CN106687580A - 在环境温度下稳定血液样品中的代谢活性细胞 - Google Patents

在环境温度下稳定血液样品中的代谢活性细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在环境温度下稳定血液样品中的一种或多种代谢活性细胞。具体地，本发明提供了用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂、组合物、制品、试剂盒及方法。

Description

在环境温度下稳定血液样品中的代谢活性细胞
交叉引用
本申请要求提交于2014年6月10日的第62/010,237号美国临时申请的权益，该申请通过引用而全文并入于此。
发明背景
1.技术领域
本发明总体上涉及在环境温度下稳定血液样品中的一种或多种代谢活性细胞。具体而言，本发明涉及用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂、组合物、制品、试剂盒及方法。
2.背景技术
全血是细胞、核酸、蛋白质和多种其它分析物的复杂混合物。具体来说，血液成分包括但不限于：细胞，诸如白细胞(单核细胞、淋巴细胞及粒细胞)、红细胞、凝血细胞及循环肿瘤细胞；核酸分子，诸如循环游离DNA(cfDNA)；多肽，诸如脂蛋白、白蛋白及血清蛋白；以及其它多种分析物。
红细胞或红血球(RBC)是填充有将氧气运送至全身的血红蛋白的柔性双凹面细胞。RBC是最致密的全血成分，因此例如可通过离心，或甚至通过使其在重力作用下沉降而从全血中轻松分离。可将浓集(packed)红细胞输送回供体患者(自体输血)或输送至具有相容的血型，例如具有合适的A、B、AB、O和rh抗原类型的患者中。白细胞或白血球(WBC)具有多种细胞类型，例如淋巴细胞、巨噬细胞及多形核嗜中性粒细胞(PMN)，其主要参与免疫应答和对抗感染。通常WBC密度略微小于RBC，并在全血离心期间与血小板一起在RBC上方形成白色的“血沉棕黄层”。血沉棕黄层可以是生长因子、母细胞及细胞因子的有用来源。
已经报道了用于在环境温度下稳定、运输及储存血液样品中的细胞的组合物和方法。目前采用的这些组合物通常不能维持血细胞的代谢活性，并且稳定化的细胞未保持与在全血中所见的相似的大小和形态，从而使得利用根据预定细胞大小和形状对细胞进行分选和计数的自动化细胞分离器和计数器对这些细胞的后续分析变得复杂。
因此，需要开发用于使来自血液的细胞在环境温度下稳定更长时间的新制剂、组合物及方法，所述细胞保持具有与全血中的该细胞相似的大小和形态的完整的和代谢活性的状态。通过在环境温度下提供完整的、活的、代谢活性的全细胞至少18天的时间，本发明的制剂、组合物及方法有利地克服了上述限制。此外，在基本上储存的细胞上表达的膜结合的细胞表面蛋白质保留其在血液样品中的天然构象，这有利于这些细胞的分析。这些稳定的血细胞可以在不需要冷藏或冷冻的情况下运输及储存，并且在环境温度下稳定延长的时间段，例如，数天、数周、数月或甚至数年，从而有利于各种血液成分的定量、分析和/或用于诊断和潜在治疗应用的用途。
发明内容
在一些实施方案中，本文描述了用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂，其中该细胞在室温下储存至少三天的时间后保持代谢活性。在一些实施方案中，至少80％的储存的细胞在室温下储存至少三天的时间后保持代谢活性。在一些实施方案中，该细胞保持代谢活性至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天或至少18天。在一些实施方案中，至少80％的细胞在室温下保持代谢活性至少18天的时间。在一些实施方案中，用于使血液样品中的代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂包含：pH缓冲液；螯合剂；以及肽。在一些实施方案中，该pH缓冲液选自2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、3-吗啉基-2-羟基丙磺酸(MOPSO)及其组合。在一些实施方案中，该肽为二肽或三肽。在一些实施方案中，该二肽序列为Ala-Gln或Gly-Gly。在一些实施方案中，该二肽序列为Ala-Gln。在一些实施方案中，该二肽序列为Gly-Gly。在一些实施方案中，该三肽序列为Gly-Gly-Gly。在一些实施方案中，该螯合剂为EDTA。在一些实施方案中，所述一种或多种代谢活性细胞选自白细胞、红细胞、循环肿瘤细胞及其组合。在一些实施方案中，该制剂包含：pH缓冲液；螯合剂；磷酸酶抑制剂；以及嘌呤。在一些实施方案中，该磷酸酶抑制剂为丝氨酸-苏氨酸磷酸酶抑制剂。在一些实施方案中，该丝氨酸-苏氨酸磷酸酶抑制剂为2-甘油磷酸酯。在一些实施方案中，该嘌呤为腺嘌呤或鸟嘌呤。在一些实施方案中，该嘌呤为腺嘌呤。在一些实施方案中，该嘌呤为鸟嘌呤。在一些实施方案中，该制剂进一步包含螯合剂，和选自阳离子化合物、两性离子化合物和肽的至少一种化合物。在一些实施方案中，该螯合剂为葡萄糖酸钠。在一些实施方案中，该两性离子化合物为式(I)化合物：
其中R1、R2和R3独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任选地形成环，Y为CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A为未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20种天然存在的氨基酸之一种中发现的任何侧链；并且Z为CO2-、SO3-或OPO3-。在一些实施方案中，该阳离子化合物选自：
(a)式(II)化合物：
其中R1、R2和R3独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任选地形成环，Y为CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A为未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20种天然存在的氨基酸之一种中发现的任何侧链；Z为CO2A；并且X为药学上可接受的阴离子；
(b)式(III)化合物：
其中R1、R2、R3和R4独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任选地形成环，Y为CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A为未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20种天然存在的氨基酸之一种中发现的任何侧链；并且X为药学上可接受的阴离子；和
(c)式(IV)化合物：
其中R1和R2独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基；并且X为药学上可接受的阴离子。在一些实施方案中，式(I)、式(II)或式(III)化合物的R1和R2形成吗啉基环、吡咯烷鎓环、哌啶鎓环或噁嗪鎓环。在一些实施方案中，该两性离子化合物选自表1中列出的两性离子化合物。在一些实施方案中，该阳离子化合物选自表1中列出的阳离子化合物。在一些实施方案中，该两性离子化合物为季内盐(quaternaryinner salt)。在一些实施方案中，该季盐为N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)-3-铵-丙酸盐，或N-乙基-哌啶鎓-4-丁基磺酸盐。在一些实施方案中，该两性离子化合物或阳离子化合物选自4-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-4-乙基吗啉-4-鎓溴化物、N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3-羟基-N,N-双(2-羟乙基)丙烷-1-铵溴化物、2-乙氧基-N,N,N-三乙基-2-氧代乙铵溴化物、2-((3-羟基丙基)二甲基铵基)乙酸盐、2-((2-羟丙基)二甲基铵基)乙酸盐、2-(2-(羟甲基)-1-甲基哌啶鎓-1-基)乙酸盐、2-((2-羟乙基)二甲基铵基)乙酸盐、2-((2,3-二羟基丙基)二甲基铵基)乙酸盐、1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-4-羟基-1-甲基哌啶鎓溴化物、2-(4-羟基-1-甲基哌啶鎓-1-基)乙酸盐、2-乙氧基-N-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙铵溴化物、2-((2-(2-羟基乙氧基)乙基)二甲基铵基)乙酸盐、2-(双(2-羟乙基)-(甲基)铵基)乙酸盐，和4-(2-羟乙基)-4-甲基-2-氧代吗啉-4-鎓溴化物、2-(双(2-羟乙基)-(甲基)铵基)乙酸盐、2-(4-(2-羟乙基)吗啉基-4-鎓)乙酸盐、4-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-4-甲基吗啉-4-鎓溴化物、1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1-甲基吡咯烷鎓溴化物、2-(苄基(2-羟基-乙基)(甲基)铵基)乙酸盐、3-(2,3-二羟基丙基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓氯化物、1,3-二甲基-1H-咪唑-3-鎓甲基硫酸盐、N-苄基-2-乙氧基-N,N-二甲基-2-氧代乙铵溴化物、1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1-甲基哌啶-鎓溴化物、N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-N,N-二甲基苯铵溴化物、1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3-羟基-1-甲基哌啶鎓溴化物、3-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)-1-甲基-1H咪唑-3-鎓氯化物、3-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓氯化物、1-甲基-3-十四烷基-1H-咪唑-3-鎓溴化物、N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-N,N-二甲基环-己铵溴化物，以及3-((2-羟基-乙基)二甲基-铵基)丙酸盐。在一些实施方案中，该肽具有Ala-Gln、Gly-Gly或Gly-Gly-Gly的氨基酸序列。在一些实施方案中，该肽具有Ala-Gln的氨基酸序列。在一些实施方案中，该肽具有Gly-Gly的氨基酸序列。在一些实施方案中，该肽具有Gly-Gly-Gly的氨基酸序列。在一些实施方案中，该制剂进一步包含乙酸盐缓冲液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化钾、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化镁或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种代谢活性细胞选自白细胞、红细胞、循环肿瘤细胞及其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种代谢活性细胞为白细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种代谢活性细胞为红细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种代谢活性细胞为循环肿瘤细胞。在一些实施方案中，该制剂选自表2中列出的制剂。在某些实施方案中，该pH缓冲液选自2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)和3-吗啉基-2-羟基丙磺酸(MOPSO)，该螯合剂为EDTA，并且该肽为二肽或三肽。在某些实施方案中，该磷酸酶抑制剂为2-甘油磷酸酯，并且该嘌呤为腺嘌呤或鸟嘌呤。在某些实施方案中，该磷酸酶抑制剂为2-甘油磷酸酯，并且该嘌呤为腺嘌呤。
在一些实施方案中，本文描述了基本稳定储存的一种或多种代谢活性白细胞的组合物，该组合物包含与用于一种或多种代谢活性细胞的基本稳定储存的制剂相混合的一种或多种代谢活性白细胞。在某些实施方案中，将所述一种或多种代谢活性白细胞纯化并储存在用于基本稳定储存的制剂中。
在一些实施方案中，本文描述了基本稳定储存的一种或多种代谢活性红细胞的组合物，该组合物包含与用于一种或多种代谢活性细胞的基本稳定储存的制剂相混合的一种或多种代谢活性红细胞。在某些实施方案中，将所述一种或多种代谢活性红细胞纯化并储存在用于基本稳定储存的制剂中。
在一些实施方案中，本文描述了基本稳定储存的一种或多种代谢活性循环肿瘤细胞的组合物，该组合物包含与用于使一种或多种代谢活性细胞基本稳定储存的制剂相混合的一种或多种代谢活性循环肿瘤细胞。在某些实施方案中，将所述一种或多种代谢活性循环肿瘤细胞纯化并储存在用于基本稳定储存的制剂中。
在一些实施方案中，本文描述了包含容纳在采血管内的本文所述制剂中的任意一种的制品。在一些实施方案中，该采血管为抽空的采血管。
在一些实施方案中，本文描述了包含一种所述制品和包装说明书的试剂盒。
在一些实施方案中，本文描述了用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的方法，该方法包括：将从受试者采集的血液样品与如本文提供的、用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂相混合，其中所述一种或多种细胞在室温下保持代谢活性至少三天的时间。在一些实施方案中，至少80％的细胞在室温下保持代谢活性至少三天的时间。在该方法的其他实施方案中，该细胞保持代谢活性至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天或至少18天。在一些实施方案中，该细胞在室温下保持代谢活性至少18天的时间。在一些实施方案中，该细胞为白细胞、红细胞、循环肿瘤细胞或其组合。在一些实施方案中，该受试者为动物。在一些实施方案中，该受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，该受试者为人。在某些实施方案中，在从受试者采集血液时将该血液样品与稳定化制剂相混合，以使所述一种或多种代谢活性细胞基本稳定。
附图说明
图1A和1B显示了3供体研究的FACS散点图，其证实本发明的制剂和组合物能够使血液样品中的CD45阳性白细胞在环境温度或4℃下在储存6天后保持稳定。图1A通过示例性制剂与未受保护的样品对比，示出了环境温度下的稳定化，而图1B则通过示例性制剂与未受保护的样品对比，示出了4℃下的稳定化。
图2A和2B提供了柱状图，其证实与未受保护的样品相比，本发明的制剂和组合物能够使血液样品中CD45阳性的总白细胞和由粒细胞、淋巴细胞及单核细胞构成的活白细胞群体在4℃下储存6天后保持稳定。
图3A和3B提供了柱状图，其证实与未受保护的样品相比，本发明的制剂和组合物能够使血液样品中CD45阳性的总白细胞和由粒细胞、淋巴细胞及单核细胞构成的活白细胞群体在室温下储存6天后保持稳定。
图4显示了FACS散点图，其证实与未受保护的样品相比，本发明的制剂和组合物能够使血液样品中的单核细胞群体在4℃下储存5天后保持稳定。
图5显示了柱状图，其证实与未受保护的样品相比，本发明的制剂和组合物能够使血液样品中的CD4和CD8阳性T细胞/淋巴细胞在室温下储存5天后保持稳定。
图6显示了FACS散点图，其证实与未受保护的样品相比，本发明的制剂和组合物能够使血液样品中的活CD66b阳性粒细胞群体在室温下储存8小时后保持稳定。
具体实施方式
根据本发明，提供了用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂、组合物、制品、试剂盒及方法。在一个方面，本文所述的制剂有利地维持与全血中所见的具有相似大小和形状的、代谢活性的完整活血细胞(例如，白细胞、红细胞和循环肿瘤细胞)的完整性。采用针对天然野生型膜蛋白质、受体和细胞表面蛋白质生成的抗体，通过流式细胞术或荧光激活细胞分选(FACS)分析，可有利地分析这些活细胞，这在使用使这些细胞表面蛋白质变性的其他储存制剂时是不可行的。
除非另有定义，否则本文中所采用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所普遍理解的相同的含义。本文提及的所有专利、专利申请和出版物均通过引用全文并入本文。
除非上下文中另有明确规定，否则如本说明书及随附的权利要求书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括其复数提法。因此，例如，提及“该/所述方法”包括本领域技术人员在阅读此公开内容等之后将会明白的一种或多种方法和/或本文描述的这种类型的步骤。
如本文所使用的“约”在提及可测值如量、时距等时，意在包括指定值的±20％或±10％或±5％或甚至±1％的偏差，因为此类偏差对于所公开的组合物或实施所公开的方法是合适的。
用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下稳定的制剂和组合物
在本发明的一个方面，提供了用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞，例如白细胞、红细胞和/或循环肿瘤细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂。在某些实施方案中，该细胞在室温下保持代谢活性至少三天的时间。在其他实施方案中，该细胞保持代谢活性至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天或至少18天。
如本文中所使用的术语“环境温度”是指平常的室内室温。在一些实施方案中，环境温度为15℃到32℃。在一些实施方案中，环境温度为20℃到27℃。
在某些其他实施方案中，用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞基本稳定储存的制剂包含：pH缓冲液；螯合剂；以及肽。在一些实施方案中，该肽为二肽或三肽。在一些实施方案中，该二肽为丙氨酸-谷氨酰胺。在一些实施方案中，该二肽为甘氨酸-甘氨酸。在一些实施方案中，该三肽为甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸。其他制剂包含：pH缓冲液；磷酸酶抑制剂；以及嘌呤。在一些实施方案中，该嘌呤为腺嘌呤或鸟嘌呤。在一些实施方案中，这些制剂进一步包含阳离子化合物、两性离子化合物或肽中的至少一种和螯合剂。在一些实施方案中，该制剂进一步包含乙酸盐缓冲液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化钾、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化镁或其组合。
在另一方面，提供了包含血液样品的组合物，该血液样品与如本文提供的稳定制剂相混合，以在全血制剂中产生基本稳定的白细胞、红细胞或循环肿瘤细胞。在其他方面，提供了一种包含与该稳定制剂相混合的分离或纯化的白细胞、红细胞或循环肿瘤细胞的组合物。
配制试剂
A.pH缓冲液
根据某些实施方案，本文描述的用于使血液样品中的一种或多种细胞基本稳定储存的制剂和组合物包含一种或多种pH缓冲液。在一些实施方案中，该pH缓冲液是因其对抗溶液的pH变化的能力而为本领域所知的大量化合物中的任意化合物，所述溶液诸如在存在pH缓冲液的水溶液。用于包含在稳定储存组合物中的一种或多种具体pH缓冲液的选择可基于本公开内容以及根据本领域的常规实践来进行，并且可受到多种因素的影响，包括希望维持的pH、待稳定的样品的性质、将采用的溶剂条件、将采用的制剂的其它成分以及其它条件。例如，一般而言，pH缓冲液以在质子解离常数(pKa)的约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位以内的pH使用，质子解离常数为缓冲液的一个特征。
pH缓冲液的非限制性实例包括柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磺基水杨酸、磺基间苯二甲酸、草酸、硼酸盐、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)、MOPSO(3-吗啉基-2-羟基丙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、TAPS(N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(2-羟基-3-[三(羟甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸)、tricine(N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)以及bis-tris(2-[二(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)。本文所涵盖的某些实施方案，包括表2中列出的大量实施方案，表征了具有约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的pH的制剂。
B.阳离子化合物和两性离子化合物
在一些实施方案中，所述制剂包含阳离子化合物、两性离子化合物或其组合。在某些实施方案中，该两性离子化合物为季内盐。在某些实施方案中，用于使血液样品中的一种或多种细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂，包括表2中所列出的那些制剂中，该季内盐为N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)-3-铵-丙酸盐或N-乙基-哌啶鎓-4-丁基磺酸盐。在一些实施方案中，该季盐为N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)-3-铵-丙酸盐或N-乙基-哌啶鎓-4-丁基磺酸盐，并且以约1.0–100mg/mL，或1.0–50mg/mL，或约10.0–50mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，该季内盐为WO2012/018638中公开的那些盐中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述两性离子化合物为式(I)化合物：
其中R1、R2和R3独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任选地形成环，Y为CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A为未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20种天然存在的氨基酸之一种中发现的任何侧链；并且Z为CO2-、SO3-或OPO3-。在一些实施方案中，R1和R2形成吗啉基环、吡咯烷鎓环、哌啶鎓环或噁嗪鎓环。
在一些实施方案中，所述阳离子化合物选自：
(a)式(II)化合物：
其中R1、R2和R3独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任选地形成环，Y为CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A为未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常可在20种天然存在的氨基酸之一种中发现的任何侧链；Z为CO2A；并且X为药学上可接受的阴离子；
(b)式(III)化合物：
其中R1、R2、R3和R4独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任选地形成环，Y为CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A为未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常可在20种天然存在的氨基酸之一种中发现的任何侧链；并且X为药学上可接受的阴离子；和
(c)式(IV)化合物：
其中R1和R2独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基；并且X为药学上可接受的阴离子。在一些实施方案中，式(II)或式(III)化合物中的R1和R2形成吗啉基环、吡咯烷鎓环、哌啶鎓环或噁嗪鎓环。
“烷基”基团是指脂肪族烃基团。该烷基部分包括“饱和烷基”基团，这意味着其不含任何烯烃或炔烃部分。该烷基部分也包括“不饱和烷基”部分，这意味着其含有至少一个烯烃或炔烃部分。“烯烃”部分是指具有至少一个碳碳双键的基团，而“炔烃”部分是指具有至少一个碳碳三键的基团。无论是饱和的还是不饱和的，该烷基部分均包括支链、直链或环状部分。根据结构，烷基基团包括单价基团或双价基团(即亚烷基)，并且如果是“低级烷基”则具有1到6个碳原子。如本文所使用的，C1-Cx包括C1-C2、C1-C3、……C1-Cx。该“烷基”部分任选地具有1到10个碳原子(本文中无论何时出现，诸如“1到10”的数值范围均指给定范围内的每个整数；例如，“1到10个碳原子”意味着该烷基基团选自具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等直至且包含10个碳原子的部分，尽管本定义也涵盖未指定数值范围的术语“烷基”的出现)。本文描述的化合物的烷基基团可被指定为“C1-C4烷基”或类似的指定。仅举例而言，“C1-C4烷基”表示在烷基链中具有一个到四个碳原子，即，该烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。因此，C1-C4烷基包括C1-C2烷基和C1-C3烷基。烷基基团为任选取代的或未取代的。典型的烷基基团包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
如本文所用的，术语“环”是指任何共价闭合的结构。环包括，例如，碳环(例如芳基和环烷基)、杂环(例如杂芳基和非芳族杂环)、芳族(例如芳基和杂芳基)和非芳族(例如环烷基和非芳族杂环)。环可以是任选取代的。环可以是单环的或多环的。
单独使用的或作为如“芳基烷基”、“芳基烷氧基”或“芳氧基烷基”中的较大部分的一部分使用的术语“芳基”是指单环的、双环的或三环的碳环体系，其包括稠环，其中该体系中的至少一个环是芳族的。术语“芳基”可与术语“芳环”互换使用。在一个实施方案中，芳基包括具有6-12个碳原子的基团。在另一个实施方案中，芳基包括具有6-10个碳原子的基团。芳基基团的实例包括苯基、萘基、蒽基、菲基、并四苯基、1,2,3,4-四氢化萘基、1H-茚基、2,3-二氢-1H-茚基等。一种具体的芳基为苯基。在另一个实施方案中，芳基包括茚满基、萘基、四氢化萘基等，其中该基团或连接点在芳环上。
术语“任选取代的”或“取代的”意指所提及的基团可被一个或多个另外的基团所取代，该另外的基团单独地且独立地选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基砜、芳基砜、氰基、卤代、酰基、硝基、卤代烷基、氟烷基、氨基(包括单取代和双取代的氨基基团)及其受保护的衍生物。举例而言，可选的取代基可以是LsRs，其中每个Ls独立地选自键、-O-、-C(＝O)-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、S(＝O)2NH-、-NHS(＝O)2、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-(取代或未取代的C1-C6烷基)或-(取代或未取代的C2-C6烯基)；并且每个Rs独立地选自H、(取代或未取代的C1-C4烷基)、(取代或未取代的C3-C6环烷基)、杂芳基或杂烷基。
在本文描述的制剂的实施方案中，包括表2中列出的那些制剂的实施方案中，所述阳离子化合物选自表1的示例性阳离子化合物中的一种。在本文描述的制剂的实施方案中，包括表2中列出的那些制剂的实施方案中，所述两性离子化合物选自表1的示例性两性离子化合物中的一种。
表1.用于使血液样品中的细胞在环境温度下稳定的示例性阳离子化合物及两性离子化合物
C.肽
在某些实施方案中，本文所述的用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂含有肽。有利地，已确定，在pH缓冲液的存在下，包含稳定量例如50mM或200mM的小二肽或三肽的制剂(包括表2中列出的那些)出乎意料地能够使血液样品中的代谢活性细胞在环境温度下基本稳定，并且稳定时间超过这些细胞冷藏的时间。在一些实施方案中，该二肽具有氨基酸序列aa-aa，其中aa是20种天然氨基酸或任何非天然氨基酸中的任意氨基酸。在一些实施方案中，该二肽为丙氨酸-谷氨酰胺。在一些实施方案中，该二肽为甘氨酸-甘氨酸。在一些实施方案中，该三肽具有氨基酸序列aa-aa-aa，其中aa是20种天然氨基酸或任何非天然氨基酸中的任意氨基酸。在一些实施方案中，该三肽为甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸。
D.磷酸酶抑制剂
在某些实施方案中，本文所述的用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂可含有磷酸酶抑制剂。在某些实施方案中，该磷酸酶抑制剂是丝氨酸-苏氨酸类磷酸酶的抑制剂。在一些实施方案中，该磷酸酶抑制剂为2-甘油磷酸酯。在一些实施方案中，该磷酸酶抑制剂以约1.0–100mM，或约25–75mM，或约50mM的浓度存在。在一些实施方案中，该磷酸酶抑制剂为2-甘油磷酸酯，并且以约1.0–100mM，或约25–75mM，或约50mM的浓度存在。
E.螯合剂
根据某些实施方案，在用于使血液样品中的完整活细胞基本稳定储存的本文所述组合物中包含螯合剂或螯合物。此类螯合剂因其与金属阳离子络合并阻碍该金属阳离子反应性的能力而为本领域技术人员所知。示例性的螯合剂包括二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CDTA)、1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、N-(2-羟乙基)亚乙基二胺-N,N',N'-三乙酸、葡萄糖酸钠和次氮基三乙酸(NTA)。在一些实施方案中，该螯合剂为葡萄糖酸钠，并且以约1.0–50mM，或约10–40mM，或约25mM的浓度存在。
F.嘌呤
在一些实施方案中，在用于使血液样品中的完整活细胞基本稳定储存的本文所述组合物中包含嘌呤。在一些实施方案中，该嘌呤为腺嘌呤、鸟嘌呤或二者。在一些实施方案中，该嘌呤为腺嘌呤。在一些实施方案中，该嘌呤为鸟嘌呤。
用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下稳定的示例性制剂
在某些实施方案中，提供了用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂。在某些实施方案中，用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞基本稳定储存的制剂包含：pH缓冲液；螯合剂；以及肽。在某些实施方案中，用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞基本稳定储存的制剂包含：pH缓冲液；螯合剂；以及二肽或三肽。在某些实施方案中，用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞基本稳定储存的制剂包含：pH缓冲液；螯合剂；以及丙氨酸-谷氨酰胺二肽、甘氨酸-甘氨酸二肽或甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸三肽。在某些实施方案中，用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞基本稳定储存的制剂包含：pH缓冲液；磷酸酶抑制剂；以及嘌呤。在某些实施方案中，该磷酸酶抑制剂为丝氨酸-苏氨酸磷酸酶抑制剂，该嘌呤为腺嘌呤或鸟嘌呤。在某些实施方案中，该磷酸酶抑制剂为2-甘油磷酸酯，并且该嘌呤为腺嘌呤。在其他实施方案中，该制剂进一步包含：螯合剂；以及阳离子化合物、两性离子化合物或肽中的至少一种。在其他实施方案中，该制剂进一步包含：葡萄糖酸钠；以及阳离子化合物、两性离子化合物或肽中的至少一种。在一些实施方案中，该制剂进一步包含乙酸盐缓冲液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化钾、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化镁或其组合。在一些实施方案中，该两性离子化合物为季内盐，并且该肽为分别具有Ala-Gln、Gly-Gly或Gly-Gly-Gly氨基酸序列的二肽或三肽。
用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的示例性制剂在表2中示出。
表2
用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下稳定的示例性制剂
用于使白细胞、红细胞及循环肿瘤细胞在环境温度下稳定的制剂的制备方法
用于制备本文所述的用于使血液样品中的代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂的方法采用本领域技术人员公知的技术并且一般采用可商购的试剂。在一些实施方案中，将该制剂制备为配制试剂的浓缩原液，例如，2X、5X、10X、20X等的浓缩原液，以便以适当的比例与血液样品相混合从而形成所需浓度。表1中公开的阳离子化合物和两性离子化合物可如先前描述的那样合成及配制，例如，参见WO20120186638。
纯化的细胞
在一些实施方案中，利用本领域技术人员惯用的公知常规方法从血液样品中纯化基本稳定的一种或多种代谢活性细胞。用于从血液中纯化血细胞的设备、试剂盒及方法是公知的。例如，已经应用多种原理将红细胞与各种白细胞群体分离。传统上，曾采用梯度分离。梯度分离基于如下原理而起作用：红细胞小而致密，并且可以在离心时形成团状物(pellet)，该团状物通常在诸如Ficoll的物质“垫”下方。梯度方法虽然有效，但通常较慢、难以自动化、不可再现、收率低，并产生具有较差活力的细胞。而且，最终产物常含有剩余的红细胞污染物，该污染物需要另外的处理步骤(例如，红细胞裂解)来去除未充分分离的细胞。
用于分离血液以供功能分析和临床诊断学的另一种常用方法为直接RBC裂解。该方法的原理是，RBC对介质的摩尔渗透压浓度(osmolarity)的变化比WBC更加敏感，使得介质或缓冲液的摩尔渗透压浓度的短暂且快速的变化将裂解比WBC更多的RBC。裂解方法的确有效，但与梯度方法一样，分离的重现性和剩余WBC细胞的活力和数目通常较差并且无法代表整个群体。这些裂解方法还可伴随有对WBC的损伤。
最近开发的一种用于分离血液细胞亚群的技术采用磁性颗粒分离血细胞。或者，采用针对天然野生型膜蛋白质和受体生成的抗体，通过亲和色谱法、流式细胞术或通过荧光激活细胞分选(FACS)分析来纯化基本稳定的、代谢活性的完整活细胞，这在使用使这些细胞蛋白质变性的储存制剂时是不可行的。可使用针对在细胞表面上表达的特定肿瘤抗原的、用于捕获循环肿瘤细胞群体的抗体分离循环肿瘤细胞，或者可根据待进行的分析及循环肿瘤细胞的表达模式，使用特异性抗体针对特定亚群进行选择。抗原表达模式和抗体选择的确定在本领域技术人员的能力范围内。
随后可将纯化的一种或多种代谢活性细胞在分析之前储存在本文所述的制剂中延长的时间。
制品
在某些实施方案中，提供了制品，其中本文描述的制剂(包括表2中列出的那些制剂)中的一种容纳在合适的采血管、采血容器或采血器皿中。这些制品可通过在采血时稳定一种或多种细胞来用于使一种或多种代谢活性细胞基本稳定储存。在某些实施方案中，该采血管为具有低于大气压的气压以抽出预定体积的全血的抽空采血管。在一些实施方案中，这些制品在本文描述的试剂盒及方法中使用。
试剂盒
在一些实施方案中，本文描述了试剂盒，该试剂盒包含任意一种含有本发明制剂(包括表2中列出的那些制剂)的制品以及包装说明书。在一些实施方案中，该试剂盒的组件装在容器中，诸如带隔室的塑料包围体中。在一些实施方案中，该容器具有可严密密封的盖子，使得该试剂盒的内容物可消毒并密封储存以备后续使用。
用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的方法
在本发明的另一个方面，提供了用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的方法。
在某些实施方案中，该方法包括将血液样品与本文所述的用于使血液样品中的代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂相混合，其中该细胞或至少80％的该细胞在室温下保持代谢活性至少三天的时间。在其他实施方案中，该细胞保持代谢活性至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天或至少18天。
在某些实施方案中，用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞，例如白细胞、红细胞和/或循环肿瘤细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂包含：pH缓冲液；螯合剂；以及肽。在一些实施方案中，该肽为二肽或三肽。在一些实施方案中，该肽为丙氨酸-谷氨酰胺二肽、甘氨酸-甘氨酸二肽或甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸三肽。在某些其他实施方案中，用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞基本稳定储存的制剂包含：pH缓冲液；磷酸酶抑制剂；以及嘌呤。在一些实施方案中，该嘌呤为腺嘌呤或鸟嘌呤。在一些实施方案中，该制剂进一步包含阳离子化合物、两性离子化合物或肽中的至少一种和螯合剂，并且还可进一步包含乙酸盐缓冲液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化钾、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化镁或其组合。在一些实施方案中，该制剂进一步包含阳离子化合物、两性离子化合物或肽中的至少一种和螯合剂，并且还进一步包含乙酸盐缓冲液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化钾、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化镁或其组合。在某些实施方案中，该制剂是表2中列出的制剂中的一种。
采血管、采血袋、采血容器和采血器皿是本技术领域公知的，并且已经被执业医师使用了数十年。为了使一种或多种代谢活性细胞基本稳定储存而采集的血液可利用本领域技术人员通常采用的任何方法或设备如静脉穿刺或手指针刺来获取。在一些实施方案中，当通过静脉穿刺采集血液时，在从受试者获取血液样品时，将该制剂置于采血管内部，例如抽空的管(VACUTAINER采血管、Becton Dickenson或VACUETTE采血管，Greiner Bio-One)内部。在一些实施方案中，当通过静脉穿刺采集血液时，在抽取后立即或不久，将该制剂添加至已获得的全血样品中。
如本文描述的方法可采用本文披露的制品及试剂盒。
以说明而非限制的方式给出以下实施例。
实施例1
在环境温度下稳定人血液样品中完整的代谢活性白细胞和红细胞至少18天
本实施例描述了用于使血液样品中的白细胞和/或红细胞在环境温度下稳定至少18天的本发明制剂和组合物。
从知情同意的供体采集人全血加至来自Greiner Bio-One(目录号455045)的K2-EDTA管中。将1.5mL的每种制剂置于来自Greiner Bio-One的3mL空Vacuette管中。将血液合并到单个容器中，混合并分配至每个管，其中在每10等份的血液分配至管后进行混合。将管盖好并通过颠倒混合10-12次。将管储存在75°F(23.9℃)的实验室中的环境温度下。为每种制剂准备一式两份的管，并另外分别为室温对照和4℃对照二者准备两个管。用各3mL的血液制备对照，以便干净地从样品等份获得血浆。4天后，通过冷冻并融化血液两次，然后将血液1:1稀释以对应于稳定剂向每个样品中的添加，以此来裂解未处理的血液。然后对血液进行10倍系列稀释，以得到10％溶血对照，然后另外稀释5倍以得到2％溶血对照。将2％溶血对照连续地1:1稀释，以得到1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125和0.015625的另外稀释液。将200微升等份的稀释液转移至96孔UV-star微量滴定板(Greiner Bio-One)，并利用Biotek Synergy 2仪器根据制造商的使用说明取得415nm处的测量值。将溶血百分比值相对于415nm处的OD作图，并用来通过这些点计算回归线。通过利用excel获得定义经计算的回归线的等式，并使用该线计算在4、10和18天时测试的、来自表2的经分析的制剂子集的溶血百分比。
表3.确定对照样品的溶血百分比的回归线
％溶血 #1 #2 平均值 ％溶血
1 6.177 6.324 6.2505 1
0.5 3.118 3.234 3.176 0.5
0.25 1.637 1.632 1.6345 0.25
0.125 0.816 0.829 0.8225 0.125
0.0625 0.404 0.415 0.4095 0.0625
0.03125 0.209 0.211 0.21 0.03125
0.015625 0.11 0.119 0.1145 0.015625
从这些数据计算所得的回归线，其为y＝0.1603x–0.0055，并且R2值等于0.9999。
在每个条件和时间点下的样品制备包括将1mL等份从每个管中取出并转移至1.5mL Eppendorf微量离心管。将管在Eppendorf 5417离心机中以3000rpm旋转5分钟，并从每个管中转移250微升等份的血浆层，并在第4天的时间点以1:1稀释。对于包括对照在内的一些制剂，稍后的时间点需要更大的稀释度，从而使得读数不会超出标度。通过水空白校准所有测量，并经由用于控制Biotek酶标仪的Gen 5软件根据制造商的使用说明进行路径长度校准。将两个重复读取的溶血百分比取平均。表4列出了对于所测试的每个制剂(来自表2的制剂编号1-24)，每个重复样品(即，“#1”和“#2”)的值、平均值以及在第4天、第10天和第18天观察到的溶血百分比。
表4.采用表2的示例性制剂稳定在环境温度下储存4、10或18天的血液样品中的细胞
如表4所示，针对白细胞和红细胞的稳定进行测试的示例性制剂的子集同样阻止了红细胞溶血，或在至少18天的相同时间段内优于4℃下未经保护而储存的样品。
实施例2
在环境温度下稳定在人血液样品中的白细胞上表达的天然细胞表面蛋白质至少六天
本实施例证实，如通过使用针对在多种白细胞的表面上表达的示例性天然蛋白质标志物CD45、CD4、CD8和CD66b的抗体的FACS分析所证明的，本发明的制剂和组合物使血液样品中的白细胞、淋巴细胞及粒细胞在环境温度下稳定多达6天的时间。
A.CD45阳性白细胞
使用白细胞特异性标志物CD45评价包含本发明制剂的全血组合物中白细胞群体的相对稳定性。
以采集在K2-EDTA VACUETTE管中的人全血与表2的制剂33、74、75、76或77的1X原液为1:1的比例，将全血与这些制剂混合。将对照样品储存在室温(RT)和4℃下。在RT储存后的第0天、第3天和第6天从储存中取出实验和对照样品，并根据制造商的使用说明利用CD45FITC-缀合的抗体对其进行标记。通过用BD FACS裂解溶液(目录号216667-08-2)或通用的非固定裂解缓冲液将血液样品处理10分钟而去除红细胞，之后使用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2次。将剩余的细胞(主要是白细胞)悬浮在1X PBS中，并在BD ACCURI流式细胞仪上以100,000个事件/样品以及中等流速设置进行分析。按照制造商的使用说明，添加COUNTBRIGHT计数珠(Life Technologies，目录号C36950)以获得准确的细胞计数。按照制造商的使用说明添加BD VIA-PROBE(目录号555816)以评估活力。获得并分析数据，以评价相对于CD45-FITC/FL-1荧光的侧向散射。
图1A示出了在室温储存后的第0天和第6天，来自对照样品的流式细胞术数据。在对照样品中，粒细胞群体分离成两个有区别的群体，一个具有较高的CD45荧光，一个具有较低的CD45荧光。在未受保护的对照中，粒细胞群体的粒度(granularity)改变，这通过SSC的降低而得到证实。在采集后的第6天，制剂74和76中几乎无粒度变化，并且不存在粒细胞群体的分离。制剂74和76中的粒细胞群体在第0天与第6天之间仅需要轻微的门(gate)调整，而未受保护的对照需要较大的门控(gating)变化。另外，在第6天，未受保护的样品中不存在门控的确定的单核细胞群体，而这些群体在第0天以及制剂74和76中在第6天是是歧异的。
图1B示出了在4℃储存后的第0天和第6天，来自对照样品的流式细胞术数据。与室温研究类似，到第6天，未受保护样品中的单核细胞群体发生位移，使得门控不可靠。制剂74和75使单核细胞群体维持，具有较小的门控位移。
与第0天的值相比，在4℃下的第6天，制剂33、74、75和77导致了粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的高回收率(>60％)(图2A)。这些粒细胞、淋巴细胞和单核细胞中有很多(30-87％)在第6天是存活的(图2B)。
与第0天的值相比，在室温下的第6天，制剂33、74、75和77导致了粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的高回收率(45->100％)(图3A)。这些粒细胞、淋巴细胞和单核细胞中有很多(>20％)在第6天是存活的(图3B)。
B.CD45阳性单核细胞
将采集在K2-EDTA管中的人全血与等体积(1mL)的1X浓度的表2的制剂76相混合。在分析前，将样品在室温下储存0或6天。将未处理的对照样品储存在4℃下并与测试样品平行处理。按照制造商的使用说明添加抗CD45-FITC抗体。用BD FACS裂解溶液(目录号216667-08-2)裂解红细胞，用PBS洗涤两次，并重悬浮在200μL的1X PBS中。将剩余的细胞(主要是白细胞)悬浮在PBS中并在BD ACCURI流式细胞仪上以100,000个事件/样品进行分析，获取了所有数据并将分析限制于相对于CD45-FITC/FL-1荧光的侧向散射。
如图4所示，制剂76能够在4℃下稳定单核细胞，而在未受保护的对照中单核细胞群体未能被准确门控。
C.CD4和CD8阳性T细胞/淋巴细胞
将采集在K2-EDTA管中的人全血与1X浓度的表2的制剂33和制剂77相混合。在分析前，将样品在室温下储存0或5天。将未处理的对照样品储存在4℃下并与测试样品平行处理。按照制造商的推荐添加抗CD4-FITC抗体和抗CD8-APC抗体。用BD FACS裂解溶液(目录号216667-08-2)裂解红细胞，用PBS洗涤两次，并重悬浮在200μL的1X PBS中。将剩余的细胞悬浮在1X PBS中，并在BD ACCURI流式细胞仪上以100,000个事件/样品进行分析。将分析限制于相对于CD45-FITC/FL-1荧光的侧向散射。
如图5所示，在4℃下到第5天时，CD4和CD8阳性淋巴细胞的数目减少至第0天的值的约20％(未受保护样品)。在制剂33和制剂77中，在第5天时存在超过两倍的CD4和CD8阳性淋巴细胞。
D.CD66b阳性粒细胞
将采集在K2-EDTA管中的人全血与1X浓度的表2的制剂33或制剂77相混合。在分析前，将样品在室温下储存6小时。将未处理的对照样品储存在4℃下并与测试样品平行处理。按照制造商的推荐添加抗CD66b-FITC抗体和BD VIAPROBE，以分别标记粒细胞并评估细胞活力。用BD FACS裂解溶液(目录号216667-08-2)裂解红细胞，用PBS洗涤两次，并重悬浮在200μL的1X PBS中。将剩余的细胞悬浮在1X PBS中，并在BD ACCURI流式细胞仪上以100,000个事件/样品进行分析。将分析限制于CD66b-FITC/FL-1荧光上的门控，然后评价相对于活力的FSC(FL3荧光)。
如图6所示，与未受保护的对照相比，制剂33能够使血液样品中的完整粒细胞在环境温度下稳定8小时的时间。在该实验中，未受保护的样品中70％的粒细胞在8小时后是存活的，而用制剂33稳定的粒细胞在8小时后有98.8％是存活的。这些结果证实了本发明制剂和组合物使活的、完整的CD66b阳性粒细胞得以稳定的能力。
除非上下文另有要求，否则在本说明书和权利要求书通篇中，词语“包含”及其变化形式(其可与“包括”、“含有”或“特征在于”互换使用)是包含性或开放式语言，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。短语“由……组成”排除权利要求中未指明的任何要素、步骤或成分。短语“基本由……组成”将权利要求的范围限制于指明的物质或步骤以及那些实质上不影响所请求保护的发明的基本特性及新特性的物质或步骤。本公开内容涵盖对应于这些短语中每一个的范围的本发明组合物及方法的实施方案。因此，包含所列举的要素或步骤的组合物或方法涵盖其中组合物或方法基本由这些要素或步骤组成或者由这些要素或步骤组成的具体实施方案。
本说明书通篇提及的“一个实施方案”或“实施方案”或“方面”意指与该实施方案相关联地描述的具体特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”在本说明书全文各处的出现并不一定都指的是同一个实施方案。此外，这些具体特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。
以上描述的各种实施方案可进行组合以提供进一步的实施方案。可根据以上详述的说明对实施方案作出这些和其它改变。总之，在所附的权利要求中，所采用的术语不应解释为将权利要求限制于说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而应解释为包括这些权利要求所请求保护的所有可能的实施方案以及等同方案的全部范围。因此，权利要求不受公开内容的限制。
从前述内容应当理解，虽然本文出于说明的目的已描述了本发明的具体实施方案，但在不偏离本发明的精神和范围的情况下可作出多种修改。因此，本发明除了随附的权利要求外不受限制。

Claims (40)

1.一种用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的制剂，其中所述一种或多种细胞在室温下储存至少三天的时间后保持代谢活性。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中至少80％的所述基本储存的细胞在室温下储存至少三天的时间后保持代谢活性。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的制剂，其中至少80％的所述细胞在室温下保持代谢活性至少18天的时间。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制剂，其包含：
(i)pH缓冲液；
(ii)螯合剂；以及
(iii)肽。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中所述pH缓冲液选自2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、3-吗啉基-2-羟基丙磺酸(MOPSO)及其组合。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的制剂，其中所述肽为二肽或三肽。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的制剂，其中所述二肽序列为Ala-Gln或Gly-Gly，而所述三肽序列为Gly-Gly-Gly。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的制剂，其中所述螯合剂为EDTA。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制剂，其中所述一种或多种代谢活性细胞选自白细胞、红细胞、循环肿瘤细胞及其组合。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的制剂，其包含：
(i)pH缓冲液；
(ii)螯合剂；
(iii)磷酸酶抑制剂；以及
(iv)嘌呤。
11.根据权利要求10所述的制剂，其中所述磷酸酶抑制剂为丝氨酸-苏氨酸磷酸酶抑制剂。
12.根据权利要求11所述的制剂，其中所述丝氨酸-苏氨酸磷酸酶抑制剂为2-甘油磷酸酯。
13.根据权利要求10所述的制剂，其中所述嘌呤为腺嘌呤或鸟嘌呤。
14.根据权利要求13所述的制剂，其中所述嘌呤为腺嘌呤。
15.根据权利要求13所述的制剂，其中所述嘌呤为鸟嘌呤。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的制剂，其进一步包含螯合剂，以及选自阳离子化合物、两性离子化合物和肽的至少一种化合物。
17.根据权利要求16所述的制剂，其中所述螯合剂为葡萄糖酸钠。
18.根据权利要求16-17中任一项所述的制剂，其中所述两性离子化合物为式(I)化合物：
其中R1、R2和R3独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任选地形成环，Y为CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A为未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20种天然存在的氨基酸之一种中发现的任何侧链；并且Z为CO2-、SO3-或OPO3-。
19.根据权利要求16-17中任一项所述的制剂，其中所述阳离子化合物选自：
(a)式(II)化合物：
其中R1、R2和R3独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任选地形成环，Y为CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A为未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20种天然存在的氨基酸之一种中发现的任何侧链；Z为CO2A；并且X为药学上可接受的阴离子；
(b)式(III)化合物：
其中R1、R2、R3和R4独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任选地形成环，Y为CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A为未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20种天然存在的氨基酸之一种中发现的任何侧链；并且X为药学上可接受的阴离子；和
(c)式(IV)化合物：
其中R1和R2独立地选自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基；并且X为药学上可接受的阴离子。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的制剂，其中式(I)、式(II)或式(III)化合物的R1和R2形成吗啉基环、吡咯烷鎓环、哌啶鎓环或噁嗪鎓环。
21.根据权利要求16所述的制剂，其中所述两性离子化合物选自表1中列出的两性离子化合物。
22.根据权利要求16所述的制剂，其中所述阳离子化合物选自表1中列出的阳离子化合物。
23.根据权利要求16所述的制剂，其中所述两性离子化合物为季内盐。
24.根据权利要求23所述的制剂，其中所述季内盐选自N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)-3-铵-丙酸盐或N-乙基-哌啶鎓-4-丁基磺酸盐。
25.根据权利要求16-24中任一项所述的制剂，其中所述肽具有Ala-Gln、Gly-Gly或Gly-Gly-Gly的氨基酸序列。
26.根据权利要求10-25中任一项所述的制剂，其进一步包含乙酸盐缓冲液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化钾、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化镁或其组合。
27.根据权利要求10-26中任一项所述的制剂，其中所述一种或多种代谢活性细胞选自白细胞、红细胞、循环肿瘤细胞及其组合。
28.根据权利要求1-3中任一项所述的制剂，其中所述制剂选自表2中列出的制剂。
29.一种组合物，其包含与权利要求1-8和10-28中任一项所述的制剂相混合的基本稳定储存的一种或多种纯化的、代谢活性的白细胞。
30.一种组合物，其包含与权利要求1-8和10-28中任一项所述的制剂相混合的基本稳定储存的一种或多种纯化的、代谢活性的红细胞。
31.一种组合物，其包含与权利要求1-8和10-28中任一项所述的制剂相混合的基本稳定储存的一种或多种纯化的、代谢活性的循环肿瘤细胞。
32.一种制品，其包含容纳在采血管内的权利要求1-28中任一项所述的制剂。
33.根据权利要求32所述的制品，其中所述采血管为抽空的采血管。
34.一种试剂盒，其包含权利要求32或33的制品中的任意一种和包装说明书。
35.一种用于使血液样品中的一种或多种代谢活性细胞在环境温度下基本稳定储存的方法，该方法包括：将从受试者采集的血液样品与权利要求1-28中任一项所述的制剂相混合，其中所述一种或多种细胞在室温下保持代谢活性至少三天的时间。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞在室温下保持代谢活性至少18天的时间。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述细胞为白细胞、红细胞、循环肿瘤细胞或其组合。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述受试者为动物。
39.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
40.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。
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