CN106659732A

CN106659732A - 膜联蛋白a5m2单倍型的携带状态及产科风险

Info

Publication number: CN106659732A
Application number: CN201580017435.XA
Authority: CN
Inventors: 德博拉·贝克
Original assignee: Ihg Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Ihg Pharmaceuticals Ltd; IHG Pharmaco Ltd
Priority date: 2014-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2017-05-10
Also published as: JP6647214B2; ES2835257T3; CA2944952A1; US10925891B2; JP2017512826A; CA2944952C; PL3129033T3; EP3129033A2; AU2015245309B2; DK3129033T3; AU2020217398A1; WO2015155523A2; AU2015245309A1; US20210161946A1; US20170027981A1; WO2015155523A3; EP3129033B1

Abstract

本发明涉及在孕前或孕后确定父母(男性和女性)的膜联蛋白A5M2单倍型携带状态，以使妊娠并发症的风险最小，所述妊娠并发症包括但不限于，习惯性流产(RPL)、不孕体外受精(IVF)失败、IUI失败、植入失败、胎儿生长受限(FGR)、小于胎龄(SGA)新生儿、宫内胎死(IUFD)、妊娠高血压(GH)、先兆子痫(PE)和/或静脉血栓栓塞(VTE)。一旦确定M2携带状态，则可以在怀孕前和/或后使用包括给予低分子量肝素(LMWH)和/或其它抗凝血剂的干预方法。还涉及检测M2携带状态的方法，以及基于患者和/或夫妇的M2携带状态诊断和/或预测预后的方法。

Description

膜联蛋白A5M2单倍型的携带状态及产科风险

技术领域

本发明涉及在孕前或孕后确定父母(男性和女性)的膜联蛋白A5M2单倍型携带状态，以使妊娠并发症的风险最小，所述妊娠并发症包括但不限于，习惯性流产(RPL)、不孕(例如，不明原因的男性不育、不明原因的女性不育、不明来源的不孕)体外受精(IVF)失败、宫内人工授精(IUI)失败、胎儿生长受限(FGR)、小于胎龄(SGA)新生儿、宫内胎死(IUFD)、妊娠高血压(GH)、先兆子痫(PE)和/或静脉血栓栓塞(VTE)。一旦确定M2携带状态，则可以在怀孕前后使用包括给予低分子量肝素(LMWH)和/或其它抗凝血剂的干预方法。进一步还涉及提高活产率和/或体外受精(IVF)比率的方法、和/或降低临床流产的方法。还涉及给予患者和/或配偶的M2携带状态检查携带状态的方法，以及诊断和/或预后的方法。

背景技术

血栓形成倾向(Thrombophilias)是不良妊娠结果的主要原因(Markoff et al,2011)，有增加证据显示，胎盘血管损害增加了习惯性流产(RPL)、宫内胎死(IUFD)、妊娠高血压(GH)、先兆子痫(PE)、静脉血栓栓塞(VTE)、胎儿生长受限(FGR)及小于胎龄(SGA)新生儿的风险(Y ounis et al,2003；Grandone et al,2003；Chinni et al,2009；Tiscia etal,2009；Grandone et al,2010；Tiscia et al,2012)。

正常妊娠是获得性高凝状态，因此，具有遗传性易感血栓的妇女在妊娠过程中或在产后期可能发生新发的凝血缺陷的临床症状(Rey et al,2003；Chunilal et al,2009)。在许多临床研究中已经报道了遗传性血栓因子的易感作用(Rodger et al,2010)，并且在大多数患者中遗传子一直以来是莱顿第五因子Factor V Leiden(FVL)或凝血素(PTm)(Bick et al,2000)。然而，在2007年发现了习惯性流产(RPL)和附加的血栓相关的产科并发症的遗传因子(Bogdanova et al,2007；Chinni et al,2010)。该命名为M2单倍型的缺陷是膜联蛋白A5ANXA5基因核心启动子中的序列变异。其包括核心启动子的四个连续核苷酸取代，并且导致M2单倍型携带者与非携带者相比ANXA5基因在胎盘中表达降低。

膜联蛋白A5是具有结合钙和磷脂特性的膜联蛋白家族成员。主要在肾脏、肝脏和胎盘中广泛分布(Morgan et al,1998)。在母体和胎盘之间交界处的胎盘合体滋养细胞的顶膜上最丰富。ANXA5最迟被命名为“胎盘抗凝血蛋白”。其在体内和体外被广泛研究(Thiagarajan et al,1990；Romisch et al,1991)。其具有与磷脂结合活性相关的潜在抗凝血特性，并且是少数在细胞外被发现的膜联蛋白之一(Gerke et al,2005)。ANXA5在细胞膜上形成二维聚集的能力导致了ANXA5“防护罩”模型的发展，该模型假设ANXA5屏蔽在该位点的磷脂不能进行凝结反应，因此有助于维持胎盘总血液流动性。

ANXA5在抗磷脂综合征(APS)患者的胎盘中时缺少的，并且抗磷脂抗体介导的血管内皮上的膜联蛋白5减少可能也导致全身性血栓形成(Rand,1999)。Bogdanova等(2012)重新审定了膜联蛋白A5防护罩模型，并报道了30个患有产科APS的狼疮样抗凝患者((LAC阳性)组的初步基因型分析，显示30个患者中11位是M2携带者，相对于产生产科抗磷脂抗体(aPA)风险的三倍。

在检测胎盘组织的非常基本的数据中，Markoff等(2010)不仅显示M2/ANXA5胎盘(包括患FGR和PE的妇女的胎盘)中ANXA5表达减少是M2单倍体携带的结果，也显示并非仅仅是母性来源，无论父母来源，这都可能发生胚胎诱导风险的结果。他们观察到，正常的ANXA5等位基因并未补偿观察到的M2等位基因特异性减少的信使RNA水平，并且显示与父母的血栓基因不与RPL相关的FVL和PTm不同(Toth et al,2008)，M2/ANXA5经胚胎起作用。

这导致了30对RPL夫妇的试点研究，其中排除了所有RPL的其他因素(包括遗传性血栓形成症和APS)。在该小且非动力的抽样中，研究显示，与对照群体相比，这些RPL夫妻中的男性和女性都可能具有等同的增加的M2携带关系。作者推断，父母携带M2/ANXA5单倍体可能与RPL相关，并且提供等同的风险。他们进一步假设，M2/ANXA5可能是通过影响胚胎抗凝血而导致妊娠病理的遗传因子的第一个实例(Rogenhofer et al,2012)。

Ueki等于2012年在其敲除的鼠模型中发现，在ANXA5空白(ANXA5-KO)的鼠中产仔数和胎儿重量都显著降低，因此说明，母本向循环提供ANXA5对于维持正常妊娠时关键的。他们进一步观察到，ANXA5-KO和WT杂交，显示仅仅使用ANXA5-KO父本交配的幼仔降低了幼仔数目。他们也显示，在妊娠期12、14及16天时向ANXA5-KO鼠给予肝素显著提高幼仔数目。

然而，当这些动物研究延伸至人类时，使用低分子量肝素并未显示有益效果。例如，在Lancet杂志的Rodger等的研究中报道，“以前公布的高质量证据”存在，显示对于以前妊娠丢失过的妇女、之前非中毒或晚发型子痫前期的妇女或者之前低于第5至第10百分数之间的小胎龄儿的妇女，产前的低分子肝素无有益效果(参见，,Rodger et al,"Antepartum Dalteparin Versus No Antepartum Dalteparin For the Prevention OfPregnancy Complications In Pregnant Women With Thrombophilia(TIPPS):AMultinational Open-Label Randomised Trial,'"Lancet 2014Nov 8；384(9955):1673-83)。因此，作者设计了一个充分有力的研究(花费12年实施)，从而最终以统计学证据回答了这个开放性的问题。Rodgers等专门解释：

我们的随机试验首先显示之前没有静脉血栓形成的血栓形成倾向的女性并不从产前低分子量肝素中收益。我们的荟萃分析显示，较低质量的证据显示，低分子量肝素可能预防周期性严重的胎盘介导的妊娠并发症(严重或早期发生的先兆子痫、低于第5百分数的小胎龄儿、以及胎盘早剥)，但是我们在我们试验的亚组分析中并未记录该益处。

Rodgers等第9页

作者进一步阐述：

该试验阐述了在大的易患患者组中的关键质量问题。缺少益处是一个重要的发现。在20世纪90年代中期发现血栓易形成症与妊娠并发症之间相关导致低分子量肝素在之前患有妊娠并发症的患或不患血栓易形成症的女性中广泛地适应症外使用。这种适应症外的使用更受到这些并发症的情绪后果、并结合专家意见、共识小组和显示有益的小的非随机研究共同推动。产前低分子量肝素并非是良性干预；其可能并发肝素诱发的血小板减少症(heparin-induced thrombocytopenia)(虽然很少),硬膜外镇痛(withholding ofepidural analgesia)、以及如我们试验所示的,增加的轻度出血、过敏反应、皮肤反应、增加肝转氨酶浓度、和引产风险。此外，每妊娠期高达400次皮下注射药物既是身体又是经济负担。临床医生和患者可以放心在整个产前期试使用低分子量肝素不会导致骨矿物质密度的显著改变。最后，治疗无效的持续的信念阻碍了对有静脉血栓风险和妊娠并发症女性的有效治疗的进一步研究。

Rodgers等第8页。

因此，需要降低与ANXA5M2单倍型所导致的易栓症相关的妊娠并发症的改进方法。

发明概述

发明概述提供了以下详细说明中进一步描述的简化形式的概念选择。该概述非意欲指出要求保护的主题的关键特征和重要特征，也非意欲确定要求保护的主题的范围。

本发明涉及治疗M2单倍型妊娠的方法，其中，如果生物学母亲或生物学父亲被确定是ANXA5M2单倍型携带者，则确定为M2单倍体妊娠，然后M2单倍体型母亲被给予有效剂量的抗凝血剂。令人吃惊并且与其他临床试验所得的结果相反，如果在怀孕、宫内人工授精、胚胎移植和/或着床之前立即给予、在怀孕时同时给予、和/或在怀孕后立即给予抗凝血剂，则活产率显著提高。在一些实例中，发现生物学母亲和生物学父亲都是A5M2单倍型携带者。

本发明的其他具体实施例包括降低产前并发症的方法，包括鉴定M2单倍型妊娠，其中，当生物学母亲或生物学父亲之一为A5M2单倍型携带者时，则存在所述M2单倍型妊娠，然后M2单倍体型母亲被给予有效剂量的抗凝血剂，其中，所述抗凝血剂降低产前并发症的风险。优选地，在怀孕、宫内人工授精、胚胎移植和/或着床之前、同时或之后立即给予抗凝血剂。在其他实施例中，给予抗凝血剂至少4周、8周、12周或16周。产前并发症的实例包括但不限于：习惯性流产(RPL)、不孕、体外受精(IVF)失败、宫内人工授精(IUI)失败、胎儿生长受限(FGR)、小于胎龄(SGA)新生儿、宫内胎死(IUFD)、妊娠高血压(GH)、先兆子痫(PE)和/或静脉血栓栓塞(VTE)。

本发明的其他优选实施例包括确定M2单倍型妊娠的方法，包括鉴定生物学母亲或生物学父亲的M2单倍体携带状态，其中，基于基因组分析进行所述鉴定；记录生物学母亲或生物学父亲的M2单倍体携带状态；如果生物学母亲或生物学父亲之一为A5M2单倍型，则报告是否存在M2单倍体妊娠。检测的优选方法包括测序、PCR和/或SNP检测技术。

一旦确定M2携带状态，则可以妊娠前和/或后施用包括给予低分子量肝素(LMWH)和/或其他抗凝血剂的本发明的方法。优选地，在怀孕、宫内人工授精、胚胎移植和/或着床之前、同时或之后立即给予抗凝血剂。因此，进一步涉及增加活产率和/或体外受精植入和/或临床妊娠和/或降低临床流产的方法。在其他实施例中，抗凝血剂增加移植率。在另一实施例中，抗凝血剂降低胎心检测之前流产率。例如，在优选实施例中，A5M2单倍型妊娠的母亲在使用方法检测早期妊娠确定妊娠后立即就尽快给予抗凝血剂。在其他实施例中，在IVF的设置中，在胚胎转移的同时给予抗凝血剂。甚至在进一步的优选实施例中，在妊娠前或在IVF的设置的胚胎转移前就给予抗凝血剂。在其他具体实施方式中，直到母亲生产婴儿之前都一直给予抗凝血剂。

在其他优选实施例中，所述抗凝血剂为低分子量肝素(LMWH)。在优选实施例中，抗凝血剂作为体外受精的部分给予。在IV治疗过程中，可以在胚胎转移的同时、之前或数日内给予母亲LMWH。优选地，如LMWH的抗凝血剂给药与胚胎转移同时发生。在其他实施例中，LMWH被给药至少4周、8周、12周或16周。在其他实施例中，直至母亲生产前一直给药。

附图说明

图1描述Carcedo(2001)在Biochem.J.356,571-579和Bogdanova N、Horst J、Chlystun M、Croucher PJ、Nebel A、Bohring A、Todorova A、Schreiber S、Gerke V、Krawczak M、Markoff A(SEQ ID NO:1))所公开的ANXA5启动子结构。膜联蛋白(ANXA5)基因启动子的常见单体型与习惯性流产相关。(Hum Mol Genet 2007；16:573-78)如在Bogdanova中所报道，图1显示了ANXA5基因核心启动子区域的结构。以垂直线条标示边界，并且根据第一个转录起始位点(tsp1)进行编号。不翻译的外显子以灰色阴影遮盖。转录因子共识基序为小字体打印，转录因子的相应缩写在序列信息上方以斜体显示。Notl和BamHI限制性位点标以下划线，启动子中的Z-DNA延伸以斜体显示。核苷酸标记转录起始点(tsp)标记下划线。启动子功能重要的区域(motifs A and B)涵盖 295-311和 328-337位置的核苷酸。M2ANXA5启动子单倍体中改变的核苷酸以粗体标示，替换的核苷酸在各自位置的上方以黑体大写字母标示。在Bogdanova等中，M2ANXA5单倍型替换位置指定19G→A、1A→C、27T→C及76G→A(例如，参见574页结果”下面的第一段)，以及相应于如图1所示的 243G→A、262A→C、288T→C和337G→A。同样，这些相同的取代也称作：(1)在US2012/0178156的SEQID No.2的186核苷酸所对应的位置处由G至A；(2)在US2012/0178156的SEQ ID No.2的203核苷酸所对应的位置处由A至C；(3)在US2012/0178156中SEQ ID No.2的229核苷酸所对应的位置处由T至C；以及(4)在US2012/0178156的SEQ ID No.2的276处的核苷酸所对应的位置处有G至A。

详细说明

在以下的说明中详细描述本发明的一个或多个实施例。通过说明书和附图以及权利要求清晰阐述本发明的其他特点、目的和优点。

在详细描述本发明之前，可以理解，本发明并不限于具体列举的材料或方法参数，当然可以改变。也应该理解，此处所使用的术语仅为了详细描述本发明的实施例，并不意欲限制使用替换术语描述本发明。

通过引用，所有出版物、专利和此处引用的专利，无论上下，都包含于此。

如该说明书及附加的权利要求所使用的，除非清楚指明，否则单数形式的“一”、“一个”以及“某个”也包括复数的指引。例如，指引“多聚核苷酸”包括两个或多个此多聚核苷酸分子的混合物，或多个所述多聚核苷酸分子。

如此处所使用，术语“包括”或其变体指包含任意引用的整数(如特征、原件、特点、特性、方法/方法步骤或限制)，但不排除任何其他整数或整组整数。因此，如此处使用，术语包括为开放性的，不排除方法/方法步骤中的其他未引用的整数。

在此处提供的任何组成和方法的实施例中，“包括”可以替换为“主要组成”或“组成”。此处使用的术语“主要组成”要求特定的整数或步骤，以及此外的基本不影响要求保护的发明的特征或功能的内容。如此处使用，术语“组成”指出现列举整数(如特征、原件、特点、特性、方法/方法步骤或限制)或单独的整数(如特征、原件、特点、特性、方法/方法步骤或限制)组。

进一步详细描述本发明。

A.定义

在本发明中，“M2单倍体妊娠”或“ANXA5M2单倍体妊娠”定义为生物学母亲和/或生物学父亲为膜联蛋白ANXA5M2单倍体携带者的妊娠。认为“M2单倍体妊娠”包括生物学母亲尚未妊娠的情况。并且，对于代孕母亲，捐赠的卵子和/或精子都应该检测，以及受体母亲自己的风险也需检测。

在本发明中，“膜联蛋白A5M2单倍体型”、“M2单倍体型”或“ANXA5M2单倍体型”(SEQID No.2)被定义为膜联蛋白(“ANXA5)启动子的取代，其中，取代为：

(i)在图1的243核苷酸所对应的位置处的G到A的点突变；

(ii)在图1的262核苷酸所对应的位置处的A到C的点突变；

(iii)在图1的288核苷酸所对应的位置处的T到C的点突变；以及

(iv)在图1的337核苷酸所对应的位置处的G到A的点突变。

在本发明中，“M1单倍体型”、“为膜联蛋白A5M1单倍体型”或“ANXA5M2单倍体型”(SEQ ID No.3)也在WO 2006/053725and Bogdanova等中公开，并且特征在于以下两个核苷酸互换(1)在图1的262核苷酸所对应的位置处的A到C，和(2)在图1的288核苷酸所对应的位置处的T到C。

在本发明中，“抗凝血剂”定义为用于防止血块形成或防止已形成的血块增大的药物。抗凝血剂药物通过阻碍凝血因子或血小板的作用而防止血块形成。抗凝血剂药物包括三组：凝血因子抑制剂、凝血酶抑制剂和抗血小板药物。例如，可以在胚胎转移或IUI的同时(例如同时和/或在同一过程中)给予凝血剂，或者在怀孕、植入、IUI、胚胎转移、将要怀孕和/或学习妊娠后立即服用抗凝血剂(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天内)。直至生产前母亲可以一直服用抗凝血剂。此外，可以在准备怀孕、怀孕、植入、IUI和/或胚胎转移之前就服用凝血剂(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天内)。

抗凝血剂的优选实例包括但不限于低分子量肝素(LMWH)或阿司匹林，优选低剂量阿司匹林。

在特定的优选实施例中，给予妊娠母亲低分子量肝素(LMWH)。可以从多种市售来源购买LMWH。在本发明中，患者可以在整个妊娠中每日都服用LMWH，直至基于治疗医生判断生产前不久。M2单倍体型的女性携带者在生产后也应接受LMWH，并服用六周，以降低静脉血栓栓塞(VTE)的风险。可以在胚胎转移或IUI的同时(例如同时和/或在同一过程中)给予LMWH，或者在怀孕、植入、IUI、胚胎转移、将要怀孕和/或学习妊娠后立即服用LMWH(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天内)。LMWH可以施用至少4、8、12或16周。LM而已WH可以一直施用至生产前。此外，可以在准备怀孕、怀孕、植入、IUI和/或胚胎转移之前就及时施用LMWH(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天内)。

如此处所使用，词语“同时”限定为经历过受精、IUI、怀孕和/或胚胎移植的数小时内。优选地，“数小时内”限定为经历过受精、IUI、怀孕和/或胚胎移植30min、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时内。

如此处所使用，“宫内人工授精”或“IUI”指一种类型的人工授精，其中，约在卵子从卵巢释放时直接将精子浓缩液置入子宫或阴道。可以使用或不使用荷尔蒙和/或其他药物(例如克罗米芬(Clomid))实施IUI，以增加卵巢释放的卵子的数目。

在本发明中，“产科并发症”限定为在妊娠过程中由于血栓易形成症和/或胎盘血管而导致的并发症。产科并发症的实例包括但不限于：习惯性流产(RPL)、不孕、体外受精(IVF)失败、宫内人工授精(IUI)失败、胎儿生长受限(FGR)、小于胎龄(SGA)新生儿、宫内胎死(IUFD),妊娠高血压(GH)、先兆子痫(PE)和/或静脉血栓栓塞(VTE)。

在本发明中，抗凝血剂有效增加植入率。在其他实施例中，抗凝血剂有效降低早期流产(即检测到胎心之前)的比率。

在本发明中，“不孕”被限定为：夫妻甚至通过监控排卵和/或通过使用荷尔蒙或其他药物(例如克罗米芬(Clomid))以增加妊娠几率尝试怀孕是都不能怀孕。不孕的实例包括但不限于：不明原因的男性不育、不明原因的女性不育和/或不知来源的不孕。

可以理解，在此处描述的实施例的上下文中，此处所提及的“生物学父亲”使女性个体妊娠。因此，如此处所使用，术语“生物学父亲”含义为此处限定的女性个体的人类胚胎的生物学父亲。在一些实施例中，女性个体已经妊娠，因此为“生物学母亲”。在其他实施例中，女性个体还未妊娠，因此，为准“预期的生物学母亲”。

因此，术语“预期的生物学父亲”的含义为人类雄性个体还未使雌性个体妊娠，但是预期所述男性个体将使女性个体妊娠。在此期间，女性个体也是“预期的”生物学母亲。一旦所述男性个体使所述女性个体妊娠，则“预期的生物学父亲”成为“生物学父亲”，“预期的生物学母亲”成为“生物学母亲”。

因此，本发明的方法包括以下情况：其中预期的生物学父亲还未使母性个体妊娠，即女性和/或预期的生物学母亲和预期的生物学父亲计划在妊娠前检测母性个体患产科并发症的倾向。例如，这包括计划妊娠的夫妇或计划通过自然生育或体外受精怀孕的女性。

本发明的方法可以用于增加活产率，以提高植入的发生率、提高临床妊娠的发生率，和/或降低临床流产的发生率。在本发明中，术语“活产”限定为无论婴儿是否足月都成功分娩成活婴儿。

“临床流产”限定为受精胚胎(例如，在体外受精过程中的胚胎移植)是否导致临床流产或活产。当确定妊娠后，例如可以通过超声波扫描检测胎心确认患者的“临床妊娠”时期。

本发明中“植入”指胚胎附着于子宫壁的能力(即使暂时的)。

本发明的方法进一步包括女性个体已经妊娠的情况。此时，此时可能仍旧想通过检测生物学父亲的样本或检测胚胎的胚性样本(例如通过循环胎细胞、绒毛膜切片、或羊膜穿刺，都获得胚胎来源的样品)检查女性个体患产科并发症的倾向。此外，但不排除也设想检测(预期的)生物学母亲。

如果在体外进行受精，即体外受精，也设想在胚胎植入所述母体之前分析在体外受精胚胎的桑胚期之前或桑胚期获得的单细胞样品。

“桑胚期”指人胚胎分化的16细胞阶段。“桑胚期或之前”含义是设想获得人胚胎分化的16-细胞期之前的、例如6-8细胞期的单细胞样品。

体外受精(IVF)是公知技术，其中，卵细胞在体外由子宫外的精子受精。

也可以想到，意欲通过精子捐赠怀孕的女性在捐赠精子用于各女性个体的体外受精之前，利用本发明的方法通过检测各个精子捐赠样品而检测其产科并发症的倾向，然后在怀孕、宫内植入、胚胎转移和/或植入的同时、之前或之后立即以抗凝血剂治疗。因此，本发明以及本发明的具体方法也包括选择非风险单体型M2携带者的精子捐赠的分层方法。

因此，通过本发明的方法，能够检测、继而选择精子捐赠者，捐赠者在所有的可能性方面不能增加各个女性个体患产科并发症的倾向。这些分析方法在母亲的母性样品已经检测不携带风险单体型M2时更尤其有意义，因为，此时检测预期的生物学父亲(例如精子捐赠者)是否为上述风险单体型是非常重要的。如果这样，之后能够理智的选择不同的精子捐赠者，优选不限定风险单体型M2的精子捐赠者。

同样，当生物学母亲(或预期的生物学母亲)不携带风险单体型M2(如母性样本所测)时，在本发明的实施例中也是理智并具体设想检测预期的生物学父亲或生物学父亲。

也可以想到，意欲通过捐赠卵子怀孕的女性在捐赠卵子用于体外受精之前，利用本发明的方法通过检测各个卵子捐赠者的基因型而检测其产科并发症的倾向。因此，本发明以及本发明的具体方法也包括选择非风险单体型M2携带者的卵子捐赠的分层方法。

因此，通过本发明的方法，能够检测、继而选择卵子捐赠者，捐赠者在所有的可能性方面不能增加各个女性个体患产科并发症的倾向。这些分析方法在母亲的母性样品已经检测不携带风险型单体M2时更尤其有意义，因为，此时检测预期的生物学卵子捐赠者是否为上述风险单体型是非常重要的。如果这样，之后能够理智的选择不同的卵子捐赠者，优选不限定风险单体型M2的卵子捐赠者。

在本发明中，母亲及父亲都可以导致女性个体患产科并发症的倾向。因此，即使女性并不是风险单体型(母性样品所测)的携带者，生物学父亲和/或预期的生物学父亲仍可能导致上述风险，因而也应检测。

如果胚胎的生物学父亲或胚胎的生物学母亲为风险单体型的杂合携带者，则也可以测试所述胚胎的样品(如绒毛膜切片样品或此处所描述的单细胞样品)，以测试其是否为风险单体型的携带者(例如体外受精的实例)。如果生物学母亲或生物学父亲之一为风险单倍体型的纯合携带者，则似乎也不必测试胚胎了，因为风险单倍体型M2的杂合出现已经说明各个女性个体具有产科并发症的倾向。如果生物学父亲不知或不可追查，进一步女性个体(生物学母亲的情况)为非M2风险单倍体型的携带者，一方可能仍想检测各女性个体患产科并发症的倾向。此时，想得到测试胚胎来源的样品(例如循环胚胎血细胞，绒毛膜切片或羊膜穿刺样品)。然而，因为女性个体意欲检测其患产科并发症的倾向性，因此可以理解，应优选不仅仅获得胚胎样品。当由于其他原因胚胎样品已经在手边时，应想到只测试该样品。

在本发明中，习惯性流产(RPL)典型的特征是出现两次货或多次妊娠以胎儿流产终止。所述两次或多次妊娠或连续发生或间隔发生，优选连续发生。

在本发明中，先兆子痫(PE)为在妊娠中发生高血压(妊娠诱导性高血压)的医学疾病。

胎儿生长受限(或胎儿生长滞后)为其中胎儿未按比例生长的疾病。例如，当基本高度小于预期超过3cm时，应怀疑FGR。

想得到在本发明的方法中，所述样品为来自一方(父亲或母亲)的血液样品，精液样品，组织样品，或细胞样品。应理解只要各样品包含允许本发明的方法检测/诊断的遗传物质，则任何生物样品都适合。

所述样品可以经活检获得，如针吸活检、手术活检，经任何类型的图片技术获得，例如通过颊粘膜拭子等，或其他。本领域普通技术人员可以知晓其他能够从人体获得含遗传物质的设备或方法。

本领域普通技术人员也知道如何避免或防止污染，例如，"可从美国医学遗传学学院获得产前检查的通用标准和指南(2006Edition of Standards and guidelines forclinical genetics laboratories,http://www.acmg.net/Pages/ACMG_Activities/stds-2002/g.htm)"，其总结了相应标准。

B.检测方法

如WO 2006/053725和Bogdanova N、Horst J、Chlystun M、Croucher PJ、Nebel A、Bohring A、Todorova A、Schreiber S、Gerke V、Krawczak M、Markoff A所公开，膜联蛋白(ANXA5)基因启动子的常见单体型与习惯性流产相关。在Hum Mol Genet 2007；16:573-78中，在人ANXA5启动子中可以检测到的风险单体型M2的特征在于以下四个核苷酸变化：

(1)在图1的243位核苷酸所对应的位置处的G到A；

(2)在图1的262位核苷酸所对应的位置处的A到C；

(3)在图1的288位核苷酸所对应的位置处的T到C；以及

(4)在图1(SEQ ID NO：2)的337位核苷酸所对应的位置处的G到A。

WO 2006/053725和Bogdanova等也公开了在人ANXA5启动子中也可以检测到的风险单体型M1，并且特征为以下两个核苷酸的变化：(1)在图1的262位核苷酸所对应的位置处的A到C，以及(2)在图1(SEQ ID NO：3)的288位核苷酸所对应的位置处的T到C。

确定和/或检测M2单倍体型的装置和方法是公知的(例如，参见WO2006/053725和Bogdanova等)，并且此处也详细公开。

“核苷酸检测技术”对于本领域普通技术人员是公知的，包括其他任何类型的基于PCR技术，或任何其他能鉴定风险单体型M2的特征核苷酸变化的技术。本发明描述了此方法(参见实施例)，并且在WO 2006/053725中公开。

所述技术可以选自非限定组，举例包括：杂交技术，核酸测序，PCR，限制性片段测定，单核苷酸多态性(SNPs)-测定，LCR(连接链反应)，或限制性片段长度多态性(RFLP)-测定。

可以从标准技术建议文献中获得相应的实例和进一步详细内容(例如Sambrook,Russell"Molecular Cloning,A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(2001)；Ausubel,"Current Protocols in Molecular Biology",Green PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)，或者Higgins and Hames(Eds.))。如WO 2006/053725的实施例所述，其他适合的方法为包括确定BamHI限制性位点的限制性片段测定或RFLP方法。如WO 2006/053725所示，测定BamHI限制性位点的缺失(BamHI’)或存在(BamHI+)，并且作为本文所限定点突变缺失或出现的指征。方法的细节参见WO 2006/053725的实施例。

在具体实施例中，相关DNA片段通过PCR技术由基因组DNA扩增。所使用的潜在引物包括但不限于SEQ ID NO:4(ANX5.P.F；WO 2006/053725的SEQ ID NO:22)和SEQ ID NO:5(ANX5.exl.R；WO 2006/05372的5SEQ ID NO:23)所提供的引物。本领域普通技术人员易推导其他使用的引物对或引物，以扩增此处限定的膜联蛋白A5(ANXA5)启动子的相关片段或其片段。获得扩增子后(参见实施例)，可以使用限制性酶BamHI消化(限制性消化)扩增子(限制性酶BamHI可以从Roche Applied Science，Mannheim，Germany；MBI Fermentas,St.Leon-Rot,Germany；New England Biolabs,Frankfurt am Main,Germany及其他供货商获得。详细内容参见试验部分。消化后根据本领域公知的方法运载(参见Sambrook/Russel,2001,(log.cit.)及其他)，进一步通过本领域常规技术，例如凝胶分析，例如琼脂糖凝胶，分析BamHI/BamHI+限制位点。

在本申请的上下文中具体想得到的其他技术为由IHG Pharmaco确定的SNP检测技术。所述技术在2006/038037和US 7,803,545中充分说明，通过引用整体包含于本文中。

具体地，在使用IHG技术的基因分型中，从主体获得核酸样品，扩增含多态性位点的基因片段，以提供负载基因片段的序列的扩增子群。典型地，通过使用与所述基因片段侧翼相接的引物对通过PCR实现基因片段的扩增。经考虑选择基因片段的特异性的适合引物。选择引物扩增长度为90～400碱基、优选100～150碱基的基因片段。通常优选多态位点位于基因片段的中心区域，也认为接近基因片段的中部三分之一。总所周知，基因片段的PCR扩增导致双链扩增子群。PCR扩增方法的更详细内容参见WO 93/19201。

当被检测的核酸是哺乳动物基因组DNA时，DNA样品取自具有目的特异性特点的基因型的个体或其他部位。(术语“个体”意欲包括胚胎)DNA可以提取自所有有核细胞。典型地，方便起见，DNA取自外周血细胞。胚胎DNA可以取自胎盘细胞或羊水。其他DNA来源包括毛囊、干尸等。可以通过任何适合的方法分离DNA，例如，通过Miller等描述的快速盐析出法(Miller,S.,Dykes,D.and Polesky,H.(1988)"A simple salting out procedure forextracting DNA from human nucleated cells"；Nucl.Acids Res.16:1215)。可选择地，可以通过逆转录酶将DNA以cDNA从mRNA中分离。

也提供了IHG分子群，所述IHG分子群具有与基因片段相应的序列，但是如本文所述被修饰以包括调控核苷酸取代，删除，插入或其组合。典型地，通过使用如PCR的扩增制备IHG群。在WO 93/19201中也可以找到用于PCR扩增的更详细的方法，其通过引用整体包含于本文。选择PCR扩增所用引物，以提供IHG分子的扩增。优选地，IHG的长度可以与被研究的基因片段的长度基本相同(无论IHG的任何必要的插入或删除的碱基)，或者长度不同，例如比基因片段短或长。然而，如果基因片段和IHG的长度不同(无论IHG的任何必要的插入或删除的碱基)，则必须有足够程度的重叠，以使在基因和IHG的扩增体之间形成异源双链。分别扩增IHG和基因片段所用的引物可以相图或不同。然而典型地，使用同样的引物，从而获得长度基本相图(无论IHG的任何必要的插入或删除的碱基)扩增的IHG和基因片段，如WO 93/19201所教导，可以标记所述引物。

基因片段和IHG的PCR扩增可以在同一或独立的容器中完成(分别为“混合”或“独立”PCR)。优选分别进行扩增，然后合并基因片段和IHG的扩增群，以可以形成异源双链。

如在含多态性位点的IHG和基因片段的混合群之间形成异源双链通过以下步骤完成：首先，加热IHG和基因片段的混合群，以将双链DNA分离为单链DNA，然后冷却，以形成异源双链，例如，如WO–A-93/19201所述。

根据其分子构象分离形成的异源双链，所述分子构象影响其表观分子量，但不影响实际分子量。例如，可以通过电泳实现分离。典型地，异源双链的分离在如非变性聚丙烯酰胺凝胶的未充分变性凝胶上实现。在使期望分辨率的双链溶液有效的条件下进行电泳。分离“表观大小”不同——由其不同分子构象所导致——的双链的分辨率通常为10bp的大小。通常大小标记也跑凝胶，以估量迁移率，及因此估量双链的表观尺寸。此外，或可选择地，也可以使用PCR单独扩增具有研究基因的已知等位基因的相应序列的对照DNA分子，以与所用的IHG形成异源双链，然后所得样品跑凝胶，以为所得的不同异源双链提供凝胶上的标记。

异源双链的分布，即分辨率布图，为等位基因特异性的。该分辨率布图或PCR指纹接下来可以可视化。当PCR引物被标记时，可以显示标记。携带分离的被标记双链的底物与检测标记存在的实际接触。当PCR引物未标记时，负载了PCR指纹的底物在紫外光下可以与溴化乙锭或SYBR^TM绿(可从Molecular Probes获得)及可视化的核酸片段接触；可选择地，异源双链可以通过银染可视化。

检测M2单倍体型状态的其他方法包括但不限于利用荧光分子和/或固相的方法。优选的固相结构可以为珠和/或盘。固相可以包括塑料、硅、玻璃、聚苯乙烯、铝、钢、铁、铜、镍、银、金、纤维素或尼龙。此外，可以使用长度至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30个核苷酸的寡核苷酸片段检测ANXA5M2单倍体型。此外，检测ANXA5M2单倍体型状态的方法可以包括利用新一代测序技术(NextGeneration Sequencing technique)的方法。这些检测方法是本领域普通技术人员已知的。

具体实施方式

实施例1、研究人群

在2012年3月至2013年2月从就诊于五个生育诊所的患者中招募研究对象。获得了所有患者的知情同意。在此期间，314为患者(157对夫妇)之前至少患有1次IVF周期(平均1.9IVF和0.2IUI)。获得了详细的临床病史、以及是否有M2/ANXA5单倍体型携带的基因分型，并且形成了部分不孕的诊断调查。女性的平均年龄为36.3岁(从23～49岁)，其男性伴侣的平均年龄为38.6岁(从23～64岁)。女性的平均体重指数为25.5(从19～40.5)，其男性伴侣的平均体重指数为33.7(从21～36).基于其以前的病史以及患者的被检测的意愿选择进行筛查的患者，在咨询时向其详细说明研究本质。女性患者筛选抗磷脂抗体。在不育性方面，大多数男性群体为少精(oligospermia)(48％)、弱/少弱精子(27％)、无精(13％)。不育随携带状态改变，非携带者的发病率分别为41％、26％、和11％；携带者的发生率分别为35％、12％和12％的携带者。关于女性群体，最普遍的是不明原因(27％)、卵巢储备不足(17％)、PCOS(11％)和子宫内膜异位症(6％)。不育随携带状态改变，非携带者的发病率分别为30％、16％、16％和3％；携带者的发病率分别为26％、9％、18％和8％。

这些患者主要为白种英国人(77％男性和75％女性)，印度/巴基斯坦人(8％)，其余为多种族人。整体而言，这种分类代表了UK和爱尔兰的人口统计。

实施例2、收集DNA以及确定M2携带状态

脱氧核苷酸(DNA)从夫妻的血液样品中收集(第一群组)，其余组在特定收集纸上进行口腔细胞分析。进行详细的实验室检查，以确保口腔细胞的转移不发生数据质量的破坏。使用QIAmp DNA blood mini kit(Qiagen GmbH,Hilden,德国)从白细胞或收集纸的洗脱液中提取DNA。以100ng的基因组DNA作为模板进行PCR反应，所述基因组DNA通过利用QIAmp DNA blood mini kit(Qiagen GmbH,Hilden,德国)从白细胞分离，或者从收集试纸纯化，包含于后续PCR反应中。使用Biotaq聚合酶进行PCR反应(Bioline.Bioline ReagentsLimited,London,Great Britain)，反应体积为25μ，L包含10x NH₄缓冲液:160mM(NH₂SO₄,670mM Tris-HCl(pH 8.8),50mM MgCL2(终浓度为1.5mM)，50pM引物(正、反向引物)，200μΜdNTP's，聚合添加剂(Bioline)及2.5单位的Biotaq聚合酶。PCR循环条件为：94℃for 45s,94℃30s、60℃30s、68℃1min，30个循环，最后延伸7分钟。使用Zymo ZR-96DNA Clean andConcentrator kit(Zymo Research Corporation.Irvine,California,美国)通过标准柱层析方法纯化PCR产物。纯化的扩增子在ABI 3730x1DNA分析仪上、利用标准条件的ABIBigDye terminator chemistry v3.1测序。以ABI Seqscape v 2.5.(AppliedBiosystems,Foster City,California,USA)进行痕迹分析和基因分型。调查M2单倍体型的出现(在ANXA5基因启动子中4个连续核苷酸组的改变:243G/A[rsll2782763],262A/C[rs28717001],288T/C[rs28651243]及337G/A[rsl 13588187])(SEQ ID NO:2)。当四个突变中仅两个(262A/C,288T/C)出现时，定义为单倍体型Ml(SEQ ID NO:3)。

利用Seqscape软件(Applied Biosystems,Foster City,California,USA)以25％的混合碱基调用阈值进行所有基因型调用。如文中所述，Seqscape被编程用于分析4个特异性碱基的核苷酸变异。结果以突变报告形式产生，详细说明了目的区域内的突变。通过室内LIMS系统(实验室信息管理系统)实现报告产生，编程设置该系统仅允许特定组合的突变。LIMS系统标记任何给出预料外结果的样品，并且在以新鲜样品重复检查前，由操作员核查。

实施例3、基因型及统计分析

M2/ANXA5单倍体型的杂合或纯合携带者的患者被记录为杂合或纯合携带者。使用Guo和Thompson(1992)的方法进行Hardy-Weinberg偏差测试(也由Bogdanova等，2007，及Rogenhofer等2012，使用)。我们在单独和整体考虑的男性和女性组内进行该测试。也检测了非UK种族以外的个体，以观察是否对结果有影响。

由于过量的M2杂合型，但是特别是M2纯合型(观测9个V.预测3.4个)，因此IVF女性患者未在HWE中(p＝0.0052)。为了核查女性亚组中观察到的显著HWE偏差是否导致意外，我们从整体(男性女性混合的)中重新随机抽样155个，并且使用相同的方法评估HWE偏差的p值，并记录该p值。重复该过程1000次，其中，仅3个记录的p值较所有女性组的观测p值更极端，因此说明，女性的HWE偏差是真实的，且不导致风险。

Rogenhofer等在2012年由从石荷州基尔大学诊所(University ClinicSchleswig-Holstein Kiel)的PopGen生物样品库所提取的人口控制样品(n＝533)使用这些用于对比的对照。PopGen人口对照来自德国西北，并且是通过官方人口注册鉴定的健康个体(Krawczak et al 2006)。该研究中所使用的样品包括分布于三个年龄组(18-30、30-50及50-80岁)的数目几乎相等的男性和女性。明斯特繁殖对照组为来自机构注册的匿名个体(Rogenhofer,等2012)，他们都具有成功的妊娠，没有文件记录的习惯流产史。

实施例4、患者基因型频率

在314位患者及157对夫妇中(由于4位男性(无精子2，少精1，65岁1)；2位女性：1位早期绝经，1位绝经，因此，6位患者未被基因定型)，综合患者携带率为25％(N＝78)，与女性(24％N＝37)和男性的(27％N＝41)几率类似。然而，在这些夫妻中，有高M2携带率(44％；n＝69)(规定为一方或双方都为M2携带者或纯合基因型)。在这些测试患者中，没有阳性抗磷脂指征(APS)。在这些携带者中，夫妻分亚组为，其中，一方为非携带者，一方为纯合型的(4％N＝7)；或者双方都是携带者(4％N＝6)；或者一方是携带者，一方为纯合型的(2％N＝3)。有9个女性纯合型，和一位男性和女性患者的基因型分布如表1所示。

表1男性/女性患者的基因型分布

基因型N M1M2指ANZXA5基因启动子单倍体型：

N＝标准/野生型

M1包括262A→C及288T→C(6个杂合型)

M2包括243G→A、262A→C、288T→C和337G→A(16个杂合型)

表2显示了男性和女性中分别出现的HWE预测的基因型以及观察到的基因型频率。在男性中，无显著的HWE偏差，但是在女性中偏差显著(p＝0.005)。将分析限制到英国和爱尔兰种族分析给出同样的结果(数据未显示)。

表2男性和女性中观察的和HWE预测的基因型统计，经马尔可夫蒙特卡罗(MCMC)计算的用于检测偏离HWE的估计p值

NS＝非统计显著

注释数值为数字(百分率)

在本研究中包括的IVF夫妻和两个不同的对照组的ANXA5基因启动子单倍体型基因型频率如表3所示。

注释数值为数字(百分率)

预测值对应于HWE所预测的值

与明斯特对照组(女性)和PopGen对照组(男性和女性)相比，M2单倍体型在男性和女性IVF患者中都丰富。

表4显示了患者之前的IVF、IUI及妊娠史。之前失败IVF周期的数目在一个纯合型的和一个非携带的夫妻(平均3.1的以往IVF)和南方为携带者的夫妻(平均2.1的以IVF)中最高。

表4患者以往IVF和IUI周期及妊娠史

*妊娠流产

标注值为数字、(平均值)或(平均值，范围)

所有携带者/纯合组(范围0-4)的过往活产率非常低，非携带者夫妻(N＝13)观察到稍高的比率。在携带者夫妻中，在17例报道了流产日期的流产中，患者最近报道的流产平均发生在10.1周(范围是5-23周)。在非携带者夫妻中，在53例流产的25例中，流产(N＝53)平均发生在9周。

实施例5、男性不育和M2携带频率

157位男性中的63位(40％)具有不育相关因子。在本组中携带几率为27％(N＝17)，整体而言，少精是最常见的原因(40％N＝不孕男性中的25位)，之后为少弱精(OATS-13％，N＝不孕男性中的8位)。

在157位男性患者中，93位(57％)具有除不明原因或男性原因的不孕。此外，93为具有该诊断中的23名(27％)患者也发现为M2携带者。不明原因的卵巢储备差/排卵失败经常与年龄相关，加之PCOS是在两组不孕中最常引用的原因。然而，男性不育在非携带者组的21％中被引为主要的不孕原因，但是在携带M2单倍体型的37名携带者中仅1名被标记为不孕原因。17个PCOS实例(35％)中的6个也是携带者。

实施例6、不明原因不孕和M2携带频率

104名患有(33％)显示为不明原因的不孕。其中，38位患者(37％)鉴定为M2携带者；25为男性(24％)和13位女性(13％)。有9个女性纯合型(所有女性中的6％)。也有一位49岁的男性纯合型，尽管其女性配偶具有2次导致流产的IVF周期，但是该对夫妻没有其他已知的确诊。

实施例7、主要结果

在这组患者中，单倍体型M2/ANXA5的携带率为44％，代表非常高的发病率。此外，单倍体型M2/ANXA5的携带率在男性不育患者中为27％，在女性不育患者中为27％，在以及过往不明原因不育患者中为37％。在本研究携带M2单倍体型的患者中，没有检测到APS阳性。在RPL组中为未见、在对照组中几乎未见M1/M1基因型。在习惯性流产组中未见M1/M2基因型，对照组中总共仅8例见此基因型，在该IVF组中仅见4例此基因型。然而，M2纯合型女性患者的发病率在该组中提供了6％，记录到一位男性M2纯合型。

女性纯合型频率比其它对照组高3倍，是习惯性流产女性组的两倍(Rogenhofer等2012)。

我们证实了PopGen和明斯特对照组的应用，如Nelis等(2009)所总结，即可以鉴定四个地区1)中、西欧，2)波罗的海国家、波兰及西俄，3)芬兰，以及4)意大利，如果不纠正群体间差异，则将影响疾病基因相关的显著性。来自德国、意大利南部和保加利亚的——三个地区的代表——公开研究的对照组发病率都已显示M2单倍体型频率的一致性。大多数IVF患者为白种英国人(77％男性，75％女性)。起相应于中、西欧地区。我们没有芬兰患者，并且利用或未利用印度/巴基斯坦或其它亚组的分析在女性中显示显著的HWE偏离，但是由于丰富的M2纯合型，在男性患者中未显示偏离。

在种族方面，我们在除印度和巴基斯坦患者以外的包括犹太、土耳其和中东患者的广泛种族中发现M2携带者。因为发病率和病理方面可能存在显著差异，从而携带率的可能差异和在这些种族中的临床影响进一步证明了调研。欧洲高加索人群的发病率已确定(Markoff et al,2011)，并且Myamura等(2011)报道，单倍体型的携带在日本人群中导致与中欧人群所观察相似的习惯性流产风险；但是，人群发病率较低(5.5VS15％)。因此，除了白种欧洲人及日本人以外的不同种族的进一步研究被证实。

因为重点往往是管理及提供健康的配子和胚胎，选择最优胚胎存活率，以及确保能够维持妊娠的健康子宫，因此在IVF实践中，任何对胚胎凝聚的损失都是非常重要的。然而，尽管流产最大的单因被认为是非整倍体胚胎，但是其它因素也是非常显著的，尤其对于RPL，其中，甚至在IVF后的整体胚胎转移后，其仍然是个问题。相对最近发现的遗传因子M2/ANXA5正在通过对胚胎抗凝血的副作用单独影响胎盘功能，并且，如果未检测到，则否定了用于通过IVF建立健康妊娠的相当多的工作和导致的花费。在我们的研究中，男性和女性之间等量分布了相当多的患者，其中，M2携带或者是已确定的附加因素，或者在许多未有其它不孕诊断的患者中出现。有越来越多的携带M2/ANXA5单倍体型对母亲健康有风险的证据(RPL,VTE,PE,GH APS:Tiscia et al,2009；Grandone et al,2010；Bogdanova et al,2012)。Bogdanova等(2012)推测携带M2/ANXA5单倍体型导致暴露的磷脂酰丝氨酸表面的ANXA5覆盖减小，这种减小的防护将使凝聚因子竞争磷脂结合。其次，磷脂抗原因子将会更大的暴露，这会导致aPA形成，反过来进一步干扰ANXA5防护。Sifakis等(2010)证明mRNA表达在标准和FGR妊娠之间的显著差异，但是在ANXA5蛋白水平没有差异。然而，作者没有确定其样品的M2/ANXA5基因型。

此外，在IVF治疗前，ANXA5携带患者的亚组鉴定是重要的，因为本研究可知这些携带者的IVF周期失败率高于非携带者。我们在此报道了单一男性纯合型患者，其没有其他不孕诊断，其女性配偶以前已有2次失败的IVF周期。因此，鉴定或治疗自身为M2携带者、或其男性配偶为携带者的女性患者可以有助于通过减轻对胚胎抗凝聚的副作用而减少小于胎龄(SGA)的发病率。

由于缺陷是胚胎传递的，并且影响胚胎抗凝血，并且风险与任何特定父母传输无关，即，如果传输是父亲或母亲的(或两者)，则可能胚胎诱导，因此，筛查患IVF的双方是否携带M2/ANXA5单倍体型对于以其自己的配子进行治疗的夫妇应被认为是常规、早期的诊断工作。M2单倍体型似乎是导致妊娠失败的附加独立因子。

实施例8、以LMWH治疗的M2单倍体型患者的初始结果数据

检测患者的M2单倍体型，并且分为两组。一组为“治疗组”，包括63名患者。这些患者都检测了M2单倍体携带者，并且在胚胎转移的同时进行LMWH治疗。第二组为“未治疗组”，包括62名患者，都检测了M2单倍体携带者，但未进行LMWH治疗。对比治疗组和未治疗组，未治疗组(35岁)比治疗组(36.1岁)年轻一整岁，并且未治疗组(4.24)患不孕比治疗组(5.24)也少一整年。参见表5，此外，治疗组中的15名患者具有已知为“胚胎发育观察(embryoscope)”的时间推移胚胎培养，同时仅1名治疗组的患者具有“胚胎发育观察”。治疗组的15名患者中的7名也有时间推移胚胎培养过程至临床妊娠和活产。然而两组表现两种特征。首先，未治疗组具有0.38的过往流产平均值，治疗组具有0.52的过往流产平均值。其次，未治疗组的过往IVF周期均值为2.7，治疗组的过往IVF周期均值为2.6。甚至对于前述的最小差异和密切相似性，与全球30～35％平均值相比，治疗组具有38％的提高的活产率，同时未治疗组没有患者实现活产。

表5主要结果数据

因此，认为以抗凝血剂(有选LMWH)治疗的母亲，其中母亲或父亲为M2单倍体型携带者，将具有改进的临床妊娠率和/或改进的活产率。在优选实施例中，母亲在胚胎专一的同时、或转以后立即或及时被治疗。给予LMWH至少4周、8周、12周或16周。以如LMWH的抗凝血剂治疗能够增加临床妊娠的可能性，和/或降低流产率，因而增加活产的几率。我们的结果与Rodgers的结果直接对比。使用如LMWH的抗凝血剂的进一步治疗可以用于提高正进行体外受精的母亲的成功妊娠率，和/或活产率。

预计双方都是M2单倍体型携带者的患者在怀孕之前、同时和/或数周内最受益于如LMWH的抗凝血剂治疗。

表6

实施例9、以LMWH治疗的M2单倍体型患者的结果数据的统计分析

统计分析125名胚胎转移患者的最终结果数据，将这些患者分为2组；测试/治疗组63名患者(50.4％)，参照(或对照)组62人(49.6％)。最终的数据延伸上述结果用于期中分析。数据组不仅包括妊娠结果的信息，也记录总结患者的人口统计和治疗史的附加变量。这些数据组的分析集中在3种特定终点：活产；临床流产；以及成功的植入。

3种特定终点的限定如下。

活产终点为说明胚胎移植是否导致活产的双变量。活产终点的分析包括所有胚胎转移的患者。

临床流产为说明胚胎转移是否导致临床流产或活产的双变量。临床流产的分析仅包括那些到达临床妊娠阶段(即，超声波扫描检查到胎心率的情况)的患者。

对于每个胚胎转移的患者，一个、两个或三个胚胎移入患者体内。然后，植入发生率限定为检测到胎心率的数目除以转移的胚胎数目。在分析前，植入发生率转化为成功的植入终点。成功的植入终点为说明每个转移胚胎的植入是成功或失败(即，是否检测到胎心率)的双变量。在成功植入的分析中包括每个转移的胚胎。

除研究组(治疗/对照)外，也研究以下独立变量(患者地理分布和治疗史)，以确定独立变量之间，以及与上述限定的三种终点是否相关。

患者年龄

M2单倍体型结果(男性和女性)。获得患者(男性)及其配偶(女性)的M2单倍体型结果。以下分组标注由Fishel等(2014)应用，这些患者被划分为：

双方携带者；

仅男性携带者；

仅女性携带者；

一个纯合型，一个携带者；以及

仅一个纯合型。

发现在“一个纯合型，一个携带者”(8个观测值)和“仅一个纯合型”(4个观测值)类别中患者很少，因此将这些患者再分组为单一纯合型类别(“仅一方纯合型，或者一个纯合型/一个携带者”)。

转移胚胎的数目。这些变量被分为2类：一类是那些具有1个转移胚胎的胚胎转移患者；一类是那些具有2个或3个转移胚胎的胚胎转移患者。

孵育器类型

不孕时间(年数)

过往IVF

周期数目：根据患者是否具有0、1、2、3或4或更多的过往IVF周期将该变量分为5类。

过往流产的数目：根据患者是否具有0、1、2或更多的过往流产将该变量分为3类。

胚胎转移：对于每个转移的胚胎，记录胚胎类型。这些胚胎记录为：桑葚胚、胚囊或转移细胞的数目。如果观察许多类别，则产生单一变量，将胚胎转移分为胚囊转移的胚胎转移，和非胚囊转移。由于在转移之内分属胚胎的胚囊转移是一直的，因此需要单一变量(无论转移的胚胎的数目)。

使用脂肪乳剂：在治疗组中国，33个胚胎转移与接受脂肪乳剂的患者相关。确定大多数情况，这些患者由于具有免疫问题而被给予脂肪乳剂，以及其更可能与妊娠结果相关。因此，将这些患者按照是否因免疫问题而以脂肪乳剂治疗分为两类。两名患者被鉴定因非临床原因接受脂肪乳剂，因而不包含在“因免疫问题以脂肪乳剂治疗”的类别。

捐赠卵子使用

对于每个终点，利用独立变量进行相关性的个体测试(经单变量回归模型)，以评估其作为结果的单独预测因子的统计学显著性。所有分析的三个终点为双变量。此时，适合逻辑回归模型，其使用逻辑变换以独立变量的线性函数表达结果(即活产)的可能性。

在单因素试验后，使用多重逻辑回归模型评估结果的独立变量的收集预测准确性。这可以实现研究组对具有每一结果的可能性的潜在影响的调查，并且也解释了(并预测影响)其它独立变量。

仅那些在单一变量分析中发现为统计学显著的变量(至少10％显著水平的让步比，即，要求观察到的影响是由于不到10％的唯一可能的概率)被考虑用于该多重变量模式的总结。

对于多重逻辑回归模型，使用反向逐步回归算法，其以包括所有从单一变量测试中鉴定为显著的独立变量的模型开始，然后将其从模型中连续移除，以确定提供最佳拟合的模型。使用可能性比率测试(具有5％显著水平，即，要求观察到的影响是由于不到5％的单一可能性的概率)确定模型拟合，确保仅对最终模型的性能有主要影响的变量被包含。

在125名具有胚胎转移记录的患者中，有34位在两个研究组都都被观察到。这意味着在研究中有的患者经历两次IVF，一次没有研究治疗，一次治疗。这些患者的多个妊娠结果并不是独立的，因而不能在统计模型中当作独立结果对待。为了解释数据的重复性特质(每个患者的多个观察值)，使用线性混合效应模型，包括对每个患者的随机影响，以模型化在其多重应答中的关联。

在许多实例中也鉴定到了分离。当可以通过独立变量分离二重结果时，在逻辑回归中发生分离。当分离正确时，发生完全分离，反之，当结果被分离到一定程度，例如，当对分类变量的一个因素的所有应答都具有相同结果时，发生拟完全分离(Heinze&Schemper,2002)。如以下所述，在该研究中，活产仅发生在治疗组的患者，并非是发生在对照组。因此，通过独立变量“研究组”分离双重结果“活产”。类似地，对照组中所有达到临床妊娠阶段的患者具有临床流产，因此通过独立变量“研究组”也分离了“临床流产”

当分离时，通过最大可能性拟合的标准逻辑回归模型能够产生无限的或偏见的预估。分离是逻辑回归的常见问题，并且样品大小越小、越多二分类变量、及越多极端的让步比，在其分布中有更大的不平衡则更可能发生。

有很多处理分析中的分离观点。首先，这些导致分离的情况可以从分析中被忽略。然而，此时，因为这意味着关于该重要独立变量的作用的信息本不存在，因此这样是不恰当的，并且由于该变量的影响无法调节其他独立变量的影响。此外，这意味着扔掉数据、减少模型的预测能力。

因此，两个其他的可选择方案是，Firth’s偏离减少，最大程度惩罚了逻辑回归(Fisher,1992,1993)，或Bayesian逻辑混合效应模型(Fong等2010；Zhao,等2006)。在该实例中，选择后者，因为，如上所述，Bayesian方法提供了更灵活的框架，不仅处理分离，而且包括模型中的随机效应，从而解释了一些患者的重复观测值。Firth’s逻辑回归模型不能包含随机效应。使用Bayesian逻辑混合效应模型确实要求指定固定和随机效应的先验分布。此时，由于没有其他可用信息，因此选择标准分布用于固定效应和随机效应的默认的扁平先验(Flat Priors)。

成功的植入终点并未显示任何被考虑的独立变量的分离。然而，出于与其他结果一致，Bayesian逻辑混合效应模型也用于该终点。此时，更标准的方法应是标准逻辑混合效应分析。使用该方法再次运行分析，并发现产生了与Bayesian模型一致的结果。

在统计软件包R版本3.1.1((R Core Team,2013)进行所有分析。blme包的bglmer功能用于执行Bayesian逻辑混合效应模型(Dorie,2014)。

活产率

如表7所示，在本研究中，125名记录的胚胎转移患者的妊娠结果划分为研究组。在125名记录的胚胎转移患者中，令人吃惊的是，在治疗组中25/63(39.7％)导致活产，而对照组(62人中)没有活产。数据显示，对对照组相比，估计治疗组患者的成功活产几率约高56倍(OR＝56.08；95％CI:4.95,635.64)(p＝0.0012)。

表7研究组中胚胎转移患者的妊娠结果

此外，与转移一个胚胎的胚胎转移患者相比，估计转移两个或多个胚胎的胚胎转移患者的活产可能性高2.7倍(OR＝2.69；95％CI:1.00,7.23)(p＝0.050)。

表8活产与转移的胚胎数目的交叉表，n(column％)

转移的胚胎数目	1	2/3
			活产患者	6(11.3)	19(26.4)
非活产患者	47(88.7)	53(73.6)
			总数	54(100)	72(100)

此外，过往IVF周期的数目与成功活产的几率正相关。与没有相比，估算具有两个过往周期的患者的几率高四倍(OR＝4.04；95％CI:0.89,18.37)(p＝0.0711)；与没有相比，估算具有两个过往周期的患者的几率高7.5倍(OR＝7.46,95％confidence interval:1.66,33.55)(p＝0.0088)。

表9活产比过往IVF周期的交叉表，n(column％)

此外，与没有相比，估计具有一个过往流产的患者的成功活产的几率高2.4倍(OR＝2.37,95％CI:0.91,6.15)(p＝0.0773)。

表10活产比过往流产的交叉表n(column％)

与未使用脂肪乳剂的患者相比，脂肪乳剂的使用(由于免疫问题)与3倍的成功活产几率相关(OR＝3.02,95％CI:1.19,7.64)(p＝0.0199)。如表11所示，与没有使用脂肪乳剂的患者的14.9％，使用脂肪乳剂(由于免疫问题)的患者的活产比例是35.5％。然而，所有这些使用脂肪乳剂的患者在治疗组中。如表11所示，仅看在治疗组中的患者，这些比例分别为35.5％，对43.8％。

表11

与未使用捐赠卵子的患者相比，捐赠卵子使用患者与4倍的成功活产几率相关(OR＝4.03,95％CI:0.93,17.46)(p＝0.0622)。

表12：活产对捐赠卵子使用的交叉表n(column％)

捐赠卵子使用	Yes	No
			活产患者	4(50.0)	21(17.9)
非活产患者	4(50.0)	96(82.1)
			总数	8(100)	117(100)

因此，数据表明，研究组(例如，在胚胎移植/植入时给予低分子量肝素治疗)对于活产是统计学显著的预测因子，与对照组的患者相比，预计研究组的活产几率高56倍(OR＝56.08；95％CI:4.95,635.64；p＝0.0012)。如果对照组的活产几率为1-89(即，p＝l/90＝l.ll％并且l-p＝89/90＝98.89％；给予模块统计的几率),OR＝56，则治疗组的活产几率为56倍，或接近1.59(即，p＝34.7/90＝38.6％，l-p＝55.3/90＝61.4％)。因此，对于导致成功妊娠的对照组中的每一妊娠，平均89个不活产，但是，对于导致成功妊娠的治疗组的每一妊娠，仅平均1.59不活产。

临床流产

在40个具有胚胎转移的达到立场妊娠阶段的患者(即通过超声波扫描检测到胎心跳)之中，12/12(100％)的对照组的患者导致临床流产，治疗组的比例为3/28(10.7％)。与对照组相比，估计治疗组患者的临床流产几率低0.01倍(即，99％)(OR＝0.010；95％CI:0.001,0.135)(p＝0.0005)。

表13与研究组相对的临床流产的交叉表n(column％)

研究组	治疗	对照
			活产患者	25(89.3)	0(0)
非活产患者	3(10.7)	12(100)
			总数	28(100)	12(100)

因此，数据表明，研究组(例如，给予低分子量肝素治疗)对于临床流产是统计学显著的预测因子，与对照组的患者相比，预计研究组的临床几率低0.01倍(即，99％)(OR＝0.010；95％CI:0.00079,0.135；p＝0.0005)。

成功植入

在199名胚胎转移患者中，36/104(34.6％)的治疗组的患者导致成功植入(检测到胎心率)，12/95(12.6％)的对照组的患者导致成功植入。因此，与对照组的患者相比，预计治疗组的胚胎移植患者的成功植入几率高4.1倍(OR＝4.08；95％CI:1.85,8.97；p＝0.0005)。

表14相对于研究组的成功植入的交叉表n(column％)

研究组	治疗	对照
			检测到胎心率的转移胚胎	36(34.6)	12(12.6)
未检测到胎心率的转移胚胎	68(65.4)	83(87.4)
			总数	104(100)	95(100)

因此，数据表明，研究组对于成功植入(即如果胚胎植入，检测到胎心率)是统计学显著的预测因子，与对照组的患者相比，预计研究组的成功植入几率约高4倍(OR＝4.08；95％CI:1.85,8.97；p＝0.0005)。

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Claims

1.治疗M2单倍体型妊娠的方法，包括：

a、鉴定M2单倍体型妊娠，其中，当生物学母亲或生物学父亲之一为ANXA5 M2单倍体型携带者时，所述M2单倍体型妊娠存在；

b、给予所述M2单倍型妊娠的母亲有效剂量的抗凝血剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物学母亲和所述生物学父亲都为ANXA5 M2单倍体型携带者。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在母亲怀孕后给予抗凝血剂。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在胚胎转移的同时或之后立即给予抗凝血剂。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在怀孕前给予抗凝血剂。

6.根据权利要求1-5其中任意所述的方法，其特征在于，所述抗凝血剂为LMWH。

7.根据权利要求1-6其中任意所述的方法，其特征在于，所述母亲正经历体外受精或宫内人工授精。

8.一种降低产科并发症的方法，包括：

b、给予所述M2单倍型妊娠的母亲有效剂量的抗凝血剂，其中，所述抗凝血剂降低产科并发症的风险。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物学母亲和所述生物学父亲都为ANXA5 M2单倍体型携带者。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在母亲怀孕后给予抗凝血剂。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在胚胎转移或宫内人工授精的同时给予抗凝血剂。

12.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在怀孕前给予抗凝血剂。

13.根据权利要求8-12其中任意所述的方法，其特征在于，所述抗凝血剂为LMWH。

14.根据权利要求8-13其中任意所述的方法，其特征在于，所述母亲正经历体外受精或宫内人工授精。

15.根据权利要求8-14其中任意所述的方法，其特征在于，所述产科并发症选自习惯性流产(RPL)、不孕、流产、体外受精(IVF)失败、IUI失败、植入失败、胎儿生长受限(FGR)、小于胎龄(SGA)新生儿、宫内胎死(IUFD),妊娠高血压(GH)、先兆子痫(PE)和/或静脉血栓栓塞(VTE)。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述不孕为不明原因的男性不育、不明原因的女性不育,不明来源的不孕。

17.确定M2单倍体型妊娠的方法，包括：

a、鉴定生物学母亲或生物学父亲的M2单倍体携带状态，其中，基于基因组分析确定所述鉴定；

b、记录所述生物学母亲和生物学父亲的M2单倍体携带状态；

c、如果所述生物学母亲或所述生物学父亲之一为ANXA5 M2单倍体型携带者，则报告是否存在M2单倍体型妊娠。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述生物学母亲和所述生物学父亲都为ANXA5 M2单倍体型携带者。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述母亲正经历体外受精或IUI。

20.根据权利要求17-19其中任意所述的方法，其特征在于，所述鉴定使用PCR或测序技术。

21.根据权利要求17-20其中任意所述的方法，其特征在于，所述鉴定使用IHG技术。

22.根据权利要求17-21其中任意所述的方法，其特征在于，使用荧光分子检测ANXA5M2单倍体型。

23.根据权利要求17-22其中任意所述的方法，其特征在于，检测方法使用固相。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述固相为珠子或板。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述固相包括塑料、硅、玻璃、聚苯乙烯、铝、钢、铁、铜、镍、银、金、纤维素或尼龙。

26.根据权利要求17-25其中任意所述的方法，其特征在于，使用具有至少15个核苷酸的寡核苷酸检测ANXA5 M2单倍体型。

27.根据权利要求17-26其中任意所述的方法，其特征在于，所述方法使用新一代基因测序技术。

28.一种增加妊娠率的方法，包括：

b、给予所述M2单倍型妊娠的母亲有效剂量的抗凝血剂。

29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述生物学母亲和所述生物学父亲都为ANXA5 M2单倍体型携带者。

30.根据权利要求28或29所述的方法，其特征在于，在母亲妊娠后不久给予抗凝血剂。

31.根据权利要求28或29所述的方法，其特征在于，在胚胎移植或IUI的同时给予抗凝血剂。

32.根据权利要求28或29所述的方法，其特征在于，在妊娠前给予抗凝血剂。

33.根据权利要求28-32其中任意所述的方法，其特征在于，所述抗凝血剂为LMWH。

34.根据权利要求28-32其中任意所述的方法，其特征在于，所述母亲正经历体外受精或IUI。

35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，母亲具有产科并发症的增加风险，所述产科并发症选自习惯性流产(RPL)、不孕、流产、体外受精(IVF)失败、IUI失败、植入失败、胎儿生长受限(FGR)、小于胎龄(SGA)新生儿、宫内胎死(IUFD),妊娠高血压(GH)、先兆子痫(PE)和/或静脉血栓栓塞(VTE)。

36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述不孕为不明原因的男性不育、不明原因的女性不育,不明来源的不孕。

37.根据权利要求1-16或28-36其中任意所述的方法，其特征在于，至少给予4周的抗凝血剂治疗有效剂量。

38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，至少给予8周抗凝血剂。

39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，至少给予12周抗凝血剂。

40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，至少给予16周抗凝血剂。

41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，直至母亲生产婴儿，一直给予抗凝血剂。

42.根据权利要求1-16或28-41其中任意所述的方法，其特征在于，抗凝血剂的治疗有效剂量对提高植入率是有效的。

43.根据权利要求1-16或28-41其中任意所述的方法，其特征在于，抗凝血剂的治疗有效剂量对降低检测到胎心跳之前的流产率是有效的。