CN106573000B - 作为抗癌药物的芳基胺取代的喹喔啉 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式I(a)～(d)和式II化合物，所述化合物能抑制蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(PP2A)，可作为蛋白质磷酸酶2A(PP2A)促进剂和癌蛋白SET拮抗剂，且能有效治疗癌症。

Description

作为抗癌药物的芳基胺取代的喹喔啉
技术领域
本发明是关于一种经芳基胺取代的喹喔啉(quinoxaline)的新颖化合物，以及该化合物的用途。
背景技术
在大部分的人类癌细胞中可发现抑制蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(cancerousinhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A)过度表现，包含白血病、前列腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、头颈部癌、结肠癌及乳癌，因此CIP2A已发现与临床上侵略性肿瘤及促进癌细胞生长有密切的关联性。CIP2A直接与转录因子c-Myc相互作用并抑制c-Myc的蛋白质磷酸酶2A(PP2A)去磷酸化，因而使致癌的c-Myc更稳定免于降解。
蛋白质磷酸酶2A(PP2A)是通过在丝氨酸或苏胺酸残基蛋白质激酶的去磷酸化进行细胞增殖的关键调节剂，PP2A是由三个调节受体专一性的次单元所组成；例如，PP2A使p-Akt在丝胺酸473去磷酸化并减少细胞生长。因此，CIP2A-PP2A-Akt信号级联放大(signaling cascade)被认为是癌症种药的生存调节剂；此外，SET另一个被发现的PP2A的抑制剂，已发现SET在许多不同肿瘤组织均有过度表现，且SET的表现量与癌细胞的生长速率呈正相关。
因此，若开发通过拮抗SET或是CIP2A对于PP2A的抑制，来在癌细胞中重新活化PP2A，继而抑制p-Akt等促癌讯息的传递，进而诱发癌细胞凋亡的化合物可成为抗癌的新的治疗策略。
发明内容
本发明提供新设计的化合物，其具有阻碍PP2A与SET结合的能力，同时能有效抑制具有抑制蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)及p-Akt表现，可作为具有蛋白质磷酸酶2A(PP2A)的促进剂及癌蛋白SET拮抗剂，且能有效治疗癌症。
本发明目的之一在于提供一种可经芳基胺取代的喹喔啉，其具有如式I(a)或式I(b)的结构：
Figure GDA0002287261410000021
其中R1、R2及R3为相同或不同，各自独立地为可经取代的苯基和苯上有其他官能基的原子或基团、杂环芳香基，且该可经取代的苯基包含
Figure GDA0002287261410000022
本发明另提供一种可经芳基胺取代的喹喔啉，其具有如式I(c)的化学结构：
Figure GDA0002287261410000023
其中R4及R5为相同或不同，各自独立地为可经取代的苯基和苯上有其他官能基的原子或基团、杂环芳香基，且该可经取代的苯基包含
Figure GDA0002287261410000024
Figure GDA0002287261410000031
以及
其中X为卤素、卤代烷基、甲氧基、硝基、胺基、酰胺基、羧基、酸基、苯酮基或甲氧羰基。
本发明另提供一种可经芳基胺取代的喹喔啉，其具有式I(d)的化学结构：
Figure GDA0002287261410000032
其中R6及R7为相同或不同，各自独立地为可经取代的苯基和苯上有其他官能基的原子或基团、杂环芳香基，且该可经取代的苯基包含
Figure GDA0002287261410000033
本发明另提供一种化合物，其具有如下式II的结构：
Figure GDA0002287261410000034
其中R8及R9为相同或不同，各自独立地为可经取代的苯基和苯上有其他官能基的原子或基团，且该可经取代的苯基包含
Figure GDA0002287261410000041
Figure GDA0002287261410000042
以及
其中Y为CO或(CH2)n，n＝1-3；Z＝COOR10,或具有取代官能基的苯环，R10为芳香基或烷基取代基。
本发明的另一个目的是提供一种医药组合物，包含上述所定义的化合物，以及药理上可接受的载体。
本发明的又一个目的是提供一种用于活化蛋白质磷酸酶2A(PP2A)在细胞内表现、作为癌蛋白SET拮抗剂、蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)拮抗剂或干扰癌蛋白(SET)与蛋白质磷酸酶2A(PP2A)结合的医药组合物，包含上述所定义的化合物，以及药理上可接受的载体。
本发明的再一个目的是提供一种用于治疗以蛋白质磷酸酶2A(PP2A)不活化以、癌蛋白SET表现量增加或蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表现量增加为特征的疾病或病症的医药组合物，包含在上述所定义的化合物，以及药理上可接受的载体。
在本发明的一个实施例中，其中该医药组合物进一步包含抗癌药物，且该抗癌药物为索拉非尼(Sorafenib)或紫杉醇(Paclitaxel)。
本发明的另一个目的是提供一种上述所定义的化合物用于制造以治疗蛋白质磷酸酶2A(PP2A)不活化、癌蛋白SET表现量增加、蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表现量增加为特征的疾病或病症的医药组合物的用途。
在本发明的一个实施例中，其中该以蛋白质磷酸酶2A(PP2A)不活化、癌蛋白SET表现量增加或蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表现量增加为特征的疾病或病症为肝癌、肺癌、白血病、乳癌、肾癌、甲状腺癌、结肠癌、头部或颈部癌症。
以下将配合附图进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例用于阐明本发明，并非用于限定本发明的范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内可做些许改动与润饰，因此本发明的保护范围视后附的权利要求所界定的范围为准。
附图说明
图1A至G表示本发明的埃罗替尼(Erlotinib)衍生物TD-52相对于埃罗替尼对HCC细胞有较佳的细胞凋亡效果。图1A表示通过MTT分析在HCC细胞中，TD-52及埃罗替尼的细胞凋亡效果，显示在不同细胞株中TD-52的IC50，点代表平均值；条带代表标准偏差(n＝3)；图1B表示通过流式细胞仪检测在剂量依赖下TD-52及埃罗替尼的HCC细胞凋亡效果，点代表平均值；条带代表标准偏差(n＝3)；图1C是以膜联蛋白-V/PI双重染色法分析细胞凋亡及细胞坏死的比例；图1D表示以西方墨点分析法分析胱氨酸蛋白酶-9、半胱氨酸蛋白酶-3及过氧化物酶体增殖物启动受体(PAPP)的表现；图1E为以TD-52处理后DNA片段化检测(n＝6)；图1F表示通过TD-52与z-VAD-fmk共处理处理会减少诱发细胞凋亡，上图为以西方墨点分析法分析，下图为以流式细胞仪分析；图1G是通过西方墨点分析法确认TD-52对比埃罗替尼不具有抑制的上皮细胞成长因子接受体(EGFR)磷酸化活性。
图2A至H显示HCC细胞通过抑制蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)使p-Akt向下调节以确认本发明的埃罗替尼衍生物TD-52的抗癌效果。图2A为HCC细胞中以不同TD-52浓度处理24小时会向下调节CIP2A蛋白质表现，收集细胞裂解物以西方墨点分析法分析CIP2A、p-Akt、Akt蛋白质表现量；图2B为HCC细胞中在不同时间下1μM TD-52处理会向下调节CIP2A蛋白质表现，收集细胞裂解物以西方墨点分析法分析CIP2A、p-Akt、Akt蛋白质表现量；图2C表示HCC细胞以TD-52处理后PP2A活性提升，通过细胞裂解物量测PP2A磷酸酶活性，柱代表平均值，误差线代表标准偏差(n＝3)；图2D是TD-52对PP2A各次单位蛋白质表现量的影响，以西方墨点分析法确认PP2A次单元的表现量；图2E为myc-标记CIP2A异位过量表现的PLC5细胞影响TD-52在PLC5细胞凋亡的效果，分别以流式细胞仪(右图)及西方墨点分析法分析(左图)，柱代表平均值，误差线代表标准偏差(n＝3)；图2F以PP2A抑制剂、黑海棉酸(OA)共处理会影响TD-52细胞凋亡的效果，分别以流式细胞仪(右图)及西方墨点分析法分析(左图)，柱代表平均值，误差线代表标准偏差(n＝3)；图2G是通过siRNA剔除PP2A催化区(PP2Ac)表现影响TD-52在PLC5细胞凋亡的效果，分别以流式细胞仪(右图)分析细胞凋亡及西方墨点分析法分析p-Akt、PP2Ac及PARP的表现量(左图)，柱代表平均值；误差线代表标准偏差(n＝3)；图2H为myc-标记Akt1异位过量表现减少TD-52在PLC5细胞凋亡的效果，分别以流式细胞仪(右图)及西方墨点分析法分析(左图)，柱代表平均值，误差线代表标准偏差(n＝3)。
图3A至D表示TD-52通过干扰Elk-1功能向下调节CIP2A的转录作用。图3A为在剂量依赖方式及时间依赖方式以TD-52处理PLC5细胞会影响CIP2A的转录，不同的TD-52剂量处理(左上图)及TD-52处理时间不同(左下图)，利用RT-PCR定量CIP2A mRNA，柱代表平均值，误差线代表标准偏差(n＝3)，右图为西方墨点分析法检测以蛋白质合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide)及有(右下图)或无(右上图)TD-52处理的CIP2A蛋白质表现量；图3B表示TD-52会影响CIP2A近端启动子区域(n＝3，*P<0.05，柱代表平均值，误差线代表标准偏差，NS代表非显著性)；图3C表示在PLC5细胞中TD-52会通过抑制Elk-1转录因子在细胞核的表现量，进而抑制CIP2A蛋白在细胞质的表现量，核质分离后的细胞裂解物，以西方墨点分析法分析Elk-1及CIP2A蛋白质表现量，核层蛋白B(lamin B)及微管蛋白(tubulin)为对照组；图3D表示在PLC5细胞中TD-52会抑制Elk-1结合至CIP2A的启动子，利用染色质免疫沈淀技术(ChIP)确认在CIP2A启动子结合位置Elk-1的结合能力，以电泳图分析PCR产物(左图)，在PLC5细胞中异位过量表现Elk-1会减少TD-52诱导癌细胞凋亡的效果(右上及右下)，柱代表平均值，误差线代表标准偏差(n＝3)。
图4A至D是以活体内PLC5小鼠模型及临床上肝癌样本证实CIP2A-PP2A-p-Akt信号路径。图4A为PLC5的异体移植小鼠模型分别给予索拉非尼、TD-52或二甲基亚(DMSO)(作为控制组)后的肿瘤生长曲线，*P<0.05，点代表平均值，条带代表标准偏差(n＝6)；图4B是以西方墨点分析法分析在PLC5异体移植肿瘤中CIP2A、p-Akt及Akt1的表现量；图4C为分别以TD-52或DMSO(作为控制组)处理的PLC5异体移植肿瘤中PP2A活性分析，*P<0.05，柱代表平均值，误差线代表标准偏差(n＝3)；图4D表示在PLC5细胞中以剂量依赖方式索拉非尼及TD-52对细胞活性的影响，柱代表平均值，误差线代表标准偏差(n＝3)；图4E为信号路径的示意图说明在HCC细胞中TD-52对促进细胞凋亡的影响。图4F为临床肝癌肿瘤样本p-Akt细胞核表现及CIP2A细胞质表现的免疫组织化学染色法影像图。
图5A至F表示在肝癌患者肿瘤组织中SET过度表现。图5A表示在成对的肝癌肿瘤组织及邻近的正常组织中SET的免疫组织化学染色法影像图；图5B在临床上样本中肿瘤组织及非肿瘤组织的平均SET表现量，柱代表平均值，误差线代表标准偏差(n＝294)；图5C表示非肿瘤组织表现量相对于成对肿瘤组织的比值，点代表每个患者的表现量的比质(n＝147)，横线代表所有病人平均比率；图5D上图表示不同患者的SET及p-Akt的免疫组织化学染色法影像图，下图表示肝癌患者手术后，通过SET及p-Akt共表现确认无复发存活率(recurrence-free survival)；图5E表示有及无剔除SET的PLC5细胞的细胞群形成影像及数目分析(n＝6)，右下方是以西方墨点分析法确认基因剔除的效果；图5F表示有及无剔除SET的Hep3B细胞的肝癌细胞微球(hepatosphere)形成影像及数目分析(n＝6)。
图6A至F是以本发明的埃罗替尼衍生物(EMQA)作为SET拮抗剂诱发肝癌细胞凋亡。图6A为通过MTT分析EMQA抑制肝癌细胞的存活率，点代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)；图6B是以流式细胞仪分析通过EMQA剂量依赖处理的肝癌细胞凋亡，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)；图6C是以DNA片段化分析通过EMQA剂量依赖处理的肝癌细胞凋亡，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)；图6D以流式细胞仪(上图)及西方墨点分析法(下图)分析在时间依赖方式EMQA诱发p-Akt致癌蛋白表现量减少与肝癌细胞凋亡，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)，CF代表切割型式；图6E表示在EMQA及控制组治疗的PLC5异体移植肿瘤小鼠的肿瘤生长曲线，点代表平均值，条带代表标准偏差(n＝10)；图6F是以西方墨点分析法分析PLC5异体移植肿瘤小鼠的肿瘤裂解物的p-Akt及Akt1(左图)及PP2A活性(右图)的表现量，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝10)。
图7A至E说明EMQA以SET为标的强化PP2A-调节p-Akt向下调节的功能的抗癌几转。图7A表示以流式细胞仪及西方墨点分析法分析EMQA对具有myc-标记Akt异位表现的PLC5细胞的细胞凋亡效果，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)；图7B表示以流式细胞仪及西方墨点分析法分析EMQA对PP2A抑制剂、黑海棉酸(OA)共处理的PLC5细胞凋亡的效果减少，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)；图7表示C以流式细胞仪及西方墨点分析法分析EMQA对通过siRNA剔除PP2Ac的PLC5细胞的细胞凋亡效果减少，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)；图7D表示以西方墨点分析法分析EMQA向下调节p-Akt表现而不影响PI3K、PTEN及PDK1的表现；图7E表示以流式细胞仪及西方墨点分析法分析EMQA对myc-标记SET异位表现的Hep3B细胞凋亡效果减少，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)；图7F表示以表面等离子共振(SPR左图)与共免疫沉淀法(co-IP右图)分析具有全长SET、N-末端片段(SETNTF，a.a.l-227)及C-末段片段(SETCTF，a.a.76-277)的重组蛋白与基因载体转殖的Sk-Hep1细胞以确定EMQA作为SET拮抗剂的影响(左图)，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)；通过西方墨点分析法显示EMQA显著减少全长SET及SETCTF对PP2Ac的结合，不会影响SETNTF的结合(右图)。
图8A至E显示在活体外(in vitro)及活体内(in vivo)EMQA与索拉非尼的组合对抗作用具有协同效果(synergism)。图8A是CalcuSyn分析软件(Biosoft,剑桥，英国)分析EMQA与索拉非尼的组合在不同肝癌细胞以MTT测试细胞凋亡实验结果，确认EMQA与索拉非尼的协同效果；图8B是以流式细胞仪及西方墨点分析法分析在肝癌细胞中EMQA显著改善索拉非尼促进细胞凋亡的效果；图8C为EMQA与索拉非尼的组合显著抑制肝癌肿瘤生长的肿瘤生长曲线图，点代表平均值(n＝10)，*P<0.05；图8D为以EMQA与索拉非尼的组合显著抑制肝癌肿瘤生长的肿瘤重量数据图，柱代表平均值，条带代表标准偏差，*P<0.05；图8E为分别分析以控制组及EMQA与索拉非尼的组合治疗PLC5异体移植肿瘤小鼠的肿瘤的PP2A活性，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝10)(上图)；以西方墨点分析法分析PLC5异体移植肿瘤小鼠的肿瘤的p-Akt、Akt1及SET的表现(下图)。
图9A至D表示EMQA及紫杉醇(paclitaxel)结合可向下调节p-Akt。图9A表示利用西方墨点分析法分析三种不同非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株以EMQA及/或紫杉醇向下调节p-Akt；图9B表示在以时间依赖的方式EMQA及紫杉醇结合处理A549细胞株的p-Akt及聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)的表现量；图9C表示在以剂量依赖的方式下EMQA及紫杉醇结合处理A549细胞株的p-Akt及PARP的表现量；图9D表示通过流式细胞仪及西方墨点分析法分析EMQA对具有myc-标记Akt过量异位表现的A549细胞的细胞凋亡效果，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)。
图10A至E显示在活体内(in vivo)EMQA与紫杉醇的组合对抗作用的效果。图10A是利用控制组、紫杉醇及/或EMQA治疗A549异体移植肿瘤小鼠的肿瘤生长曲线，点代表平均值，*P<0.05(每组治疗n＝10)；图10B表示为利用控制组、紫杉醇及/或EMQA治疗A549异体移植肿瘤小鼠的平均肿瘤重量，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝10)；图10像C为PP2A活性分析图，柱代表平均值，条带代表标准偏差(n＝3)；图10D表示以西方墨点分析法分析A549异体移植肿瘤小鼠的肿瘤裂解物的p-Akt及Akt表现量；图10E表示受治疗的小鼠的体重改变，点代表平均值。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的所有技术及科学术语与本发明所属技术领域技术人员通常理解的含义相同。本文所提及的所有出版物都以引用方式并入本文，以揭露及描述与该被引用的出版物有关的方法及/或材料。
如本文所使用，单数形式「一」(a、an)和「该」(the)包括复数对象，除非该内文清楚地另有规定。因此，例如，参照「样品」包括复数个此类样品以及本领域技术人员已知的等同物。
本文所使用的「EMQA」代表本发明所述的埃罗替尼(Erlotinib)衍生物，其包含TD-52至TD-95、ITRI TD-627、ITRI TD-602至ITRI TD-605、ITRITD-607、ITRI TD-608、ITRITD-612至ITRI TD-626、ITRI TD-628至ITRI TD-631以及TD-632化合物。
「羧基」一词是指基团-C(O)OR，其中R为如本文所定义的氢、低碳烷基、经取代的低碳烷基、芳基、经取代的芳基，及其类似物。
「卤代烷基」一词是指烷基基团被一个或多个卤素原子取代，这样的实例包含，但并不限于，三氟甲基。
「卤素」一词是指氟、氯、溴、碘及鈪。
在本发明中研究埃罗替尼的结构与其生物活性之间的关系，并修改了埃罗替尼的结构。本发明据此开发了一些具有SET拮抗剂功能的埃罗替尼衍生物，并且意外地发现，相较于癌症常用药物埃罗替尼(Erlotinib)、索拉非尼(Sorafenib)及紫杉醇(Paclitaxel)，这些化合物在某些疾病中，如癌症，具有良好的治疗效果。根据本发明，本发明新设计的化合物可用作SET拮抗剂，且能有效治疗以SET的表现量增加为特征的疾病或病症，如肝癌、白血病、肺癌、乳癌、肾癌、甲状腺癌、头部及颈部癌症。本发明的化合物以干扰SET-PP2A结合为目标进而活化PP2A达到使癌细胞凋亡的效果，因此，本发明的化合物透过一种新的标靶机制，提供替代的治疗选择，该选择可能在对传统医药治疗具有抗性的癌症的治疗上是极有帮助的。
作为本发明的一个目的，提供一种可经芳基胺取代的喹喔啉，其具有如式I(a)或式I(b)的结构：
其中R1、R2及R3为相同或不同，各自独立地为可经取代的苯基和苯上有其他官能基的原子或基团、杂环芳香基，且该可经取代的苯基包含
Figure GDA0002287261410000102
Figure GDA0002287261410000111
在本发明的一个实施例中，该式I(a)化合物为如表一所列的化合物TD-70至TD-82，但不限于此。
表一、式I(a)化合物
Figure GDA0002287261410000121
在本发明的一个实施例中，该式I(b)化合物为如表二所列的化合物TD-52至TD-69以及ITRI TD-627，但不限于此。
表二、式I(b)化合物
Figure GDA0002287261410000131
作为本发明的另一个目的，提供可经芳基胺取代的喹喔啉，其具有式I(c)的化学结构：
Figure GDA0002287261410000132
其中R4及R5为相同或不同，各自独立地为可经取代的苯基和苯上有其他官能基的原子或基团、杂环芳香基，且该可经取代的苯基包含
Figure GDA0002287261410000141
以及其中X为卤素、卤代烷基、甲氧基、硝基、胺基、酰胺基、羧基、酸基、苯酮基或甲氧羰基。
在本发明的一个实施例中，该式I(c)化合物为如表三所列的化合物TD-83至TD-95、ITRI TD-602至ITRI TD-604、ITRI TD-607、ITRI TD-608、ITRI TD-613至ITRI TD-618、ITRI TD-620至ITRI TD-624及ITRI TD-629，但不限于此。
表三、式I(c)化合物
Figure GDA0002287261410000151
作为本发明的另一个目的，提供一种可经芳基胺取代的喹喔啉，其具有如式I(d)的结构：
Figure GDA0002287261410000152
其中R6及R7为相同或不同，各自独立地为可经取代的苯基和苯上有其他官能基的原子或基团、杂环芳香基，且该可经取代的苯基包含
Figure GDA0002287261410000161
在本发明的一个实施例中，该式I(d)化合物为如表四所列的化合物ITRI TD-605、ITRI TD-612、ITRI TD-619、ITRI TD-625、ITRI TD-626、ITRI TD-628、ITRI TD-630、ITRITD-631，但不限于此。
表四、式I(d)化合物
Figure GDA0002287261410000162
作为本发明的另一个目的，提供一种化合物，其具有如下式II的结构：
Figure GDA0002287261410000171
其中R8及R9为相同或不同，各自独立地为可经取代的苯基和苯上有其他官能基的原子或基团，且该可经取代的苯基包含
Figure GDA0002287261410000172
Figure GDA0002287261410000173
以及
其中Y为CO或(CH2)n，n＝1-3；Z＝COOR10,或具有取代官能基的苯环，R10为芳香基或烷基取代基。
在本发明的一个实施例中，该式II化合物为如下所示
Figure GDA0002287261410000174
本发明的化合物经合成后可以通过色层分析法或结晶法或本领域中已知的任何其他适当的方法进一步纯化。
本发明提供一种医药组合物，包含一种或多种上述化合物以及医药上可接受的载剂。本发明的医药组合物可用于阻碍蛋白质磷酸酶2A(PP2A)与癌蛋白SET的结合，以增加PP2A在细胞内的生物活性，或用于治疗以PP2A的不活化或癌蛋白CIP2A与SET过度表现为特征的疾病或病症。此外，将任何上述化合物用于增加PP2A在细胞内的表现量或癌蛋白SET拮抗剂，或用于治疗如本文所述的以PP2A的表现量减少或SET过度表现为特征的疾病或病症的用途，以及用于治疗该等疾病的药剂的制造也包含在本发明的范围内。
本发明并提供一种增加PP2A或减少癌蛋白SET在细胞内的表现量或生物活性的方法，包含将该细胞与有效量的本文所述化合物或医药组合物接触。本发明并进一步提供一种在需要PP2A的个体中治疗以PP2A的不活化或SET过度表现为特征的疾病或病症的方法，包含将本文所述的化合物或医药组合物以有效量投予至该个体。
本发明的化合物可以被用于治疗以PP2A的不活化或癌蛋白SET过度表现为特征的疾病或病症。本发明的化合物可以单独或以医药组合物的形式投予人类病患一剂量，该医药组合物是与适当的载剂或赋形剂混合，以治疗或改善各种以PP2A的表现量减少或癌蛋白SET过度表现为特征的病症。因子(例如PP2A)的表现量或生物活性的增加或减少可以通过该因子的基因产物如蛋白质或RNA而容易地侦测到，在来自于个体的检体(例如自血液或活体组织而来)中使用本领域已知的检测方法如酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)、西方墨点分析法以及北方墨点分析法进行体外分析其RNA含量、表现蛋白及其类似物的结构及/或活性。根据本发明，以PP2A的不活化或癌蛋白SET及CIP2A过度表现为特征的疾病或病症的具体实例包括，但不限于，癌症(例如肝癌、白血病、肺癌、乳癌、肾癌)及骨质疏松症。
「治疗」一词包括该特定失调或病症的预防，或与特定失调或病症有关的症状的减轻及/或该症状的预防或消除。
具体而言，「个体」为动物，如人类，但也可以是宠物(例如，狗、猫及其类似物)、经济动物(例如，牛、羊、猪、马及其类似物)或实验用动物(例如，大鼠、小鼠、天竺鼠及其类似物)，该动物需要如本文所述的治疗。
本文所述的「有效量」是指在个体上达到治疗效果所需要的活性剂的量，不论是单独或与一种或多种其他活性剂组合使用。根据给药途径、赋形剂的使用，以及与其他活性剂共同使用等不同情况，在由本领域技术人员确认下，有效量各不相同。
适合的给药途径可能包括如口服、直肠给药、黏膜给药、或肠道给药；非经口传输，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉、腹膜、鼻内或眼内注射，并可为补充或缓释剂型。
本发明的医药组合物可以通过本领域已知的方式制造，例如，透过常用的混合、溶解、乳化、包埋、包封、或冻干过程制造。因此，根据本发明所提供使用的医药组合物，可以通过常规的方式配制，使用一个或多个生理上可接受的载剂，包含赋形剂及/或助剂，以助于活性化合物的加工而形成医药上可使用的制剂。如本文所用，「可接受」是指该载剂必须与该组合物的活性成分兼容(且较佳地，能够稳定该活性成分)，且不会对受治疗的个体有害。适当的剂型取决于所选择的给药途径。
具体而言，针对注射给药，本发明的化合物可以被配制于例如生理上兼容的缓冲液内，如汉克缓冲液、林格氏缓冲液或生理食盐缓冲液。针对口服给药，本发明的化合物的配制可通过将该活性化合物与本领域已知的医药上可接受的载剂结合，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠，及/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP，polyvinylpyrrolidone)，以使本发明的化合物可以配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液及其类似物。针对吸入法给药，本发明的化合物可被配制为自加压容器或喷雾器喷出的气雾喷雾，并搭配使用适当的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。
实施例1化学合成
具体而言，以下所示的反应式提供了本发明某些化合物的合成方案I至V。
1.1 合成方案I
Figure GDA0002287261410000201
本发明的化合物可以通过上述合成方案I制备得到，具体合成方案见实施例的描述。在合成方案1中，先将1当量的2,3-二氯喹喔啉(2,3-dichloroquinoxaline)及2.3当量的苯胺类似物加入至3至5mL的异丙醇(isopropy alcohol)中，随后加入2滴浓HCl。然后将混合物加热至60℃隔夜，并产生白色或黄色固体。反应完成后，将该反应的混合物用异丙醇冲洗，得到二个取代基的喹喔啉衍生物，将该产物进一步使用乙酸乙酯/己烷通过正相色谱法进行纯化，以得到TD-52至TD-69及ITRI TD-627等化合物。
1.1.1 N2,N3-双(3-乙炔基苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(3-ethynylphenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-52)
Figure GDA0002287261410000202
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ 3.47(s,1H)7.16(d,J＝7.6Hz,1H),7.29-7.33(m,2H),7.56(dd,J＝3.4,6.4Hz,1H),7.84(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.96(s,1H)。
1.1.2 N2,N3-双(4-苯氧基苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(4-phenoxyphenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-53)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.02(d,J＝7.6Hz,2H),7.08-7.13(m,3H),7.32(s,1H),7.38(t,J＝7.2Hz,2H),7.53(s,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,2H)。
1.1.3 N2,N3-二苄基喹喔啉-2,3-二胺(TD-54)(N2,N3-dibenzylquinoxaline-2,3-diamine)(TD-54)
Figure GDA0002287261410000212
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ 4.72(s,2H),7.18-7.24(m,2H),7.29(t,J＝7.2Hz,2H),7.38(d,J＝7.2Hz,2H),7.52(dd,J＝3.4,6.4Hz,1H)。
1.1.4 N2,N3-联苯喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-diphenylquinoxaline-2,3-diamine)(TD-55)
Figure GDA0002287261410000213
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ 7.10(t,J＝7.6Hz,1H),7.34(dd,J＝3.4,6.4Hz,1H),7.39(t,J＝7.6Hz,2H),7.58(dd,J＝3.4,6.4Hz,1H),7.83(d,J＝8.0Hz,2H)。
1.1.5 N2,N3-双(3-氯苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(3-chlorophenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-56)
Figure GDA0002287261410000221
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.14(d,J＝8.0Hz,1H),7.38-7.43(m,2H),7.60(dd,J＝3.2,6.0Hz,1H),8.02(d,J＝8.4Hz,1H),8.24(s,1H)。
1.1.6 N2,N3-双(2-氟-5-甲基苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(2-fluoro-5-methylphenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-58)
Figure GDA0002287261410000222
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ 2.42(s,3H),7.23(s,1H),7.25(d,J＝1.2Hz,1H),7.43(dd,J＝3.4,6.4Hz,1H),7.51(d,J＝7.2Hz,1H),7.61(dd,J＝3.4,6.4Hz,1H)。
1.1.7 N2,N3-双(3-苯乙醚)喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(3-ethylphenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-59)
Figure GDA0002287261410000231
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ 1.23(t,J＝7.6Hz,3H),2.61(q,J＝7.6Hz,2H),6.86(d,J＝7.6Hz,1H),7.21(t,J＝7.6Hz,1H),7.26(s,1H),7.54-7.56(m,2H),7.62(d,J＝7.6Hz,1H)。
1.1.8 N2,N3-双(3-(三氟甲基)苯基)喹喔啉-2,3二胺(N2,N3-bis(3-(trifluoromethyl)phenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-60)
Figure GDA0002287261410000232
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.40(t,J＝8.0Hz,2H),7.58(dd,J＝3.6,5.6Hz,1H),7.62(t,J＝8.0Hz,1H),8.19(d,J＝8.0Hz,1H),8.34(s,1H),9.33(s,1H)。
1.1.9 2,2'-((喹喔啉-2,3-亚基双(脲二基))双(4,1-苯二胺；))乙腈(2,2'-((quinoxaline-2,3-diylbis(azanediyl))bis(4,1-phenylene))diacetonitrile)(TD-62)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 4.03(s,2H),7.35-7.39(m,3H),7.58(dd,J＝3.4,6.4Hz,1H),7.99(d,J＝8.8Hz,2H)。
1.1.10 N2,N3-双(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-63)
Figure GDA0002287261410000242
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ 7.28(dd,J＝3.6,6.0Hz,1H),7.45(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(dd,J＝3.4,6.4Hz,1H),8.03(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.34(d,J＝2.4Hz,1H)。
1.1.11 N2,N3-双(4-(三氟甲氧基)苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(4-(trifluoromethoxy)phenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-65)
Figure GDA0002287261410000251
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ 7.26(d,J＝8.4Hz,2H),7.32(dd,J＝3.2,6.0Hz,1H),7.57(dd,J＝3.2,6.0Hz,1H),7.90(d,J＝9.2Hz,2H)。
1.1.12 5,5'-(喹喔啉-2,3-亚基双(脲二基)双(2-甲基苯酚)(5,5'-(quinoxaline-2,3-diylbis(azanediyl))bis(2-methylphenol))(TD-66)
Figure GDA0002287261410000252
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ 2.24(s,3H),7.03(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.21(d,J＝8.0Hz,1H),7.26(s,1H),7.44(dd,J＝3.4,6.0Hz,1H),7.67(dd,J＝3.4,6.0Hz,1H)。
1.1.13 N2,N3-双(4-(五氟硫基)苯基)喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(4-(Pentafluorothio)phenyl)quinoxaline-2,3-diamine)(TD-68)
Figure GDA0002287261410000261
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ 7.41(dd,J＝3.6,6.0Hz,1H),7.67(dd,J＝3.4,6.4Hz,1H),7.79(d,J＝9.2Hz,2H),8.03(d,J＝8.8Hz,2H)。
1.2 合成方案II
本发明的化合物可以通过上述合成方案II制备得到，具体合成方案见实施例的描述。在合成方案II中，先将1当量的2,3-二氯喹喔啉(2,3-dichloroquinoxaline)及1当量的苯胺类似物加入至3至5mL的异丙醇中，随后加入1滴浓HCl。然后将混合物通过通过微波炉加热至150℃30分钟。反应完成后，将该反应混合物利用异丙醇(IPA)过滤以产生白色固体，将该反应的混合物通过异丙醇冲洗，将该产物使用醚或乙酸乙酯烷冲洗，以得单一取代的喹喔啉衍生物，即，TD-70至TD-82等化合物。
1.2.1 3-氯-N-(3,5-二氯苯基)喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(3,5-dichlorophenyl)quinoxalin-2-amine)(TD-78)
Figure GDA0002287261410000263
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.20-7.28(m,4H),7.52(d,J＝8.0Hz,1H),8.35(s,2H),9.82(s,1H)。
1.2.2 3-氯-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)quinoxalin-2-amine)(TD-79)
Figure GDA0002287261410000271
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.21-7.26(m,3H),7.47(d,J＝8.0Hz,1H),7.64(d,J＝8.8Hz,1H),8.47(d,J＝8.8Hz,1H),8.89(s,1H),9.97(s,1H)。
1.2.3 3-氯-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(4-(trifluoromethoxy)phenyl)quinoxalin-2-amine)(TD-80)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.19-7.20(m,3H),7.34(d,J＝8.4Hz,2H),7.50(d,J＝7.6Hz,1H),8.28(d,J＝8.4Hz,2H),9.65(s,1H)。
1.2.4 3-氯-N-(4-(五氟硫基)苯基)喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(4-(Pentafluorothio)phenyl)quinoxalin-2-amine)(TD-81)
Figure GDA0002287261410000273
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.22-7.27(m,3H),7.54(d,J＝7.6Hz,1H),7.84(d,J＝8.4Hz,2H),8.38(d,J＝8.8Hz,2H),9.90(s,1H)。
1.3 合成方案III
Figure GDA0002287261410000281
本发明的化合物可以通过上述合成方案III制备得到，具体合成方案见实施例的描述。在合成方案III中，先将4个位置有修饰的苯二胺a溶解在2mL的浓HCl并加热至180℃隔夜，将该混合物通过水过滤并干燥后获得沉淀的中间产物b。然后将该中间产物b溶解至POCl3并加热至110℃3小时。反应混合物降温至室温之后，将其倒入冰水中产生沉淀物，将该沉淀物以烤箱烘干以获得中间产物c。将苯胺及中间产物c溶解在IPA中，随后加入2滴浓HCl，然后将混合物加热至60℃隔夜。将该混合物利用IPA过滤以产生沉淀物，将该沉淀物进一步使用色谱法进行纯化，以得到TD-83至TD-95、ITRI TD-602至ITRI TD-604、ITRI TD-607、ITRI TD-608、ITRI TD-613至ITRI TD-618、ITRI TD-620至ITRI TD-624、ITRI TD-629等化合物。
1.3.1 甲基2,3-双((4-(三氟甲氧基)苯基)胺基)喹喔啉-6-羧酸(methyl2,3-bis((4-(trifluoromethoxy)phenyl)amino)quinoxaline-6-carboxylate)(TD-94)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 3.84(s,3H),7.38(dd,J＝4.4,8.0Hz,4H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),7.83(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),8.10(d,J＝1.2Hz,1H),8.18(t,J＝8.8Hz,4H)。
1.3.2 N2,N3-双(4-甲氧苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(4-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-602)
Figure GDA0002287261410000291
1H NMR(500MHz,DMSO-d6).3.79(s,6H),7.00(dd,4H),7.56(d,1H),7.89(dd,4H),8.03(d,1H),8.23(s,1H),10.0(b,2H)。
1.3.3 N2,N3-bis(3-乙炔基苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(3-ethynylphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-604)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6).4.19(s,1H),4.20(s,1H)7.23(dd,2H),7.42(m,3H),7.64(d,1H),8.11(b,4H),8.23(s,1H),10.1(b,2H)。
1.3.4 N2,N3-双(4-三氟甲基)苯基)喹喔啉-2,3,6-三胺(N2,N3-bis(4-(trifluoromethyl)phenyl)quinoxaline-2,3,6-triamine)(ITRI TD-607)
Figure GDA0002287261410000293
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 5.4(s,2H),6.7(s,1H),6.82(d,1H),7.35(d,1H),7.65(d,2H),7.68(d,2H),7.92(d,2H),8.08(d,2H),(9.04,1H),(9.20,1H)。
1.3.5 N2,N3-双(3-甲氧苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(3-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-608)
Figure GDA0002287261410000301
1H NMR(500MHz,DMSO-d6).3.98(s,3H),3.97(s,3H),6.68(dd,2H),7.27(t,2H),7.43(d,1H),7.44(d,1H),7.61(s,1H),7.62(m,2H),8.05(d,1H),8.25(s,1H),9.28(s,1H),9.35,(s,1H)。
1.3.6 3-(2-(3-氢氧苯胺)-6-硝基喹喔啉-3-基胺基)苯酚(3-(2-(3-hydroxyphenylamino)-6-nitroquinoxalin-3-ylamino)phenol)(ITRI TD-613)
Figure GDA0002287261410000302
1H NMR(500MHz,DMSO-d6).6.68(dd,2H),7.09(m,2H),7.18(m,2H),7.58(d,1H),7.61(d,1H),7.70(d,1H),8.10(d,1H),8.31(s,1H),9.60-10.1,(b,4H)。
1.3.7 N2,N3-双(3-溴苯)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(3-bromophenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-618)
Figure GDA0002287261410000303
1H NMR(500MHz,DMSO-d6).7.00(dd,1H),7.19(m,2H),7.30(m,1H),7.58(d,1H),7.39(dd,2H),7.62(d,1H),8.05(m,3H),8.38(s,1H),10.2-10.6,(b,2H)。
1.3.8 N2,N3-雙(4-氟苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(4-fluorophenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-620)
Figure GDA0002287261410000311
1H NMR(500MHz,DMSO-d6).7.25(m,4H),7.59(d,1H),7.88(m,4H),8.06(d,1H),8.26(s,1H),9.34(s,1H),9.51(s,1H)。
1.3.9 N2,N3-双(4-氯-3-氟苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺N2,N3-bis(4-chloro-3-fluorophenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine(ITRI TD-624)
Figure GDA0002287261410000312
1H NMR(500MHz,DMSO-d6).7.41(dd,2H),7.68(m,3H),7.95(s,1H),8.08(s,1H),8.10(d,1H),8.30(s,1H),10.0(b,2H)。
1.3.10 N2,N3-双(4-苯磺酰胺)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N2,N3-bis(4-phenylsulfonamide)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-629)
Figure GDA0002287261410000313
1H NMR(500MHz,DMSO-d6).7.29(b,4H),7.74(d,1H),7.88(d,4H),8.20(m,5H),8.42(s,1H),10.14(s,1H),10.30(b,1H)。
1.4 合成方案IV
本发明的化合物可以通过上述合成方案IV制备得到，具体合成方案见实施例的描述。在合成方案IV先分别将1当量的4-(2-氯-7-硝基喹喔啉-3-基胺基)苯酚(4-(2-chloro-7-nitroquinoxalin-3-ylamino)phenol)、3-氯-N-(4-甲氧苯基)-6-硝基喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(4-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxalin-2-amine)、4-(2-氯-7-硝基喹喔啉-3-基胺基)-3-甲基苯酚(4-(2-chloro-7-nitroquinoxalin-3-ylamino)-3-methylphenol)或3-氯-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-6-硝基喹喔啉-2-胺(3-chloro-N-(5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)-6-nitroquinoxalin-2-amine)与1.2当量的苯胺化合物加入3至5mL的DMF，随后加热至110℃3小时。反应完成后，将该反应混合物加水并以乙酸乙脂萃取，将乙酸乙脂经水洗、干燥后减压抽干，得到粗产物。将粗产物进一步使用乙酸乙酯/己烷通过正相色谱法进行纯化可分别得到ITRI TD-605、ITRI TD-612、ITRI TD-619、ITRI TD-625、ITRI TD-626、ITRI TD-628、ITRI TD-630、ITRI TD-631等化合物。
1.4.1 N3-(3-乙炔基苯基)-N2-(4-甲氧基苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N3-(3-ethynylphenyl)-N2-(4-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TR-605)
Figure GDA0002287261410000321
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 3.78(s,3H),4.21(s,1H),7.00(d,2H),7.21(d,1H),7.42(t,1H),7.59(d,1H),8.01(dd,2H),8.02(d,2H),8.07(d,1H),8.26(s,1H),9.34(s,1H),9.41(s,1H)。
1.4.2 3-(2-(4-甲氧基苯基胺)-6-硝基喹喔啉-3-基胺基)苯酚(3-(2-(4-methoxyphenylamino)-6-nitroquinoxalin-3-ylamino)phenol)(ITRI TD-612)
Figure GDA0002287261410000322
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 3.78(s,3Η)，6.51(d,1H),7.02(dd,2H),7.17(t,1H),7.24(d,1H),7.56(d,1H),7.68(s,1H),7.77(dd,2H),8.06(d,1H),8.30(s,1H),9.16(s,1H),9.45(s,1H),9.47(s,1H)。
1.4.3 4-(2-(3-乙炔基苯基胺)-7-硝基喹喔啉-3-基胺基)苯酚(4-(2-(3-ethynylphenylamino)-7-nitroquinoxalin-3-ylamino)phenol)(ITRI TD-619)
1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ 4.19(s,1Η)，6.81(dd,2H),7.20(d,1H),7.22(t,1H),7.54(d,1H),7.60(dd,2H),8.00(d,2H),8.05(d,1H),8.23(s,1H),9.31(b,2H),9.39(b,1H)。
1.4.4 4-(2-(3-乙炔苯基胺)-7-硝基喹喔啉-3-基胺基)-3-甲基苯酚(4-(2-(3-ethynylphenylamino)-7-nitroquinoxalin-3-ylamino)-3-methylphenol)(ITRI TD-625)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 2.05(s,3Η)，4.21(s,1H),6.65(d,1H),6.67(s,1H),7.13(d,1H),7.21(d,1H),7.42(m,2H),8.05(d,1H),8.05(m,2H),8.26(s,1H),9.10(s,1H),9.25(s,1H),9.39(s,1H)。
1.4.5 N3-(4-(三氟甲基)苯基)-N2-(4-甲氧基苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-N2-(4-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-dia mine)(ITRI TD-626)
Figure GDA0002287261410000333
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 3.89(s,3Η)，7.00(d,2H),7.59(d,1H),7.77(m,4H),8.11(d,1H),8.17(d,2H),8.36(s,1H),9.47(s,1H),9.56(s,1H)。
1.4.6 4-(2-(5-甲基-1H-吡唑-3-基胺基)-6-硝基喹喔啉-3-基胺基)苯酚(4-(2-(5-methyl-1H-pyrazol-3-ylamino)-6-nitroquinoxalin-3-ylamino)phenol)(ITRI TD-628)
Figure GDA0002287261410000341
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 2.28(s,3Η)，6.80(d,2H),6.88(s,1H),7.64(d,1H),7.65(d,2H),8.03(d,1H),8.21(s,1H),9.28(s,1H),9.30(s,1H),10.2(s,1H)。
1.4.7 N3-(4-氟苯基)-N2-(4-甲氧基苯基)-6-硝基喹喔啉-2,3-二胺(N3-(4-fluorophenyl)-N2-(4-methoxyphenyl)-6-nitroquinoxaline-2,3-diamine)(ITRI TD-631)
Figure GDA0002287261410000342
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 3.78(s,3Η)，7.00(d,2H),7.26(t,2H),7.57(d,1H),7.93(d,2H),7.92(dd,2H),8.07(d,1H),8.25(s,1H),9.31(s,1H),9.40(s,1H)。
1.5 合成分案V
本发明的化合物可以通过上述合成方案V制备得到，在合成方案V中；先将1当量的(2,3-二氯喹喔啉-6-基)(苯基)甲酮((2,3-dichloroquinoxalin-6-yl)(phenyl)methanone)与1.2当量的3-乙炔基苯胺(3-ethynylbenzenamine)于IPA中加热回流5小时后冷却，将析出的固体再以IPA洗涤，所得固体经烘干可得到产物TD-632(式II)。
1.5.1 2,3-双(3-乙炔苯基胺)喹喔啉-6-基)(苯基)甲酮(2,3-bis(3-ethynylphenylamino)quinoxalin-6-yl)(phenyl)methanone)(TD-632)
Figure GDA0002287261410000351
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)4.2(s,1H),4.1(s,1H).7.24(d,1H),7.25(d,1H),7.56(d,2H),7.40(m,2H),7.6(m,3H),7.64(m 3H),7.79(m 2H)7.82(s1H),8.15(b,2H),9.25(b,2H)。
实施例2生物活性检测
2.1 材料与方法
2.1.1 试剂与抗体
索拉非尼(Sorafenib)(蕾莎瓦膜衣锭)、埃罗替尼(Erlotinib)(得舒缓膜衣锭)紫杉醇(Paclitaxel)分别由拜耳制药公司(Bayer Pharmaceuticals)(西哈芬，康乃迪克州)及罗氏大药厂(Roche Pharmaceuticals)(巴赛尔，瑞士)提供。黑海棉酸(okadaic acid，OA)购自开曼化学公司(Cayman Chemical)(安娜堡，密执安州)以及z-VAD-fmk购自西格玛(Sigma)(圣路易、蜜苏里州)。关于活体外(in vitro)实验，各种药物皆溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，并细胞培养在含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM杜氏改良Eagle培养基(dulbecco'smodified eagle's medium)或RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培养基中。
关于活体内(in vitro)实验，加入至培养基后最后DMSO的浓度为0.1％。免疫墨点分析所用的抗体，如抗-CIP2A、抗-Akt1、抗-PAPP、anti-PP2A-C、抗-PP2A-A、抗-PP2A-B55及抗-Elk-1均购自圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)(圣地亚哥，加州)。其他抗体，如抗-半胱氨酸蛋白酶-3(anti-caspase-3)及抗-P-Akt(Ser473)均来自细胞信号转导公司(Cell Signaling)(丹弗斯，麻州)。
2.1.2 细胞培养
Sk-Hep1、PLC/PRF/5(PLC)及Hep3B细胞株则获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(马那萨斯，维吉尼亚州)。Huh-7肝癌细胞株获自健康科学研究资源库(Health Science Research Resources Bank)(大阪，日本；JCRB0403)。上述细胞维持在含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃的含有5％二氧化碳的加湿培养箱中。其他的细胞株，包括非小细胞肺癌细胞株H358、H460及A549以及人类鳞癌细胞NCI-1703、H2170、H520、SW900及NCI-H226均获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(马那萨斯，维吉尼亚州)等也提供给如下所述细胞检测使用。
2.1.3 细胞凋亡分析
在以DMSO、索拉非尼、本发明的埃罗替尼衍生物进行处理后，使用流式细胞仪(sub-G1)对凋亡的细胞进行计量。使用膜联蛋白-V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)双重染色法检测细胞凋亡及坏死的数量。上述两种分析方式，本发明的埃罗替尼衍生物处理后将HCC细胞收成，在与PI单独培养以作为sub-G1分析使用，以及与膜联蛋白-V-FITC组合培养。以流式细胞仪进行细胞组合物的分析；通过半胱氨酸蛋白酶以及剪切的PAPP利用西方墨点分析评估本发明的埃罗替尼衍生物诱导细胞死亡效果；以细胞质组蛋白相关的DNA片段化的酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)检测细胞死亡(罗氏，印第安纳波利斯，印第安纳州)。通过西方墨点分析及流式细胞仪评估以本发明的埃罗替尼衍生物及z-VAD-fmk、半胱氨酸蛋白酶进行共处理的效果。
2.1.4 西方墨点分析法
细胞与半胱氨酸蛋白酶-3、PAPP、P-Akt、Akt、CIP2A等处理一段时间后细胞裂解物以西方墨点分析法进行分析。
2.1.5 使用siRNA进行基因剔除
Smart-pool siRNA，包括对照组(D-001810-10)以及PP2A-C(L-001810-10)，均购自Dharmacon公司(芝加哥，伊利诺伊州)。11121-11133)。依据制造商的操作手册，在六孔盘内使用Dharma-FECT4转染液(Dharmacon公司)以siRNA(最后浓度100nM)进行细胞第一次转染48小时，之后替换为培养液，再将细胞以本发明的埃罗替尼衍生物(2μM，48小时)，然后收成细胞以进行西方墨点分析法及流式细胞仪的细胞凋亡分析。
2.1.6 过渡性转染(Transient transfection)
CIP2A cDNA(KIAA1524)及Elk-1 cDNA购自Origene公司(RC219918及RG208921；罗克维尔，马利兰州)。进行转染48小时之后，细胞以本发明的埃罗替尼衍生物处理一段时间后接者收成以进一步进行分析。
2.1.7 PP2A磷酸酶活性
使用孔雀石绿磷酸盐复合物分析(malachite green–phosphate complex assay)(upstate生物科技公司，普莱西德湖，纽约州)量测从苏胺酸磷酸肽产生游离的磷酸盐以确定在每一个细胞裂解物的蛋白磷酸酶活性。先在低洗涤剂裂解缓冲液(low-detergentlysis buffer)中制备HCC细胞裂解液，在含有750μM磷酸肽受质的PP2A-特定反应缓冲液(密理博公司，比尔里卡，麻州)中进行磷酸酶分析。在30℃培养10分钟后，加入孔雀石染剂且在650nm下通过光密度量测游离的磷酸盐。为避免样本之间免疫沉淀蛋白质数量的差异而导致差异，磷酸酶活性以每个处理群组皆经过免疫印迹检测及定量的PP2A免疫沉淀数量标准化。
2.1.8 建构荧光酶报导子分析CIP2A启动子及5’端检测
依据上述研究的PLC5细胞的基因组DNA含有外显子1(-2000bp至-1bp)的CIP2A启动子上游区域以PCR进行扩增，以及选殖至报导子载体，Friefly载体(pGL4.17)通过KpnI及Bg/II限制酶切割，PCR扩增的引子区域-1000/-1、-400-/-1、-300/-1、-150/-1、-110/-1选殖至pGL4载体KpnI及Bg/II限制酶切割位置，通过定序确认选殖的核苷酸序列。
2.1.9 染色质免疫沈淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)分析
Chip试剂组购买自Novus生物公司(NBP1-71709，利特尔顿，科罗拉多州)。以1×107个PLC5细胞数进行ChIP，该细胞以本发明的埃罗替尼衍生物处理16小时，以37％甲醛v/v(Sigma公司，F1635)在1％最终浓度达到1％，在室温下DNA结合蛋白与DNA交联10分钟。交联后，该细胞以含有蛋白酶抑制剂混合物(Cocktail)的1倍冰PBS清洗两次，收集细胞以800×g离心5分钟，以400μl含有蛋白酶抑制剂混合物(Cocktail)的裂解缓冲液再悬浮。然后该细胞以六次脉冲超声波处理，每个脉冲50％输出15秒，每个脉冲之间休息60秒。在4℃下将细胞裂解物以12500×g离心5分钟，加入Elk1或兔子IgG抗体最为阴性对照组进行免疫沉淀，在4℃下该免疫复合物以25μl蛋白质A/G磁珠处理进行沉淀反应1小时。使用400μl洗脱缓冲液将蛋白质-DNA复合物从磁珠冲洗出来，在95℃下蛋白质-DNA的交联经由8μl 5M的NaCl进行交联15分钟。利用自旋管柱(spin column)纯化DNA，取2μl DNA进行半定量PCR反应扩增CIP2A启动子区域(-139/-16bp)。
2.1.10 异体移植(xenograft)肿瘤的生长
雄性NCr无胸腺裸鼠(5-7周龄)来自台湾地区实验动物中心(台北，中国台湾)。所有使用这些小鼠进行的实验程序，都按照台湾大学批准的实验操作程序。当1×106个PLC5或A549细胞数悬浮在含有Matrigel(基底膜基质，BD生物科技，贝德福尔，马萨诸塞州)不含血清的培养基中。当小鼠肿瘤达到100-150mm3，对小鼠进行口服灌胃给予实验预定的治疗，如每天每公斤10mg索拉非尼、本发明的埃罗替尼衍生物或控制组4周。
2.1.11 免疫组织化学染色法
石蜡包埋的HCC组织切片(4mm)在聚-1-赖氨酸包被玻片(poly-1-lysine-coatedslides)上去包埋，以10mM Tris-HCl(pH7.4)及150mM氯化钠冲洗，过氧化氢酶以甲醇及3％过氧化氢抑制(quenched)，然后在100℃下加压加热室内将玻片放置于10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)20分钟。以1:200稀释的p-Akt1/2/3(Thr 308)-抗体(ab8805，abcam公司，剑桥)以及以1:100稀释的CIP2A抗体(ab84547，abcam公司，剑桥)在室温下处理1小时，玻片以PBD完全地清洗三次。使用EnVision过氧化氢酶检测系统/DAB兔子/小鼠试剂组(Dako公司，格洛斯楚普)检测已结合的抗体，然后将该玻片以苏木精(hematoxylin)反染色。小鼠石蜡包埋切片肾组织和人类结肠癌分别作为p-Akt1/2/3及CIP-2A的阳性对照组。阴性对照组以PBS取代初级抗体。通过认证的病理学家基于半定量的染色强度评估p-Akt1/2/3及CIP-2A的表现，染色强度的评分为负、弱、中等及强。
2.2.12 表面等离子共振(Surface plasmon resonance)
本发明分析全长SET及截断SET结合至PP2Ac(PP2A的催化区)的结合亲和力以及本发明的埃罗替尼衍生物干扰SET及PP2Ac的效果。PP2Ac-GST重组蛋白结合至具有GST捕捉抗体的CM5芯片，通过注射不同浓度本发明的埃罗替尼衍生物与固定浓度的SET组合蛋白质，或在固定剂量本发明的埃罗替尼衍生物不同浓度的截断SET蛋白质所产生的传感图(sensergram)。PP2Ac-GST重组蛋白购自亚诺法生技公司(H00005515，Abnova公司，台湾)以及SET-His重组蛋白购自Genway公司(GWB-ATG319)。
2.2.13 统计分析
肿瘤生长数据为平均肿瘤体积±S.E.并与独立样本t-检验进行比较，临床样本以X2-检验进行比较。在双尾检验P值＜0.05视为显著意义。所有统计分析采用在支持Windows软件的SPSS软件计算(第17.0版，SPSS公司，芝加哥，伊利诺伊州)。
结果
2.2.1 本发明的埃罗替尼(erlotinib)衍生物增加HCC细胞凋亡
本发明以埃罗替尼衍生物TD-52及埃罗替尼进行在HCC细胞中抗癌活性的比较。本发明使用MTT分析以证实HCC细胞暴露于TD-52及埃罗替尼48小时之后的细胞活性，并以DMSO处理做为对照组，其结果如图1A所式，在HCC细胞株(包含HA22T、Hep3B、PLC5及Hep3B)测试中TD-52对癌细胞活性的减少优于埃罗替尼，其中包含HA22T(IC50＝0.9μmol/l)、Hep3B(IC50＝0.9μmol/l)、PLC5(IC50＝0.8μmol/l)及Sk-Hep1(IC50＝1.2μmol/l)。为了进一步确认细胞凋亡的程度，将四个细胞株分别以TD-52及埃罗替尼处理24小时后，以流式细胞仪确认sub-G1细胞的比例，如图1B所示，在剂量依赖下sub-G1分析反映出与MTT分析中一样的结果，也就是TD-52比埃罗替尼更具有抗癌的效果。
为了进一步确认TD-52抗癌的特性，本发明进行膜联蛋白-V/PI双重染色法、西方墨点分析、细胞周期分析及DNA片段化分析(图1C至图1E)。在剂量逐渐增加下，以膜联蛋白-V/PI双重染色法分析细胞凋亡及细胞坏死的比例，其结果发现以2μM TD-52及更高剂量处理四个细胞株中48小时之后，癌细胞死亡的程度(包含细胞凋亡及坏死)为50％或更高(图1C)，且Hep3B细胞对于TD-52诱导坏死细胞死亡较为敏感，而相同剂量下在HA22T、PLC5及Sk-Hep1细胞中大部分为诱导细胞凋亡死亡。而西方墨点分析结果中，以TD-52处理的细胞会诱发半胱氨酸蛋白酶-9、半胱氨酸蛋白酶-3的活性及聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)产生裂解物(图1D)。再者，TD-52(2μM)与z-VAD-fmk、pan-半胱氨酸蛋白酶抑制剂共处理48小时后，会减少TD-52诱发细胞凋亡的结果(图1F)。同时，在较低浓度TD-52处理(1μmol/l，24小时)会诱发癌细胞DNA片段化(图1E)。但TD-52并不具有与埃罗替尼相同抑制上皮细胞成长因子接受体(EGFR)激酶抑制剂的效果(图1G)。因此，本发明的埃罗替尼衍生物的抗癌活性的效果优于埃罗替尼，且该活性是通过异于上皮细胞成长因子接受体(EGFR)激酶抑制的机转。
此外，本发明的各个埃罗替尼衍生物也分别以1μM及10μM处理人类鳞癌细胞NCI-1703、H2170、H520、SW900及NCI-H226、非小细胞肺癌A549、H358细胞株进行细胞活性及IC50检测，其结果陈列于表五，证实本发明的埃罗替尼衍生物能有效促进癌细胞死亡。
2.2.2 本发明的埃罗替尼衍生物可通过抑制CIP2A强化PP2A活性
本发明进一步探讨本发明的埃罗替尼衍生物TD-52的作用机制，特别注重于蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)-蛋白质磷酸酶2A(PP2A)-p-Akt信号路径。如图2A及B所示，在剂量及时间依赖的方式下TD-52向下调节CIP2A及p-Akt的表现。再者，HCC细胞通过1μM TD-52的处理24小时后可提升PP2A的活性(图2C)，而与PP2A相关的次单元(subunit)、PP2A-A、PP2A-B5及PP2A-C次单元的表现量不受影响(图2D)。依据上述结果，TD-52处理通过抑制CIP2A表现而提升PP2A活性，进而向下调节p-Akt及导致HCC细胞凋亡(图2E)。
为了确认通过TD-52诱发细胞凋亡CIP2A-PP2A-p-Akt信号路径扮演的角色，本发明通过过渡型转染(Transient transfection)具有myc-标记CIP2A异位表现的PLC5细胞48小时(图2E)，再利用2μM TD-52处理24小时后，相较于野生型细胞在CIP2A-过度表现细胞中p-Akt的表现量被向上调节。甚至，本发明利用sub-G1分析发现TD-52的凋亡影响显著地在该些CIP2A-过度表现细胞中减少。接者，本发明利用两个方法确认PP2A在TD-52处理的HCC细胞中扮演的角色，通过沉默RNA(siRNA)剔除PP2A基因，并与PP2A抑制剂、黑海棉酸(OA)共处理(图2F及G)。当PLC5细胞由100nM OA处理时，p-Akt的表现量会提升，并减少TD-52-诱发HCC肿瘤细胞凋亡(图2F)。同样地，当PP2A被通过siRNA剔除时，p-Akt的表现量会增加且TD-52的抗癌效果减少。本发明通过过渡型转染产生Akt-过度表现PLC5细胞，并发现HCC细胞TD-52诱发细胞凋亡显著减少(图2H)，该些结果证实CIP2A-PP2A-p-Akt信号路径在调节HCC细胞TD-52抗癌效果中扮演关键性的角色。
2.2.3 本发明的埃罗替尼衍生物诱发细胞凋亡在CIP2A-PP2A-p-Akt信号路径的分子机制
为了进一步确认TD-52如何影响CIP2A-PP2A-p-Akt信号路径，本发明确认当蛋白质合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide)阻碍转译作用时，TD-52是否会影响CIP2A蛋白质的降解(degradation)，并以DMSO处理做为对照组，其结果如图3A所示，CIP2A蛋白质的降解所需的时间不会因有或没有TD-52而受影响，但通过RT-PCR的检测结果发现其mRNA表现是因TD-52处理而被抑制。该结果显示TD-52可抑制CIP2A的转录作用。本发明进一步确认CIP2A启动子的作用机制，当CIP2A基因启动子与荧光素酶(luciferase)报导子连接时，发现在剂量依赖的方式下TD-52会抑制荧光素酶的活性(图3B上图)。本发明建构一系列pGL4荧光素载体缺失选植株以确认CIP2A基因启动子区域中的序列对TD-52的影响是关键性的，如图3B所示，在具有-110/-1载体的细胞中，TD-52处理不会影响荧光素酶活性，此结果说明在PLC5细胞中-110及-150之间还有CIP2A表现的结合位置。在现有文献中提及Elk-1会结合至该位置上，在子宫颈癌及子宫内膜癌中Elk-1会与另一个转录因子Ets-1一起调节CIP2A的表现。因此，本发明通过西方墨点分析法确认经TD-52处理的PLC5细胞检测Elk-1及CIP2A的表现，已确认Elk-1在调节CIP2A-PP2A-p-Akt信号路径扮演的角色，其结果是，发现在肝癌细胞中Elk-1转录因子会透过在细胞核中表现进而调控CIP2A基因的转录，但在经TD-52处理后的PLC5细胞，CIP2A及Elk-1表现是显著被抑制的(图3C)。本发明以染色质免疫沈淀技术(ChIP)及定量PCR确认Elk-1与CIP2A启动子基因之间的关系(图3D)，在未处理的细胞中，以交联蛋白质-DNA复合物检测Elk-1表现可证实Elk-1结合至CIP2A基因的启动子区域，再者，当细胞暴露于TD-52时，在剂量依赖方式下Elk-1的表现是减少的。因此，此结果表示TD-52通过干扰Elk-1与CIP2A启动子之间的结合进而导致CIP2A转录减少向下调节CIP2A。当CIP2A受抑制时，PP2A活化导致Akt去磷酸化使癌细胞凋亡。再者，Elk-1过度表现会减少TD-52诱导CIP2A向下调节作用及癌细胞凋亡(图3D，右栏)。
2.2.4 本发明的埃罗替尼衍生物对带有PLC5的异体移植的体内作用
本发明中用PLC5的异体移植小鼠模型评估TD-52在活体内(in vivo)的影响。本发明使用目前临床上的抗癌药物索拉非尼(10/mg/kg)、TD-52(10/mg/kg)或DMSO(作为控制组)，给予四周后，接受索拉非尼及TD-52的小鼠的肿瘤尺寸小于控制组。再者，相较于索拉非尼，TD-52显示对活体外肿瘤生长及活体内的细胞活性更有抑制能力(P<0.05；图4A及D)。本发明进一步检测给予TD-52及控制组小鼠的异体移植肿瘤组织的蛋白质表现，如图4B及C所示，在活体肿瘤样本中TD-52提升PP2A活性且向下调节CIP2A及p-Akt的表现量。因此，TD-52显示出通过干扰Elk-1与CIP2A启动子之间的结合进而导致CIP2A转录减少向下调节CIP2A的转录及增加PP2A的活性。当TD-52增加PP2A活性时，Akt会去磷酸化而促进HCC细胞凋亡。
2.2.5 肝癌患者肿瘤组织的检测
为了确认p-Akt及CIP2A的临床意义，更进一步分析147个肝癌患者的肿瘤样本及临床特性，在图4F中，55.5％的肿瘤样本CIP2A高度表现，再者，p-Akt免疫组织化学染色法显示细胞核p-Akt表现强度与细胞核质CIP2A有显著相关。
2.2.6 癌蛋白SET在肿瘤组织中过度表现
本发明进一步验证在肝癌肿瘤组织中SET过度表现及SET及p-Akt共表现可预测手术后肝肿瘤患者再复发的风险。本发明收集147肝癌患者肿瘤组织及其邻近正常组织检测SET癌症蛋白质的异常表现(图5A至C)，在肿瘤组织中SET的表达显著高于其他正常组织，在294样本中(每个患者有一对样本)SET表现在肿瘤组织的平均H分数是170.8，在非肿瘤组织的分数是86.7(p＝86.8)(图5B)，当肿瘤中的SET的表现量相较于成对的正常组织时显示出肿瘤组织SET专一性的表现。如图5C所示，几乎每个患者皆具有明显更高SET表现，肿瘤对非肿瘤SET表现的平均比例为2.2。甚至，SET的高表现量与较差的临床特性可显著关联性。因SET为一种癌症抑制剂磷酸酶PP2A的抑制剂，本发明进行检测肿瘤细胞中SET的异常表现与PP2A功能障碍碍有关，发现SET的高表现量与Akt信号的活性有显著关联性，通过PP2A调节重要的肿瘤信号路径(图5D)，且肝癌患者手术后SET与p-Akt共表现量高可预测再复发的高风险(图5D，下图)。进一步确认在肝肿瘤细胞中SET致癌的特性，以特定的shRNS在细胞生长中使SET沉默的效果，如图5E所示，以抗SET的shRNA转殖至PLC5细胞相较于以shRNA转殖的阴性对照组的生长率，其结果与先前一致，SET沉默会导致Hep3B细胞自我分化成为肝癌细胞微球(hepatosphere)的能力减少((图5F)。因此，该发现显示SET的异常表现会促进肝肿瘤的发生。同时，本发明也通过非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株及非小细胞肺癌患者组织证实SET在肺癌细胞中扮演关键性致癌的角色，以及肝癌细胞中SET与PP2Ac(PP2A催化区域(catalytic domain))结合会导致PP2A的活性增加(结果未显示)。
2.2.7 PP2A会促进Akt向下调节及肝癌细胞凋亡
本发明进一步证实SET-PP2A是否可为抗癌策略的新目标。首先本发明将肝癌细胞暴露于相同剂量的本发明的埃罗替尼衍生物(EMQA)48小时，利用MTT分析检测以确定细胞活性，如图6A所示，EMQA会造成肝癌细胞活性显著的减少，包含四种肝癌细胞PLC5、HuH7、Hep3B及Sk-Hep1细胞株。检测由EMQA处理后促进细胞凋亡的效果，四种肝癌细胞暴露于相同浓度的EMQA下24小时，再通过流式细胞仪、酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)及西方墨点分析法分析细胞死亡，并以DMSO为对照组。通过流式细胞仪检测相对于EMQA高剂量或长时间处理的sub-G1细胞的比例(图6B及D，上图)，通过ELISA分析，显示DNA片段化程度随着EMQA处理的剂量增加而增加(图6C)。在剂量依赖及时间依赖的方式下EMQA-诱发-肝细胞凋亡会向下调节p-Akt信号(图6D)。再者，本发明通过PLC5异体移植肿瘤小鼠模型以评估活体内EMQA对抗肝癌的影响，相较于接受控制组的小鼠，以EMQA治疗(10mg/kg/day)的带肿瘤小鼠显著减少肿瘤生长(图6E)。为了确认肿瘤组织发生的分子机制，以西方墨点分析法分析及PP2A活性分析检测接受EMQA及控制组的异体移植肿瘤小鼠的肿瘤组织，其与在活体外检测的结果一致，接受EMQA治疗的异体移植肿瘤小鼠的肿瘤组织比控制组p-Akt表现更低且PP2A的活性更高(图6F)。
2.2.8 以SET/PP2A/p-Akt信号的抑制确认本发明的埃罗替尼衍生物的促细胞凋亡的效果
本发明确认Akt是否为调节EMQA对抗HCC效果的关键。通过过渡性转染(Transienttransfection)产生具有myc-标记Akt异位表现的PLC5细胞并由5μM EMQA处理24小时后，如图7A所示，相较于野生型，由EMQA处理后sub-G1细胞及PARP切割形式的比例在过度表现Akt的PLC5细胞中显著地减少，其表示Akt决定EMQA促进细胞凋亡的效果。接者，本发明以三个不同的策略证实EMQA-调节Akt向下调节PP2A的角色，首先，使用PP2A抑制剂、黑海棉酸(OA)以抑制PP2A的活性，如图7B所示，通过EMQA处理诱发后向下调节p-Akt的表现及促进细胞凋亡的效果会再通过5μM EMQA及100nM OA共处理后得到相反的结果；接者，本发明通过siRNA专一性地剔除PP2Ac，相较于野生型的PLC5细胞，当以siRNA剔除PP2Ac时p-Akt的表现增强(如图7C)；再者，MQA-诱发细胞凋亡的比例在PP2Ac-剔除-PLC5细胞中明显减少，除了PP2A外，其他蛋白质激酶，包含PI3K、PTEM及PDK1已知与调节Akt信号活性有关，本发明在EMQA-处理肝癌细胞裂解物中确认该些蛋白质的表现，如图7D所示，通过EMQA能显著抑制p-Akt的表现，但不会影响PI3K、PTEM及PDK1的表现，该些结果证实PP2A在PP2A在调节EMQA-诱发Akt向下调节过程中扮演重要的角色。
因EMQA通过打断SET-PP2Ac结合而再活化PP2A，本发明为了证实SET的角色，通过过渡性转染产生具有myc-标记SET异位表现的Hep3B细胞，并在SET过度表现的细胞中，通过EMQA处理诱发后向下调节p-Akt的表现及细胞凋亡的效果皆减少(图7E)。本发明以两种截断的SET蛋白质确认EMQA的目标位置，其分别为N-末端片段(SETNTF，a.a.l-227)及C-末段片段(SETCTF，a.a.76-277)，并以活体外SPR系统检测(图7F，左图)以及细胞系统(cell-basedsystem，图7F，右图)。随着PP2Ac涂覆固定于CM芯片的量，本发明测试在SPR系统中固定剂量的EMQA会干扰不同比例全长及截断型式的SET蛋白质，如图7F所示，EMQA的干扰效果不因SETNTF的比例增加而受到影响，相反地，含有SETNTF及全长的SET蛋白质复合体对PP2Ac的结合亲和力随SETNTF比例增加而增加。本发明也通过过渡性转染产生具有两个截断型式的Flag-标记SET蛋白质的异位表现的细胞，与SPR的结果一致，EMQA会减少全长SET及SETCTF对PP2Ac的结合，不会影响SETNTF的结合(图7F，右图)，同时本发明也在肺癌细胞A549中得到相同的结果(结果未示)，此结果证实EMQA专一性地将SET蛋白的C-末端设为目标。
2.2.9 本发明的埃罗替尼衍生物在活体外及活体内改善索拉非尼对HCC细胞的敏感性强化PP2A的功能
目前，索拉非尼为治疗肝癌患者合格的标靶药物，其具有有限的无恶化存活(progression-free survival)及较高的治疗相关毒性程度，因此有必要改善索拉非尼对肝癌患者的药物敏感性，本发明测试再活化PP2A是否能改善索拉非尼的效果，本发明先通过MTT测试EMQA组合索拉非尼的效果，在四个不同的肝癌细胞株中，当EMQA组合索拉非尼的比值为1:5时可显著改善抗癌效果，通过MTT的结果确认所有的肝癌细胞株的组合比值，其表示有协同效果(synergism)(图8A)。进一步通过sub-G1分析及西方墨点分析法确认该组合处理的促进细胞凋亡的结果，相较于单独以索拉非尼处理，当在Hep3B及PLC5细胞中EMQA加入至索拉非尼时，通过流式细胞仪检测sub-G1的比例以及PARP的切割型式皆显著的增加(图8B)。目前索拉非尼仅适合用于晚期的肝癌治疗，其肿瘤通常是巨大的且无法以其他的方式处理，为了模拟这种临床症状，本发明以具有PLC5异体移植肿瘤的小鼠测试索拉非尼及EMQA结合的治疗效果，如图8C，相较于单独接受EMQA或索拉非尼的小鼠，索拉非尼及EMQA结合能显著抑制肿瘤生长的速率，且在接受治疗的末期肿瘤的平均重量明显较低(图8D)，甚至，在肿瘤中该组合治疗也可强化PP2A的活性(图8E，上图)及抑制p-Akt表现。
2.2.10 本发明的埃罗替尼衍生物与紫杉醇(paclitaxel)会向下调节p-Akt并促进非小细胞肺癌细胞凋亡
本发明利用西方墨点分析法以紫杉醇及/或EMQA处理的细胞裂解物，如图9A所示，在以紫杉醇及EMQA处理的肺癌细胞p-Akt表现量显著减少。再者，在剂量依赖及时间依赖的方式下共处理会诱发p-Akt向下调节(图9B及C)，更重要的是，PARP信号的活性与p-Akt向下调节的结果一致。本发明通过过渡性转染产生具有myc-标记Akt异位表现的A549细胞并由5μM EMQA及10nM紫杉醇处理24小时后，如图9D所示，共处理可显著减少Akt过度表现细胞，因此通过抑制Akt信号可确认在非小细胞肺癌细胞中EMQA及紫杉醇的协同效果。
2.2.11 在活体内(in vivo)本发明的埃罗替尼衍生物与紫杉醇对抗癌的协同效果
本发明在活体内测试EMQA与紫杉醇结合的抗癌效果，本发明产生A549异体移植肿瘤的小鼠并以控制组、紫杉醇及/或EMQA治疗小鼠，相较于单独接受EMQA或紫杉醇的小鼠，接受EMQA与紫杉醇结合治疗的小鼠的肿瘤生长速率明显减少(图10A)，且平均肿瘤种量亦显著较低(图10B)，值得注意的是，给予不同治疗的小鼠的体重没有明显差异(图10E)。本发明通过西方墨点分析法及PP2A活性分析肿瘤裂解物，其结果与先前相同，接受EMQA与紫杉醇结合治疗的小鼠肿瘤的PP2A活性明显高于接受控制治疗(图10C)，且p-Akt的表现也向下调节；本发明也通过西方墨点分析法分析A549异体移植肿瘤小鼠的肿瘤裂解物p-Akt及Akt表现量有减少的趋势(图10D)。
因此，本发明的埃罗替尼衍生物在肿瘤细胞表现新的治疗机制，通过抑制CIP2A进而提升PP2A表现且向下调节p-Akt，显示出本发明的埃罗替尼衍生物可用作增强PP2A活性的癌症治疗方法。同时，本发明也证实SET的高度表现与患者肿瘤较严重及预后较差有关，因此，本发明将干扰SET-PP2A的结合作为治疗癌症的新策略，并通过本发明的埃罗替尼衍生物与索拉非尼或紫杉醇结合以强化索拉非尼的治疗效果，可有效抑制肿瘤的生长。本发明提供一种癌症治疗的替代选择，该选择可能在对传统医药治疗具有抗性的癌症的治疗上是极有帮助的。
Figure GDA0002287261410000471
Figure GDA0002287261410000481
Figure GDA0002287261410000501
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Figure GDA0002287261410000521
Figure GDA0002287261410000531
Figure GDA0002287261410000541

Claims (9)

1.一种可经芳基胺取代的喹喔啉用于制造以治疗蛋白质磷酸酶2A(PP2A)不活化为特征的疾病或病症的医药组合物的用途，以蛋白质磷酸酶2A(PP2A)不活化为特征的疾病或病症为肝癌、或肺癌；
所述可经芳基胺取代的喹喔啉具有如式I(a)或式I(b)的结构：
Figure FDA0002063394910000011
其中R1为可经取代的苯基，且可经取代的苯基为以下结构中的任意一种：
Figure FDA0002063394910000012
R2及R3选自
Figure FDA0002063394910000013
2.一种医药组合物，包含可经芳基胺取代的喹喔啉，以及药理上可接受的载体；
所述可经芳基胺取代的喹喔啉具有如式I(a)或式I(b)的结构：
Figure FDA0002063394910000014
其中R1自独立地为可经取代的苯基，且可经取代的苯基为以下结构中的任意一种：
Figure FDA0002063394910000015
Figure FDA0002063394910000021
R2及R3选自
Figure FDA0002063394910000022
3.一种用于活化蛋白质磷酸酶2A(PP2A)在细胞内表现的医药组合物，包含可经芳基胺取代的喹喔啉，以及药理上可接受的载体；
所述可经芳基胺取代的喹喔啉具有如式I(a)或式I(b)的结构：
其中R1为可经取代的苯基，且可经取代的苯基为以下结构中的任意一种：
Figure FDA0002063394910000024
R2及R3选自
Figure FDA0002063394910000025
4.一种用于治疗以蛋白质磷酸酶2A(PP2A)不活化为特征的疾病或病症的医药组合物，包含可经芳基胺取代的喹喔啉，以及药理上可接受的载体；
所述可经芳基胺取代的喹喔啉具有如式I(a)或式I(b)的结构：
Figure FDA0002063394910000026
其中R1为可经取代的苯基，且可经取代的苯基为以下结构中的任意一种：
R2及R3选自
5.一种用于作为蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)拮抗剂的医药组合物，包含可经芳基胺取代的喹喔啉，以及药理上可接受的载体；
所述可经芳基胺取代的喹喔啉具有如式I(a)或式I(b)的结构：
其中R1为可经取代的苯基，且可经取代的苯基为以下结构中的任意一种：
Figure FDA0002063394910000034
R2及R3选自
6.一种用于治疗以蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表现量增加为特征的疾病或病症的医药组合物，包含可经芳基胺取代的喹喔啉，以及药理上可接受的载体；
所述可经芳基胺取代的喹喔啉具有如式I(a)或式I(b)的结构：
Figure FDA0002063394910000036
其中R1为可经取代的苯基，且可经取代的苯基为以下结构中的任意一种：
Figure FDA0002063394910000041
R2及R3选自
Figure FDA0002063394910000042
7.如权利要求2至6中任一项所述的医药组合物，进一步包含抗癌药物,该抗癌药物为索拉非尼(Sorafenib)。
8.一种可经芳基胺取代的喹喔啉用于制造以治疗蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表现量增加为特征的疾病或病症的医药组合物的用途；
所述可经芳基胺取代的喹喔啉具有如式I(a)或式I(b)的结构：
Figure FDA0002063394910000043
其中R1为可经取代的苯基，且可经取代的苯基为以下结构中的任意一种：
Figure FDA0002063394910000044
R2及R3选自
Figure FDA0002063394910000045
9.如权利要求8所述的用途，其中，该以蛋白质磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)表现量增加为特征的疾病或病症为肝癌、或肺癌。
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