的一种方式是通过在溶解有FGH的缓冲溶液中浸泡鱼。虽然经处理的鱼明显比用普通缓冲溶液浸泡的对照鱼更快速地生长，但是这种给予方式是低效的，劳动密集型的并且在大规模上不可行。
我们的实验室已经参与构建有效的微生物系统，用于生产商业用途的重组蛋白。除了良好表征的革兰氏阴性细菌大肠杆菌以外，我们认为未像大肠杆菌那样充分研究的革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌具有很大的作为通用的重组体宿主系统的开发潜力。由于缺乏外部膜，枯草芽孢杆菌良好适合工程化用于分泌生产异种蛋白。此外，由于缺少外膜，枯草芽孢杆菌不含内毒素，因此它的使用通常被认为是安全的(GRAS)。
本发明开拓性的开发了枯草芽孢杆菌分泌系统，用于有益蛋白的重组生产，包括人表皮生长因子和分解纤维的细菌(纤维单胞菌，Cellulomonas fimi)的内切葡聚糖酶。随后，构建了枯草芽孢杆菌的veg I启动子的衍生物，并且证明它们在大肠杆菌中在功能上具有活性。
应理解的是，为了清楚，在单独的实施方式或实验的内容中描述的本发明的某些特征可以在单一实施方式中组合提供。相反地，为了简洁，在单一实施方式的内容中描述的本发明的各种特征可以单独地或以任何合适的亚组合提供。应注意的是，实施方式的某些特征通过非限制性实施例来说明。并且，本领域技术人员了解为了简洁的目的在以上未解释的现有技术。一些现有技术如下所示，它们通过引用将全文结合到本文中。
参考文献
1.Acosta J,Estrada MP,Carpio Y,et al.(2009)Tilapia somatotropinpolypeptides:potent enhancers of fish growth and innate immunity.BiotecnolApl 26(3):267-272.
2.Rentier-Delrue F,Swennen D,Philippart JC,et al.(1989)Tilapia growthhormone:molecular cloning of cDNA and expression in Escherichia coli.DNA 8(4):271-278.
3.Liu B,Zang XN,Liu XF,et al.(2012)Stable cell-surface expression ofJapanese flounder growth hormone in yeast Saccharomyces cerevisiae andgrowth-promoting effect on juvenile fish by oral administration.Fish Sci 78:99-107.
4.Sciara AA,Vigliano FA,Somoza GM,et al.(2011)Muscular hypertrophyand growth-promoting effects in juvenile pejerrey(Odontesthes bonariensis)after oral administration of recombinant homologous growth hormone obtainedby a highly efficient refolding process.Aquacult Res 42:844-857.
5.Acosta J,Carpio Y,Besada V,et al.(2008)Recombinant truncatedtilapia growth hormone enhances growth and innate immunity in tilapia fry(Oreochromis sp.).Gen Comp Endocr 157:49-57.
6.Sivakesava S,Su ZN,Chen YH,Hackett J,et al.(1999)Production ofexcretion human epidermal growth factor(hEGF)by an efficient recombinantEscherichia coli system.Process Biochem 34:893-900.
7.Kwong WY,Wong WKR,(2013)A revolutionary approach facilitating co-expression of authentic human epidermal growth factor and basic fibroblastgrowth factor in both cytoplasm and culture medium of Escherichia coli.ApplMicrobial Biotechnol 97(20):9071-9080.
8.Wong WKR,(2008)Application of recombinant microbial systems to theproduction of commercially valuable proteins.Res J Biotechnol 3(3).
9.Wong WKR,(2015)Means and methods for producing authentic humanbasic fibroblast growth factor.US patent US:9,017,968 B2.
10.Lam KH,Chow KC,Wong WKR,(1998)Construction of an efficientBacillus subtilis system for extracellular production of heterologousproteins.J Biotechnol 63:167-177.
11.Wang Y,Ng KL,Lam CC,et al.(2010)Efficient Bacillus subtilispromoters for graded expression of heterologous genes in Escherichia coli.ResJ Biotechnol 5(4):5-14.
12.Kwong WY,Ng KL,Lam CC,et al.(2013)Authentic human basic fibroblastgrowth factor produced by secretion in Bacillus subtilis.Appl MicrobialBiotechnol 97:6803-6811.
13.Mandel M,Higa A,(1970)Calcium-dependent bacteriophage DNAinfection.J Mol Biol 53(1):159-162.
14.Spizizen J,(1958)Transformation of biochemically deficient strainsof Bacillus subtilis by deoxyribonucleate.Proc Natl Acad Sci USA 44:1072–1078.
15.Titok MA,Chapuis J,Selezneva YV,et al.(2003)Bacillus subtilis soilisolates:plasmid replicon analysis and construction of a new theta-replicating vector.Plasmid 49(1):53–62.
16.Sambrook J,Fritsch EF,Maniatus T,(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual.Cold Spring Harb Perspect Med,Cold Spring Harbor,New York.
17.Schagger H,Von JG,(1987)Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in therange from 1 to 100 kDa.Anal Chem 166:368–79.
18.Liu S,Zang X,Liu B,et al.(2007)Effect of growth hormone transgenicSynechocystis on growth,feed efficiency,muscle composition,haematology andhistology of turbot(Scophthalmus maximus L.).Aquacult Res 38(12):1283-1292.
19.T,Austreng E,(1995)Optimal utilization of marine proteinsand lipids for human interest,In:Helge Reinersten,Herborg Haaland.Sustainablefish farming.A A Balkema Publishers 79-87.
20.Gisbert E,(2010)Protein hydrolysates in larval fish nutrition--Yeast,pig blood hydrolysates substitute for fishmeal in study.GlobalAquaculture Advocate March/April:73-74.
21.Wikimedia Foundation,Inc.,:Aquarium fish feed,2015.Available from:http://en.wikipedia.org/wiki/Aquarium_fish_feed.
22.Raven PA,Sakhrani D,Beckman B,et al.(2012)Growth and endocrineeffects of recombinant bovine growth hormone treatment in non-transgenic andgrowth hormone transgenic coho salmon.Gen Comp Endocr 177(1):143-152.
23.Habibi HR,(2004)Recombinant fish growth hormones,safety&efficacy.Global Aquaculture Advocate August:36-37.
24.MA,Robles-Basto CM,Mena-herrera A,(2013)Somaticgrowth effects of intramuscular injection of growth hormone in androgen-treated juvenile Nile tilapia,Oreochromis niloticus(Perciformes:Cichlidae).Rev Biol Trop 61(1):203-212.
25.Li Y,Bai J,Jiana Q,et al.(2003)Expression of common carp growthhormone in the yeast Pichia pastoris and growth stimulation of juveniletilapia(Oreochromis niloticus).Aquaculture 216(1-4):329-341.
26.Kim YS,Fox B,Kim KH,et al.(2012)Immersion bath treatment oftilapia fry with myostatin-1 prodomain does not affect tilapia growth atmarket size.Aquacult Res 1-6 Doi:10.1111/j.1365-2109.2012.03168.x
27.Hertz Y,Tchelet A,Madar Z,et al.(1991)Absorption of bioactivehuman growth hormone after oral administration in the common carp(Cyprinuscarpio)and its enhancement by deoxycholate.J Comp Physiol B 161(2):159-163.
28.Liu S,Zhang X,Zang X,et al.(2008)Growth,feed efficiency,bodymuscle composition,and histology of flounder(Paralichthys olivaceus)fed GHtransgenic Synechocystis.Aquaculture 277(1-2):78-82.
29.Vareli K,Jaeger W,Touka A,et al.(2013)Hepatotoxic SeafoodPoisoning(HSP)Due to Microcystins:A Threat from the Ocean？Marine Drugs 11:2751-2768.
30.Olmos J and Paniagua-Michel J.(2014)Bacillus subtilis a potentialprobiotic bacterium to formulate functional feeds for aquaculture.J MicrobBiochem Technol 6(7):361-365.
SEQUENCE LISTING
<110> 吴嘉伦（NG, KA LUN）
<120> 用于促进鱼的生长的手段和方法
<130> I41943MLI
<150> HK 15112136.3
<151> 2015-12-09
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 1
acactagtaa aaagatatct aatttaaatt ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac 60
aat 63
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 2
gaacaaacgc tggctgtctg tgatctgctg caattttatc acctcctttg tgaaattgtt 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 3
aacaatttca caaaggaggt gataaaattg cagcagatca cagacagcca gcgtttgttc 60
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 4
cagagagctc tcaaagtccg agaagagtct ctgggcgagc aggtgcaggt gcgtgactct 60
gttgactgca atgga 75
<210> 5
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 5
cttctcggac tttgagagct ctctgcagac ggaggagcaa cgtcagctca acaaaatctt 60
cctgcaggac ttctg 75
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 6
tgcgctgcgt ctcgtgtttg tcgatcgggc tgatgatgta atcagagttg cagaagtcct 60
gcaggaagat tttgt 75
<210> 7
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 7
atcgacaaac acgagacgca gcgcagctcg gtcctgaagc tgctgtcgat ctcctatgga 60
ctggttgagt cctgg 75
<210> 8
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 8
atctggttcc tcagagagga acctccagac agagagcgac tgggaaactc ccaggactca 60
accagtccat aggag 75
<210> 9
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 9
gaggttcctc tctgaggaac cagatttcac caaggctgtc tgagcttaaa acgggaatct 60
tgctgctgat caggg 75
<210> 10
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 10
gtgctggagg gtgtcggtgt caggataatt ctctgcttca tcctgattgg ccctgatcag 60
cagcaagatt cccgt 75
<210> 11
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 11
tcctgacacc gacaccctcc agcacgctcc ttacggaaac tattatcaaa gtctgggagg 60
caacgaatcg ctgag 75
<210> 12
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 12
ccaccttgtg catgtccttc ttgaagcaag ccagcaattc ataagtttgt ctcagcgatt 60
cgttgcctcc cagac 75
<210> 13
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 13
ttcaagaagg acatgcacaa ggtggagacc tacctgacgg tagctaaatg tcgactctct 60
ccagaagcaa actgc 75
<210> 14
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 14
agccccgggc taatgatgat gatgatgatg cagagtgcag tttgcttctg gagagagtcg 60
a 61
Claims (12)
1.一种在枯草芽孢杆菌宿主中表达编码荷那龙罗非鱼(Oreochromis hornorum)的鱼生长激素(tiGH)的基因的方法，该方法包括以下步骤：
—制备重组DNA表达盒，所述DNA表达盒从5’端到3’端包括：三对以串联的形式存在的vegA启动子(vegA)和lac操纵基因(lacO)、枯草芽孢杆菌共有核糖体结合位点(RBS)、ATG起始密码子、编码所述tiGH的DNA序列和编码6个组氨酸残基(6x His标签)的DNA低聚核苷酸序列；
—在枯草芽孢杆菌或大肠杆菌的穿梭载体中插入所述DNA表达盒，从而形成重组构建体3vegAtiGHH6；
—将所述重组构建体转化至所述枯草芽孢杆菌宿主中；
—使所述枯草芽孢杆菌宿主在细胞培养物中生长并且在细胞内表达所述tiGH；和
—通过溶解所述枯草芽孢杆菌释放所述tiGH。
2.一种在枯草芽孢杆菌宿主中表达编码荷那龙罗非鱼的鱼生长激素(tiGH)的基因的方法，该方法包括以下步骤：
—制备重组DNA表达盒，所述DNA表达盒包括：至少一对vegA启动子(vegA)和lac操纵基因(lacO)、枯草芽孢杆菌共有核糖体结合位点、ATG起始密码子、编码所述tiGH的DNA序列和编码6个组氨酸残基(6x His标签)的DNA低聚核苷酸序列；
—在枯草芽孢杆菌或大肠杆菌的穿梭载体中插入所述DNA表达盒，从而形成重组构建体3vegAtiGHH6；
—将所述重组构建体转化至所述枯草芽孢杆菌宿主中；
—使所述枯草芽孢杆菌宿主在细胞培养物中生长并且在细胞内表达所述tiGH；和
—释放所述tiGH。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述tiGH为22kDa的单一多肽。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述重组DNA表达盒从5’端到3’端包括：三对以串联的形式存在的vegA启动子(vegA)和lac操纵基因(lacO)、枯草芽孢杆菌共有核糖体结合位点、ATG起始密码子、编码所述tiGH的DNA序列和编码6个组氨酸残基(6x His标签)的DNA低聚核苷酸序列。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述穿梭载体为6.62-kb大小的pMTLBs72。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其中，在IPTG诱导剂和/或氯霉素抗生素的存在下，使转化后的枯草芽孢杆菌宿主生长，直至对数晚期或稳定期。
7.根据权利要求2或3所述的方法，所述方法包括将所述枯草芽孢杆菌宿主的细胞离心下来以获取所述tiGH的步骤。
8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中，通过使用French压力细胞匀浆器，以机械的方式实现所述tiGH的释放。
9.一种制备鱼饲料的方法，该方法包括权利要求1或3所述的方法。
10.一种工程质粒，该工程质粒含有：具有至少一对vegA启动子(vegA)和lac操纵基因(lacO)的编码序列、共有核糖体结合位点(RBS)、编码罗非鱼生长激素(tiGH)的基因和编码6-组氨酸密码子(6x His标签)的序列，其中，所述质粒从5’端到3’端还含有至少三对可操作地连接在一起的vegA启动子(vegA)和lac操纵基因(lacO)。
11.含有权利要求10所述的工程质粒的重组枯草芽孢杆菌。
12.一种动物食物或饲料添加剂，该动物食物或饲料添加剂含有权利要求11所述的重组枯草芽孢杆菌的细胞、其溶解产物或由其表达的蛋白。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HK15112136.3 | 2015-12-09 | ||
| HK15112136.3A HK1218486A2 (zh) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | 提高魚生長的手段和方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106893735A true CN106893735A (zh) | 2017-06-27 |
| CN106893735B CN106893735B (zh) | 2022-03-25 |
Family
ID=58009559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611128302.2A Active CN106893735B (zh) | 2015-12-09 | 2016-12-09 | 用于促进鱼的生长的手段和方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6707441B2 (zh) |
| CN (1) | CN106893735B (zh) |
| HK (1) | HK1218486A2 (zh) |
| TW (1) | TWI717434B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112021019368A2 (pt) * | 2019-03-29 | 2021-12-07 | Hoffmann La Roche | Método para produzir fcrn biotinilado no terminal c |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990007578A1 (en) * | 1989-01-06 | 1990-07-12 | Eurogentec S.A. | Recombinant fish hormone proteins |
| US6146848A (en) * | 1998-07-23 | 2000-11-14 | The Hong Kong University Of Science & Technology | Bacterial expression system |
| CN1349743A (zh) * | 2001-10-27 | 2002-05-22 | 深圳市三方圆信息技术有限公司 | 一种促进动物生长的绿色添加剂及其生产方法 |
| WO2007009403A1 (es) * | 2005-07-21 | 2007-01-25 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia | Polipéptidos estimuladores del crecimiento para uso en peces y crustáceos |
| CN101280282A (zh) * | 2008-05-23 | 2008-10-08 | 中国海洋大学 | 转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用 |
| CN102703483A (zh) * | 2012-06-08 | 2012-10-03 | 武汉凯肽来生物科技有限公司 | 罗非鱼重组口服蛋白tat-gh及制备方法和应用 |
| CN102899342A (zh) * | 2012-06-08 | 2013-01-30 | 武汉凯肽来生物科技有限公司 | 鲇生长激素与穿肠膜肽tat融合蛋白及制备方法和应用 |
| CN104447957A (zh) * | 2014-11-14 | 2015-03-25 | 中山大学 | 一种能促进罗非鱼生长激素表达的多肽pp2及其应用 |
-
2015
- 2015-12-09 HK HK15112136.3A patent/HK1218486A2/zh not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-12-06 TW TW105140272A patent/TWI717434B/zh active
- 2016-12-08 JP JP2016238123A patent/JP6707441B2/ja active Active
- 2016-12-09 CN CN201611128302.2A patent/CN106893735B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990007578A1 (en) * | 1989-01-06 | 1990-07-12 | Eurogentec S.A. | Recombinant fish hormone proteins |
| US6146848A (en) * | 1998-07-23 | 2000-11-14 | The Hong Kong University Of Science & Technology | Bacterial expression system |
| CN1349743A (zh) * | 2001-10-27 | 2002-05-22 | 深圳市三方圆信息技术有限公司 | 一种促进动物生长的绿色添加剂及其生产方法 |
| WO2007009403A1 (es) * | 2005-07-21 | 2007-01-25 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia | Polipéptidos estimuladores del crecimiento para uso en peces y crustáceos |
| CN101280282A (zh) * | 2008-05-23 | 2008-10-08 | 中国海洋大学 | 转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用 |
| CN102703483A (zh) * | 2012-06-08 | 2012-10-03 | 武汉凯肽来生物科技有限公司 | 罗非鱼重组口服蛋白tat-gh及制备方法和应用 |
| CN102899342A (zh) * | 2012-06-08 | 2013-01-30 | 武汉凯肽来生物科技有限公司 | 鲇生长激素与穿肠膜肽tat融合蛋白及制备方法和应用 |
| CN104447957A (zh) * | 2014-11-14 | 2015-03-25 | 中山大学 | 一种能促进罗非鱼生长激素表达的多肽pp2及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| REBECA MART´INEZ等: "Mendelian transmission, transgene dosage and growth phenotype in transgenic tilapia Oreochromis hornorum/showing ectopic expression of homologous growth hormone", 《AQUACULTURE》 * |
| 刘春雷等: "转大麻哈鱼生长激素基因鲤表型性状与体质量的相关性及通径分析", 《应用生态学报》 * |
| 简清等: "饲料中添加重组鱼生长激素对罗非鱼鱼种的促生长作用研究", 《淡水渔业》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TWI717434B (zh) | 2021-02-01 |
| JP6707441B2 (ja) | 2020-06-10 |
| JP2017104107A (ja) | 2017-06-15 |
| CN106893735B (zh) | 2022-03-25 |
| HK1218486A2 (zh) | 2017-02-17 |
| TW201720930A (zh) | 2017-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI262083B (en) | Microbially-expressed thermotolerant phytase for animal feed | |
| Lobo et al. | Dietary probiotic supplementation (Shewanella putrefaciens Pdp11) modulates gut microbiota and promotes growth and condition in Senegalese sole larviculture | |
| Chiu et al. | Using a fermented mixture of soybean meal and earthworm meal to replace fish meal in the diet of white shrimp, Penaeus vannamei (Boone) | |
| US20130216653A1 (en) | Spore surface display of bioactive molecules | |
| US20140315278A1 (en) | Spore surface displays of bioactive molecules | |
| PT2264156E (pt) | Fitases | |
| CN103533843A (zh) | 饲料添加剂组合物 | |
| US9631185B2 (en) | Fusion of bioactive molecules | |
| Ng Alan et al. | Enhancement of fish growth employing feed supplemented with recombinant fish growth hormone expressed in Bacillus subtilis | |
| US20210120845A1 (en) | Method for producing a protein hydrolysate employing an aspergillus fumigatus tripeptidyl peptidase | |
| KR100887334B1 (ko) | 아라자임을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류양식용 사료첨가제 | |
| Chung et al. | Recombinant production of biologically active giant grouper (Epinephelus lanceolatus) growth hormone from inclusion bodies of Escherichia coli by fed-batch culture | |
| CN101356191A (zh) | 用于水生生物培养的神经肽 | |
| CN106893735A (zh) | 用于促进鱼的生长的手段和方法 | |
| Gebremichael et al. | Does dietary inclusion of defatted yellow mealworm (Tenebrio molitor) affect growth and body composition of juvenile common carp (Cyprinus carpio)? | |
| Funkenstein et al. | Expression and purification of a biologically active recombinant rabbitfish (Siganus guttatus) growth hormone | |
| Gyan et al. | Effects of yeast antimicrobial peptide in aquaculture | |
| MX2007011479A (es) | Polipeptidos y acidos nucleicos que codifican a los mismos. | |
| CN106119978A (zh) | 中国明对虾抗脂多糖因子lbd结构域突变体文库及其构建方法和应用 | |
| CN104212807B (zh) | 斜带石斑鱼orexin‑A在调控石斑鱼糖代谢中的应用 | |
| CN105950636B (zh) | 一种松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因、松江鲈TfM-CK重组蛋白及其应用 | |
| TWI715312B (zh) | 飼料原料的製造方法 | |
| Wang et al. | Gut microbiota of bighead carp (Aristichthys nobilis) and paddlefish (Polyodon spathula) affected by their diets | |
| Mirzapour et al. | Investigation of characteristics of gelatin produced from common carp (Cyprinus carpio) wastes by enzymatic hydrolysis. | |
| Veisi et al. | Effects of microencapsulated Lactobacillus rhamnosus JCM 1136 probiotics on blood parameters and body composition of rainbow trout |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220425 Address after: Room 15, 14th floor, Xinglin Pavilion, Guanglin garden, New Territories, Hong Kong, China Patentee after: Huang Yunqiang Address before: Room 6, K block 13 layer Chinese Kowloon Hongkong Wong Chuk Garden Patentee before: Wu Jialun |