CN106884051B - 一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的pcr检测方法 - Google Patents

一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的pcr检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106884051B
CN106884051B CN201710157290.4A CN201710157290A CN106884051B CN 106884051 B CN106884051 B CN 106884051B CN 201710157290 A CN201710157290 A CN 201710157290A CN 106884051 B CN106884051 B CN 106884051B
Authority
CN
China
Prior art keywords
vibrio parahaemolyticus
vibrio
pcr
dna
specific primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710157290.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106884051A (zh
Inventor
刘宏生
张新刚
邹本尧
艾海新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liaoning Wellcome Testing and Evaluation Technology Co.,Ltd.
Original Assignee
Liaoning University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liaoning University filed Critical Liaoning University
Priority to CN201710157290.4A priority Critical patent/CN106884051B/zh
Publication of CN106884051A publication Critical patent/CN106884051A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106884051B publication Critical patent/CN106884051B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法。提取水产养殖动物组织的总DNA；以所提取的DNA为模板，采用副溶血弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的副溶血弧菌特异性引物是针对副溶血弧菌的recB基因的特异性引物P1或pyrH基因的特异性引物P2；根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被副溶血弧菌感染。本发明，使得水产养殖动物体内残留副溶血弧菌的检测更为简便，为今后水产养殖动物体内残留副溶血弧菌检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，同时为我国水产品病原菌检测和我国食品进出口安全奠定基础。

Description

一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法
技术领域
本发明属于病原微生物检测领域，具体的涉及一种养殖水产动物中常见的病原菌：副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)的PCR检测方法。
背景技术
副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)，是一种主要的食源性致病菌，嗜盐的革兰氏阴性细菌，属弧菌科弧菌属，广泛分布于沿海、河口环境和鱼、虾、贝等海产品中。同时副溶血弧菌是一种引起食源性疾病的重要病原菌，可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。研究数据表明，50％～70％因食用海产品引发的腹泻病例是由副溶血弧菌引起的。
目前国内外对副溶血弧菌检测方法主要有细菌生化方法、免疫学检测方法、环介导恒温扩增技术、分析化学方法、分子生物检测法。但存在着检测方法复杂，灵敏性差等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种水产养殖动物体内残留副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)的PCR检测方法。本发明的方法可快速鉴定致病源，为我国水产品进出口安全提供技术支持。
本发明采用的技术方案是：一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法，方法如下：
1)提取水产养殖动物组织的总DNA；
2)以所提取的DNA为模板，采用副溶血弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的副溶血弧菌特异性引物是针对副溶血弧菌的recB基因的特异性引物P1或pyrH基因的特异性引物P2；
所述的特异性引物P1的上下游引物的序列是：P1-F:AGAAGAAGCGCCCGTTGAAG；P1-R:GCATGCAATCTGTGTGTCGG。所述的特异性引物P2的上下游引物的序列是：P1-F:AGTTATCGGTGGCGGTAACC；P1-R:GCCTGCTGAGAAGATTACAACG。
Figure BDA0001247465360000011
PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；
第二阶段：94℃30s，61℃或62℃30s，72℃30s；30循环；
第三阶段：72℃5min；
第四阶段：4℃保存。
3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被副溶血弧菌感染。判断标准为，
针对特异性引物P1，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有212bp条带产生，则水产养殖动物被副溶血弧菌感染，否则没有被感染；
针对特异性引物P2，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有253bp条带产生，则大菱鲆被副溶血弧菌感染，否则没有被感染。
所述的水产养殖动物为大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾或三文鱼。
本发明的有益效果是：
1.本发明，设计的副溶血弧菌特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出副溶血弧菌，表现出很强的特异性。
2.本发明，设计的副溶血弧菌特异性引物，灵敏性高，可有效检出养殖水产品动物体内残留的副溶血弧菌，其最低检测浓度可达到10-3ng/ul。
3.本发明，所提供的水产养殖动物体内残留副溶血弧菌的PCR检测方法，使得水产养殖动物体内残留副溶血弧菌检测更为简便。在水产养殖动物中，一旦存在病原菌副溶血弧菌，即能够做到快速鉴定，为我国水产品进出口提供有效的检查方法。
4.本发明的检测方法可有效检出水产养殖动物体内的高危致病菌副溶血弧菌，经验证此检测方法特异性强，灵敏度高。该检测方法的确立为今后水产养殖动物体内残留病原菌副溶血弧菌的检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，不仅为我国水产品进出口食品安全提供技术支持，同时为我国养殖水产品食品安全健康发展做出了贡献。
附图说明
图1是实施例1副溶血弧菌特异性引物P1的PCR反应条件优化；
其中，M:Marker D，1-5:退火温度分别为58℃，59℃，60℃，61℃，62℃。
图2是实施例1副溶血弧菌特异性引物P1的特异性验证；
其中，1.Vibrio vulnificus；2.Vibrio hollisae；3.Vibrio parahemolyticus；4.Vibrio harveyi；5.Vibrio gigantis；6.Vibrio campbellii；7.Vibrioalginolyticus；8.Vibrio metschnikovii；9.Vibrio mimicus；10.Vibriocyclitrophicus；11..Aeromonas hydrophila；12.Aeromonas salmonicida；13.Aeromonassobria 14.Aeromonas veronii 15.Pseudomonas helmanticensis；16.Pseudomonasaeruginosa；17.Pseudomonas kilonensis，18.Bordetella trematum；M:Marker D。
图3是实施例1副溶血弧菌特异性引物P1的PCR反应灵敏性验证。
其中，M:Marker D，1-7:模板浓度分别为101ng/ul，100ng/ul，10-1ng/ul，10-2ng/ul，10-3ng/ul，10-4ng/ul，10-5ng/ul。
图4是实施例1副溶血弧菌特异性引物P1对不同水产养殖动物PCR扩增产物的凝胶成像结果；
其中，M:Marker D，1-7分别为注射0.1ml副溶血弧菌菌液的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织；8-14分别为注射0.90％生理盐水的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织。
图5是实施例2副溶血弧菌特异性引物P2的PCR反应条件优化；
其中，M:Marker DL 2000，1-5:退火温度分别为57℃，58℃，59℃，60℃，61℃。
图6是实施例2副溶血弧菌特异性引物P2的特异性验证；
其中，1.Vibrio vulnificus；2.Vibrio parahemolyticus；3.Vibrio harveyi；4.Vibrio fluvialis；5.Vibrio campbellii；6.Vibrio alginolyticus；7.Vibriometschnikovii；8.Vibrio mimicus；9.Vibrio gigantis；10.Aeromonas hydrophila；11.Aeromonas salmonicida；12.Aeromonas veronii；13.Pseudomonas helmanticensis；14.Pseudomonas aeruginosa；15.Pseudomonas kilonensis；16.Bordetella trematum M:Marker DL2000。
图7是实施例2副溶血弧菌特异性引物P2的PCR反应灵敏性验证。
其中，M:Marker DL 2000，1-7:模板浓度分别为101ng/ul，100ng/ul，10-1ng/ul，10-2ng/ul，10-3ng/ul，10-4ng/ul，10-5ng/ul。
图8是实施例2副溶血弧菌特异性引物P2对大菱鲆人工感染副溶血弧菌PCR扩增产物的凝胶成像结果；
其中，M:Marker DL 2000，1-7分别为注射0.1ml副溶血弧菌菌液的大菱鲆肌肉组织，8-14分别为注射0.90％生理盐水的大菱鲆肌肉组织。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
(一)副溶血弧菌特异性引物的设计
本实施例针对菌种副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)的recB基因，利用软件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)和MEGA6软件，设计出对副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)具有特异性强且灵敏性高的一对特异性引物P1，该副溶血弧菌特异性引物的具体信息如表1所示。
表1
Figure BDA0001247465360000041
(二)副溶血弧菌特异性引物P1最佳PCR反应条件的探索
1、副溶血弧菌DNA的提取
使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，提取副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)的DNA，具体步骤如下：
1.1)取1ml过夜培养的含有菌种副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)的菌液，加入1.5ml离心管中，室温8000rmp离心1min，弃上清，收集菌体，加入180ulBufferDigestion，再加入20ul Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。水浴过程中，每10分钟颠倒混匀一次，促进细胞裂解。
1.2)加入200ul Buffer BD，充分颠倒混匀。加入Buffer BD后，如有沉淀产生，可70℃水浴10分钟。
1.3)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。
1.4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
1.5)将吸附柱重新放回收集管中，加入500ul PW Solution，10000rmp离心30s，倒掉收集管滤液。
1.6)将吸附柱重新放回收集管，加入500ul Wash Solution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。
1.7)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心2min，弃去残留的WashSolution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的WashSolution，Wash Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。
1.8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-200ul CE Buffer静置3min，12000rmp室温离心2min，收集DNA溶液，即为副溶血弧菌的DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
2、副溶血弧菌特异性引物P1最佳退火温度的探索
分别以提取的副溶血弧菌的DNA为模板做PCR扩增，并将目的引物的退火温度分别设置为58℃、59℃、60℃、61℃、62℃，PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，根据PCR后的凝胶电泳结果确定副溶血弧菌特异性引物的最佳退火温度。具体PCR反应条件和体系如表2所示，结果如图1。
表2 目的引物最佳PCR反应探索条件
Figure BDA0001247465360000051
由图1可见，温度对该引物并无明显影响，但根据PCR基本原则，温度越高越有利于引物的特异性结合，故确定最佳退火温度为62℃。
(三)副溶血弧菌特异性引物P1的特异性探索
1、待试菌株DNA的提取
使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，分别提取如表3所示的不同菌种的DNA，具体步骤如上述(二)中步骤1。
2、特异性探索
分别以表3中，提取的不同菌种的DNA为模板做PCR扩增，具体PCR反应条件和体系如表4所示，PCR后的凝胶电泳结果如图2所示。
表3 待试菌株如下：
Figure BDA0001247465360000052
Figure BDA0001247465360000061
表4 目的引物最佳PCR反应条件
Figure BDA0001247465360000062
由图2可见，本发明的副溶血弧菌特异性引物在弧菌属内，以及气单胞菌属和假单胞菌属内均表现出很强的特异性，只能和目的菌株副溶血弧菌产生特异性扩增，而非目的菌株未产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。
(四)副溶血弧菌特异性引物P1的灵敏性的探索
1、副溶血弧菌DNA的提取
使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，提取副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)菌种的DNA，具体步骤如上述(二)中步骤1。
2、灵敏性的探索
将副溶血弧菌的DNA浓度调至101ng/ul，并且依次稀释为100ng/ul、10-1ng/ul、10- 2ng/ul、10-3ng/ul、10-4ng/ul、10-5ng/ul，分别取1ul DNA作为PCR反应模板，具体PCR反应条件和体系如表5所示，PCR后的凝胶电泳结果如图3所示。
表5 目的引物最佳PCR反应探索条件
Figure BDA0001247465360000071
由图3可见，本发明的副溶血弧菌特异性引物在副溶血弧菌DNA浓度为101ng/ul、100ng/ul、10-1ng/ul、10-2ng/ul、10-3ng/ul时均可产生特异性扩增，其最低检测浓度可达到10-3ng/ul。
(五)水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测
1、提取水产养殖动物组织的总DNA；
使用Ezup柱氏动物基因组DNA抽提试剂盒，提取水产养殖动物组织的DNA，具体步骤如下：
1.1)分别取约未注射副溶血弧菌和注射0.1ml副溶血弧菌菌悬液的25mg水产养殖动物组织，用液氮研磨成粉末，加到1.5ml离心管中，加入180ul Buffer ACL，再加入20ulProteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。
1.2)加入200ul Buffer CL，充分颠倒混匀。加入Buffer CL后，如有沉淀产生，可70℃水浴10分钟。
1.3)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。
1.4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
1.5)将吸附柱重新放回收集管中，加入500ul CW1Solution，10000rmp离心30s，倒掉收集管滤液。
1.6)将吸附柱重新放回收集管，加入500ul CW2Solution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。
1.7)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心2min，弃去残留的CW2Solution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的CW2Solution，CW2Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。
1.8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-200ul CE Buffer静置3min，12000rmp室温离心2min，收集DNA溶液，即为水产养殖动物组织的总DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
2、PCR方法扩增
以提取的DNA为模板，采用副溶血弧菌特异性引物P1，利用PCR方法扩增，得到PCR产物；
P1-F:AGAAGAAGCGCCCGTTGAAG
P1-R:GCATGCAATCTGTGTGTCGG
Figure BDA0001247465360000081
PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；
第二阶段：94℃30s，62℃30s，72℃30s；30循环；
第三阶段：72℃5min；
第四阶段：4℃保存。
3、PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，如图4所示。
M:Marker D，1-7分别为注射0.1ml副溶血弧菌菌液的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织；8-14分别为注射0.90％生理盐水的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织。
4、判断标准：根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断该引物实际检测效果；如果琼脂糖凝胶呈现结果有212bp条带产生，则实际检测效果良好。如果琼脂糖凝胶未呈现结果有212bp条带产生，则实际检测效果不理想。
由图4可见，注射0.1ml副溶血弧菌菌液的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织(1-7)均产生212bp大小条带，而注射0.90％生理盐水的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织(8-14)未产生212bp大小条带，由此可见，本发明根据副溶血弧菌recB基因所设计的特异性引物具有较好的检测能力，可应用到实际检测中。
实施例2
(一)副溶血弧菌特异性引物的设计
本实施例针对菌种副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)的pyrH基因，利用软件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)和MEGA6软件，设计出对副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)具有特异性强且灵敏性高的一对特异性引物P2，该副溶血弧菌特异性引物的具体信息如表1所示。
表1
Figure BDA0001247465360000091
(二)副溶血弧菌特异性引物P2最佳PCR反应条件的探索
1、副溶血弧菌DNA的提取：同实施例1
2、副溶血弧菌特异性引物最佳退火温度的探索
分别以提取的副溶血弧菌的DNA为模板做PCR扩增，并将目的引物的退火温度分别设置为57℃、58℃、59℃、60℃、61℃，PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，根据PCR后的凝胶电泳结果确定副溶血弧菌特异性引物的最佳退火温度。具体PCR反应条件和体系如表6所示，结果如图4。
表6 目的引物最佳PCR反应探索条件
Figure BDA0001247465360000092
由图5可见，温度对该引物并无明显影响，但根据PCR基本原则，温度越高越有利于引物的特异性结合，故确定最佳退火温度为61℃。
(三)副溶血弧菌特异性引物普的特异性探索
1、待试菌株DNA的提取
使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，分别提取如表7所示的不同菌种的DNA，具体步骤如实施例1的(二)中步骤1。
2、特异性探索
分别以表7中，提取的不同菌种的DNA为模板做PCR扩增，具体PCR反应条件和体系如表8所示，PCR后的凝胶电泳结果如图6所示。
表7 待试菌株如下：
Figure BDA0001247465360000101
表8 目的引物最佳PCR反应条件
Figure BDA0001247465360000102
由图6可见，本发明的副溶血弧菌特异性引物在弧菌属内，以及气单胞菌属和假单胞菌属内均表现出很强的特异性，只能和目的菌株副溶血弧菌产生特异性扩增，而非目的菌株未产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。
(四)副溶血弧菌特异性引物P2的灵敏性的探索
1、副溶血弧菌DNA的提取：同实施例1
2、灵敏性的探索
将副溶血弧菌的DNA浓度调至101ng/ul，并且依次稀释为100ng/ul、10-1ng/ul、10- 2ng/ul、10-3ng/ul、10-4ng/ul、10-5ng/ul，分别取1ul DNA作为PCR反应模板，具体PCR反应条件和体系如表9所示，PCR后的凝胶电泳结果如图7所示。
表9 目的引物最佳PCR反应探索条件
Figure BDA0001247465360000111
由图7可见，本发明的副溶血弧菌特异性引物在副溶血弧菌DNA浓度为101ng/ul、100ng/ul、10-1ng/ul、10-2ng/ul、10-3ng/ul时均可产生特异性扩增，其最低检测浓度可达到10-3ng/ul。
(五)大菱鲆养殖过程中副溶血弧菌的PCR检测
1、提取大菱鲆组织的总DNA；
使用Ezup柱氏动物基因组DNA抽提试剂盒，提取大菱鲆组织的DNA，具体步骤如下：
1.9)分别取约未注射副溶血弧菌和注射0.1ml副溶血弧菌菌悬液的25mg大菱鲆组织，用液氮研磨成粉末，加到1.5ml离心管中，加入180ul Buffer ACL，再加入20ulProteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。
1.10)加入200ul Buffer CL，充分颠倒混匀。加入Buffer CL后，如有沉淀产生，可70℃水浴10分钟。
1.11)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。
1.12)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
1.13)将吸附柱重新放回收集管中，加入500ul CW1Solution，10000rmp离心30s，倒掉收集管滤液。
1.14)将吸附柱重新放回收集管，加入500ul CW2Solution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。
1.15)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心2min，弃去残留的CW2Solution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的CW2Solution，CW2Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。
1.16)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-200ul CE Buffer静置3min，12000rmp室温离心2min，收集DNA溶液，即为大菱鲆组织的总DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
2、PCR方法扩增
以提取的DNA为模板，采用副溶血弧菌特异性引物P2，利用PCR方法扩增，得到PCR产物；
P2-F:AGTTATCGGTGGCGGTAACC
P2-R:GCCTGCTGAGAAGATTACAACG
Figure BDA0001247465360000121
PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；
第二阶段：94℃30s，61℃30s，72℃30s；30循环；
第三阶段：72℃5min；
第四阶段：4℃保存。
3、PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，如图8所示。
4、判断标准：根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断该引物实际检测效果；如果琼脂糖凝胶呈现结果有253bp条带产生，则实际检测效果良好。如果琼脂糖凝胶未呈现结果有253bp条带产生，则实际检测效果不理想。
由图8可见，注射0.1ml副溶血弧菌菌液的大菱鲆组织(1-7)均产生253bp大小条带，而注射0.90％生理盐水的大菱鲆组织(8-14)未产生253bp大小条带，由此可见，本发明根据副溶血弧菌pyrH基因所设计的特异性引物具有较好的检测能力，可应用到实际检测中。

Claims (3)

1.用于检测水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物是针对副溶血弧菌的recB基因的特异性引物P1和针对副溶血弧菌pyrH基因的特异性引物P2，其序列为：
P1-F:AGAAGAAGCGCCCGTTGAAG
P1-R:GCATGCAATCTGTGTGTCGG
P2-F:AGTTATCGGTGGCGGTAACC
P2-R:GCCTGCTGAGAAGATTACAACG。
2.根据权利要求1所述的PCR引物，其特征在于，所述的副溶血弧菌是Vibrioparahemolyticus。
3.根据权利要求1所述的PCR引物，其特征在于，用所述PCR引物进行PCR扩增的反应体系和反应条件如下：
Figure FDA0002736881980000011
PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；
第二阶段：94℃30s，61℃或62℃30s，72℃30s；30循环；
第三阶段：72℃5min；
第四阶段：4℃保存。
CN201710157290.4A 2017-03-16 2017-03-16 一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的pcr检测方法 Active CN106884051B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710157290.4A CN106884051B (zh) 2017-03-16 2017-03-16 一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的pcr检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710157290.4A CN106884051B (zh) 2017-03-16 2017-03-16 一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的pcr检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106884051A CN106884051A (zh) 2017-06-23
CN106884051B true CN106884051B (zh) 2021-01-08

Family

ID=59181555

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710157290.4A Active CN106884051B (zh) 2017-03-16 2017-03-16 一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的pcr检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106884051B (zh)

Also Published As

Publication number Publication date
CN106884051A (zh) 2017-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Development and evaluation of a real-time fluorogenic loop-mediated isothermal amplification assay integrated on a microfluidic disc chip (on-chip LAMP) for rapid and simultaneous detection of ten pathogenic bacteria in aquatic animals
Bisha et al. A review of the current status of cultural and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus
CN102747165B (zh) 一种应用环介导等温扩增技术快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒
WO2015196778A1 (zh) 对普罗威登斯菌o3，o4，o8，o12，o13和o20特异的核苷酸及其应用
Zhi et al. Development of recombinase-aided amplification (RAA)-Exo-probe and RAA-CRISPR/Cas12a assays for Rapid Detection of Campylobacter jejuni in Food samples
CN105734166B (zh) 一种多重pcr引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用
WO2015180484A1 (zh) 对普罗威登斯菌031，041，042，043和050特异的核苷酸及其应用
CN106884051B (zh) 一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的pcr检测方法
CN106939347B (zh) 三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测试剂盒与方法
CN108103152B (zh) 一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法
Klaif et al. Molecular characterization of enterohemorrhagic E. coli O157 and O153 isolated from tissue camel and human stool samples in Al-Diwaniyah, Iraq.
CN106755550B (zh) 一种水产养殖动物体内溶藻弧菌的pcr检测方法
CN105256041B (zh) 对亲水气单胞菌o44，o24，o25和o28特异的核苷酸及应用
CN105200044B (zh) 对河流弧菌o1，o6，o7，o8和o9特异的核苷酸及其应用
CN105969907B (zh) 一种检测st251型致病性嗜水气单胞菌的试剂盒及应用
CN106755552A (zh) 一种水产养殖动物或水产食品中创伤弧菌的pcr检测方法
KR101752274B1 (ko) 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형 stx1 및 stx2를 동시에 판별하기 위한 고감도 실시간 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형의 판별 방법
CN111621578A (zh) 一种基于ru61_00441基因的德尔卑沙门氏菌恒温检测试剂盒及方法
CN105256042B (zh) 对亲水气单胞菌o13，o36，o16和o19特异的核苷酸及应用
CN105256028B (zh) 对柠檬酸杆菌017和o39特异的核苷酸及其应用
CN105154439B (zh) 对蜂房哈夫尼亚菌g5902，g5903，g5904，g5906特异的核苷酸序列
Dzierzanowska et al. PCR for identification and typing of Helicobacter pylori isolated from children
Choudhary et al. Recent Trends in Diagnosis of Campylobacter Infection
CN115838815B (zh) 用于检测鰤鱼诺卡氏菌的rpa组合物、荧光rpa试剂盒及检测方法
CN114262707B (zh) 用于检测空肠弯曲杆菌基因的sgRNA、CRISPR/Cas12a体系、试剂盒、检测方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220920

Address after: No. 10-1, No. 10-2, Jincang Road, Hunnan District, Shenyang City, Liaoning Province 110000

Patentee after: Liaoning Wellcome Testing and Evaluation Technology Co.,Ltd.

Address before: 110000 58 Shenbei New Area Road South, Shenyang, Liaoning.

Patentee before: LIAONING University