CN106796241A

CN106796241A - 确定先兆子痫风险的方法

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Publication number: CN106796241A
Application number: CN201580054200.8A
Authority: CN
Inventors: 塔加·阿霍拉; 海卡基·科鲁; 米科·赛拉宁
Original assignee: Wallac Oy
Current assignee: Wallac Oy
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2015-09-01
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2035-09-01
Also published as: PL3189336T3; WO2016034767A1; US10656163B2; US20170285041A1; CN106796241B; EP3189336B1; EP3189336A1

Abstract

本说明书涉及确定患有慢性高血压的孕妇发生早发型或晚发型先兆子痫的风险的方法。本说明书提供了可用于确定患有慢性高血压的妊娠个体发生早期先兆子痫或晚期先兆子痫的风险的方法。本文中描述了包括PlGF和sP‑选择蛋白在内的生化标志物的有用组合和相关临床群体研究。

Description

确定先兆子痫风险的方法

先兆子痫(PE)影响约3至5％的妊娠并且是孕产妇和围产期死亡和发病的重要原因。如Perni等，Hypertension.2012；59：740-746综述，先兆子痫也可以在患有慢性(预先存在)高血压的女性中发生，并且与受孕时血压正常的女性相比，发生频繁高3至5倍。并发先兆子痫的诊断经常是困难的，因为女性已经患有高血压并且有些甚至有蛋白尿。PE以及并发先兆子痫的发病机理可能涉及胎盘血管重塑，导致有缺陷的胎盘形成、胎盘缺血、和母体内皮细胞功能障碍。披露的数据提示，胎盘缺血与胎盘蛋白质产生增加有关，所述蛋白质在释放到母体循环中时，造成母体的全身性炎症和内皮细胞功能障碍。与不患有预先存在的高血压的女性中的PE相比，并发PE与甚至更高的孕产妇和胎儿发病率和死亡率有关，Perni等(2012)。

母体样品中存在的许多生物标志物目前被认为与先兆子痫相关。胎盘生长因子(PlGF)已经被证明是预测先兆子痫(EP2368119A1)、特别是早发型先兆子痫(Pool等2013，Vol.33，No.1，2013期刊发行日：2013年1月Fetal Diagn Ther 2013；33：16–27)的良好标志物。然而，在导致本公开的研究中结果发现，对于那些患有慢性高血压的女性来说，它不是良好标志物。

因此需要对患有慢性高血压的妊娠个体发生先兆子痫、特别是早发型或晚发型先兆子痫的风险提供早期评估的方法。

此外，需要基于可以体外进行的生物样品分析来确定所述风险的方法。

此外，需要基于可以在妊娠的前三月期中进行的生物样品分析来确定所述风险的方法。

还有，还需要确定先兆子痫、特别是早发型或晚发型先兆子痫的风险的方法，所述方法在单次筛查中具有改善的检出率。

发明内容

本说明书提供了可用于确定患有慢性高血压的妊娠个体发生早期先兆子痫或晚期先兆子痫的风险的方法。本文中描述了生化标志物的有用组合和相关临床群体研究。另外，本文中提出了生化标志物的某些组可用于在单次筛查中确定早期先兆子痫或晚期先兆子痫的风险。意外地发现，PlGF和sP-选择蛋白(sP-selectin)的组合可用于确定患有慢性高血压的妊娠个体的早期和晚期先兆子痫的风险。

本文中提供了在妊娠个体中确定早发型或晚发型先兆子痫风险的方法，所述方法包括测定来自患有慢性高血压的个体的一个或多个血液样品中包括PlGF和sP-选择蛋白在内的生化标志物的水平；和利用所测定的生化标志物水平来确定早发型或晚发型先兆子痫的风险。

该方法包括个体的高血压史；患有慢性高血压的个体和利用包括PlGF和sP-选择蛋白在内的生化标志物的水平确定先兆子痫的风险。

在下文中，本文中提供的方法将借助于详细说明和参考实施例1来进一步描述。

附图说明

图1a显示了从后来发生EO-PE的血压正常的女性测量的PlGF。

图1b显示了在后来发生EO-PE(并发EO-PE)的慢性高血压女性之中的PlGF。

图2a显示了并发EO-PE的PlGF预测。

图2b显示了并发EO-PE的PlGF+sP-选择蛋白预测。

图3显示了在有正常(对照组)和EO-PE情况的血压正常和慢性高血压妊娠之中的PlGF MoM。在GA 11-13时取样。

图4显示了在有正常(对照组)和EO-PE情况的血压正常和慢性高血压妊娠之中的sP-选择蛋白MoM。在GA 11-13时取样。

图5显示了在后来发生“典型”PE的女性之中的PlGF。数据显示，正如与EO-PE一样，PlGF作为单一标志物在血压正常的女性中比在慢性高血压女性中效果更好。

图6显示了PlGF和并发PE。

图7表1。

发明的详细说明

慢性高血压是指个体血压长期高于正常的病状。如果血压经常等于或高于140/90mmHg，通常就说存在高血压。患有慢性高血压的妊娠个体在妊娠之前已经患有高血压或妊娠个体一般在20孕周之前被诊断患有高血压。

并发先兆子痫是指在20孕周之前患有高血压的女性中伴或不伴蛋白尿的高血压(ACOG指南)。它可以通过以下来表征：

-如果在妊娠早期已经存在蛋白尿的话，蛋白尿突然加重

-高血压突然加重

-发生HELLP综合征(HELLP综合征是出现在孕妇中的一组症状，所述孕妇具有溶血、肝酶升高和血小板计数低)。

-患有慢性高血压的女性发生头痛、暗点或上腹痛。

样品

在妊娠个体中确定早期或晚期先兆子痫风险的方法包括利用来自所述妊娠个体的生物样品。所述生物样品可以是含有所选择的生化标志物的任何体液或组织样品。优选地，所述样品是血液或血液级分，例如血清。生物样品的选择常常可取决于在特定的临床实验室中可用的用于测试标志物水平的测定形式。例如，一些测定形式缺乏测定全血所需要的灵敏度，致使临床实验室选择测试血液级分例如血清，或使用干血。此外，已经保存、例如通过冷冻或干燥(例如以血卡片形式)保存的样品适合用于本文中描述的方法。实施例1描述了使用血清形式的母体血液。可用于本文中描述的方法的示例性生物样品包括血液、纯化的血液制品(例如血清、血浆等)、尿、羊水、绒毛膜绒毛活检、胎盘活检和宫颈阴道液。优选的样品包含血液样品。这意味着所述方法在体外、在孕妇(在本文中也称为母体、个体、患者或受试者)的身体外部进行。

用于测定样品中多肽和其他生物标志物水平的典型的测定形式包括使用对照多肽，尤其在定量这样的多肽的水平时。可商购的蛋白质和其他生物标志物可用作测量生化标志物水平的测定法中的标准品。或者，用于表达蛋白质、例如在原核和真核系统中表达蛋白质的方法和用于合成多肽的方法是公知的。全长蛋白及其片段可用作定量测定从孕妇获得的样品中生物标志物水平的标准品。

“对照样品”在此是指从处于妊娠的相同三月期或孕龄的受试者获得的样品，并且其中所述妊娠被证实具有关于先兆子痫的特定结果。通常，“对照样品”已经被证实没有发生先兆子痫(参见本文中的实施例)，然而也可以使用被证实已经发生先兆子痫的对照样品。该术语在此被定义为包括一个或多个样品，使得对照样品可以是从群体获得的一组样品。所选的妊娠对照可以通过生物物理参数例如孕产妇年龄、体质指数、种族和孕龄、抽烟状况而与先兆子痫病例匹配。

生化标志物的水平

“在来自所述个体的至少一个血液样品中测定包括PlGF和sP-选择蛋白在内的生化标志物的水平”是指通过具体评估从所述孕妇获得的样品和对照样品中所选择的生化标志物水平的方法来测定所提到的标志物。样品中存在的生化标志物的水平可利用适合于测量生物样品中的蛋白质的任何测定形式来测定。出于这种目的的常用测定形式是免疫测定法，包括例如酶免疫测定法(EIA)例如酶放大免疫测定技术(EMIT)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、IgM抗体捕捉ELISA(MAC ELISA)、和微粒子酶免疫测定法(MEIA)；毛细管电泳免疫测定法(CEIA)；放射免疫测定法(RIA)；免疫放射测定法(IRMA)；荧光偏振免疫测定法(FPIA)；解离增强的镧系荧光免疫测定法(DELFIA)和化学发光测定法(CL)。

相对于对照样品，所述样品中生化标志物的水平的差异指示了该女性中先兆子痫的风险。取决于所测试的具体生物标志物，所述差异可以是所述生化标志物水平的增加或降低。

在某些情况下，可以不只一次地从孕妇收集生物样品，例如，当由于先验风险、出现症状和/或其他因素，她的高血压和/或胎盘状况要求监测先兆子痫的发生时。本文中描述的确定先兆子痫风险的方法也可以用于监测正经历高血压和/或胎盘状况的疗法或治疗的妊娠个体。如果需要，生化和/或生物物理标志物的测试可以在家庭环境中进行，例如通过利用家用的试纸条生化测试形式和自动血压器而在家庭环境中进行。

“发生早发型或晚发型先兆子痫的风险增加”是指受试者(孕妇)分别发生早发型或晚发型先兆子痫的可能性的水平高于没有发生所述病症的对照组孕妇中的水平。

生化标志物

在确定妊娠个体的先兆子痫风险的情况下最令人感兴趣的生化标志物是PlGF和sP-选择蛋白。

以前发表的研究已经显示，PlGF水平降低指示先兆子痫的发生。

缩写“PlGF”是指胎盘生长因子。PlGF最初是在1991年从人足月胎盘cDNA文库中克隆得到的。PlGF也已在其他组织例如心脏、肺、肌肉和脂肪组织中检测到。PlGF属于血管内皮生长因子(VEGF)家族蛋白质。它与VEGF-A具有约50％的中等序列相似性。可变剪接产生大小不同的四个同种型，其中PlGF-1和PlGF-2被认为是主要同种型。PlGF-1含有131个氨基酸(MW：单体14.7kDa，二聚体29.4kDa)。PlGF-2含有PlGF-1和21个氨基酸的肝素结合位点插入片段(MW：单体17.3kDa，二聚体34.6kDa)。全长PlGF-2蛋白的长度因此是152个氨基酸。PlGF-3含有PlGF-1和C-端附近的72个氨基酸插入片段(MW＝单体22.8kDa，二聚体45.6kDa)。因此，全长PlGF-3蛋白的长度是203个氨基酸。PlGF-4含有PlGF-3和21个氨基酸的肝素结合位点插入片段(MW＝单体26.2kDa，二聚体52.4kDa)。全长PlGF-4的长度因此是224个氨基酸。本文中在没有同种型的任何限定时对PlGF的指称，是指PlGF-1。

SP-选择蛋白(也称为P-选择蛋白)是血小板中发现的粘附分子。在炎性和血栓形成条件中，所述分子在细胞膜上表达并启动内皮细胞、白细胞和血小板之间的相互作用。血小板活化出现在正常妊娠中，但这在PE中放大，以血小板凝聚、血管收缩和内皮损伤为特征。控制血小板活化的因子是未知的，但细胞因子例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)被牵涉在内。血小板活化标志物——sP-选择蛋白的血清浓度在已确定的PE期间增加，并且还有证据表明这种升高可从妊娠的前三月期开始明显(Akolekar R.等，妊娠高血压病症中11至13孕周时的母体血浆P-选择蛋白(Maternal plasma P-selectin at 11 to 13 weeks ofgestation in hypertensive disorders of pregnancy).Hypertens Pregnancy 2011；30(3)：311-21.

如本文中所述，现在已经认识到，在患有慢性高血压的妊娠个体的母体样品中测量PlGF和sP-选择蛋白的组合可用于更好地确定孕妇发生早期或晚期先兆子痫的风险。筛查性能因此得到改善，如与只使用PlGF检测的实验室测试相比检出率增加和假阳性率降低所反映的。

标志物PlGF和sP-选择蛋白的选择性检测可以与用于评估先兆子痫发生风险的任何其他合适的生化标志物或其他指标相组合。这样的生化标志物是例如选自激活素A、Ue-3、PAPP-A、PAI-1、PAI-2、PlGF-2、PlGF-3、PlGF-4、PP13、VEGF165b和ADAM-12的那些标志物。

生物物理标志物

本文中描述的方法包括测定个体的血压。可以使用选自妊娠个体的收缩压、舒张压和平均动脉血压的一种或多种度量。

生化标志物PlGF和sP-选择蛋白的选择性检测也可以与用于评估先兆子痫发生风险的任何合适的生物物理标志物相组合。这样的生化标志物是例如血压、平均动脉压(MAP)和子宫动脉搏动指数(PI)。当应用这种实施方式时，确定先兆子痫发生风险利用生化标志物和至少一种生物物理标志物这二者的水平来进行。

平均动脉压(MAP)是指在心动周期中的平均血压，并使用确定的程序，通过心输出量(CO)、全身血管阻力(SVR)和中心静脉压(CVP)来测定。医护人员可以使用任何方法来测量妊娠个体的血压，包括例如触诊法、听诊法和示波法。也可以使用自动血压测量设备。

在实施方式中，本文中描述的方法可包括测定子宫动脉搏动指数(PI)。“子宫动脉搏动指数”是指动脉血流速度波形指数，其被设计成定量所述波形的搏动或振动。已经发现PI在有舒张期血流逆转、即双向流的临床病例中特别有用。可以利用任何已知的方法测量妊娠个体的PI。

孕产妇史(maternal history)

在本文中使用时，“孕产妇史因素”是指预计对所测量的生化和生物物理标志物水平有影响的孕产妇特征集。在不良妊娠结果筛查领域中，孕产妇史公认至少包括孕产妇年龄、孕周、种族来源、妊娠期间吸烟、受孕方法、病史、用药、胎次(parity)、产科史和BMI。也可以包括妊娠个体的高血压史。为了改善风险计算的可靠性，可以在算法中包括这些因素。包含孕产妇史改善了妊娠期间筛查的检出率。为了确定在算法中可用的因素，从其中生化标志物和不良妊娠结果的关系被确定的群体收集孕产妇史。收集通常是基于由个体自身完成的问卷，所述问卷优选由专业医护人员与患者一起复查。当评估个人风险时，从她收集相同的特征并在进行风险确定时纳入考虑。待研究的特征是母亲中的高血压史、孕产妇年龄、种族来源、妊娠期间吸烟、受孕方法、病史、用药、胎次、产科史和PE家族史。收集或测量的孕产妇体重和身高可以转变为体质指数(BMI)，以Kg/m²计。

统计分析

下文的实施例包括关于使用生物标志物确定孕产妇健康状况的风险的临床研究的统计分析说明。妊娠个体发生先兆子痫的风险可基于在患者群体研究中收集的临床数据，利用统计分析从生化标志物水平来确定。存在多种统计方法用于组合表征所述妊娠个体的参数，例如生化标志物的水平，以获得风险评估。似然法(Palomaki和Haddow，Am.J.Obstet.Gynecol.156，460-3(1987))、线性判别函数法(Norgarrd-Pedersen等Clin.Genet.37，35-43(1990))和多因素Logistic回归分析通常用于这种目的。因而，本文中描述的风险确定方法可以基于使用公知的统计方法，其中使用截止值或MoM确定风险。要理解，可以采取等效的公知统计方法来评估医学状况的风险。

似然法的基本原理是参数(例如生化标志物的水平)的群体分布在“未受影响”和“受影响”组中是已知的。因此，对任何给定的参数(例如标志物水平和血压读数)而言，可以计算“未受影响”和“受影响”组的成员的似然。对基于群体平均值和标准偏差的参数而言，所述似然按高斯高度(Gaussian height)计算。“似然比”是利用“未受影响”和“受影响”的群体参数计算的高度的比率，并且是相对于先验风险，患病风险增加的表示。

例如，利用由临床群体研究导出的公式(Cuckle等1987)，可以计算女性的先验概率(其是与先验风险相关的统计学表示，如本文中下面所描述的)以得到孕产妇的健康状况。这些先验概率可利用所述似然比进行修正以导出后验概率，后验概率可用于先兆子痫或染色体异常风险评估。利用似然法预测胎儿具有染色体异常的风险的详细说明在例如以下文献中阐述：“唐氏综合征筛查(Screening for Down’s Syndrome)”，J.G.Grudzinskas，T.Chard，M.Chapman和H.Cuckle编著；Cambridge University Press出版，1994)。利用本文中描述的方法，用观察到的似然比分布来确定风险也是可能的(参见，例如，Spencer等Ann.Clin.Biochem.，29，506-18(1992))。

作为确定孕妇发生先兆子痫的风险的方法的实例，可从已知患有先兆子痫的女性群体收集样品。分析这些样品以测定各生化标志物的水平。所测定的各生化标志物的水平然后通常被转变为对具有相同的孕龄、孕产妇体重、种族、抽烟状况、受孕方法和胎次的妊娠来说特异性的预期正常中位数的倍数(MoM)。然后使用公知的统计回归方法进行风险计算(参见，例如Draper等《应用回归分析》(Applied Regression Analysis)(第三版)Wiley：New York，NY，1998和Cuckle HS等，利用女性的年龄和血清甲胎蛋白水平评估她具有与唐氏综合征相关的妊娠的风险(Estimating a woman′s risk of having a pregnancyassociated with Down′s syndrome using her age and serum alphafetoproteinlevel).Br.J Obstet Gynecol 1987；94：387-402；和上面的其他参考文献)。

先兆子痫和其他高血压病症

按本文中的理解，妊娠期间出现的先兆子痫和其他高血压病症是以当病症发生时可检测的症状为特征的。如果按照严重度递增的顺序排列，最不严重的病症是妊娠高血压。当除了妊娠高血压之外还检出蛋白尿时，它被称为先兆子痫，其被分成晚发型和早发型先兆子痫，如下面所定义的。早发型先兆子痫是这些病症中最严重的。

根据国际妊娠高血压研究学会(International Society for the Study ofHypertension in Pregnancy)指南(Davey等，Am.J.Obstet Gynecol；158；892098，1988)，妊娠高血压被描述为相隔至少4h两次记录到舒张压90mmHg以上，和相隔至少4h两次记录到压力至少110mm Hg以上的重度高血压，或一次记录到舒张压至少120mm Hg。

在本文中使用时，术语“先兆子痫”是指部分特征在于妊娠高血压和蛋白尿的妊娠病症。对以前血压正常的女性来说，PE通常定义为妊娠高血压伴蛋白尿，重度PE通常定义为重度妊娠高血压伴蛋白尿。对患有慢性高血压的女性来说，并发PE通常定义为新发生的蛋白尿。可用于做出PE诊断的PE的各方面可根据各种医学组织制定的指南来分类。

蛋白尿经常被描述为在24h内排泄300mg以上，或者如果24h收集不可用，在中段或导管尿样本的试纸条分析上两次读数2+以上。女性一般在20孕周之前被分类为以前血压正常或患有慢性高血压。

先兆子痫在本文中被理解和应该被定义为包括和属于先兆子痫病症谱内，所述先兆子痫病症谱包括胎盘功能不全、宫内生长迟缓、早期流产、早产、宫内死亡和子痫。虽然不希望受理论束缚，已经提出宫内生长迟缓反映了孕妇身体应对先兆子痫状况的适应，它让胎儿存活。另一方面，早期流产和早产可反映孕妇身体应对先兆子痫状况的适应，它让女性存活。在这种情况下，宫内死亡是这种适应的失败。因此，本文中描述的确定先兆子痫风险的方法包括、并且也可以用于确定所述先兆子痫谱上的先兆子痫病症的风险。

先兆子痫可早在20孕周时发生，并且如果因为先兆子痫在34周之前进行婴儿分娩的话，一般被认为是“早期先兆子痫”或“早发型先兆子痫”。在本文中使用时，“晚期先兆子痫”或“晚发型先兆子痫”被定义为在34周时或之后发生婴儿分娩。早期先兆子痫与发病率增加有关，并因此被认为是更严重的先兆子痫形式。本文中描述的确定先兆子痫风险的方法特别可用于筛查“早期先兆子痫”。对用于检测先兆子痫的方法而言，可在前三月期内、中三月期内和后三月期内收集样品。优选地，样品在前或中三月期内、优选在前三月期内收集。虽然从公众健康的观点来看，较早检验经常是有益的策略，但要了解样品的收集有时可受到实际考虑的影响，例如女性推迟到她的医护人员那里就诊直到相对较后的孕周。

在利用如本文所述的方法确定妊娠个体发生先兆子痫的风险增加的情况下，所述个体可从医护人员那里接受治疗或生活方式的建议。虽然对先兆子痫没有广泛使用的治疗，但各种研究已经显示了疗法例如抗高血压药例如硫酸镁、阿司匹林、地西泮和苯妥英；和膳食增补剂例如维生素D、钙和硒的益处。

测定生化标志物水平的时机

所述生化标志物的测定可在妊娠的前三月期或中三月期内、或在这两个三月期内进行。然而，在妊娠的前12周内检测发生高血压病症的高风险的能力为医护人员给孕妇提供预防策略提供了更多的时间。经常希望在妊娠早期完成风险评估，以便为预防或延迟先兆子痫在孕妇中发生的措施提供时间。

本文中描述的确定患有慢性高血压的孕妇发生早期或晚期先兆子痫的风险的方法可利用在妊娠的前三月期内从女性获得的样品来实践。在具体实施方式中，所述样品是在妊娠的前三月期内，优选在孕龄的8-13周期间，更优选在11-13周期间获得的。在一种实施方式中，可在妊娠的一个或多个三月期从所述女性获得一个或多个样品。根据本发明方法的另一种实施方式，在妊娠的中三月期内获取样品。通常这是指妊娠的14至26周。

任选地，可在妊娠的前三月期内获得一个样品，并在妊娠的后面阶段、优选在妊娠的中三月期内获得另一个样品。在妊娠的前三月期内检测发生先兆子痫的高风险的能力为医护人员给孕妇提供预防策略提供了更多的时间。经常希望在妊娠早期完成风险评估，以便为预防或延迟PE状况在女性中发生的措施提供时间。

风险的计算

通常，由测量生化标志物的水平获得的结果利用在计算机上运行的算法来处理。在计算机上执行的计算机程序使计算机执行确定孕妇先兆子痫风险的过程。该过程可包括输入至少两种生物标志物的测量结果，所述测量结果通过如下获得：i)测定从孕妇获得的样品，其中至少所述生化标志物至少包括PlGF和sP-选择蛋白；ii)将所述样品中各生物标志物的水平与对照样品中相同生物标志物的水平进行比较，其中相对于对照样品，所述样品中生化标志物的水平的差异指示先兆子痫，和iii)基于所述比较的结果确定所述风险的定量评估。

另外，所述方法可包括利用孕产妇高血压史以便选择患有慢性高血压的个体。

所述计算机程序可进一步包括使用至少一种附加的生化标志物。任选地，所述计算机程序可进一步包括使用至少一种选自激活素A、Ue-3、PAPP-A、PAI-1、PAI-2、PlGF-2、PlGF-3、VEGF165b、PlGF-4和ADAM-12的附加的生化标志物。

所述计算机程序可包括输入通过测定受试者的一种或多种生物物理标志物而获得的至少一种生物标志物的测量结果；将所述受试者的一种或多种生物物理标志物与对照受试者中的相同生物物理标志物进行比较，其中相对于所述对照，所述受试者中所述一种或多种生物物理标志物的度量增加或降低指示发生先兆子痫的风险增加，和基于所比较的一种或多种生化标志物和所比较的一种或多种生物物理标志物的结果确定发生先兆子痫风险的定量评估。

在所述计算机程序中，所述过程也可以包括确定先兆子痫风险的定量评估，所述定量评估包含利用多变量分析确定先兆子痫的似然，并且其中所述多变量分析包含利用所述生化标志物的水平和来自于一组对照参考数据的分布参数。优选地，所述多变量分析是多变量高斯分析。

评估孕妇的先兆子痫风险的试剂盒

可利用用于评估患有慢性高血压的孕妇的先兆子痫风险的试剂盒或商业包来运用本文中描述的方法。

根据一种实施方式，利用至少两种试剂盒来运用所述方法，一种试剂盒用于PlGF，另一种试剂盒用于sP-选择蛋白。各试剂盒含有至少两种与所述标志物(例如PlGF)特异性结合的结合配偶体，并且至少一种所述结合配偶体是可检测的。

根据另一种实施方式，所述试剂盒提供i)至少四种可检测的结合配偶体，其中至少两种可检测的结合配偶体与PlGF特异性结合，并且至少两种可检测的结合配偶体与sP-选择蛋白特异性结合。各标志物的至少一种结合配偶体是可检测的。

在实施方式中，所述可检测的结合配偶体是抗体或其抗原结合片段。

在另一种具体实施方式中，试剂盒还可提供关于在所述确定中使用所述可检测的结合配偶体的说明书。所述说明书中可提供试剂体积、温育时间、反应条件等。

检测方法

在一个方面，本文中提供了确定孕妇发生先兆子痫的风险的方法。所述方法包括测定从孕妇获得的样品中至少两种生化标志物的水平，其中所述生化标志物包含PlGF和sP-选择蛋白；和利用所测定的生化标志物水平确定先兆子痫风险。优选被确定风险的所述先兆子痫是早发型先兆子痫。

在所述方法的实施方式中，确定孕妇发生先兆子痫的风险还包括利用孕产妇史因素，特别是高血压史。

根据所述方法的公开内容，从受试者获得的样品中PlGF水平降低和sP-选择蛋白水平增加是所述受试者中早发型或晚发型先兆子痫的风险增加的指示。

样品观察结果

换句话说，鉴定了以下观察结果中的至少一种，并因此鉴定了水平差异：相对于对照样品中的PlGF水平，从受试者获得的样品中的PlGF水平降低；相对于对照样品中的sP-选择蛋白水平，从受试者获得的样品中的sP-选择蛋白水平增加。

这些观察结果被生成为数值，它们在算法中产生对孕妇发生早发型或晚发型先兆子痫风险的评估。

简而言之，如本文中所述的用于确定患有慢性高血压的孕妇的早期或晚期先兆子痫风险的方法的示例性版本可通过从孕妇获取血液样品来进行。如果需要，所述血液可被处理以制备血浆或血清。使用利用特异性针对生化标志物PlGF和sP-选择蛋白的至少两种抗体(一种涂布在微量滴定板上，捕获抗体，并且另一种用可检测标记物进行标记，示踪抗体)的标准免疫测定法来进行生化标志物的测定。实例是使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)，其中试样中的显色强度与存在的标志物浓度成正比。基于这种测试，可计算所述生化标志物的水平。该水平可独立地，或者如果需要，与其他标志物水平相组合，用于风险算法中。为了设计所述风险算法，可使用针对假定所述群体中先兆子痫的％发病率进行调整的数据集的标准Logistic回归分析。为了确定所述生化标志物的水平是否大于或小于正常，测定来自相关群体的母体生物样品中存在的正常生化标志物水平。所述相关群体可基于能影响所述标志物的正常(未受影响的)水平的任何特征来定义。为了确定早期先兆子痫的风险，所述相关群体可分别在早期先兆子痫和晚发型先兆子痫的低风险的基础上建立。一旦知道所述正常标志物水平，就可利用标准统计方法比较所测定的标志物水平和确定差异显著性。当所测定的标志物水平和所述正常水平之间有统计显著性差异时，所测试的个体存在发生早发型或晚发型先兆子痫的显著风险。

将所述样品中所选的生化标志物的水平与对照样品中相同的生化标志物的水平相比较。相对于对照样品，所述样品中生化标志物的水平的差异是发生早发型或晚发型先兆子痫的风险增加的指示。差异是指数值的统计显著性差异。存在任何一种所述生化标志物的“水平增加或降低”是指任何一种所述生化标志物的水平统计显著性偏离对照样品中相同生化标志物的水平，高于或低于对照样品中的水平。

为了在常规先兆子痫筛查中分析单个样品的测量结果，首先需要对照群体的数据。该数据通过测量来自大量样品、优选每个妊娠周超过100个样品的所选的生化标志物而获得。然后优选将所选的生化标志物的测量浓度进行log10转换，以产生生物变异的高斯分布。随后，从对照数据确定各选定生化标志物在各妊娠周的中值浓度和标准偏差。之后，可以将任何单个样品的结果与适当的中值浓度比较，以确定所选的生化标志物的浓度是否不同于它们的正常值。这种比较可用作计算患者先兆子痫风险的基础，而先兆子痫风险作为做出早发型或晚发型先兆子痫诊断的基础。从研究产生这种数据的实例在实施例中进行。

也可以进行匹配病例对照研究来证实生化标志物PlGF和sP-选择蛋白的行为。在这样的研究中，使用通过生理参数与早发型或晚发型先兆子痫病例群体匹配的对照群体。也可以使用稍有不同的方法来计算这样的研究与常规筛查相比较的结果。

PlGF的组合、测量和本发明的确定患有慢性高血压的孕妇发生早发型或晚发型先兆子痫的风险的方法。

作为一种实施方式，所述确定患有慢性高血压的孕妇发生早发型或晚发型先兆子痫风险的方法包括测量PlGF水平的差异，较早已经报导PlGF是先兆子痫的指示并将测量它与sP-选择蛋白相组合用于所述分析。PlGF比sP-选择蛋白更好地预测没有慢性高血压的PE，而sP-选择蛋白比PlGF更好地预测有慢性高血压的PE。PlGF和sP-选择蛋白的组合预测所有形式的PE。采用利用PlGF和sP-选择蛋白的生物标志物组合的本发明方法，能够以适合于所述状况的方式监测和治疗显示出发生早期先兆子痫或晚发型先兆子痫风险的那些人。

单独的PlGF是预测并发EO-PE的差标志物。当与sP-选择蛋白组合使用时，性能明显增加。当在妊娠的前三月期内测量时，标志物组合在10％FPR下检出约60％的会发生并发EO-PE的那些女性，而单独的PlGF只检出约20％的病例。

单独使用的PlGF检出约40％的LO-PE(晚发型PE)病例，而PlGF与sP-选择蛋白一起在5％FPR下检出约60％。当PlGF与sP-选择蛋白组合使用时，对LO-PE的性能也明显增加(表1，第53、54和55行)。

考虑到筛查群体和作出医护决定这两方面，并且也考虑到个体、她们在妊娠期间的习性、担忧和甚至焦虑，本文中公开的方法都具有重要的益处。在群体水平上，通过相对于可能的高血压病症的预计严重度来调整造访助产士或产科医师的频率，实现了费用节省。

数据分析原则

-将数据分成不同的孕周区：

10-14，15-26，27-36(整周)

-将各孕区中的浓度(MoM化)(MoM 1-3)归一化。协变量：孕龄，母亲体重，种族和吸烟

-计算各孕周区内不同结果的基于Logistic回归的风险模型

变量＝分析物MoM

最多三种分析物的组合

-计算不同假阳性率下的检出率并对所有模型作出ROC曲线。

指征和分组如下：

先兆子痫(PE)

全部

有或没有慢性高血压(并发PE)

早发型或晚发型(通过分娩孕龄在34周之前和之后来划分)

有或没有慢性高血压的早发型

有或没有慢性高血压的晚发型

实施例

实施例1

图1a显示了从后来发生EO-PE的血压正常的女性测量的PlGF。

图1a的箱线图显示，与未患EO-PE的妊娠(对照组)相比，后来在妊娠中发生EO-PE的血压正常的女性中的PlGF浓度降低。样品的获取越接近所述疾病的发作，PlGF浓度降低得越多。

对照是指没有不良结果的正常妊娠。

包括“非正常”的对照是指没有发生EO-PE但可能遭受其他不良妊娠结果的妊娠。

GA是指抽血时的孕龄。

图1b的箱线图显示，在患有慢性高血压并且后来在妊娠中发生并发EO-PE的女性中，PlGF浓度没有降低到与在血压正常的女性之中相同的程度。

在慢性高血压上的并发PE：在20孕周之前患有高血压的女性中新发作蛋白尿。它可以通过以下来表征：

-如果在妊娠早期已经存在蛋白尿的话，蛋白尿突然加重

-高血压突然加重

-发生HELLP综合征

-患有慢性高血压的女性发生头痛、暗点或上腹痛。

图2显示了并发EO-PE的PlGF预测。

图2a是PlGF的受者工作特征(ROC)曲线，用于在高血压女性中预测EO-PE(并发PE)。图2a显示了并发EO-PE的PlGF预测。

图2b显示了并发EO-PE的PlGF+sP-选择蛋白预测。

图2b.PlGF+sP-选择蛋白组合的ROC曲线，用于预测并发EO-PE。图2b显示了并发EO-PE的PlGF+sP-选择蛋白预测。

从所述结果可得出结论：

PlGF是预测并发EO-PE的差标志物。当与sP-选择蛋白组合使用时，性能明显增加。当在妊娠的前三月期内测量时，标志物组合在10％FPR下检出约60％的会发生并发EO-PE的那些女性，而单独的PlGF只检出约20％的病例。

另一个数据集证实了上述结果：

图6显示了PlGF和并发PE。

图7表1。

Claims

1.在患有慢性高血压的妊娠个体中确定先兆子痫风险的方法，所述方法包括：在来自所述个体的至少一个血液样品中测定包括PlGF和sP-选择蛋白在内的生化标志物的水平；和利用所测定的生化标志物水平确定先兆子痫的风险，其中将所述生化标志物的水平与相同生化标志物的对照值比较，并且其中所述生化标志物的水平与相同生化标志物的对照值相比较的差异是早发型或晚发型先兆子痫的指示。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在从受试者获得的样品中PlGF水平降低和sP-选择蛋白水平增加是早发型或晚发型先兆子痫的风险增加的指示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中确定所述风险还包括利用孕产妇史因素。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述样品是在前三月期内收集的。