CN106680475A - 一种gant61抑制剂对hl‑60增殖和凋亡的检测方法 - Google Patents

一种gant61抑制剂对hl‑60增殖和凋亡的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种GANT61抑制剂对HL‑60增殖和凋亡的检测方法，检测方法包括CCK‑8法检测不同浓度抑制剂对HL‑60细胞生长增殖情况、双染检测抑制剂对HL‑60细胞凋亡情况、RT‑PCR检测不同浓度的抑制剂作用HL‑60细胞的表达情况、免疫荧光技术检测不同浓度的抑制剂作用HL‑60细胞蛋白的表达情况。本发明采用以GLI为靶点的Hedgehog‑GLI信号通路特异性抑制剂来抑制Hedgehog‑GLI通路的表达，观察当Hedgehog‑GLI通路被抑制后，急性髓系白血病细胞增殖、凋亡情况，为白血病的治疗提供新的治疗策略。

Description

一种GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法
技术领域
本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法。
背景技术
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，尽管目前的诱导治疗完全缓解率(complete remission,CR)近80﹪，但60﹪以上最终耐药复发，即使是大剂量化疗和干细胞移植，仍有较高复发率，5年总生存率不到40﹪。因此，非常有必要研发新的治疗药物和新的联合治疗方案。
近年研究发现，HH信号通路的异常活化与多种肿瘤的发生、发展相关，其中包括白血病，并参与肿瘤血管新生、肿瘤干细胞的调控、肿瘤的侵袭转移。
综上所述，现有技术中，通过CCK8以及流式细胞仪检测、RT-PCR检测进行白血病检测。对HL-60细胞起增殖抑制作用，并诱导其凋亡的原理缺乏指导作用；以GLI为靶点的Hedgehog(HH)信号通路抑制剂GANT61对人急性早幼粒细胞白血病细胞HL-60增殖和凋亡的作用及机制不明确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法，旨在解决以GLI为靶点的Hedgehog(HH)信号通路抑制剂GANT61对人急性早幼粒细胞白血病细胞HL-60增殖和凋亡的作用及机制不明确的问题。
本发明是这样实现的，一种GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法，所述GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法包括：
采用CCK-8法检测不同浓度GANT61对HL-60细胞生长增殖情况：取对数生长期HL-60细胞，调整细胞密度，接种细胞于孔板中，加入不同浓度的GANT61，每孔加入CCK-8溶液作用，用酶标仪测各孔的吸光度OD值；
采用Annexin V-FITC/PI双染检测GANT61对HL-60细胞凋亡情况：将HL-60细胞接种于孔板内，加入不同浓度的GANT61，每日固定时相收集对数生长期HL-60细胞，用冷PBS洗涤，离心去上清液；用Annexin结合液重悬细胞，向细胞悬液加AnnexinⅤ-FITC混匀，孵育，用流式细胞仪检测HL-60细胞凋亡；
采用RT-PCR检测不同浓度的GANT61作用HL-60细胞GLI 1、BCL-2、BCL-XL和GAPDH的mRNA表达情况：将HL-60细胞接种于孔板内，加入不同浓度的GANT61，RT-PCR法检测HL-60细胞GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH的表达；
采用免疫荧光技术检测不同浓度的GANT61作用HL-60细胞GLI 1蛋白的表达情况：将HL-60细胞接种于的孔板内，加入不同浓度的GANT61，收集各组HL-60细胞，冷PBS液洗，兔抗人GLI 1抗体孵育过夜，PBS液洗，FITC荧光标记山羊抗兔二抗室温避光孵育,PBS液洗，5分钟/次，避光孵育，PBS液洗，封固，共聚焦显微镜下分析。
进一步，CCK-8法检测不同浓度GANT61对HL-60细胞生长增殖情况具体包括：
取对数生长期HL-60细胞，调整细胞密度，按4.5×104/孔接种细胞于96孔板中，24h后加入0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、45μmol/L、60μmol/L、75μmol/L、90μmol/L不同浓度的GANT61，DMSO组设为阴性对照组，放入培养箱中孵育到24h，每孔加入10μL CCK-8溶液作用2h，用酶标仪测450nm处各孔的吸光度OD值，最后按以下公式计算各实验组抑制率，抑制率(％)＝〔1－(实验组OD值－空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值－空白对照组OD值)〕×100％。
进一步，所述采用Annexin V-FITC/PI双染检测GANT61对HL-60细胞凋亡情况具体包括：将HL-60细胞按5×105ml-1接种于24孔板内，24h后加入0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L不同浓度的GANT61，DMSO组设为阴性对照组，每日固定时相收集对数生长期HL-60细胞，用冷PBS洗涤2次，离心去上清液；用Annexin结合液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，向细胞悬液加5μl AnnexinⅤ-FITC混匀，4℃避光孵育15min，加入10μl PI，4℃避光孵育5min，上流式细胞仪检测HL-60细胞凋亡情况。
进一步，所述采用RT-PCR检测不同浓度的GANT61作用HL-60细胞GLI 1、BCL-2、BCL-XL和GAPDH的mRNA表达情况具体包括：
将HL-60细胞按3×106ml-1接种于的6孔板内，24h后加入0μmol、10μmol、20μmol、30μmol/L不同浓度的GANT61，DMSO组设为阴性对照组；RT-PCR法检测48h的HL-60细胞GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH的表达；提取总RNA，将mRNA逆转录为cDNA，逆转录产物进行GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH基因扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统拍照，进行mRNA表达分析和灰度扫描。
进一步，所述采用免疫荧光技术检测不同浓度的GANT61作用HL-60细胞GLI 1蛋白的表达情况包括：
将HL-60细胞按5×105ml-1接种于的24孔板内，24h后加入0μmo、10μmo、20μmo、30μmol/L不同浓度的GANT61，DMSO组设为阴性对照组，收集各组48h时HL-60细胞，冷PBS洗2次，100μL细胞混悬液均匀滴加至多聚赖氨酸包被的载玻片上风干，4％多聚甲醛固定30分钟，PBS液洗3次，5分钟/次，0.5％Triton X-100透膜处理10分钟，PBS液洗3次，5分钟/次，10％山羊血清37℃封闭1h，稀释浓度1∶100的兔抗人GLI 1抗体4℃孵育过夜，PBS液洗3次，5分钟/次，FITC荧光标记稀释浓度1:150的山羊抗兔二抗室温避光孵育1h,PBS液洗3次，5分钟/次，终浓度为0.1mg/L PI室温避光孵育1分钟，PBS液洗3次，5分钟/次，封固，共聚焦显微镜下分析。
进一步，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。
本发明提供的GANT61抑制剂及其对HL-60增殖和凋亡的检测方法，提供了抑制剂使用的详细浓度以及相对应的凋亡率，以及对凋亡基因的表达的影响。说明了在哪个浓度的抑制剂下凋亡最明显。24、48、72h时GANT61作用于HL-60细胞的IC50分别是37.360μmol/L,19.851μmol/L，11.806μmol/L。GANT61呈时间和浓度依赖性抑制HL-60细胞增殖；24h时GANT61(0、5、10、30、40μmol/L)对HL-60细胞早期凋亡率分别为3.970±0.1562，6.463±1.0523，12.903±2.255，36.056±1.5184，43.613±3.020；48h时GANT61(0、5、10、30、40μmol/L)对HL-60细胞早期凋亡率分别为3.906±1.189，9.290±0.854，15.960±1.502，46.766±1.750，21.086±1.603；72h时GANT61(0、5、10、30、40μmol/L)对HL-60细胞早期凋亡率分别2.697±0.190，4.500±0.873，8.687±0.44，55.586±4.344，35.880±4.000。GANT61呈浓度和时间依赖性诱导HL-60细胞凋亡；GANT61呈浓度依赖性抑制GLI 1、BCL-2、BCL-XL mRNA表达；GANT61呈浓度依赖性抑制GLI 1蛋白表达；本发明GANT61通过抑制Hedgehog-Gli信号通路进而下调BCL-2和BCL-XL基因的表达，对人急性髓系白血病细胞HL-60起增殖抑制作用，并诱导其凋亡。
本发明采用以GLI为靶点的Hedgehog-GLI信号通路特异性抑制剂GANT61来抑制Hedgehog-GLI通路的表达，观察当Hedgehog-GLI通路被抑制后，急性髓系白血病细胞增殖、凋亡情况，为白血病的治疗提供新的治疗策略。
附图说明
图1是本发明实施例提供的通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况中各浓度组中HL-60细胞增殖情况图。
图2是本发明实施例提供的不同浓度GANT61对HL-60细胞GLI1、BCL-XL、BCL-2mRNA表达影响图；
图中：1:GANT61 0μmol/L；2:GANT61 10μmol/L；3:GANT61 30μmol/L。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明采用以GLI为靶点的Hedgehog-GLI信号通路特异性抑制剂GANT61来抑制Hedgehog-GLI通路的表达，观察当Hedgehog-GLI通路被抑制后，急性髓系白血病细胞增殖、凋亡情况，为白血病的治疗提供新的治疗策略。
本发明具体实施例提供的GANT61抑制剂，
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步描述。
1材料与方法
1.1药物和试剂GANT61为Selleck公司产品；RPMI 1640培养基和胎牛血清为Gibco公司产品；Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)购自日本同仁化学研究所(Dojindo)；AnnexinV FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。Trizol购自于invitrogen公司，逆转录试剂盒购自于Thermo Fisher Scientific公司，Gli1抗体购买与Abcam公司。
1.2细胞株及培养条件急性髓系白血病HL-60细胞购自中国科学院细胞库，细胞培养采用含10％胎牛血清的RPMI 1640，在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞取生长良好，细胞存活率(台盼蓝拒染法)＞95％的细胞进行实验。
1.3本发明具体实施例提供的对HL-60增殖和凋亡的检测方法包括：
1.3.1 CCK-8法检测细胞增殖：
取对数生长期HL-60细胞，调整细胞密度，按4.5×104/孔接种细胞于96孔板中，24h后加入不同浓度的GANT61(0、5、10、20、30、45、60、75、90μmol/L)，DMSO组设为阴性对照组，放入培养箱中孵育到上述各相应时间，每孔加入10μL CCK-8溶液作用2h，用酶标仪测450nm处各孔的吸光度(OD)值，最后按以下公式计算各实验组抑制率，抑制率(％)＝〔1－(实验组OD值－空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值－空白对照组OD值)〕×100％。
1.3.2 AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡率：
将HL-60细胞按5×105ml-1接种于的24孔板内，24h后加入不同浓度的GANT61(0、10、20、30μmol/L)，DMSO组设为阴性对照组，每日固定时相收集对数生长期HL-60细胞，用冷PBS洗涤2次，离心去上清液。用Annexin结合液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，向细胞悬液加5μl AnnexinⅤ-FITC混匀，4℃避光孵育15min，加入10μl PI，4℃避光孵育5min，上流式细胞仪检测。
1.3.3 RT-PCR检测HL60细胞中Hedgehog信号通路成分和抑凋亡基因表达：
将HL-60细胞按3×106ml-1接种于的6孔板内，24h后加入不同浓度的GANT61(0、10、20、30μmol/L)，DMSO组设为阴性对照组。RT-PCR法检测48h的HL-60细胞GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH的表达。按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，将mRNA逆转录为cDNA，逆转录产物进行上述基因扩增，扩增条件见(表1)。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统拍照，照片用Image J进行mRNA表达分析和灰度扫描。
本发明实施例提供的GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH的RNA序列分别为：
SEQ ID NO1：F5’-TCCTACCAGAGTCCCAAGTTTC-3’、
SEQ ID NO2：F5’-GAGGAGCTCTTCAGGGACGG-3’、
SEQ ID NO3：F5’-ATGGCAGCAGTAAAGCAAGCG-3’、
SEQ ID NO4：F5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；
逆转录为cDNA分别为：
SEQ ID NO5：R5’-CCAGAATAGCCACAAAGTCCAG-3’、
SEQ ID NO6：R5’-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3’、
SEQ ID NO7：R5’-TCATTTCCGACTGAAGAGTGA-3’、
SEQ ID NO8：R5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3。
GLI1的扩增条件为：95℃5min，94℃30s,58.3℃30s,72℃45s,循环30次；
BCL-2的扩增条件为：95℃3min，94℃40s,60℃40s,72℃40s,循环30次；
BCL-XL的扩增条件为：95℃5min，94℃30s,64.5℃30s,72℃45s,循环30次；
GAPDH的扩增条件为：95℃5min，94℃30s,59℃30s,72℃30s,循环30次。
表1 RT-PCR基因信息汇总
1.3.4免疫荧光法检测GLI 1表达：
将HL-60细胞按5×105ml-1接种于24孔板内，24h后加入不同浓度的：
GANT61(0、10、20、30μmol/L)，DMSO组设为阴性对照组，收集各组48h时HL-60细胞，冷PBS洗2次，100μL细胞混悬液均匀滴加至多聚赖氨酸包被的载玻片上风干，4％多聚甲醛固定30分钟，PBS液洗3次，5分钟/次，0.5％Triton X-100透膜处理10分钟，PBS液洗3次，5分钟/次，10％山羊血清37℃封闭1h，兔抗人GLI1抗体(1∶100)4℃孵育过夜，PBS液洗3次，5分钟/次，FITC荧光标记山羊抗兔二抗(1:150)室温避光孵育1h,PBS液洗3次，5分钟/次，终浓度为0.1mg/L PI室温避光孵育1分钟，PBS液洗3次，5分钟/次，封固，共聚焦显微镜下观察。
1.3.5采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 GANT61对HL-60细胞增殖抑制情况：
通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况，结果显示(图1)：24h时与0μmol/L处理组的增殖抑制率比较，5、10μmol/L处理组的差异无统计学意义(p>0.05)，其余各处理组的差异均有统计学意义(p<0.05)；48h时与0μmol/L处理组的增殖抑制率比较，5μmol/L处理组的差异无统计学意义(p>0.05)，其余各处理组的差异均有统计学意义(p<0.05)；72h时与0μmol/L处理组的增殖抑制率比较，各处理组的差异均有统计学意义(p<0.05)；24、48、72h时GANT61作用于HL-60细胞的IC50分别是37.360μmol/L,19.851μmol/L，11.806μmol/L。GANT61呈时间和剂量依赖性抑制HL-60细胞增殖。
2.2 GANT61对HL-60细胞凋亡率的影响：
由表2A可知，24h与DMSO处理组凋亡率比较，0、5、10μmol/L处理组无统计学差异(p>0.05)，其余各处理组的差异均有统计学意义(p<0.05)；由表2B可知，48h与DMSO处理组凋亡率比较，0μmol/L处理组无统计学差异(p>0.05)，其余各处理组的差异均有统计学意义；由表2C可知，72h与DMSO处理组凋亡率比较，0μmol/L处理组无统计学差异(p>0.05)，其余各处理组的差异均有统计学意义。综合表2A、B、C可见GANT61呈时间和浓度依赖性促进HL-60细胞凋亡，虽然48、72h时40μmol/L处理组早期凋亡率比30μmol/L处理组早期凋亡率低，但是40μmol/L处理组晚期凋亡率比30μmol/L处理组晚期凋亡率高。
表2A.不同处理组对HL-60细胞早期凋亡率的比较(x±s，n＝3)
*P＜0.05。
表2B.不同处理组对HL-60细胞早期凋亡率的比较(x±s，n＝3)
*P＜0.05。
表2C.不同处理组对HL-60细胞早期凋亡率的比较(x±s，n＝3)
*P＜0.05。
2.3 RT-PCR检测HL60细胞中Hedgehog信号通路成分和抑凋亡基因表达48h时不同实验组HL-60细胞mRNA表达情况，结果(图2、表3)示与0μmol/L GANT61处理组相比，10、30μmol/L GANT61处理组中HL-60细胞GLI1、BCL-XL、BCL-2 mRNA表达降低，差异具有统计学意义(p>0.05)。综合图2、表3可知，GANT61呈浓度依赖性抑制GLI1、BCL-XL、BCL-2mRNA表达。表3不同浓度GANT61对HL-60细胞GLI1、BCL-XL、BCL-2 mRNA相对表达量的影响
注：10、30μmol/L处理组与0μmol/L处理组mRNA相对表达量比较，*P＜0.05；30μmol/L处理组与10μmol/L处理组mRNA相对表达量比较，△P＜0.05。
2.4免疫细胞荧光检测GLI1的表达水平:
与DMSO处理组的HL-60细胞相比较，10、30μmol/LGANT61处理的HL-60细胞荧光强度减弱，说明GLI 1的蛋白表达水平下降，GANT61浓度越高荧光强度越弱。
3.结论
Hedgehog(HH)信号通路参与调节胚胎发育时期细胞的增殖、分化、组织极性、干细胞的维持。果蝇和人类的HH信号通路一般转导途径高度保守。哺乳动物中，当不存在HH配体(sonic Hedgehog，desert Hedgehog，Indian Hedgehog)时，Patched(PTCH)受体局限在初级纤毛能抑制HH通路的关键信号转导器-七跨膜受体蛋白Smoothened(SMO)，核转录因子GLI转变为抑制形式，使信号通路失活；当HH配体存在时，PTCH受体在其共同受体CDO,BOC和GAS1.的协助下，促使SMO构象发生改变，进而促进GLI向活性形式转变，刺激HH靶基因的表达。Hedgehog信号通路的异常活化与多种肿瘤的发生、发展相关，其中包括白血病。但是Hedgehog信号通路在正常造血和恶性血液病的发生中存在很大的争论。Dierks和Zhao等表明BCR-ABL+CML干细胞中存在SMO高表达，导致Hedgehog信号通路活化，抑制SMO可减少CML干细胞存活，发病率降低。Kobune等表明原代CD34+的急性髓系白血病细胞及细胞株存在Hedgehog信号通路的活化，应用以SMO为靶点的Hh信号通路抑制剂cyclopamine可以诱导这些细胞凋亡并且逆转它们对阿糖胞苷的耐药。Lu等发现在多种急性髓系白血病细胞株及急性髓系白血病患者细胞中存在Hedgehog信号通路的异常激活，脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素(IFNs)与Hedgehog信号通路抑制剂cyclopamine具有协同杀伤急性髓系白血病细胞的作用,Ghezali L等应用SMO特异性小RNA干扰片段和Hedgehog信号通路抑制剂GANT61证明Hedgehog信号通路参与薯蓣皂苷元诱导的人急性红白血病细胞中巨核细胞的分化；然而Hofmann等表明Smoothened(SMO)失活对正常造血无影响，包括外周血数目，干或祖细胞的数目或细胞周期状态，造血细胞集落形成能力，此外，Hedgehog信号通路在MLL-AF9诱导的急性髓系白血病(AML)中没有起作用。Gao等发现条件性降低和升高SMO的表达对正常造血干细胞的自我更新和功能没有影响，而且T-ALL的发生不依赖Hedgehog信号通路。关于Hedgehog信号通路与肿瘤的关系及其抑制剂的研究，大多关注于信号通路上游的SMO受体，越来越多的发现以SMO为靶点的HH信号通路抑制剂对多种肿瘤没有杀伤作用；作为信号通路转导终点的核转录因子GLI，调节参与细胞增殖、分化(CyclinD1和D2,N-Myc,Wnts,PDGFR,IGF2,FoxM1,FoxA2,Nkx2.2,FoxF1,Myf5,HES1,and IGFBP3)基因表达，参与细胞存活(Bcl2)基因表达，参与自我更新和决定细胞命运(Bmi1和Nanog)基因表达，血管生成(VEGF),基因表达，上皮间质转化(Snail1,Sip1,Elk1和Msx2)基因，肿瘤细胞侵袭(Osteopontin)基因表达及自身成分GLI 1和PTCH 1基因的表达，以GLI为靶的HH信号通路抑制剂可能成为更有效的抗肿瘤药物。所以本发明采用以GLI为靶点的HH信号通路抑制剂GANT61进行分析。CCK–8检测增殖实验和AnnexinⅤ-FITC/PI检测凋亡实验结果表明GANT61呈时间及浓度依赖性抑制HL-60细胞增殖并且促进凋亡。GLI 1既是Hedgehog信号通路的组成成分，又是信号的转录靶基因，因此GLI 1可作为信号通路激活的标记基因。因此本发明检测GLI 1mRNA和蛋白的表达判断HH信号通路的活化情况。细胞凋亡是有核细胞在凋亡刺激信号作用下通过启动细胞内死亡机制,经过一系列信号转导途径,最终发生细胞程序性变性和死亡的过程。凋亡通路的失调不仅参与肿瘤的形成，而且还使肿瘤细胞发生化疗药物耐药。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡通路的关键蛋白分子。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2，Bcl-xL等)和促凋亡蛋白(如Bcl-rambo，Bid，Bax，Bak，等)。B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,bcl-2)基因是第一个被发现的拥有抗凋亡作用的原癌基因，它最初在小鼠B细胞淋巴瘤中被发现，故称Bcl-2。Bcl-2通过抑制细胞凋亡干扰正常情况下细胞增殖与死亡的平衡，从而参与肿瘤的发生。GANT61处理HL-60细胞48小时后，RT-PCR检测GLI 1、BCL-2、BCL-XLmRNA表达下降，并且成浓度依赖。同样免疫荧光技术检测GLI1蛋白表达下降。Bigelow等表明Sonic hedgehog信号通路通过Gli-1介导Bcl-2的转录调控。综上所述，本发明结果表明GANT61可通过抑制HH信号通路GLI1的表达进而下调BL-2和BCL-XL的表达，以达到抗急性髓系白血病细胞的作用，为急性髓系白血病的治疗提供新的治疗策略。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 申请人名称 石河子大学
<120>一种GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法
<160>8
<210> 1
<211>22
<212> RNA
<213>人工序列
<400> RNA序列TCCTACCAGAGTCCCAAGTTTC
<210> 2
<211>20
<212> RNA
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<211>21
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<213>人工序列
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<210>8
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列TCCACCACCCTGTTGCTGTA。

Claims (6)

1.一种GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法，其特征在于，所述GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法包括：
采用CCK-8法检测不同浓度GANT61对HL-60细胞生长增殖情况：取对数生长期HL-60细胞，调整细胞密度，接种细胞于孔板中，加入不同浓度的GANT61，每孔加入CCK-8溶液作用，用酶标仪测各孔的吸光度OD值；
采用Annexin V-FITC/PI双染检测GANT61对HL-60细胞凋亡情况：将HL-60细胞接种于孔板内，加入不同浓度的GANT61，每日固定时相收集对数生长期HL-60细胞，用冷PBS洗涤，离心去上清液；用Annexin结合液重悬细胞，向细胞悬液加AnnexinⅤ-FITC混匀，孵育，用流式细胞仪检测HL-60细胞凋亡；
采用RT-PCR检测不同浓度的GANT61作用HL-60细胞GLI 1、BCL-2、BCL-XL和GAPDH的mRNA表达情况：将HL-60细胞接种于孔板内，加入不同浓度的GANT61，RT-PCR法检测HL-60细胞GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH的表达；
采用免疫荧光技术检测不同浓度的GANT61作用HL-60细胞GLI 1蛋白的表达情况：将HL-60细胞接种于的孔板内，加入不同浓度的GANT61，收集各组HL-60细胞，冷PBS液洗，兔抗人GLI 1抗体孵育过夜，PBS液洗，FITC荧光标记山羊抗兔二抗室温避光孵育,PBS液洗，5分钟/次，避光孵育，PBS液洗，封固，共聚焦显微镜下分析。
2.如权利要求1所述的GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法，其特征在于，CCK-8法检测不同浓度GANT61对HL-60细胞生长增殖情况具体包括：
取对数生长期HL-60细胞，调整细胞密度，按4.5×104/孔接种细胞于96孔板中，24h后加入0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、45μmol/L、60μmol/L、75μmol/L、90μmol/L不同浓度的GANT61，DMSO组设为阴性对照组，放入培养箱中孵育到24h，每孔加入10μLCCK-8溶液作用2h，用酶标仪测450nm处各孔的吸光度OD值，最后按以下公式计算各实验组抑制率，抑制率(％)＝〔1－(实验组OD值－空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值－空白对照组OD值)〕×100％。
3.如权利要求1所述的GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法，其特征在于，所述采用Annexin V-FITC/PI双染检测GANT61对HL-60细胞凋亡情况具体包括：将HL-60细胞按5×105ml-1接种于24孔板内，24h后加入0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L不同浓度的GANT61，DMSO组设为阴性对照组，每日固定时相收集对数生长期HL-60细胞，用冷PBS洗涤2次，离心去上清液；用Annexin结合液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，向细胞悬液加5μl AnnexinⅤ-FITC混匀，4℃避光孵育15min，加入10μl PI，4℃避光孵育5min，上流式细胞仪检测HL-60细胞凋亡情况。
4.如权利要求1所述的GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法，其特征在于，所述采用RT-PCR检测不同浓度的GANT61作用HL-60细胞GLI 1、BCL-2、BCL-XL和GAPDH的mRNA表达情况具体包括：
将HL-60细胞按3×106ml-1接种于的6孔板内，24h后加入0μmol、10μmol、20μmol、30μmol/L不同浓度的GANT61，DMSO组设为阴性对照组；RT-PCR法检测48h的HL-60细胞GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH的表达；提取总RNA，将mRNA逆转录为cDNA，逆转录产物进行GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH基因扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统拍照，进行mRNA表达分析和灰度扫描。
5.如权利要求1所述的GANT61抑制剂对HL-60增殖和凋亡的检测方法，其特征在于，所述采用免疫荧光技术检测不同浓度的GANT61作用HL-60细胞GLI 1蛋白的表达情况包括：
将HL-60细胞按5×105ml-1接种于的24孔板内，24h后加入0μmo、10μmo、20μmo、30μmol/L不同浓度的GANT61，DMSO组设为阴性对照组，收集各组48h时HL-60细胞，冷PBS洗2次，100μL细胞混悬液均匀滴加至多聚赖氨酸包被的载玻片上风干，4％多聚甲醛固定30分钟，PBS液洗3次，5分钟/次，0.5％Triton X-100透膜处理10分钟，PBS液洗3次，5分钟/次，10％山羊血清37℃封闭1h，稀释浓度1∶100的兔抗人GLI 1抗体4℃孵育过夜，PBS液洗3次，5分钟/次，FITC荧光标记稀释浓度1:150的山羊抗兔二抗室温避光孵育1h,PBS液洗3次，5分钟/次，终浓度为0.1mg/L PI室温避光孵育1分钟，PBS液洗3次，5分钟/次，封固，共聚焦显微镜下分析。
6.如权利要求5所述的对HL-60增殖和凋亡的检测方法，其特征在于，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。
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