CN106645514A - 钩吻素子的肝微粒体代谢分析及相关动物的毒代动力学 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种钩吻素子的肝微粒体代谢分析及相关动物的毒代动力学。本发明方法主要包括以下步骤：1.KM肝微粒体代谢分析，包括以下步骤：（1）肝微粒体孵育体系建立；（2）样本处理；（3）样本分析，通过比较KM在各种实验动物肝微粒体的代谢产物分布特点及各种属肝微粒体对KM代谢的动力学特征，进行KM人类相关动物的选择。2. KM恒河猴急性毒性伴随毒代动力学，包括以下步骤：（1）染毒实验动物的血液样本采集及血浆样本处理；（2）定量检测；（3）血药浓度数据分析。本发明优点在于通过KM在各种实验动物体外肝微粒体代谢分析，选择人类相关动物进行相伴毒代动力学研究，以提高实验动物毒性评价对临床的可预测性。
Description
技术领域
本发明是涉及生物化学分析及生物代谢领域，具体涉及KM的肝微粒体代谢分析及相关动物急性毒性伴随毒代动力学，为后期临床研究提供科学依据。
背景技术
钩吻素子（koumine，KM）是马钱科植物胡蔓藤钩吻的主要活性生物碱中含量最高的成分，研究提示其具有高效低毒的作用，具有抗肿瘤、镇痛镇静、抗焦虑、治疗类风湿关节炎等多种药理作用，并获得了KM治疗慢性疼痛及类风湿性关节炎的国家专利，因此就目前已开展的研究显示了KM具有巨大的药效学应用前景。
前期本课题组发明的“高速逆流色谱法从钩吻中分离制备钩吻生物碱单体的方法”（已授权，授权公告号: CN101323618B），该发明提供了高效、速效获得钩吻素子的途径，为钩吻素子的产业化应用奠定基础。
非临床药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要作用，通过阐明药代动力学特征，为药物制剂学研究和评价提供重要依据，在药效学和毒理学评价中有助于深入阐明药物作用机制以及为实验方案设计提供参考依据，尚能为设计和优化临床试验方案提供有关参考信息。新药研究开发是一个包括动物和人体安全性评价的逐步推进的过程，非临床安全性评价可以确定潜在的毒性靶器官和毒性反应出现的时间、性质、程度、及其可逆性；确定临床监测的安全性参数；推算人体使用等的安全起始剂量以及随后的剂量递增方案等。而毒代动力学研究是药物非临床安全性评价的重要内容，可解释药物毒性试验结果,发现毒性的剂量水平和时程的关系,提高毒性研究资料的价值。
但钩吻生物碱的毒效作用存在明显的种属差异，如，钩吻对人有剧毒，而对猪和羊等动物却有益。有研究认为：导致这种差异是猪羊等动物对钩吻有良好的耐受性，含有对抗、抑制、转化或者降解这种毒素的酶，即可能与存在生物代谢方面的差异有关。因此，仅以常规动物进行药物的代谢研究不能最真实的反映药物的代谢情况，即无法为临床研究提供可靠的参考依据。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的提供一种钩吻素子的肝微粒体代谢分析及相关动物的毒代动力学测试方法，是通过体外代谢研究判断和选择KM人类相关动物，再以相关动物为实验动物进行伴随毒代动力学研究，以提高实验动物毒性评价对临床的可预测性，为临床研究提供更为可靠的参考依据。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
KM的肝微粒体代谢分析，包括以下步骤：
（1）肝微粒体孵育体系建立
在EP管中依次加入相应种属的肝微粒体及所需浓度的KM、PBS，置37 ℃恒温振荡箱中预孵育5 min，再加入预孵育的NADPH溶液20 μL启动反应，置37 ℃恒温振荡箱中孵育一定时间后立即加入800μL的纯冰乙腈终止反应并沉淀蛋白；
通过对孵育时间、肝微粒体蛋白含量和KM浓度等条件的考察优化KM与肝微粒体的反应体系，在反应体系的优化反应条件下，测定不同浓度KM在各种属肝微粒体反应体系中随孵育时间的浓度变化；所用KM浓度范围为0.05~1.25 g·L-1，孵育时间范围为0.25~4 h；
（2）样本处理
将上述步骤（1）的孵育体系涡旋3 min 混匀，15 000 r·min-1，4 ℃下离心15 min 后取上清液 700 μL；离心获得的沉淀再加700 μL冰乙腈进行同法萃取，合并萃取液，氮气浓缩仪中挥干后，用100 μL 25% 乙腈复溶，涡旋3 min 后15 000 r·min-1，4 ℃下离心15min，过滤，取上清液进样；
（3）样本分析
采用UPLC进行待测样品测定，通过比较KM在各种属肝微粒体的代谢产物分布特点以及根据随行标准曲线计算各时间点KM的浓度，按照底物消除法计算米氏常数Km、最大反应速率Vmax和半衰期T1/2，具体条件如下：
色谱条件：安捷伦PoroshellHPH-C18 液相色谱柱；柱温：30 ℃；流动相：乙腈-0.1% 正丁胺水溶液，乙腈、0.1% 正丁胺水溶液体积比为25∶75；检测器：DAD 检测器；进样量：1 μL；流速：0.3mL·min-1；检测波长：256 nm。
所述的优化反应条件为各种属肝微粒体反应体系的最佳孵育时间分别为人和小型猪4 h，SD 大鼠和比格犬3 h，恒河猴2 h；肝微粒体最佳浓度均为0.5 g·L-1；KM反应浓度为0.25 g·L-1。
所述色谱柱型号为安捷伦PoroshellHPH-C18的2.1 mm×100 mm，2.7 μm的液相色谱柱。
所述肝微粒体为人、小型猪、SD大鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体。
KM的相关动物伴随毒代动力学研究，包括以下步骤：
（1）染毒实验动物的血液样本采集及血浆样本处理
染毒实验动物采血后的血浆样本解冻后，取血浆100 µL，置于2 mL离心管中，加入75ng·mL-1的钩吻素甲内标10 µL，涡旋混合，加入萃取剂乙酸乙酯400 µL，涡旋混合3 min后12000 r·min-1，4 ℃下离心5 min，取上清有机相于另一离心管，于60 ℃下氮吹仪挥干，残留物于100 µL流动相复溶，涡旋混合3 min后12000 r·min-1，4 ℃下离心10 min，取上清液经0.22 µm过滤，吸取5 µL待测样品进行LC-MS/MS分析；
（2）定量检测
采用HPLC-MS/MS对步骤（1）的待测样品进行定量测定，具体条件如下：
色谱条件：仪器：Agilent 1200型HPLC；色谱柱：Gemini C18 液相色谱柱；流动相：甲醇-水-氨水，甲醇、水、氨水体积比为49:51:0.00625；流速：0.2 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；
质谱条件：仪器：Agilent 6410B LC/MS三重串联四极杆；离子源：正离子模式ESI；干燥气流速：10 L/min；干燥气温度：350 ℃；喷雾气：25 psi；Vcap：3500 V；KM：碰撞诱导解离电压140 V、碰撞能量56 V 、MRM离子307.2→180.2、驻留时间200 ms ；GM：碰撞诱导解离电压135 V、碰撞能量25 V 、MRM离子323.2→236.1、驻留时间200 ms；
（3）血药浓度数据分析
测定KM血药浓度，用DAS 3.0软件计算染毒实验动物的毒代动力学参数。
所述KM人类相关动物为恒河猴。
所述色谱柱型号为Gemini 5μ C18的110A，50×2.0 mm的液相色谱柱。
所述染毒实验动物的血液样本采集步骤为：取3~4岁恒河猴8只，分为阴性对照组和给药组，每组动物4只，雌雄各半，采用累积剂量法进行急性毒性试验，每天鼻饲给予一个剂量，给药顺序按5、10、20、40、80mg·kg−1由低剂量往高剂量连续5天逐天给药，给药容量为5 mL·kg−1，于给药第一天及第四天给药前及给药后5、20、60、120、240、480、1440 min采血进行伴随毒代动力学研究。
本发明的有益效果是：
通过前期体外肝微粒体温孵试验，比较了KM的肝微粒体酶代谢过程在人与实验动物之间的相似性和差异性，可以判断何种动物为人类相关动物，在伴随毒代动力学研究中选择相关动物作为实验动物进行测试，以提高实验动物毒性评价对临床的可预测性。
附图说明
图1为反应条件优化：KM代谢曲线（A、B 上半部分）和主要代谢产物生成曲线（C 及A、B 下半部分）。
图2为KM在各种属肝微粒体代谢的UPLC 图谱（λ=256 nm），图中：肝微粒体浓度：0.5 g·L-1；KM 浓度：0.25 g·L-1；孵育时间：人和猪4 h、大鼠和犬3 h、猴2 h；Ⅰ~Ⅸ：代谢物按保留时间先后顺序编号。
图3为KM在各种属肝微粒体代谢产物构成比（A）及相对生成比率（B），图中：A： 代谢物/ 所有代谢物×100%；B： 代谢物 / KM（0h）×100%。
图4为UPLC 全波长扫描图谱（λ=190 ～ 400 nm），图中的A：人肝微粒体（humanliver microsome）； B：钩吻素子（koumine）； C：钩吻素子与人肝微粒体共孵育（koumineincubated with human liver microsomes）；X-轴为保留时间（X-axis:retention time，min），Y-轴为吸光度（Y-axis: absorbance，mAU），Z-轴为波长（Z-axis: wavelength，nm）。
图5为剩余底物水平-时间曲线（A~E）及倒数作图法（F），图中：钩吻素子浓度（g·L-1，A~E）: ；
回归方程（F）: y=18.1394x+2.7562, r=0.9914 (HLM); y=4.3280x+4.5964, r=0.9397 (PLM); y=2.3918x+0.4351, r=0.9972 (RLM); y=4.1924x-0.1986, r=0.9986(MLM); y=0.7733x+1.736, r=0.8126 (DLM). HLM,PLM, RLM, MLM, DLM: 分别为人、猪、大鼠、猴、犬肝微粒体。
图6为KM标准品TIC色谱图。
图7为GM标准品TIC色谱图。
图8为恒河猴给药后血浆样品MRM色谱图，图中的A：GM；B：KM。
具体实施方式
实施例1 KM的肝微粒体代谢分析
采用超高效液相色谱法（UPLC）比较KM在各种属肝微粒体的代谢产物分布特点及各种属肝微粒体对KM代谢的动力学特征，进行KM人类相关动物的判断。
1 实验材料
1.1肝微粒体
各种属肝微粒体均购自瑞德肝脏疾病研究（上海）有限公司，蛋白含量20g·L-1 ，批号分别为：SUBK（人），RUIB（雄性小型猪），BDVH（雄性SD大鼠），AWWJ（雄性比格犬）和GPIU（雌性恒河猴），-80℃保存。
1.2 试药和试剂
1)钩吻素子盐酸盐，白色粉末，批号201310，纯度99%，福建医科大学药学院提供 。
2)PBS（粉末），0.01M（2L/袋），pH 7.2-7.4，批号1225F022，北京索莱宝科技有限公司，4℃保存。
3)NADPH粉末，批号509D0115，北京索莱宝科技有限公司，4℃保存。
4)乙腈，批号JA032030，默克公司，色谱纯。
5)甲醇，批号I766807506，默克公司，色谱纯。
1.3 仪器
1)Agilent 1290型UPLC工作系统，Agilent公司，美国。
2)Agilent Poroshell HPH-C18液相色谱柱（2.1mm×100mm，2.7μm），Agilent公司，美国。
3)THZ—98AB型恒温振荡箱，上海一恒科学仪器有限公司。
4)HeraeusMultifuge X1R型台式低温离心机，赛默飞世尔科技有限公司。
5)BT25S型精密天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
6)ORION 3 STAR型 pH计，赛默飞世尔科技有限公司。
7)XH—C型漩涡混合器，金坛市国旺实验仪器厂。
8)HAC—I型自动氮气浓缩仪，天津市恒奥科技发展有限公司。
9)UXF30086V超低温冰箱，赛默飞世尔科技有限公司。
10)DW25L262医用低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司。
2 方法
2.1 供试品和试剂的配制
KM溶液以 PBS 溶解，配制成5 g·L-1的母液用于肝微粒体孵育试验；PBS 以超纯水溶解；NADPH 溶液以PBS 溶解，配制成10 mmol·L-1。
2.2 分析条件建立
2.2.1 温孵条件 温孵总体积为200 μL，量取5 μL肝微粒体、10 μL 钩吻素子和一定量PBS 加入 EP 管中，置37 ℃ 恒温振荡箱中预孵育5min，再加入预孵育的 NADPH（为辅酶）溶液20 μL启动反应，置37 ℃ 恒温振荡箱孵育一定时间后加入800 μL的纯冰乙腈终止反应并沉淀蛋白。
KM的酶促反应动力学是根据优化反应条件，肝微粒体浓度为0.5g·L-1下，测定不同浓度KM在各种属肝微粒体反应体系中随孵育时间的浓度变化。KM为0.05、0.1、0.25、0.625、1.25 g·L-1，孵育时间为0.25、0.5、1、1.5、2、3、4 h（人和猪4 h，大鼠和犬3 h，猴2h）。
2.2.2 样品处理 将上述温孵体系涡旋3 min 混匀，离心（15 000 r·min-1，4 ℃）15 min 后取上清液 700μL。沉淀再加700 μL 冰乙腈进行同法萃取，合并萃取液，氮气浓缩仪中挥干后，用100 μL 25%乙腈复溶，涡旋3 min 后离心（15 000 r·min-1，4 ℃）15 min，过滤，取上清进样。
2.2.3 色谱条件 通过比较理论塔板数、分离情况及峰面积等指标确定色谱条件：安捷伦PoroshellHPH-C18 液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；柱温：30 ℃；流动相：乙腈：0.1 % 正丁胺水溶液（25∶75）；检测器：DAD 检测器；进样量：1 μL； 流速：0.3mL·min-1；检测波长：256 nm。
2.3 KM在不同种属微粒体中反应条件的优化
通过对孵育时间、肝微粒体蛋白含量和KM浓度等条件的考察优化KM与肝微粒体的反应体系，实验设3 复管，重复1 次。
2.3.1 孵育时间 KM 0.25 g·L-1、肝微粒体0.5g·L-1 条件下，观察各种属肝微粒体反应体系中不同孵育时间对KM代谢的影响。结果表明，随孵育时间的延长，KM峰面积逐渐减小，代谢物Ⅴ峰面积逐渐增大，在一定时间后变化曲线趋于平坦（见图1中的A）。据此，各种属微粒体反应体系的最佳孵育时间分别为：人和小型猪4 h，SD 大鼠和比格犬3 h，恒河猴2 h。
2.3.2 肝微粒体浓度 KM 0.25 g·L-1、优化确定的孵育时间下，观察反应体系中不同肝微粒体浓度对KM代谢的影响。结果表明，随着肝微粒体浓度的增高，KM的代谢增加，当各种属肝微粒体浓度超过0.5 g·L-1 时，KM的降解和代谢物Ⅴ的生成变化曲线趋于平坦（见图1中的B），即各种属肝微粒体的最佳浓度均为0.5 g·L-1。
2.3.3 KM浓度 采用优化确定的肝微粒体浓度和孵育时间，观察不同KM浓度在反应体系中代谢的变化。结果表明主要代谢产物峰面积随着KM浓度的增高而增大，0.1 ～0.625 g·L-1（恒河猴和比格犬）、0.1 ～ 1.25 g·L-1（人、小型猪和SD 大鼠）范围内呈线性关系（见图1中的C），故选择KM反应浓度为0.25 g·L-1。
3 结果
3.1 KM在人与各动物种属肝微粒体的代谢产物分布特点
3.1.1 代谢产物分布 在相应优化孵育条件下，比较KM在人与各种属实验动物肝微粒体代谢后其代谢产物分布状况（见图2 及图3中的A），代谢物按其保留时间的先后顺序以罗马数字编号。KM在人和小型猪肝微粒体可检测到2 个代谢产物，在其他种属则有多个代谢产物，但均以代谢物Ⅴ峰面积最大。尤其是在人、SD 大鼠、恒河猴肝微粒体中，代谢物Ⅴ占所有代谢物的峰面积百分比分别为97.73%、89.53%和90.40%；小型猪代谢物Ⅴ占58.09%，代谢物Ⅰ占41.91%；比格犬代谢物Ⅴ占79.06%，代谢物Ⅰ和Ⅷ分别为6.69%和7.35%；其他代谢产物均在3%以下。
3.1.2 全波长扫描 采用优化反应条件处理和进行连续波长（190 ～ 400 nm）扫描，得到各种属肝微粒体中KM及其代谢产物的分离图谱，显示连续波长下各成分的构成和分布，图4 为人肝微粒体反应图谱及其对照，表明检测波长256 nm 下可代表所有代谢产物的分布情况，图4中的A：人肝微粒体（human liver microsome）；图4中的 B：钩吻素子（koumine）；图4中的 C：钩吻素子与人肝微粒体共孵育（koumine incubated with humanliver microsomes）；X-轴为保留时间（X-axis:retention time，min），Y-轴为吸光度（Y-axis: absorbance，mAU），Z-轴为波长（Z-axis: wavelength，nm）。
3.2 不同种属肝微粒体对KM代谢的相对速率和代谢量
在优化的孵育条件下，比较不同种属肝微粒体对KM代谢随孵育时间的变化，实验设3复管，重复一次。以KM线性消除段斜率计算代谢速率常数k e（见表1），可见不同种属的代谢速率有一定差异，其快慢顺序为：恒河猴、比格犬、SD 大鼠、小型猪、人。计算各种属微粒体中反应完全时KM的相对降解量（KM峰面积减少值占初始KM峰面积值的百分比）和代谢物相对生成量（平衡时代谢产物峰面积占初始KM峰面积比例），可见在不同种属肝微粒体中KM的相对代谢量有一定差异（见表1）。相对降解量在人最低，仅代谢22.28 %，小型猪、SD 大鼠、比格犬、恒河猴分别为33.38%、43.22%、48.54 %和47.38 %；以代谢物Ⅴ相对生成量计，人、小型猪、SD 大鼠、比格犬、恒河猴分别为17.68%、16.92%（另：代谢物Ⅰ为12.20%）、35.18%、34.49%和41.59%（见图3B）。
3.3 KM的酶动力学参数测定
根据不同浓度钩吻素子在各种属肝微粒体反应体系的代谢随孵育时间的浓度变化曲线（图5中的A~E），图中：钩吻素子浓度（g·L-1，A~E）:；回归方程（F）: y=18.1394x+2.7562, r=0.9914 (HLM); y=4.3280x+4.5964, r=0.9397(PLM); y=2.3918x+0.4351, r=0.9972 (RLM); y=4.1924x-0.1986, r=0.9986 (MLM); y=0.7733x+1.736, r=0.8126 (DLM). HLM,PLM, RLM, MLM, DLM: 分别为人、猪、大鼠、猴、犬肝微粒体，计算相应底物浓度下的消耗常数kdep，可见kdep值表现为浓度依赖关系，再以不同底物浓度的kdep值的倒数对底物浓度（S）作图，进行倒数法直线回归（图5中的F），计算K m、V max和T 1/2，结果见表2。
综上所述，KM在人与SD大鼠、恒河猴、比格犬肝微粒体体外代谢的主要代谢产物一致，但是代谢产物的生成量、代谢速率等存在着一定的种属差异。通过比较KM在人和多种实验动物的酶促反应动力学结果，可见猴的K m值最小，即KM与猴的亲和力最大，与大鼠、人的亲和力居中，与猪、犬的亲和力较小；比较V max、T 1/2和CL int 值可见，KM在人、猪的代谢较慢、肝清除率较低，在猴、大鼠、犬的代谢较快、肝清除率较高。表明KM在人与不同实验动物种属肝微粒体中的酶促反应动力学特征有较明显差异，在应用实验动物进行体内外代谢研究时，应考虑其与人之间的相似性和差异的存在。因此在KM的体内代谢研究中可考虑采用这些动物种属，但也应考虑到它们与人在KM代谢差异的存在，将这些动物的体内外试验结果外推到人时应关注其差异。
表1 钩吻素子在各种属肝微粒体的代谢（n=3）
Tab. 1 Metabolism of koumine incubation with liver microsomes in variousspecies（n=3）
注（Note）：降解率（degradation ratio）=（ KM(0h)－ KM）/ KM(0h)×100%；ke：代谢速率常数（elimination rate constant）；代谢物Ⅴ生成比率（relative pecent of themetabolite Ⅴ， Ⅴ/ KM(0h)×100%；：平均峰面积（average peak area）；*；代谢物Ⅰ（metaboliteⅠ）。
表2 钩吻素子在不同种属肝微粒体的酶动力学参数
Tab. 2 Enzyme kinetic parameters of koumine incubation with livermicrosomes of various species（n=3 ,±s）
与HLM 比较， *：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。
实施例2 KM恒河猴急性毒性伴随毒代动力学
1 实验材料
1.1 动物
普通级恒河猴由福建省人口和计划生育科学技术研究所提供，生产许可证号：SCXK（闽）2010-0002。8只，雌雄各半，年龄3～4岁，体重3.59～4.70kg。
1.2 试药和试剂
1)钩吻素子盐酸盐（KM），白色粉末，批号201310，纯度99%，福建医科大学药学院提供，4℃保存。
2)内标物（IS）：钩吻素甲（GM），批号MUST-16042112，纯度99.75%，成都曼思特生物科技有限公司，4℃保存。
3)甲醇，批号I512907948，德国默克公司，色谱纯。
4)乙酸乙酯，批号I807568601，德国默克公司，色谱纯。
5)氨水，批号20100406，天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯。
6)蒸馏水，购自娃哈哈有限公司。
1.3 仪器
1)Agilent 1200 型HPLC，Agilent 公司，美国。
2)Agilent G6410B 三重串联四级杆质谱仪，Agilent 公司，美国。
3)Gemini 5μ C18 液相色谱柱（110A，50×2.0 mm），菲罗门公司，美国。
4)HeraeusMultifuge X1R 型台式低温离心机，赛默飞世尔科技有限公司。
5)BT25S 型精密天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
6)XH—C 型漩涡混合器，金坛市国旺实验仪器厂。
7)HAI—I 型自动氮气浓缩仪，天津市恒奥科技发展有限公司。
8)UXF30086V 超低温冰箱，赛默飞世尔科技有限公司。
9)DW25L262 医用低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司。
10)RPR1204V 实验室冰箱，赛默飞世尔科技有限公司。
2 方法
2.1 动物实验
2.1.1 动物分组
采用随机区组法，动物按体重随机分为2组，每组4只，雌雄各半。分为对照组和给药组。
2.1.2 给药方法
采用累积剂量法每天鼻饲给予一个剂量，给药顺序由低剂量往高剂量(5、10、20、40、80mg·kg−1)连续5天逐天给药，给药容量为5 mL·kg−1,末次给药后连续观察14天。
2.1.3 采血方案
于给药第一天及第四天给药前及给药后5、20、60、120、240、480、1440 min采血进行伴随毒代动力学研究。
2.1.4 毒性试验检测指标
临床观察、心电图、血液学指标、血液生化指标、尿液检查、病理学检查。
2.2 内标（钩吻素甲，GM）标准储备液及标准溶液配制
精密称取GM标准品5.30 mg，至于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.530 mg·mL-1的储备液，-20 ℃冰箱保存。以此为母液，用流动相稀释成浓度为75 ng·mL-1的标准内标溶液，4 ℃保存待用。
2.3 色谱条件
仪器：Agilent 1200型HPLC；色谱柱：Gemini 5μ C18 液相色谱柱（110A，50×2.0 mm）；流动相：甲醇-水-氨水（49:51:0.00625）；流速：0.2 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。
2.4 质谱条件
仪器：Agilent 6410B LC/MS三重串联四极杆；离子源：正离子模式ESI；干燥气流速：10L/min；干燥气温度：350 ℃；喷雾气：25 psi；Vcap：3500 V；KM：碰撞诱导解离电压140 V、碰撞能量56 V 、MRM离子307.2→180.2、驻留时间200 ms ；GM：碰撞诱导解离电压135 V、碰撞能量25 V 、MRM离子323.2→236.1、驻留时间200 ms。
2.5 血浆样品处理
血浆样品解冻后，取血浆100 µL，置于2 mL离心管中，加入内标（GM，75 ng·mL-1）10 µL，涡旋混合，加入萃取剂乙酸乙酯400 µL，涡旋混合3 min后离心（12000 r·min-1，4 ℃）5min，取上清有机相于另一离心管，于60 ℃下氮吹仪挥干，残留物于100 µL流动相复溶，涡旋混合3 min后离心（12000 r·min-1，4 ℃）10 min，取上清液经0.22 µm过滤，吸取5 µL进行LC-MS/MS分析。
3 结果
急性毒性试验中5、10、20、40mg·kg−1均未见明显毒性症状，80mg·kg−1剂量下见1只雌性动物给药后出现一过性足震颤及一过性头部震颤，血液学、血液生化等临床检验指标及大体解剖均未见明显异常。
伴随毒代动力学结果显示，40mg·kg−1与5mg·kg−1比较，雌性动物AUC 0-t、C max分别为15.0和8.7倍，雄性动物分别为24.2和10.6倍，即体内暴露量的递增倍数高于剂量增加倍数；同时T max呈延迟趋势（5mg·kg−1下60 min，40mg·kg−1下90~120 min），而T 1/2未见改变（在39.7~66.5 min）；此外，雌性动物的AUC 0-t、C max为雄性动物的1.59~2.57倍。可见钩吻素子高于理论治疗量时在恒河猴体内暴露量呈剂量依赖性增高，递增倍数高于剂量增加倍数，提示其在高剂量下可能有蓄积；雌性恒河猴体内暴露量明显高于雄性，雌性动物NOAEL为40mg·kg−1，雄性动物NOAEL大于80 mg·kg−1。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1. 一种KM的肝微粒体代谢分析，其特征在于：包括以下步骤：
（1）肝微粒体孵育体系建立
在EP管中依次加入相应种属的肝微粒体及所需浓度的KM、PBS，置37 ℃恒温振荡箱中预孵育5 min，再加入预孵育的NADPH溶液20 μL启动反应，置37 ℃恒温振荡箱中孵育一定时间后立即加入800μL的纯冰乙腈终止反应并沉淀蛋白；
通过对孵育时间、肝微粒体蛋白含量和KM浓度等条件的考察优化KM与肝微粒体的反应体系，在反应体系的优化反应条件下，测定不同浓度KM在各种属肝微粒体反应体系中随孵育时间的浓度变化；所用KM浓度范围为0.05~1.25 g·L-1，孵育时间范围为0.25~4 h；
（2）样本处理
将上述步骤（1）的孵育体系涡旋3 min 混匀，15 000 r·min-1，4 ℃下离心15 min 后取上清液 700 μL；离心获得的沉淀再加700 μL 冰乙腈进行同法萃取，合并萃取液，氮气浓缩仪中挥干后，用100 μL 25% 乙腈复溶，涡旋3 min 后15 000 r·min-1，4 ℃下离心15min，过滤，取上清液进样；
（3）样本分析
采用UPLC进行待测样品测定，通过比较KM在各种属肝微粒体的代谢产物分布特点以及根据随行标准曲线计算各时间点KM的浓度，按照底物消除法计算米氏常数Km、最大反应速率Vmax和半衰期T1/2，具体条件如下：
色谱条件：安捷伦PoroshellHPH-C18 液相色谱柱；柱温：30 ℃；流动相：乙腈-0.1% 正丁胺水溶液，乙腈、0.1% 正丁胺水溶液体积比为25∶75；检测器：DAD 检测器；进样量：1 μL；流速：0.3 mL·min-1；检测波长：256 nm。
2.根据权利要求1所述的KM的肝微粒体代谢分析,其特征在于：步骤（1）所述的优化反应条件为各种属肝微粒体反应体系的最佳孵育时间分别为人和小型猪4 h，SD 大鼠和比格犬3 h，恒河猴2 h；肝微粒体最佳浓度均为0.5 g·L-1；KM反应浓度为0.25 g·L-1。
3.根据权利要求1所述的KM的肝微粒体代谢分析,其特征在于：步骤（3）色谱柱型号为安捷伦PoroshellHPH-C18的2.1 mm×100 mm，2.7 μm的液相色谱柱。
4.根据权利要求1所述的KM的肝微粒体代谢分析，其特征在于：所述肝微粒体为人、小型猪、SD大鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体。
5.一种KM的相关动物伴随毒代动力学研究，其特征在于：包括以下步骤：
（1）染毒实验动物的血液样本采集及血浆样本处理
染毒实验动物采血后的血浆样本解冻后，取血浆100 µL，置于2 mL离心管中，加入75ng·mL-1的钩吻素甲内标10 µL，涡旋混合，加入萃取剂乙酸乙酯400 µL，涡旋混合3 min后12000 r·min-1，4 ℃下离心5 min，取上清有机相于另一离心管，于60 ℃下氮吹仪挥干，残留物于100 µL流动相复溶，涡旋混合3 min后12000 r·min-1，4 ℃下离心10 min，取上清液经0.22 µm过滤，吸取5 µL待测样品进行LC-MS/MS分析；
（2）定量检测
采用HPLC-MS/MS对步骤（1）的待测样品进行定量测定，具体条件如下：
色谱条件：仪器：Agilent 1200型HPLC；色谱柱：Gemini C18 液相色谱柱；流动相：甲醇-水-氨水，甲醇、水、氨水体积比为49:51:0.00625；流速：0.2 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；
质谱条件：仪器：Agilent 6410B LC/MS三重串联四极杆；离子源：正离子模式ESI；干燥气流速：10 L/min；干燥气温度：350 ℃；喷雾气：25 psi；Vcap：3500 V；KM：碰撞诱导解离电压140 V、碰撞能量56 V 、MRM离子307.2→180.2、驻留时间200 ms ；GM：碰撞诱导解离电压135 V、碰撞能量25 V 、MRM离子323.2→236.1、驻留时间200 ms；
（3）血药浓度数据分析
测定KM血药浓度，用DAS 3.0软件计算染毒实验动物的毒代动力学参数。
6.根据权利要求5所述的KM的相关动物伴随毒代动力学研究，其特征在于：所用的KM人类相关动物为恒河猴。
7.根据权利要求5所述的KM的相关动物伴随毒代动力学研究，其特征在于：步骤（2）色谱柱型号为Gemini 5μ C18的110A，50×2.0 mm的液相色谱柱。
8.根据权利要求4所述的KM的相关动物伴随毒代动力学研究，其特征在于：染毒实验动物的血液样本采集步骤为：取3~4岁恒河猴8只，分为阴性对照组和给药组，每组动物4只，雌雄各半，采用累积剂量法进行急性毒性试验，每天鼻饲给予一个剂量，给药顺序按5、10、20、40、80mg·kg−1由低剂量往高剂量连续5天逐天给药，给药容量为5 mL·kg−1，于给药第一天及第四天给药前及给药后5、20、60、120、240、480、1440 min采血进行伴随毒代动力学研究。
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