CN106701821A - 一种猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆在间接免疫荧光实验中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒2型(PCV2)双拷贝感染性克隆的病毒拯救方法及其在间接免疫荧光实验中的应用，通过采用适当的基因工程技术方法，基于临床分离得到的PCV2基因组DNA，设计特异性引物，经聚合酶链式反应(PCR)获得全长基因，将两个拷贝的PCV2全长基因以首尾相连的方式串联连到pEGFP-N1载体上，形成PCV2双拷贝全基因重组质粒，转染ST细胞后连续盲传60代，借助PCR检测方法以及间接免疫荧光实验技术(IFA)对其在ST细胞上的感染性以及病毒增殖稳定性进行鉴定，为进一步开展圆环病毒的致病机理及诊断技术研究打下基础。

Description

一种猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆在间接免疫荧光实验中的应用

技术领域

本技术涉及重组猪圆环病毒2型(PCV2)毒株的构建方法及其在间接免疫荧光实验中的应用，属于农业生物技术领域，具体为重组猪圆环病毒2型毒株领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原。PMWS在临床上以断奶仔猪呼吸急促、腹泻、贫血、间质性肺炎和进行性消瘦以及明显的淋巴结病变为主要特征。PCV2主要侵害仔猪和育肥猪，与此病毒相关的疾病还有：新生仔猪的先天性震颤(CT)、新生仔猪腹泻病、增生性坏死性肺炎(PNP)、育肥猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)、呼吸道疾病综合征(PRDS)。此外，还可导致怀孕母猪繁殖障碍，严重影响母猪的生产性能。目前，此病已在世界范围内广泛蔓延，给世界养猪业带来了无法估量的经济损失。我国PCV2的感染形势亦相当严峻。因此，研制PCV2的诊断试剂和疫苗已成当务之急。因而开展PCV2感染性分子克隆的研究对该病毒致病机理以及增殖特性相关方面的研究具有重要的意义，以期为进一步深入研究猪圆环病毒病疫苗，为深入研究PCV2与宿主相互作用的分子机制以及病毒的分子流行病学研究奠定了基础。

构建PCV2感染性分子克隆目前主要有两种方法。Fenaux M，Halbur P G，Haqshenas G，et al.Cloned genomic DNA of type 2porcine circovirus is infectiouswhen injected directly into the liver and lymph nodes of pigs：characterization ofclinical disease，virus diribution，and pathologic lesions[J].J Virol，2002，76(2)：541-551.

Fenaux M，Opriessnig T，Halbur P G，et al.Immunogenicity and pathogenicity ofchimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2(PCV2)andnonpathogenic PCV1 in weanling pigs[J].J Virol，2003，77(20)：11232-11243

一种是将病毒基因组克隆到质粒上，回收基因组全长片段后利用T4 DNA连接酶连接过夜进行体外自身环化从而模拟天然病毒的基因结构，转染细胞获得病毒。另一种是构建包含首尾相连的双拷贝病毒基因的重组质粒，经转染细胞获得感染性病毒。在第二种方法中又有两种策略，一是先将病毒基因在体外串连成二聚体再克隆入载体。另一种是先将单拷贝病毒基因克隆入载体，再通过完全酶切得到片段，通过不完全酶切得到含单拷贝病毒基因的线性化的重组质粒，然后将片段和线性化的载体连接得到感染性分子克隆。研究表明，上述两种方法均能得到感染性病毒，但相比之下后者可操作性强、重复性好。

PCV2串联双拷贝感染性克隆最初由国外学者Fenaux成功构建。在Fenaux的这项研究中，巧妙地利用了PCV2基因组内部单一存在且较为保守的酶切位点Sac II，将两个拷贝PCV2全基因组以首尾串联的方式插入到pBluescript SK载体的多克隆位点中，随后将构建好的双拷贝克隆接种SPF猪，成功复制出PMWS的典型的临床症状和病理变化，由此拉开了PCV2感染性克隆的构建工作的序幕。该实验是首次应用含有PCV2全基因组的重组质粒直接注射猪体并获得PCV2病毒粒子。郗鑫等(2004)在构建的单拷贝PCV2病毒基因组感染性克隆过程当中，将克隆到的病毒基因组环化后，经脂质体介导体外转染PK-15细胞，结果克隆到的3株病毒的基因组，在转染PK-15细胞后没有检测到荧光，但将转染细胞盲传3代后，毒株的基因组转染的细胞检测到了荧光，而其中的2株仍然检测不到荧光，究其原因，可能是PCR扩增的保真度不够，致使某些克隆子发生点突变，影响到了病毒基因组的转录和复制。另外，由于PCV2在细胞中的增殖滴度不高，基因组转染效率较差，故造成实验成功率低。很多研究人员会在拯救病毒过程中用适量浓度的D-氨基葡萄糖对转染后的细胞进行处理以提高病毒滴度，但由于D-氨基葡萄糖对细胞有毒性，往往会造成细胞发生退行性变化，严重影响了细胞的生长状态。国内还有很多其他科研单位也陆续开展了PCV2单拷贝感染性克隆的相关研究，但是都存在一个缺陷，即病毒拯救效率低下。Fenaux等早在2002年就进行了PCV2感染性克隆的研究。而在国内，虽然也有此方面的报道，但转染后产生子代病毒的能力不是很好，一般都需要经过数次盲传后才能检测到子代病毒粒子的产生。(芦银华，华修国，崔立，等.感染性猪圆环病毒2型基因组DNA的分子克隆[J].中国病毒学，2003，18(4)：371-375；郗鑫，陈焕春，陈华平等.猪II型圆环病毒全基因组的克隆及感染性鉴定[J].微生物学报，2004，44(2)：172-17)

虽然国内亦陆续有成功构建PCV2双拷贝感染性克隆的报道，但是从现有的相关研究数据来看，拯救病毒的遗传稳定性不是很好，很多拯救成功的PCV2一般都是盲传到10代以内，并未见到更高代次(几十代)的遗传稳定性的报道。此说明，可能这些构建成功的PCV2双拷贝感染性克隆在PK-15细胞上遗传稳定性不好，不能在PK-15细胞上持续稳定增殖。纵观现有的PCV2全基因单拷贝以及双拷贝感染性分子克隆构建的各项研究，虽然有不少病毒拯救成功的案例，但是所拯救的病毒滴度或者比亲本毒的滴度还要低或者二者相差不大，并未见拯救毒株滴度明显高于亲本毒的报道。

中国农业科学院兰州兽医研究所利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列，将其定向克隆入pEGFP-N1载体，成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2，在PK-15细胞上连续盲传了5代并进行间接免疫荧光检测，从第3代开始才可以检测到病毒抗原。虽然该研究构建的也是双拷贝感染性克隆，但是与其相比，我们的构建策略做了较大调整，所达到的病毒拯救效果也得到大幅提升，我们设计了不同的引物，选择了不同的酶切位点，选用了特殊的工具酶，采用了同步接毒的细胞接毒方式，又开创性地选用猪睾丸细胞(ST细胞)作为双拷贝病毒的宿主细胞，让其在ST细胞上进行增殖，本发明构建的双拷贝重组质粒经转染宿主细胞后从第1代就开始检测到特异性荧光，且将其连续传了60代后依然能检测到比较强烈的荧光。

发明内容

本发明旨在克服PCV2病毒拯救效率低下，遗传不稳定性等缺点，提高病毒培养滴度，降低全病毒灭活疫苗成本，对防治PCV2引发的疾病有重要意义。

本发明通过采用适当的基因工程技术方法，基于临床分离得到的PCV2基因组DNA，设计特异性引物，经PCR获得全长基因，将两个拷贝的PCV2全长基因以首尾相连的方式串联连到pEGFP-N1载体上，形成PCV2双拷贝全基因重组质粒，转染ST细胞连续盲传60代，借助PCR检测方法以及间接免疫荧光实验技术(IFA)对其在ST细胞上的感染性以及病毒增殖稳定性进行鉴定，为进一步研究圆环病毒的致病机理打下基础，同时也为PCV2灭活疫苗的研制奠定基础。

与现有技术相比，本发明的病毒拯救方法具有以下优势：经过基因比对和序列分析，设计了特异性的引物，选择了有效的酶切位点；使用高保真酶对两个拷贝PCV2全基因组进行扩增，提高了扩增效率及准确度，在克隆过程中，利用高效连接酶Ligation high，亦有效提高了片段连接的效率，与普通的T4连接酶相比连接效率提高了50多倍；选用了带有报告基因GFP的真核表达载体pEGFP-N1，从而简化了鉴定重组质粒是否转染成功的方法；采用了同步接毒的细胞接毒方式；更为重要的是，本发明开创性地选用猪睾丸细胞(ST细胞)作为双拷贝病毒的宿主细胞，让感染性克隆在ST细胞上进行增殖，并且实现了持续稳定遗传，且滴度最高可达10⁷TCID₅₀/0.1ml。本发明构建的双拷贝重组质粒经转染宿主细胞后从第1代就开始检测到特异性荧光，且将其连续传了60代后依然能检测到比较强烈的荧光。

本发明是通过以下技术方案实现的：

猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆的病毒拯救方法包括以下四个步骤：

步骤一：双拷贝感染性克隆pEGFP-N1-BD的构建：

(1)PCV2 DNA的提取

a、从临床PMWS症状猪群中分离得到PCV2毒株，对其进行基因比对和序列分析；取含PCV2-GD毒株的细胞培养物200μL，加入20μLProteinase K溶液，混匀；

b、加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，待溶液变清亮简短离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15秒，简短离心去除管壁盖内壁的水珠；

c、将上一步所得溶液加入到试剂盒配的吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前加入适量无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

d、向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW(使用前加入适量无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，该步骤重复两次，然后将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液，将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加60μL洗脱液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集病毒基因组DNA，-20℃保存备用。

(2)设计引物和选择酶切位点

第一对引物：GDF1：cg ctcgag gctggctgaacttttg，GDR1 cga ccgcgg aaatttctgacaaacg，上游引物GDF1下划线部分是Xho I酶切位点，下游引物GDR1下划线部分是Sac II酶切位点；

第二对引物：GDF2：cat ccgcgg gctggctgaac ca，GDR2 ca ggatccaaatttcrgacaaacgttacaggg，上游引物GDF2下划线部分是Sac II酶切位点，下游引物GDR2下划线部分是BamH I酶切位点；

(3)全基因扩增

以上述DNA为模板，利用设计的2对PCR引物GDF1/GDR1，GDF2/GDR2分别扩增两个拷贝的PCV2-GD全基因组片段(即片段B、D)；扩增条件为：95℃预变性4min，94℃变性1min，54℃退火1min30s，72℃延伸3min，30个循环，72℃延伸10min；PCR反应体系如下：高保真酶Primer STAR 1μL，10×Buffer 5μL，dNTP Mix 8μL，PCV2-GD DNA 1μL，GDF1/GDF2 2.5μL，GDR1/GDR2 2.5μL，dd H2O 30μL，总共计50μL；

PCR结束后取5μL PCR产物在10g/L的琼脂糖凝胶上电泳检测，结果如图1所示；

(4)双拷贝全基因感染性分子克隆的构建

将纯化后的B片段与pEGFP-N1质粒用Xho I酶、Sac II酶进行同步双酶切，切胶回收后再将二者按一定比例相连，连接采用10μL体系：B片段4μL，双酶切的载体pEGFP-N1 1μL，连接酶Ligation High(含Buffer)5μL，随后转化到DH5α感受态细胞，涂卡那抗性板，筛选并提取阳性重组质粒pEGFP-N1-B，再用Sac II酶、BamH I酶将D片段和重组质粒pEGFP-N1-B进行同步双酶切，切胶回收后再将二者高效连接酶Ligation High按一定比例相连：D片段4μL，双酶切的载体pEGFP-N1-B 1μL，连接酶Ligation High(含Buffer)5μL，转化到DH5α感受态细胞，涂卡那抗性板，筛选并提取质粒pEGFP-N1-BD，经菌液PCR、双酶切鉴定以及序列测定，最终成功构建双拷贝重组质粒pEGFP-N1-BD；

(5)重组质粒双酶切鉴定

pEGFP-N1-BD的双酶切体系如下：BamHI 2μL，XhoI 2μLBuffer(10×K)2μL，dd H2O 9μL，pEGFP-N1-BD 15μL，共计30μL；将上述组分充分混匀，置于37℃水浴锅内，酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，结果如图2所示；

(6)测序鉴定

将酶切鉴定后的质粒进行测序；

(7)阳性重组质粒大量提取

将已构建好的双拷贝重组质粒pEGFP-N1-BD提取后测定浓度和纯度，于-20℃保存备用，具体提取步骤如下：

a、平衡柱子：向吸附柱CP6中加入2.5ml平衡液BL，8000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，取100ml过夜培养的已鉴定为阳性的菌液加入离心管，室温8000rpm离心3分钟收集细菌，尽量吸除上清，用干净的吸水纸吸去管壁上的水滴；

b、向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1(已加入适量RNaseA)，漩涡震荡以彻底悬浮细菌细胞沉淀，向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转混匀，室温放置5分钟，向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转混匀，待溶液出现白色分散絮状沉淀后室温放置10分钟左右，8000rpm离心10分钟，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄，滤液收集在干净的50ml干净的离心管中；

c、向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中，室温8000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中，向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已提前加入适量无水乙醇)，8000rpm离心2分钟，该步骤重复2次，向吸附柱中加入3ml无水乙醇，室温8000rpm离心2分钟，倒掉废液；

d、将吸附柱重新放回收集管中，8000rpm离心5分钟，除去吸附柱中的残留漂洗液，吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位滴加2ml洗脱液TB，室温放置5分钟，然后室温8000rpm离心2分钟，将50ml离心管中的洗脱液全部转移到一个干净的1.5ml离心管中，-20℃保存备用。

步骤二：PCV2感染性克隆在ST细胞上的转染、传代以及体外感染性鉴定

(1)重组质粒转染ST细胞

复苏并传代培养ST细胞，选用进入对数生长期的无PCV1污染的ST细胞用胰酶按常规方法消化，以1×10⁶个细胞/mL接种6孔板，每孔2mL，37℃5％CO₂培养箱中培养，待细胞铺满约90％时，通过脂质体Lipofectamine 2000介导转染无PCV2污染的ST细胞，具体转染步骤如下：

每孔吸取150μL OPTI-MEM与10μL脂质体Lipofectamine2000充分混匀后，再吸取150μLOPTI-MEM+3ug双拷贝重组质粒+3μL reagent plus；将上述两种溶液混合，室温下放置5min；与此同时，将6孔板中的细胞用无血清MEM轻轻洗涤两遍后，每孔加入2ml无血清培养基，随后将质粒/脂质体复合物逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃、5％的CO₂培养箱中培养5小时，同时设平行转染空载体pEGFP-N1作为阴性对照，6小时后，更换10％血清的MEM，在37℃、5％的CO₂培养箱中培养，期间每隔12小时置于荧光显微镜下观察转染是否成功，培养72小时后冻存收获细胞培养物，按照普通病毒培养的方法对其进行盲传；

(2)在ST细胞上的传代

构建好的重组质粒转染ST细胞72小时后，将病毒液反复冻融3次，离心取上清，将正常ST细胞按1∶4比例传代后，用T25细胞培养瓶进行培养，每瓶9ml细胞悬液，再吸取1ml转染后培养72h收获的细胞培养物上清轻轻摇晃均匀，置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养，24h后弃掉细胞瓶中液体，用灭菌的PBS轻轻洗涤细胞表面2遍，换用2％胎牛血清的MEM营养液10ml，继续培养48h后病毒液反复冻融3次，离心取上清，将按此方法继续盲传；

(3)在ST细胞上的感染性鉴定

再借助间接免疫荧光的方法对病毒在ST细胞上能否稳定增殖进行检测，具体操作步骤如下：将收获的病毒液按10％的比例同步接种于消化好的ST细胞悬液，再接种于96孔细胞培养板，100μL/孔，24h后弃掉板内液体，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养48小时，甩弃板内液体，用PBS洗涤三遍，倒扣拍干孔内液体后再进行下面步骤：

a、固定：每孔加入100μL无水乙醇，先在室温放置15min，再4℃放置1h，弃掉孔内无水乙醇，拍干。

b、孵育一抗：用抗体稀释液将抗PCV2Cap蛋白鼠源单抗PCV2-A(美国RTI公司产品)按1∶1000的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，37℃孵育1h。弃掉一抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干。

c、孵育二抗：用抗体稀释液将FITC标记的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，包裹上锡箔纸避光，37℃避光孵育1h。弃掉二抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干。

d、染核：将DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用灭菌水稀释到1ug/μL，充分混匀后每孔加入100μL，室温下作用5分钟后弃之，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干。

e、封片：每孔加入碳缓甘油100μL，倒置荧光显微镜下观察，观察结果如图3-11所示。

间接免疫荧光试验检测显示均在细胞核中聚集大量的病毒抗原，而转染空载体的ST细胞未见特异性荧光。抽检不同盲传代次细胞培养物均能检测到特异性荧光，而且结果表明，随着代次增高阳性细胞数量也逐渐增多，提示病毒能在ST细胞上进行增殖并复制出子代病毒，表明用本研究中的方法构建的双拷贝PCV2基因组重组质粒经转染ST细胞后具有感染性，为基因工程苗的进一步研发奠定了基础。由上可以推理，可能是双拷贝感染性克隆的构建遵循了PCV2病毒滚环复制的规律，因而病毒得以拯救成功。间接免疫荧光实验的最后阶段加完荧光抗体洗涤之后用DAPI进行细胞染核，结果可以发现PCV2抗原在细胞核出现大量聚集，为特异性荧光，说明病毒拯救成功。

步骤三：拯救毒株各代次盲传病毒液PCR检测

收获每一代病毒液保存于-20℃，抽取部分代次病毒液提取DNA进行PCR检测，检测结果如图12所示。结果表明：拯救的病毒在本研究使用的ST细胞上具有良好的适应性，能够稳定遗传，并且随着代次的增加检测到特异性核酸亮度也不断增大，暗示了拯救病毒的增殖能力也在不断提高。

步骤四：拯救毒株毒价的初步测定

抽取盲传收获的病毒液部分代次F5，F10，F15，F20，F25，F40，F60做间接免疫荧光实验，计算阳性细胞孔数，用Reed-Muench法计算半数细胞培养感染量：

a、将长成单层的ST细胞用0.25％的胰酶消化，分装到96孔细胞培养板，用维持液将待测病毒液以10倍倍比稀释后同步接种ST细胞，每个稀释度接种8孔细胞，每孔100μL，并留两列ST细胞做空白对照，37℃5％CO₂中培养24h；

b、弃去96孔细胞培养板内的液体，用MEM细胞培养液轻轻洗涤细胞表面2次，加足维持液继续培养48h，每孔加入100μL无水乙醇，先在室温放置15min，再4℃放置1h，弃掉孔内无水乙醇，拍干；

c、用抗体稀释液将抗PCV2Cap蛋白鼠源单抗PCV-A按1∶1000的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，37℃孵育1h；弃掉一抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干，用抗体稀释液将FITC标记的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，包裹上锡箔纸避光，37℃避光孵育1h；弃掉二抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；

d、将DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用灭菌水稀释到1ug/μL，充分混匀后每孔加入100μL，室温下作用5分钟后弃之，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；

e、每孔加入碳缓甘油100μL，倒置荧光显微镜下观察，以出现绿色荧光者为阳性，表示病毒在此孔得到扩增；记录每列中出现绿色荧光的孔数，按Reed-Muench法计算病毒的半数感染量(TCID₅₀)。抽取的各代次病毒毒价测得结果如下：

病毒代次	F5	F10	F15	F20	F25	F40	F60
								TCID50/0.1ml	103.5	104.5	106.5	107.0	106.3	105.0	105.2

结果表明：拯救的PCV2双拷贝病毒在传代过程中趋于稳定，从第10代开始病毒滴度明显增高，且能稳定传到第60代滴度仍可维持在10^5.0TCID₅₀/0.1ml以上，且最高值出现在F15到F25之间。

附图说明

图1为PCV2-GD全基因组B、D的扩增结果，其中M：DL2000分子质量标准；NC：阴性对照；1：第一个拷贝全基因组(片段B)；2：第二个拷贝全基因组(片段D)。

图2为双拷贝重组质粒pEGFP-N1-BD的Xho I、BamH I双酶切鉴定结果，其中M：DL5000分子质量标准；1～2：重组质粒pEGFP-N1-BD的Xho I、BamH I双酶切。

图3为IFA的阴性对照，图4为转染后的IFA检测结果，图5-11分别为拯救病毒盲传F5、F10、F15、F20、F25、F40、F60代次的IFA检测结果。

图12为拯救病毒不同代次病毒液抽检PCR电泳图，其中，1～10为F1、F5、F10、F15、F20、F25、F30、F35、F40、F60，11～12为正常未接毒的ST细胞；M为DNA Marker；13为PCV2阳性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例：按以下步骤对猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆进行病毒拯救：

步骤一：双拷贝感染性克隆pEGFP-N1-BD的构建：

(1)PCV2 DNA的提取

a、从临床PMWS症状猪群中分离得到PCV2毒株，对其进行基因比对和序列分析；取含PCV2-GD毒株的细胞培养物200μL，加入20μLProteinase K溶液，混匀；

b、加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，待溶液变清亮简短离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15秒，简短离心去除管壁盖内壁的水珠；

c、将上一步所得溶液加入到试剂盒配的吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前加入适量无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

d、向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW(使用前加入适量无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，该步骤重复两次，然后将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液，将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加60μL洗脱液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集病毒基因组DNA，-20℃保存备用。

(2)设计引物和选择酶切位点

第一对引物：GDF1：cg ctcgag gctggctgaacttttg，GDR1cga ccgcgg aaatttctgacaaacg，上游引物GDF1下划线部分是Xho I酶切位点，下游引物GDR1下划线部分是Sac II酶切位点；

第二对引物：GDF2：cat ccgcgg gctggctgaac ca，GDR2ca ggatccaaatttctgacaaacgttacaggg，上游引物GDF2下划线部分是Sac II酶切位点，下游引物GDR2下划线部分是BamH I酶切位点；

(3)全基因扩增

以上述DNA为模板，利用设计的2对PCR引物GDF1/GDR1，GDF2/GDR2分别扩增两个拷贝的PCV2-GD全基因组片段(即片段B、D)；扩增条件为：95℃预变性4min，94℃变性1min，54℃退火1min30s，72℃延伸3min，30个循环，72℃延伸10min；PCR反应体系如下：高保真酶Primer STAR 1μL，10×Buffer 5μL，dNTP Mix 8μL，PCV2-GD DNA 1μL，GDF1/GDF2 2.5μL，GDR1/GDR2 2.5μL，ddH₂O 30μL，总共计50μL；

PCR结束后取5μL PCR产物在10g/L的琼脂糖凝胶上电泳检测，结果如图1所示；

(4)双拷贝全基因感染性分子克隆的构建

将纯化后的B片段与pEGFP-N1质粒用Xho I酶、Sac II酶进行同步双酶切，切胶回收后再将二者按一定比例相连，连接采用10μL体系：B片段4μL，双酶切的载体pEGFP-N1 1μL，连接酶Ligation High(含Buffer)5μL，随后转化到DH5α感受态细胞，涂卡那抗性板，筛选并提取阳性重组质粒pEGFP-N1-B，再用Sac II酶、BamH I酶将D片段和重组质粒pEGFP-N1-B进行同步双酶切，切胶回收后再将二者高效连接酶Ligation High按一定比例相连：D片段4μL，双酶切的载体pEGFP-N1-B 1μL，连接酶Ligation High(含Buffer)5μL，转化到DH5α感受态细胞，涂卡那抗性板，筛选并提取质粒pEGFP-N1-BD，经菌液PCR、双酶切鉴定以及序列测定，最终成功构建双拷贝重组质粒pEGFP-N1-BD；

(5)重组质粒双酶切鉴定

pEGFP-N1-BD的双酶切体系如下：BamHI 2μL，XhoI 2μLBuffer(10×K)2μL，dd H2O 9μL，pEGFP-N1-BD 15μL，共计30μL；将上述组分充分混匀，置于37℃水浴锅内，酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，结果如图2所示；

(6)测序鉴定

将酶切鉴定后的质粒进行测序；

(7)阳性重组质粒大量提取

将已构建好的双拷贝重组质粒pEGFP-N1-BD提取后测定浓度和纯度，于-20℃保存备用，具体提取步骤如下：

a、平衡柱子：向吸附柱CP6中加入2.5ml平衡液BL，8000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，取100ml过夜培养的已鉴定为阳性的菌液加入离心管，室温8000rpm离心3分钟收集细菌，尽量吸除上清，用干净的吸水纸吸去管壁上的水滴；

b、向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1(已加入适量RNaseA)，漩涡震荡以彻底悬浮细菌细胞沉淀，向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转混匀，室温放置5分钟，向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转混匀，待溶液出现白色分散絮状沉淀后室温放置10分钟左右，8000rpm离心10分钟，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄，滤液收集在干净的50ml干净的离心管中；

c、向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中，室温8000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中，向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已提前加入适量无水乙醇)，8000rpm离心2分钟，该步骤重复2次，向吸附柱中加入3ml无水乙醇，室温8000rpm离心2分钟，倒掉废液；

d、将吸附柱重新放回收集管中，8000rpm离心5分钟，除去吸附柱中的残留漂洗液，吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位滴加2ml洗脱液TB，室温放置5分钟，然后室温8000rpm离心2分钟，将50ml离心管中的洗脱液全部转移到一个干净的1.5ml离心管中，-20℃保存备用。

步骤二：PCV2感染性克隆在ST细胞上的转染、传代以及体外感染性鉴定

(1)重组质粒转染ST细胞

复苏并传代培养ST细胞，选用进入对数生长期的无PCV1污染的ST细胞用胰酶按常规方法消化，以1×10⁶个细胞/mL接种6孔板，每孔2mL，37℃5％CO₂培养箱中培养，待细胞铺满约90％时，通过脂质体Lipofectamine 2000介导转染无PCV2污染的ST细胞，具体转染步骤如下：

每孔吸取150μLOPTI-MEM与10μL脂质体Lipofectamine2000充分混匀后，再吸取150μLOPTI-MEM+3ug双拷贝重组质粒+3μL reagent plus；将上述两种溶液混合，室温下放置5min；与此同时，将6孔板中的细胞用无血清MEM轻轻洗涤两遍后，每孔加入2ml无血清培养基，随后将质粒/脂质体复合物逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃、5％的CO₂培养箱中培养5小时，同时设平行转染空载体pEGFP-N1作为阴性对照，6小时后，更换10％血清的MEM，在37℃、5％的CO₂培养箱中培养，期间每隔12小时置于荧光显微镜下观察转染是否成功，培养72小时后冻存收获细胞培养物，按照普通病毒培养的方法对其进行盲传；

(2)在ST细胞上的传代

构建好的重组质粒转染ST细胞72小时后，将病毒液反复冻融3次，离心取上清，将正常ST细胞按1∶4比例传代后，用T25细胞培养瓶进行培养，每瓶9ml细胞悬液，再吸取1ml转染后培养72h收获的细胞培养物上清轻轻摇晃均匀，置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养，24h后弃掉细胞瓶中液体，用灭菌的PBS轻轻洗涤细胞表面2遍，换用2％胎牛血清的MEM营养液10ml，继续培养48h后病毒液反复冻融3次，离心取上清，将按此方法继续盲传；

(3)在ST细胞上的感染性鉴定

再借助间接免疫荧光的方法对病毒在ST细胞上能否稳定增殖进行检测，具体操作步骤如下：将收获的病毒液按10％的比例同步接种于消化好的ST细胞悬液，再接种于96孔细胞培养板，100μL/孔，24h后弃掉板内液体，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养48小时，甩弃板内液体，用PBS洗涤三遍，倒扣拍干孔内液体后再进行下面步骤：

a、固定：每孔加入100μL无水乙醇，先在室温放置15min，再4℃放置1h，弃掉孔内无水乙醇，拍干。

b、孵育一抗：用抗体稀释液将抗PCV2Cap蛋白鼠源单抗PCV2-A按1∶1000的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，37℃孵育1h。弃掉一抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干。

c、孵育二抗：用抗体稀释液将FITC标记的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，包裹上锡箔纸避光，37℃避光孵育1h。弃掉二抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干。

d、染核：将DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用灭菌水稀释到1ug/μL，充分混匀后每孔加入100μL，室温下作用5分钟后弃之，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干。

e、封片：每孔加入碳缓甘油100μL，倒置荧光显微镜下观察，观察结果如图3-11所示。

间接免疫荧光试验检测显示均在细胞核中聚集大量的病毒抗原，而转染空载体的ST细胞未见特异性荧光。抽检不同盲传代次细胞培养物均能检测到特异性荧光，而且结果表明，随着代次增高阳性细胞数量也逐渐增多，提示病毒能在ST细胞上进行增殖并复制出子代病毒，表明用本研究中的方法构建的双拷贝PCV2基因组重组质粒经转染ST细胞后具有感染性，为基因工程苗的进一步研发奠定了基础。由上可以推理，可能是双拷贝感染性克隆的构建遵循了PCV2病毒滚环复制的规律，因而病毒得以拯救成功。间接免疫荧光实验的最后阶段加完荧光抗体洗涤之后用DAPI进行细胞染核，结果可以发现PCV2抗原在细胞核出现大量聚集，为特异性荧光，说明病毒拯救成功。

步骤三：拯救毒株各代次盲传病毒液PCR检测

收获每一代病毒液保存于-20℃，每隔4代抽取病毒液提取DNA进行PCR检测，检测结果如图12所示。结果表明：拯救的病毒在本研究使用的ST细胞上具有良好的适应性，能够稳定遗传，并且随着代次的增加检测到特异性核酸亮度也不断增大，暗示了拯救病毒的增殖能力也在不断提高。

步骤四：拯救毒株毒价的初步测定

抽取盲传收获的病毒液部分代次F5，F10，F15，F20，F25，F40，F60做间接免疫荧光实验，计算阳性细胞孔数，用Reed-Muench法计算半数细胞培养感染量：

a、将长成单层的ST细胞用0.25％的胰酶消化，分装到96孔细胞培养板，用维持液将待测病毒液以10倍倍比稀释后同步接种ST细胞，每个稀释度接种8孔细胞，每孔100μL，并留两列ST细胞做空白对照，37℃5％CO₂中培养24h；

b、弃去96孔细胞培养板内的液体，用DMEM细胞培养液轻轻洗涤细胞表面2次，加足维持液继续培养48h，每孔加入100μL无水乙醇，先在室温放置15min，再4℃放置1h，弃掉孔内无水乙醇，拍干；

c、用抗体稀释液将抗PCV2Cap蛋白鼠源单抗PCV2-A按1∶1000的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，37℃孵育1h；弃掉一抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干，用抗体稀释液将FITC标记的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，包裹上锡箔纸避光，37℃避光孵育1h；弃掉二抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；

d、将DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用灭菌水稀释到1ug/μL，充分混匀后每孔加入100μL，室温下作用5分钟后弃之，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；

e、每孔加入碳缓甘油100μL，倒置荧光显微镜下观察，以出现绿色荧光者为阳性，表示病毒在此孔得到扩增；记录每列中出现绿色荧光的孔数，按Reed-Muench法计算病毒的半数感染量(TCID₅₀)。抽取的各代次病毒毒价测得结果如下

病毒代次	F5	F10	F15	F20	F25	F40	F60
								TCID50/0.1ml	103.5	104.5	106.5	107.0	106.3	105.0	105.2

结果表明：拯救的PCV2双拷贝病毒在传代过程中趋于稳定，从第10代开始病毒滴度明显增高，且能稳定传到第60代滴度仍可维持在10^5.0TCID₅₀/0.1ml以上，且最高值出现在F15到F25之间。

Claims (1)

1.一种猪圆环病毒2型(PCV2)双拷贝感染性克隆在间接免疫荧光实验中的应用，该PCV2双拷贝感染性克隆经细胞转染、传代后经浓缩纯化后可作为抗原接种ST细胞，结合FITC标记的荧光抗体可应用于间接免疫荧光实验，用于PCV2临床血清样品抗体水平的检测。该猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆的拯救方法包括以下四个步骤：

步骤一：双拷贝感染性克隆pEGFP-N1-BD的构建：

(1)PCV2 DNA的提取

a、从临床PMWS症状猪群中分离得到PCV2毒株，对其进行基因比对和序列分析，取含PCV2-GD毒株的细胞培养物200μL，加入20μLProteinase K溶液，混匀；

b、加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，待溶液变清亮简短离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15秒，简短离心去除管壁盖内壁的水珠；

c、将上一步所得溶液加入到试剂盒配的吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前加入适量无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

d、向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW(使用前加入适量无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，该步骤重复两次，然后将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液，将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加60μL洗脱液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集病毒基因组DNA，-20℃保存备用；

(2)设计引物和选择酶切位点

第一对引物：GDF1：cg ctcgag gctggctgaacttttg，GDR1 cga ccgcgg aaatttctgacaaacg，上游引物GDF1下划线部分是Xho I酶切位点，下游引物GDR1下划线部分是Sac II酶切位点；

第二对引物：GDF2：cat ccgcgg gctggctgaacca，GDR2 ca ggatccaaatttctgacaaacgttacaggg，上游引物GDF2下划线部分是Sac II酶切位点，下游引物GDR2下划线部分是BamH I酶切位点；

(3)全基因扩增

以上述DNA为模板，利用设计的2对PCR引物GDF1/GDR1，GDF2/GDR2分别扩增两个拷贝的PCV2全基因组片段(即片段B、D)；扩增条件为：95℃预变性4min，94℃变性1min，54℃退火1min30s，72℃延伸3min，30个循环，72℃延伸10min；PCR反应体系如下：高保真酶Primer STAR 1μL，10×Buffer 5μL，dNTP Mix 8μL，PCV2 DNA 1μL，GDF1/GDF2 2.5μL，GDR1/GDR2 2.5μL，dd H2O 30μL，总共计50μL；

PCR结束后取5μL PCR产物在10g/L的琼脂糖凝胶上电泳检测；

(4)双拷贝全基因感染性分子克隆的构建

将纯化后的B片段与pEGFP-N1质粒用Xho I酶、Sac II酶进行同步双酶切，切胶回收后再将二者按一定比例相连，连接采用10μL体系：B片段4μL，双酶切的载体pEGFP-N1 1μL，连接酶Ligation High(含Buffer)5μL，随后转化到DH5α感受态细胞，涂卡那抗性板，筛选并提取阳性重组质粒pEGFP-N1-B，再用Sac II酶、BamH I酶将D片段和重组质粒pEGFP-N1-B进行同步双酶切，切胶回收后再将二者高效连接酶Ligation High按一定比例相连：D片段4μL，双酶切的载体pEGFP-N1-B 1μL，连接酶Ligatiion High(含Buffer)5μL，转化到DH5α感受态细胞，涂卡那抗性板，筛选并提取质粒pEGFP-N1-BD，经菌液PCR、双酶切鉴定以及序列测定，最终成功构建双拷贝重组质粒pEGFP-N1-BD；

(5)重组质粒双酶切鉴定

pEGFP-N1-BD的双酶切体系如下：BamHI 2μL，XhoI 2μLBuffer(10×K)2μL，dd H2O 9μL，pEGFP-N1-BD 15μL，共计30μL；将上述组分充分混匀，置于37℃水浴锅内，酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测；

(6)测序鉴定

将酶切鉴定后的质粒进行测序；

(7)阳性重组质粒大量提取

将已构建好的双拷贝重组质粒pEGFP-N1-BD提取后测定浓度和纯度，于-20℃保存备用，具体提取步骤如下：

a、平衡柱子：向吸附柱CP6中加入2.5ml平衡液BL，8000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，取100ml过夜培养的已鉴定为阳性的菌液加入离心管，室温8000rpm离心3分钟收集细菌，尽量吸除上清，用干净的吸水纸吸去管壁上的水滴；

b、向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1(已加入适量RNaseA)，漩涡震荡以彻底悬浮细菌细胞沉淀，向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转混匀，室温放置5分钟，向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转混匀，待溶液出现白色分散絮状沉淀后室温放置10分钟左右，8000rpm离心10分钟，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄，滤液收集在干净的50ml干净的离心管中；

c、向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中，室温8000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中，向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已提前加入适量无水乙醇)，8000rpm离心2分钟，该步骤重复2次，向吸附柱中加入3ml无水乙醇，室温8000rpm离心2分钟，倒掉废液；

d、将吸附柱重新放回收集管中，8000rpm离心5分钟，除去吸附柱中的残留漂洗液，吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位滴加2ml洗脱液TB，室温放置5分钟，然后室温8000rpm离心2分钟，将50ml离心管中的洗脱液全部转移到一个干净的1.5ml离心管中，-20℃保存备用。

步骤二：PCV2感染性克隆在ST细胞上的转染、传代以及体外感染性鉴定

(1)重组质粒转染ST细胞

复苏并传代培养ST细胞，选用进入对数生长期的无PCV1污染的ST细胞用胰酶按常规方法消化，以1×10⁶个细胞/mL接种6孔板，每孔2mL，37℃5％CO₂培养箱中培养，待细胞铺满约90％时，通过脂质体Lipofectamine 2000介导转染无PCV1污染的ST细胞，具体转染步骤如下：

每孔吸取150μL OPTI-MEM与10μL脂质体Lipofectamine2000充分混匀后，再吸取150μLOPTI-MEM+3ug双拷贝重组质粒+3μL reagent plus；将上述两种溶液混合，室温下放置5min；与此同时，将6孔板中的细胞用无血清MEM轻轻洗涤两遍后，每孔加入2ml无血清培养基，随后将质粒/脂质体复合物逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃、5％的CO₂培养箱中培养5小时，同时设平行转染空载体pEGFP-N1作为阴性对照，6小时后，更换含10％血清的MEM，在37℃、5％的CO₂培养箱中培养，期间每隔12小时置于荧光显微镜下观察转染是否成功，培养72小时后冻融收获细胞培养物，按照普通病毒培养的方法对其进行盲传；

(2)在ST细胞上的传代

构建好的重组质粒转染ST细胞72小时后，将病毒液反复冻融3次，离心取上清，将正常ST细胞按1∶4比例传代后，用T25细胞培养瓶进行培养，每瓶9ml细胞悬液，再吸取1ml转染后培养72h收获的细胞培养物上清轻轻摇晃均匀，置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养，24h后弃掉细胞瓶中液体，用灭菌的PBS轻轻洗涤细胞表面2遍，换用2％胎牛血清的MEM营养液10ml，继续培养48h后病毒液反复冻融3次，离心取上清，将按此方法继续盲传；

(3)在ST细胞上的感染性鉴定

再借助间接免疫荧光的方法对病毒在ST细胞上能否稳定增殖进行检测，具体操作步骤如下：将收获的病毒液按10％的比例同步接种于消化好的ST细胞悬液，再接种于96孔细胞培养板，100μL/孔，24h后弃掉板内液体，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养48小时，甩弃板内液体，用PBS洗涤三遍，倒扣拍干孔内液体后再进行下面步骤：

a、固定：每孔加入100μL无水乙醇，先在室温放置15min，再4℃放置1h，弃掉孔内无水乙醇，拍干；

b、孵育一抗：用抗体稀释液将抗PCV2Cap蛋白鼠源单抗PCV2-A按1∶1000的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，37℃孵育1h。弃掉一抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；

c、孵育二抗：用抗体稀释液将FITC标记的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，包裹上锡箔纸避光，37℃避光孵育1h。弃掉二抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；

d、染核：将DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用灭菌水稀释到1ug/μL，充分混匀后每孔加入100μL，室温下作用5分钟后弃之，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；

e、封片：每孔加入碳缓甘油100μL，倒置荧光显微镜下观察。

步骤三：拯救毒株各代次盲传病毒液PCR检测

收获每一代病毒液保存于-20℃冰箱，抽取部分代次病毒液提取DNA进行PCR检测。

步骤四：拯救毒株毒价的初步测定

抽取盲传收获的病毒液部分代次F5，F10，F15，F20，F25，F40，F60做间接免疫荧光实验，计算阳性细胞孔数，用Reed-Muench法计算半数细胞培养感染量进行检测：

a、将长成单层的ST细胞用0.25％的胰酶消化，分装到96孔细胞培养板，用维持液将待测病毒液以10倍倍比稀释后同步接种ST细胞，每个稀释度接种8孔细胞，每孔100μL，并留两列ST细胞做空白对照，37℃5％CO₂中培养24h；

b、弃去96孔细胞培养板内的液体，用MEM细胞培养液轻轻洗涤细胞表面2次，加足维持液继续培养48h，每孔加入100μL无水乙醇，先在室温放置15min，再4℃放置1h，弃掉孔内无水乙醇，拍干；

c、用抗体稀释液将抗PCV2Cap蛋白鼠源单抗PCV2-A按1∶1000的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，37℃孵育1h；弃掉一抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干，用抗体稀释液将FITC标记的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，包裹上锡箔纸避光，37℃避光孵育1h；弃掉二抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；

d、将DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用灭菌水稀释到1ug/μL，充分混匀后每孔加入100μL，室温下作用5分钟后弃之，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；

e、每孔加入碳缓甘油100μL，倒置荧光显微镜下观察，以出现绿色荧光者为阳性，表示病毒在此孔得到扩增；记录每列中出现绿色荧光的孔数，按Reed-Muench法计算病毒的半数感染量(TCID₅₀)。