CN106769338B - 一种单细胞全自动连续捕获与收集装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单细胞全自动连续捕获与收集装置及方法，装置包括玻璃底片、PDMS微流控芯片、电磁铁和永磁铁偶件、开关继电器、信号放大电路以及信号采集控制系统，所述PDMS微流控芯片凹刻有微通道，所述微通道包括：一端有进样孔的直主通道、垂直主通道两侧均匀分布的若干细胞捕获通道、细胞捕获通道与主通道之间有一个带有细胞检测门通道的细胞捕获孔，所述细胞捕获通道末端设有一个细胞收集孔。电磁铁和永磁铁偶件分别位于检测门处玻璃底片下方和PDMS芯片上方。本发明具有全自动化操作的特点，且通过电磁铁、永磁铁偶件以及微流控芯片的配合使用可实现单细胞的高通量自动捕获与收集。

Description

一种单细胞全自动连续捕获与收集装置及方法

技术领域

本发明涉及细胞操纵技术领域，具体说是涉及一种基于微流控芯片进行单细胞全自动连续捕获与收集的装置及方法。

背景技术

细胞分析是生物、医学分析领域的一种核心手段，目前在相关领域内普遍采用的主要是显微镜人工操作的方法，这样可以保证分析结果的准确性、可研究性与全面性，但由于其过程耗时、效率低、样品消耗大、成本高且对操作人员的专业水平要求较高等原因，在高强度大规模地应用中受到了限制。

微流控芯片装置可以将生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离和检测等基本操作集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。它具有液体流动可控、消耗试剂和试样极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点，可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析，并且能在线实现样品的预处理及分析全过程。

在微流控芯片上，通过对微流体施加如电场、磁场、激光束等外力，并结合微流控通道内的流体动力，能够实现单细胞的操控与分选，在生命科学与分析化学等领域有着广阔的应用前景。目前，在微流控芯片上实现单细胞操控的方法主要有：

介电电泳法：指本身不带电、但可以被不同程度极化的细胞在非均匀的电场中会产生侧向移动。由于不同的细胞具有的不同介电特性，基于这种原理的微流控芯片设备已经可以用于医学诊断。此方法优点是操作精确且不损坏待测物，收集速度快且位置可调，以及易于集成等；缺点是受外界电场影响大，易产生误差，不能捕获和收集单个细胞用于后续研究。

磁场力技术：通过对微流控芯片系统施加外部磁场实现对惰性细胞的操控。优点是相对于光强或电场来说，恒定的磁场对细胞产生的不利影响小的多，操纵效果十分明显；缺点是并非所有细胞都受磁铁力影响，也无法实现单细胞捕获。

光镊技术：指通过运用光钳设备提供聚焦激光束，从而产生一种吸引或排斥的力来固定或移动微观绝缘体。这种技术已经可以用来在三维环境下以一种不接触的方式来对绝缘细胞进行操控和分选，优点是具有高灵敏性，适用性强；缺点是操作复杂，设备复杂，成本高，可能对细胞本身造成破坏。

离心力技术：指通过对螺旋的微流控通道施加离心力，根据细胞的尺寸实现对细胞的分选。优点是可以轻松实现细胞的分离目的；缺点是只能单方向分离，且操作难度大，无法捕获单个细胞用于后续研究。

电渗流法：指在微通道两端施加外加电场后引起的溶液流动，并带动溶液内细胞一起运动而实现操作与分离的方法。优点是操作简单，设备简单，成本低等；缺点是操纵作用较弱，技术不成熟。

综上所述，目前还没有一种设备简单、操作方便的装置和方法能够实现单细胞的连续自动捕获和收集以满足在生物研究和医学分析等领域内此方面的需求。

发明内容

鉴于已有技术存在的不足，本发明的目的是要提供一种结构简单、操作方便的单细胞全自动连续捕获与收集的装置。

为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

一种单细胞全自动连续捕获与收集装置，其包括玻璃底片、PDMS微流控芯片、电磁铁和永磁铁偶件、信号放大电路以及信号采集控制系统，所述PDMS微流控芯片凹刻有微通道的一侧与所述玻璃底片封装为一体，以形成供样品流通的微通道，其特征在于，所述微通道包括：

位于微流控芯片中心位置一端设置有进样孔且另一端封闭的主通道；

所述主通道两侧向主通道外侧均匀凹刻有N个与主通道连通的细胞捕获孔，N≥2；

任意所述细胞捕获孔上方沿垂直于主通道方向均延伸有一定长度的细胞检测门通道，且所述细胞检测门通道末端连接细胞捕获通道；

所述细胞捕获通道上设置有细胞收集孔，且所述细胞收集孔连有溢流槽；

同时所述电磁铁安装于玻璃底片下方；所述永磁铁安装在PDMS芯片上方；

所述主通道进样孔和所有细胞收集孔内均插有铂电极，任意所述细胞收集孔内的铂电极通过一参考电阻与直流电源的负极连接，所述主通道进样孔内的铂电极与上述直流电源的正极连接；

所述参考电阻的两端均通过导线与所述信号放大电路的输入端连接，所述信号放大电路的输出端与所述信号采集控制系统连接。

进一步地，所述细胞捕获孔包括两个直径长度为待捕获目标细胞直径长度的半圆区域以及一个与检测门通道等宽的矩形区域。

进一步地，所述待捕获目标细胞直径与细胞检测门通道的宽度的差值等于待捕获目标细胞直径的10％，且细胞检测门通道的长度等于待捕获目标细胞直径。

进一步地，所述捕获通道下端两侧向中心方向渐缩直至其宽度与细胞检测门通道相同，并与细胞检测门通道相连接。

进一步地，所述电磁铁的安装于所有细胞捕获通道渐缩的起始位置所对应的在玻璃底片下方，所述永磁铁安装在细胞检测门通道位置所对应的PDMS芯片正上方。

本发明另一目的是要提供一种基于上述单细胞全自动连续捕获与收集装置的细胞捕获与收集方法，其特征在于，包括如下步骤：

样品滴加：首先向所述主通道进样孔中滴加一定量的PBS缓冲液，再向各细胞收集孔内滴加等量PBS缓冲液，接通电磁铁电源，然后将一定量的样品细胞滴入到所述主通道进样孔中；

样品输运：接通所述直流电源，使得所述主通道进样孔中的样品在压力作用下流向各个细胞捕获孔；

细胞捕获：当有细胞进入细胞捕获孔时，由于电磁铁和永磁铁偶件的配合作用，细胞会卡在检测门通道入口，主通道进样孔内铂电极与相应的细胞采集孔内铂电极之间的参考电阻两端产生一个脉冲信号，该脉冲信号被信号采集控制系统检测到，并在显示器上显示相应通道有细胞被捕获，当信号采集控制系统显示所有细胞捕获孔内都有细胞时，系统向开关继电器发送电磁铁断电信号，电磁铁与永磁铁偶件分离，各细胞检测门通道释放细胞进入到相应的细胞收集孔内；

细胞收集：系统延时一定时间后，电磁铁继续通电，阻断细胞捕获通道与主通道的连通，此时可以使用移液器从各个细胞采集孔中取出单个细胞进一步处理。

进一步地，在细胞捕获与收集过程中，当电磁铁处于通电状态时，其与永磁铁偶件配合使得检测门通道高度小于待捕获目标细胞的直径。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明基于微流控芯片利用多条细胞捕获通道同时工作，单细胞分选的通量大；

2、本发明能够方便实现单细胞的捕获和收集，为后续研究工作提供了极大的便利。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明细胞捕获与收集装置微流控芯片结构示意图；

图2为本发明系统结构图。

附图标号说明：

图中：M、微流控芯片，L、玻璃底片，S、细胞捕获孔，T、细胞检测门通道，Q、溢流槽，P、主通道进样孔，A～J、1～10号细胞采集孔，V、电磁铁，W、永磁铁，1～10、1～10号细胞捕获通道，11、主通道。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

通过磁铁间相互作用实现微流控芯片流道局部高度变化，用以控制通道中细胞的流动。施加磁力流道高度变低，阻碍细胞通过实现细胞捕获；去除磁力作用后，流道高度恢复，细胞流动正常实现细胞释放。

基于上述设计背景，本发明设计了一种基于微流控芯片进行单细胞全自动连续捕获与收集的装置，下面结合附图以及具体实施例进一步说明本发明的技术方案：

如图1所示，以微流控芯片为载体的单细胞全自动连续捕获和释放的方法和装置，其包括玻璃底片L、PDMS微流控芯片M、电磁铁和永磁铁偶件、信号放大电路以及信号采集控制系统。

所述PDMS微流控芯片M凹刻有微通道的一侧与所述玻璃底片L封装为一体，以形成供待测样品流通的微通道，所述微通道包括：

主通道11，主通道的一端开设有进样孔P，另一端为封闭端。

细胞捕获通道1～10，细胞捕获通道在主通道两侧均匀分布，细胞捕获通道的数量可以根据使用需求以及微流控芯片承载量确定，本实施例优选为10条。各细胞捕获通道下端宽度逐渐变窄，两侧微流道壁向中心方向均匀收缩直至其宽度与细胞检测门通道相同，并与细胞检测门通道相连接。

细胞收集孔A～I，任意细胞捕获通道末端均设有细胞收集孔，且每一细胞收集孔均接有溢流槽Q，本实施例中优选溢流触发的液面高度值为1㎜。

细胞捕获孔S，细胞捕获孔为设置于细胞捕获通道与主通道之间且带有细胞检测门通道T的凹槽，其包括直径与待捕获目标细胞直径相同的两个半圆形区域及一个位于两个半圆形中间且与细胞检测门通道等宽的矩形区域。

细胞检测门通道T，细胞检测门通道设置在各细胞捕获孔S上方与细胞捕获通道连通，且待捕获目标细胞直径与细胞检测门通道宽度的差值等于待捕获目标细胞直径的10％，细胞检测门通道的长度等于待捕获目标细胞的直径，这样设计可以保证每条细胞捕获通道一次仅能捕获或释放一个目标细胞，实现装置单细胞操作功能。

所述电磁铁安装在玻璃底片下方，其位置正对个细胞检测通道S宽度变窄的起始位置；所述永磁铁偶件安装在细胞检测门通道T对应的PDMS芯片正上方。

同时所述主通道进样孔P和各细胞收集孔A～I内均插入铂电极，所述细胞采集孔A～I内插有的铂电极通过一参考电阻与直流电源的负极连接，所述主通道进样孔P内插有的铂电极与上述直流电源的正极连接；所述参考电阻的两端均通过导线与所述信号放大电路的输入端连接，所述信号放大电路的输出端与所述信号采集控制系统连接。

所述信号放大元件采用差分放大器元件。

所述信号采集控制系统包括开关继电器、NI采集卡和计算机，计算机控制所述开关继电器实现各捕获通道电路的通断同时控制电磁铁通、断电。

所述信号采集与控制系统，初始设定为各支路全部通电，有细胞流入细胞捕获孔时对应的细胞捕获通道的外接电路会产生细胞脉冲信号；当十个细胞捕获通道都检测到脉冲信号后或可以在任意时刻根据使用需求使电磁铁断电，细胞捕获孔内的目标细胞会流入此对应细胞捕获通道的细胞采集孔。

下面以聚苯乙烯样品细胞为例进行检测，如图2所示：

本实施案例的装置参数：本实施案例所用的芯片收集通道的尺寸100*50μm(宽×高)，主通道尺寸是200*50μm(宽×高)，检测门尺寸是18*20*50μm(宽×长×高)，捕获口尺寸是18*20*50μm(宽×长×高)，安装永磁铁时的旋涂厚度为100μm；样品为20μm聚苯乙烯细胞溶液；缓冲液为PBS(1×)溶液；施加于进样通道储液孔与检测通道储液孔的电压为48V；

该装置包括位于所述PDMS微流控芯片上的主通道进样孔P、细胞收集孔A-J、以及主通道11、采集通道1-10。在进液通道储液孔P和细胞收集孔A-J中插入铂电极，并通过电阻Rn连接至直流电源两端；在电阻Rn两端通过两根导线并联于一差分放大器的两个输入端；差分放大器的输出端连接至NI数据采集卡的输入端；NI输出信号可以直接在所连接的计算机显示并进行分析和控制各通道电路的通断。

本实施例中使用的微流控芯片可以由如下方法制得：

先在硅基模具上旋涂一层100μm厚的PDMS(固化剂含量1/16)，热烘5min后取出，将10个永磁铁分别放置在10个检测门正上方位置后继续热烘25min，然后取出正常倒胶(厚度不高于磁铁高度)制作芯片基片，基片与载玻片plasma后在载玻片底部芯片对应位置粘上所述永磁铁。

基于上述单细胞全自动连续捕获和释放装置进行细胞捕获与释放的方法，包括如下步骤：

样品滴加：首先在所述主通道进样孔中滴加一定量的PBS缓冲液，再向各细胞收集孔内滴加等量PBS缓冲液，令电磁铁通电，然后将一定量的样品细胞滴加入到所述主通道进样孔中；

样品输运：接通所述直流电源，使得所述主通道进样孔中的样品在压力作用下输运至主通道和各细胞捕获孔中；

细胞捕获：当有细胞进入细胞捕获孔时，由于电磁铁和永磁体偶件的相互吸引作用，迫使细胞检测通道的高度降低至其小于待捕获目标细胞的直径，导致细胞会卡在细胞检测通道入口处，此时信号采集控制系统会检测到一个脉冲信号，并在显示频上显示该通道有细胞被捕获。由于捕获孔的尺寸限制，其仅能捕获一个细胞。样品中剩余的细胞则继续进入其它捕获孔。当控制系统显示所有捕获孔内都有细胞时，系统发出信号，通过继电器使电磁铁断电，各捕获口释放细胞进入到相应的细胞收集孔内。

细胞收集：系统延时一定时间后，电磁铁继续通电，阻断细胞捕获通道与主通道的连通，可以方便的使用移液器从各个细胞采集孔中取出单个细胞以便进行后续操作。

本发明以微流控芯片为载体利用多条细胞捕获通道同时工作，实现单细胞大通量分选；且能够进一步实现单细胞的捕获和收集，为后续研究工作提供了极大的便利。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (3)

1.一种单细胞全自动连续捕获与收集装置，其包括玻璃底片、PDMS微流控芯片、电磁铁和永磁铁偶件、信号放大电路以及信号采集控制系统，所述PDMS微流控芯片凹刻有微通道的一侧与所述玻璃底片封装为一体，以形成供样品流通的微通道，其特征在于，所述微通道包括：

位于微流控芯片中心位置、一端设置有进样孔且另一端封闭的主通道；

所述主通道两侧向主通道外侧方向均匀凹刻有N个与主通道连通的细胞捕获孔，N≥2；

任意所述细胞捕获孔上方沿垂直于所述主通道方向均延伸有一定长度的细胞检测门通道，且所述细胞检测门通道末端连接细胞捕获通道；

所述细胞捕获通道末端设置有细胞收集孔，且所述细胞收集孔连有溢流槽；

同时所述电磁铁安装于玻璃底片下方；所述永磁铁安装在PDMS微流控芯片正上方；

所述主通道进样孔和所有细胞收集孔内均插有铂电极，任意所述细胞收集孔内的铂电极通过一参考电阻与直流电源的负极连接，所述主通道进样孔内的铂电极与上述直流电源的正极连接；

所述参考电阻的两端均通过导线与所述信号放大电路的输入端连接，所述信号放大电路的输出端与所述信号采集控制系统连接；

所述细胞捕获孔包括两个直径长度为待捕获目标细胞直径长度的半圆区域以及一个与检测门通道等宽的矩形区域；

待捕获目标细胞直径与细胞检测门通道的宽度的差值等于待捕获目标细胞直径的10％，且细胞检测门通道的长度等于待捕获目标细胞直径；

所述捕获通道下端两侧向中心方向渐缩直至其宽度与细胞检测门通道相同，并与细胞检测门通道相连接；

所述电磁铁的安装于所有细胞捕获通道渐缩的起始位置所对应的玻璃底片下方，所述永磁铁安装在细胞检测门通道位置所对应的PDMS芯片正上方。

2.一种根据权利要求1所述的单细胞全自动连续捕获与收集装置进行细胞捕获与收集的方法，其特征在于，包括如下步骤：

样品滴加：首先向所述主通道进样孔中滴加一定量的PBS缓冲液，再向各细胞收集孔内滴加等量PBS缓冲液，接通电磁铁电源，然后将一定量的样品细胞滴入到所述主通道进样孔中；

样品输运：接通所述直流电源，使得所述主通道进样孔中的样品在压力作用下流向各个细胞捕获孔；

细胞捕获：当有细胞进入细胞捕获孔时，由于电磁铁和永磁铁偶件的配合作用，细胞会卡在检测门通道入口，主通道进样孔内铂电极与相应的细胞采集孔内铂电极之间的参考电阻两端产生一个脉冲信号，该脉冲信号被信号采集控制系统检测到，并在显示器上显示相应通道有细胞被捕获，当信号采集控制系统显示所有细胞捕获孔内都有细胞时，系统向开关继电器发送电磁铁断电信号，电磁铁与永磁铁偶件分离，各细胞检测门通道释放细胞进入到相应的细胞收集孔内；

细胞收集：系统延时一定时间后，电磁铁继续通电，阻断细胞捕获通道与主通道的连通，此时可以使用移液器从各个细胞采集孔中取出单个细胞进一步处理。

3.根据权利要求2所述的细胞捕获与收集方法，其特征在于：在细胞捕获与收集过程中，当电磁铁处于通电状态时，其与永磁铁配合使得检测门通道高度小于待捕获目标细胞的直径。